检查RNA完整性的方法
分离完整的RNA在基因表达分析所用的众多技术中是必不可少的。有很对技术可以用于基因表达分析，对于这些技术而言，分离得到完整的RNA是必不可少的一步。Northern分析，cDNA文库构建以及用于微阵列芯片分析的cDNA标记实验（尤其在使用oligo(dT)作为引物时）均要求RNA具有高度的完整性。而RT-PCR与核糖核酸酶保护实验均涉及到对较短序列区域的分析（通常短于1kb），因此较易接受部分降解的RNA。不论具体的下游应用是什么，进行基因表达分析之前检查RNA完整性都是有意义的。
评估总RNA完整性的最常用的方法是使用少量的RNA样品进行变性凝胶电泳并用溴化乙锭（EtBr）进行染色。虽然使用非变性凝胶电泳也是可以的，但其结果可能较难解读。RNA的二级结构会改变其在非变性凝胶中的迁移模式，从而使RNA不会按真实片段大小进行迁移。非变性环境同样会使条带不那么清晰，甚至会产生多条带分别对应于同一种RNA的不同结构。
完整的总RNA在进行变性凝胶电泳时会产生清晰的28S和18S rRNA条带（真核样品）。28S rRNA条带的强度应当大致为18S rRNA条带的两倍（图1，第3条泳道）。这种2:1的比率（28S：18S）是判断RNA完整性的一个很好的指标。部分降解的RNA样品电泳条带会弥散，没有清晰的rRNA条带，或者不会出现前面提到的高质量RNA才具有的2:1比率（28S:18S）。完全降解的RNA会表现为在极低分子量处的弥散状（图1，第2条泳道）。电泳中加入RNA分子量标志物可以帮助确定条带或弥散对应大小，也可以帮助判断电泳是否正确进行（图1，第1条泳道）。注意：利用Poly(A)进行进一步纯化得到的样品不会带有明显的rRNA条带，而是会表现为6kb到0.5kb大小范围的弥散（mRNA的集合，具体范围与曝光时间和环境有关），其中1.5到2kb的区域亮度最强（这一弥散有时也会出现在总RNA样品中）。
图1：完整的RNA与降解的RNA之间的比较。 分别取2微克的降解总RNA及完整总RNA与Ambion的RNA Millennium Markers(TM)一同进行1.5%的变性琼脂糖凝胶电泳。在完整RNA样品中可以清楚地观察到18S和28S核糖体RNA。而降解的RNA则表现为较低分子量的弥散。
使用变性凝胶电泳来评估RNA完整性的一个缺陷是观察所需的RNA样品量。通常情况下，需要在变性凝胶中上样至少200 ng的RNA才能在EtBr染色下进行观察。而在某些RNA制备实验中，如从穿刺活检样品或激光捕获显微切割样品中提取RNA，得率是非常低的。这种情况下，或许就不可能在进行表达谱分析实验前取出200ng的RNA来评估其完整性。其它的核酸染料，比如Moleculor Probes (Eugene, OR) 的SYBR(R) Gold及SYBR Green II RNA染料，相比传统的琼脂糖凝胶电泳EtBr染色方法可以显著提高灵敏度。通过使用300nm的透射光源（6 x 15瓦的灯泡）及特殊的滤光片，SYBR Gold RNA凝胶染色可以检测到低至1ng的RNA，而SYBR Green II则可以检测到2ng，从而可以使用更少的样品来进行RNA完整性分析。
图2：该图为高质量的真核总RNA样品的电泳图。在39秒及46秒位置分别可以观察到清晰的18S和28S峰。Bioanalyzer的微通道充满了筛孔高分子聚合物和荧光染料。样品可以通过其发出的荧光而被检测到，其信号可转换为电泳峰图或类凝胶电泳图像（数据未显示）
目前有一种快速简单的方法可以替代传统的凝胶分析方法，这种方法可以同时对RNA样品进行定量及质量评估。Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)是第一款商业化的提供RNA样品状态细节信息的微流体仪器。当与RNA 6000 LabChip(R)（Caliper Technologies Corporation所拥有的一个注册商标）结合使用时，每次进行分析最低仅需1ul浓度为10 ng/ul 的样品。除了评估RNA完整性，这台自动化系统同样可以提供样品RNA浓度及纯度（如mRNA制备中的rRNA污染）的评估。在过去，检测浓度及纯度需要使用部分RNA样品（通过A260分光光度法），而评估完整性则需要另外使用部分样品。通过使用LabChip(R)系统，可以仅使用一份5ng的样品来同时对浓度、完整性及纯度进行分析。分析数据可以显示为类凝胶图像、电泳峰图（图2）及表格形式等。
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电话：86-21-从小量样品中提取RNA
Quantitative RNA recovery from 4 - 400,000 cells
Generates concentrated RNA for immediate use in downstream applications
Includes DNA-free(TM) technology to remove contaminating genomic DNA
Molecular analysis of gene expression from very small samples can be challenging. The RNA isolation method used for limited samples should provide for quantitative recovery of RNA that is intact, free from contaminants, and as highly concentrated as possible. Increasingly, expression analysis is being carried out on "micro-sized" samples, including samples obtained by Laser Capture Microdissection (LCM) and related microd and samples comprised of low numbers of cultured cells. In these cases, it is desirable to recover the total RNA in a small volume so that the entire sample can be used in downstream applications, such as reverse transcription. Also, keeping the sample as concentrated as possible facilitates analysis and quantitation of the total RNA using sensitive microfluidic assays (e.g. Agilent 2100 bioanalyzer). Ambion's RNAqueous(TM)-Micro Kit was developed to optimize recovery of highly concentrated total RNA from micro-sized samples.
The RNAqueous-Micro Kit begins with sample disruption in a chaotropic solution to lyse the cells and inactivate cellular nucleases. The cell lysate is loaded onto a glass fiber filter, washed and eluted. The filter cartridge provided in the RNAqueous-Micro Kit is only a few millimeters in diameter so that it can be saturated with a small volume of fluid. This allows the RNA to be eluted in a volume of only 20 ul. After elution, the RNA is treated with DNase I to eliminate genomic DNA contamination that can interfere with RT-PCR assays. The DNase is then removed using the
which removes the DNase I and buffer ions in a simple, quick step without organic extraction or heat inactivation. (Heat inactivation of DNase frequently causes divalent cation-mediated degradation of the RNA.) Using the RNAqueous-Micro Kit, the entire RNA isolation procedure, including DNase treatment, takes about 30 minutes.
To demonstrate the quality of RNA isolated by the RNAqueous-Micro Kit, RNA from 4 - 400,000 cells was recovered using the procedure and analyzed for integrity and concentration. Figure 1B shows an electropherogram of some of this total RNA. The RNA was intact. The RNA was then used in a one step qRT-PCR assay, and linear recovery of mRNA was shown over a range of 1 - 100,000 cell-equivalents (diluted from the 4 - 400,000 Figure 1A). Minus RT reactions showed no amplification (data not shown).
Figure 2 shows an electropherogram and real-time PCR data generated from cells isolated by LCM and RNA purified using the RNAqueous-Micro Kit. The RNAqueous-Micro Kit contains sufficient reagents and filter cartridges to isolate total RNA free of DNA from 50 samples of 1 - 1 x 105 cells or up to 5 mg of tissue.
Figure 1. (A) Linear Recovery of RNA from Cells Over a 5 Log Range. RNAqueous(TM)-Micro Kit was used to isolate total RNA from K562 cells diluted from 100,000 cell equivalents down to 1 cell equivalent. The RNA samples were then used for amplification of GAPDH by real time RT-PCR. (B)Electropherogram of RNA isolated from 10,000 K562 cells. RNA was run on an Agilent 2100 bioanalyzer. Total yield after DNase treatment and clean up was 360 ng with an 28S/18S rRNA ratio of 1.87.
Figure 2. (A) Use of LCM Samples for One Step RT-PCR of Neurogranin. RNA was isolated from nine mouse brain Laser Capture Microdissection samples using the RNAqueous(TM)-Micro Kit. The 20 ul post isolation eluates were DNase treated (final volume 25 ul). A fifth of this treated sample was subjected to one-step RT-PCR for analysis of neurogranin (Ct of 18.44).
(B) Electropherogram of RNA Isolated from the Granule Cell Layer of Hippocampus (Mouse Brain). Cells were obtained through LCM and RNA was isolated with the RNAqueous(TM)-Micro Kit. 5 ul was run and analyzed on an Agilent 2100 bioanalyzer. Total yield after DNase treatment and clean up was 120 ng with an 28S/18S rRNA ratio of 0.72.
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3秒自动关闭窗口细胞加入TRIZOL后保存于－70可存放多久(抽提)
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细胞加入TRIZOL后保存于－70可存放多久(抽提)
RNALater标题: 细胞加入TRIZOL后保存于－70可存放多久(抽提)
摘要: [细胞加入TRIZOL后保存于－70可存放多久(抽提)] 请问各位高手细胞加入TRIZOL裂解后保存于－70度，可以存放多久？如果不准备马上抽提RNA，是否先冻存细胞抽提之前再加TRIZOL比较合适还是直接加好TRIZOL后再冻存好？谢谢！ 关键词:[抽提]……
关键词: 请问各位高手细胞加入TRIZOL裂解后保存于－70度，可以存放多久？如果不准备马上抽提RNA，是否先冻存细胞抽提之前再加TRIZOL比较合适还是直接加好TRIZOL后再冻存好？谢谢！
回复做之前再加比较合适吧。没有加完TRIZOL再保存的道理。回复有些标本我已经加了TRIZOL，请问最多可放多久？回复加TRIZOL裂解后－70度保存，至少可以放置一个月，有条件的话，可以考虑加RNALater，更安全一些！回复那么最长可以放置多久？有些标本我已经放了半年左右，还能抽提吗？此外，还想问问TRIZOL抽提细胞总RNA至少要多少细胞？10^5左右够吗？谢谢回复我觉得加了变性剂－70℃放半年应该没有问题，一般按照每10^6细胞加入1ml的TRIZOL即可，10^5应该也可以了。我一般都是提新鲜的细胞，将细胞培养至长满培养瓶，按一大瓶细胞加入2ml TRIZOL的比例，建议你也这样做。其实你也可以将RNA提出来，分装后于－70℃冻存，同样可以保存半年～一年，只是个人经验，祝你顺利。回复昨天值班没有上网.谢谢楼上朋友的帮助,我会把已经冻存的标本试着抽提看看,以后还是及时抽提RNA较好.回复加了Trizol放-80C，基本上可以无限保存，随便你什么时候再拿出来抽提RNA。在Trizol里面RNA降解不了。我都用过1ml溶10^8细胞。关键是homogenize之后你max spin，全部soluable，没有pellet就行了。如果有pellet，就少用一点细胞，或者多加一点Trizol。回复我用的上海华舜公司的柱离心式RNA提取试剂盒,从培养的淋巴细胞中提RNA，也不知道试剂盒里的裂解液是不是你们说的Trizo。提了很多次，别说降解，电泳后连痕迹都没有，我也不知道该如何是好。请问，我用的是细胞培养板，24孔的，裂解液的量怎么控制啊？回复Trizol是什么，Google!!!我用的上海华舜公司的柱离心式RNA提取试剂盒,从培养的淋巴细胞中提RNA，也不知道试剂盒里的裂解液是不是你们说的Trizo。提了很多次，别说降解，电泳后连痕迹都没有，我也不知道该如何是好。请问，我用的是细胞培养板，24孔的，裂解液的量怎么控制啊？回复半年,我们有做过.回复楼上的朋友，里有很多关于用TRIZOL抽提RNA的介绍，搜一下就可发现。我抽提了5个冻存超过半年的加了TRIZOL的标本，其中3个没有测出浓度，还有2个有浓度，但很奇怪把标本全部逆转录后PCR扩增B-actin，竟然全部有条带，后来我又抽了2个最近的标本，也没有测出浓度，但同样扩增出B-actin的条带，是否我的细胞量太少（大约1×10×6左右，甚至更低）所以测不出OD值，但其实有痕量的RNA存在？我看文献说逆转录一般取RNA2ug，如果测不出浓度是否会影响标本之间的可比性（接下来我准备作定量PCR）？还是只要设置好内参，就无所谓起始量？此外还想请教我想换用RNA抽提试剂盒抽提RNA以提高得率，但原先的标本已经加了TRIZOL还能用试剂盒抽提吗？请问哪个公司的试剂盒效果较好？谢谢。回复按照Trizol试剂说明书：After homogenization and before addition of chloroform, samples can be stored at -60 to -70°C for at least one month.我们的经验半年一年都行。回复最好一个月吧，我试过
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