酶联免疫测定（ELISA）标准化的一般原则 - 免疫实验 - 生物秀
标题: 酶联免疫测定（ELISA）标准化的一般原则
摘要: [酶联免疫测定（ELISA）标准化的一般原则]酶联免疫测定（ELISA）标准化的一般原则对酶联免疫测定标准化的目的就是通过这种标准化以改善实验室测定的准确度，从而提高不同的实验室间结果的可比性。进行标准化的先决条件是，标准品和检测物应该是相同的，否则标准化就无从谈起。这在目前的许多临床免疫测定项目中标准品往往没有达到这一要求。涉及到免疫测定标准化的组织有世界…… [关键词:标准品 校准 标准化 免疫测定 激素 酶联免疫测定 多肽激素]……
酶联免疫测定（ELISA）标准化的一般原则
对酶联免疫测定标准化的目的就是通过这种标准化以改善实验室测定的准确度，从而提高不同的实验室间结果的可比性。进行标准化的先决条件是，标准品和检测物应该是相同的，否则标准化就无从谈起。这在目前的许多临床免疫测定项目中标准品往往没有达到这一要求。
涉及到免疫测定标准化的组织有世界卫生组织(WHO)生物学标准化专家委员会(ECBS)，其负责建立生物物质的国际标准及参比材料。WHO通过国家生物学标准和质控物研究所(NIBSC)提供大多数多肽激素和一些肿瘤标志物的国际标准品。一些区域和地区性组织也制备标准品，如美国的疾病控制中心(CDC)、美国病理学家协会(CAP)的国家委员会。国家卫生研究所(NIH)提供尤其是用于研究目的的多肽激素标准品。IFCC也已组织制备了一种脂蛋白和血清蛋白的标准品，可通过CAP得到。国际癌发生生物学和医学学会已启动一个肿瘤标志物的决定计划。在国内中国药品生物制品检定所提供一些多肽激素、肿瘤标志物等标准品。卫生部临床检验中心则为全国各级医院血站实验室提供室内质控物。尽管仅仅使用标准品并不能保证免疫测定结果的可比性，但标准品对保证免疫测定的重要性是不言而喻的。目前在世界上有各种不同的科学协会如IFCC及国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)以及美国和加拿大临床化学协会(AACC和CSCC)等正致力于免疫测定的标准化工作，这些组织也制备一些标准品。在美国，免疫测定必须有食品和药物管理局(FDA)的批准。在德国的监督机构是医学实验室标准化和文件化研究所(INSTAND)。在国内免疫诊断的审批由国家药品监督管理局(SDA)负责。卫生部临床检验中心也正在着手临床免疫检验标准化方面的工作。
第一代生物学标准品是在70多年前由Henry Dale制备的用于胰岛素(insulin)测定的标准品，该标准品被WHO的前身即国家卫生组织联合会(League Of National Health Organization)所采用。从那时起，在一系列国际标准品(IS)中胰岛素(insulin)制剂的含量以国际单位(IU)表示，每一个国际标准品均用前一个进行校准。其后，对大多数重要的多肽激素和其他具有“复杂分子组成的物质”(即不能仅通过使用物理和化学方法完全鉴定其均一性、效力或安全性的物质)均制备了国际标准品。每一种IS的单位由ECBS在国际合作研究的基础上确定。并评估提出来作为一种IS的制剂在不同的试验系统中的适用性。生物试验主要是用于多肽激素标准的评价和使用以前的旧标准晶对新标准品的校准。因此，单位通常表示生物活性，但其也用于缺乏已知生物活性的物质。通常标准品的制备批量应至少够用10—20年。
对于临床分析测定来说，标准品和参考制剂可用作校准物，而在每个具体的实验室中，其可用来评价试验的有效性，以及作为室内质控样本，对测定的质量评价来说，也是非常有价值的。术语“IS”取代了已被WHO用于某些标准品的术语“国际参考制剂”(IRP)。目前使用的人绒毛膜促性腺激素(hCG)刚开始被称为第一代IRP，后来被称为第三代IS。尽管大多数IS制剂由溶解在含一载体蛋白的缓冲液中的纯抗原所组成，但某些标准品(如血清蛋白)是以血清作为基质材料的。标准品可归类为第一、第二和第三等三个等级。一级标准品数量有限，可使用10～20年，为冻干品，内含载体蛋白。一级标准可用来校准第二和第三级标准，例如，常规测定中使用的校准品。IS可作为第一级标准品，一旦第一级标准确定，二级标准可用来维持校准。校准的二级标准可在以国家为基础的范围内供应。标准品的特性应该清楚明确，理想的标准品应该是纯的但仍需有特定分析物质可能的同种型不均一性，这种要求通常难以达到，因为在纯化过程中，使用生化方法去除杂质会引起少量的同种型丢失。免疫亲和层析纯化方法可用来提取所有特异的同种型，但洗提过程常需在低pH变性条件下进行，这种变性条件可能会引起某些蛋白的不可逆修饰。免疫亲和层析纯化方法也可使用在细胞系统中表达生成的蛋白，但表达产物仍需纯化和糖基化，而糖基化又可能与天然蛋白有所不同。
目前可得到的国际标准品中特定分析物的浓度一般以U／L表示，而已经很明确的物质如类固醇和甲状腺激素，则应以物质浓度(m01／L)表示。但已很明确的肽类激素的数量也正在不断增加，因此，虽然促肾上腺皮质激素(ACTH)和胰岛素(insulin)已有国际标准品，但其浓度常以m01／L或g／L而不是U／L来表示。鉴定明确的肿瘤标志物的浓度常以质量浓度(g／L)表示，而不太明确的标志物则以指定的单位(U／L)表示。激素浓度以U／L表示会给人这样一个印象，即所测定的是具有生物学活性的激素的浓度，但免疫测定并不能测定生物活性，其实际上测定的是抗原上一个决定基(epitope)或一组决定基的摩尔浓度，尤其是使用单克隆抗体进行测定时。因此，质量浓度(以m01／L表示)最能确切地反映所测定的是什么。即使蛋白的糖的组成和等电点不均一，氨基酸分析也可准确地测定纯化蛋白的含量。糖蛋白质量的称重测定是不准确的，因为其含有结合很紧的水，冻干并不能去除。第四代hCG标准品将通过氨基酸分析的方法来测定，以m01／L来表示，至于将现有的第三代国际标准转换至第四代的转换因子可通过免疫测定进行交叉校准确定。如果一个免疫试验测定分子量不同但免疫反应性相同的同一物质的不同分子变异体，则质量浓度可正确地反映不同成分的浓度，然而，如果不同的分子形式没有相等的免疫反应性，则质量浓度也会出现偏差，该问题可通过使用具有适当特异性的抗体和标准品来解决。
当标准晶更换时也会出现标准化方面的问题，一个新的标准品可能会改变诊断免疫试验的效果估价，尽管已进行了仔细的校准。使用生物试验校准激素标准品颇为复杂，生物试验较之免疫试验的重复性要差，对免疫反应性影响不大的激素的糖组成成分对其生物活性却影响较大，用于体内和体外实验的效果是不一样的。如果一新的激素标准品是根据生物活性来进行校准的，则将其用于免疫测定时会有所不同。如卵泡刺激激素标准FSH83／575用于FSH免疫测定校准时，其变化因子为4，但催乳激素、促黄体生成激素(LH)和生长激素则不引起或只引起很小的改变。
从一级标准的值传递到最终试验所使用的校准物的过程通常由几个校准步骤组成，包括标准品和测定方法、缓冲液及其基质、稀释的控制、最终结果的统计学评价和质量控制等。当建立一个测定方法时，一级标准品的值要传递至二级、三级和(或)校准品，使得所建立的方法的测定值可溯源至一级标准品。当引入一批新的时，即需要重复这种传递过程，从而保持校准的可靠性。不同的分析物如蛋白、多肽或与载体蛋白结合的低分子量等其校准过程有所不同。
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