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　　对菌群16S rRNA基因进行高通量测序，无疑是微生物组研究中最基础也是最常用的研究方法，能以较高的性价比揭示菌群的具体物种组成，从而解答“群落中有谁在？”的基本问题。然而，很多时候，我们更希望知道菌群行使的具体功能，也就是解释“它们在干什么？”。对菌群进行宏基因组测序自然是最佳解决方案，但如此高大上的研究方法，投入成本相对较多，分析方法也相对复杂。如果仅仅知道菌群组成，该怎么把物种的“身份”和它的“功能”对应起来呢？
　　由此，一款名为PICRUSt的菌群代谢功能预测利器应运而生，相关论文发表在权威期刊《Nature Biotechnology》上[1]。PICRUSt全称为“Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States”，可以通过16S rRNA基因序列，预测对应的细菌和古菌的代谢功能谱。
　　有了PICRUSt，相当于在菌群的“组成”和“功能”之间搭起了一座桥，即使只有16S rRNA基因的测序结果，我们一样可以获得宏基因组级别的研究结果！
1PICRUSt的基本原理
　　PICRUSt的总体思路说来很简单，主要分为3步：
　　1. 先根据已测微生物基因组的16S rRNA基因全长序列，推断它们的共同祖先的基因功能谱；
　　2. 对Greengenes数据库中其它未测物种的基因功能谱进行推断，构建古菌和细菌域全谱系的基因功能预测谱；
　　3. 最后，将测序得到的菌群组成“映射”到数据库中，对菌群代谢功能进行预测。该步骤具体通过以下方式实现：
　　i. 对测序获得的16S rRNA基因序列，进行“封闭式”参考OTU划分（Closed-reference OTU picking），通过与Greengenes数据库比对，寻找每一条测序序列的“参考序列最近邻居”，并归为参考OTU；
　　ii. 根据“参考序列最近邻居”的rRNA基因拷贝数，对获得的OTU丰度矩阵进行校正；
　　iii. 根据“参考序列最近邻居”对应的KEGG/EggNOG等基因功能谱数据，换算预测菌群的整体代谢功能。
　　PICRUSt分析的基本流程图示[1]
2PICRUSt的特点
　　PICRUSt算法的一大特点，就是基于Greengenes的16S rRNA基因全长序列数据库，对菌群测序结果进行“封闭式”参考OTU划分。PICRUSt开发者对古菌和细菌域的大多数模式微生物的功能进行预测，让人欣喜的是，绝大多数的微生物预测结果与真实的基因功能谱非常接近（古菌预测精确度为0.94 & 0.04，n= 103；细菌为0.95 & 0.05，n= 2487）。也就是说，绝大多数情况下，PICRUSt的预测效果还是相当靠谱滴！
　　PICRUSt对细菌/古菌基因组预测的精确度
　　当然，若测序序列与Greengenes数据库中没有同源物种的参考序列，则对应的物种将无法被预测。也就是说，原始数据在分析过程中会有一定损失。此外，PICRUSt的特点也表明，它只能对已知微生物的已知功能进行功能预测，所以目前并不能完全代替宏基因组研究，但可以看作宏基因组研究的“近似”结果，在经费、资源有限的情况下，不失为一种理想的选择。
3PICRUSt的应用
　　在小编看来，PICRUSt对于菌群研究的贡献大大滴！首先，PICRUSt能从菌群组成数据解读潜在的功能，可谓充分发挥了16S rRNA基因测序简单、快速、物美价廉的优势；其次，PICRUSt对菌群功能的预测，可以帮助指导后续宏基因组De novo鸟枪法测序的实验设计，更合理地筛选用于后续研究的样本。
　　同时，PICRUSt分析的操作相当便捷，只需对测序数据进行“封闭式”参考OTU划分，并将得到的OTU丰度矩阵上传至Galaxy在线分析平台（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root?tool_id=PICRUSt_normalize），按提示操作就能得到预测结果啦！
　　PICRUSt在线分析平台
416S+PICRUSt，研究新趋势
　　PICRUSt这一方法横空出世后，已有越来越多的研究开始采用这一方法预测菌群组成数据，相关论文发表数量逐年增长，表明该方法已得到大家广泛的认可。16S+PICRUSt，已成为发表高水平论文的必备技能；同时与宏基因组分析相比，更方便快捷，成本也更低，何乐而不为！
采用PICRUSt方法的菌群研究文献逐年增长
　　比如，今年发表在微生态学旗舰期刊《The ISME Journal》（影响因子9.328）的一篇论文《Cigarette smoking and the oral microbiome in a large study of American adults》[2]中，作者就通过PICRUSt预测了吸烟人群和未吸烟人群的口腔菌群，发现共有83个基因功能代谢通路存在显著差异，吸烟大大降低了碳水化合物和能量代谢、异型生物质降解等代谢通路的含量。
　　PICRUSt对吸烟人群口腔菌群的功能预测[2]
　　经过上面的讲解，大家是不是感受到了PICRUSt预测菌群功能的强大威力了呢？小编在这里想说，PICRUSt虽然厉害，但并不是万能，一方面由于它是基于16S rRNA基因的参考序列库，因此尚无法对真菌群落进行功能预测，而预测过程也会造成原始数据的部分损失，对于不同来源的菌群的预测效果也有所差异（一般对于人源微生物组的预测效果最好）；同时，它并不能完全代替宏基因组研究（目前只能对已知微生物的已知功能进行功能预测），但可以对后续实验设计作出指导。
　　参考文献
　　1. Langille MGI, Zaneveld J, Caporaso JG, McDonald D, Knights D, et al. (2013) Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.Nature Biotechnology31: 814-+.
　　2. Wu J, Peters BA, Dominianni C, Zhang Y, Pei Z, et al. (2016) Cigarette smoking and the oral microbiome in a large study of American adults.ISME J 10.1038/ismej.2016.37.
文案 产品运营部宏基因组产品线
派森诺生物
　　上海派森诺生物科技股份有限公司于日正式挂牌新三板（股票代码837170），是一家集科技服务、健康医学、产品研发为一体的国内知名高新技术企业。旗下子公司包括上海桑尼生物技术有限公司、上海派森诺医学检验所有限公司。现拥有一代（常规测序）、二代（高通量测序）和三代（单分子测序）等新型测序平台和相关仪器设备，同时拥有一支由多名基因组学和生物信息学专家带队的测序合成、产品研发及信息分析为一体的王牌技术团队。
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微生物多组学研究｜16S与宏基因联合分析经典思路
前面提到，微生物群落研究可以包括物种组成，群落多样性，群落功能结构，功能作用情况等多个方面（）。16S测序技术一般只侧重于研究群落的多样性变化，虽然可以通过一些软件根据16S的测序数据来进行通路功能分析，但分析准确性往往有限。而宏基因组测序则侧重于研究群落的功能结构，虽已有大量工具可以挖掘宏基因组中的16S rRNA数据进行多样性分析，但数据量不足和16S rRNA的组装效果不理想也往往成为分析的制约因素。如果需要更高效更准确地同时了解微生物群落的组成、多样性以及功能情况，利用16S和宏基因组的联合组学分析已经成为一些高分文章的主流思路。16S测序相比宏基因组测序来说，价格更加便宜。利用16S技术对大量样本进行测序分析后，首先发现并阐明不同条件的样本间微生物组成以及多样性差异，然后挑选个别有代表性的样本，进行宏基因组测序，从而可以验证16S的分析结论、更加深入的阐明群落的功能情况，更好地说明微生物群落与环境之间的关系。下面用一篇文章来印证我们的思路：标题：肠道微生物分析发现黑色素瘤治疗会引起病人患有结膜炎[1]肠道微生物组成与炎症发展相关。部分黑色素瘤患者使用Ipilimumab（黑色素瘤治疗药物）治疗后会引发结膜炎，另一部分病人则不会。利用16S和宏基因组测序，寻找病人中与抗结膜炎相关的微生物biomarkers，为更合理地使用Ipilimumab提供帮助。Ipilimumab用药后，利用16S测序技术，比较10位结膜炎患者（PtC）和24位非结膜炎患者（C-F）在发生炎症反应之前的肠道微生物生长情况，发现两组样本有约80%的微生物组成是一致的（图1a），这与宏基因组测序结果基本一致。但在炎症发生后，比较两组样本的微生物组成，结果发现非结膜炎患者的bacteriodetes组分明显增加（图1b）。图1. 结膜炎与肠道微生物改变相关A．C-F和PtC组粪便微生物组成比较；B. C-F和PtC组中bacteriodetes的丰度存在差异。挑选10位结膜炎患者和12位非结膜炎患者的肠道微生物样本，进行宏基因组测序发现，两种样本的微生物菌落功能基本一致，但聚胺转运系统（polyamine transport System）和维生素B（thiamine （B1）、riboflavin（b2）、pantothenate（b5））合成等功能模块与抗结膜炎相关。图2. 在C-F病人中富集的微生物通路联合16S rRNA测序和宏基因组测序两种技术，发现维生素B合成等微生物群落功能与抗结膜炎相关后。利用相关通路作为biomarker，对病人的患结膜炎情况进行预测，发现这些通路biomarkers的预测准确率极高（图3）。图3. 利用不同通路的预测准确性比较（Poly, polyam Thi, t Ribo, rib Panto, pantothenate biosynthesis.）基迪奥能够为客户提供专业的微生物研究思路，丰富的分析内容和更多个性化的数据挖掘手段，有兴趣的老师可以积极参加我们近期的讲座哦（对应的讲座主题是：微生物群落研究发文策略与项目问题讨论）！我们下周的讲座行程安排如下：参考文献：[1] Dubin, Krista, et al. 'Intestinal microbiome analyses identify melanoma patients at risk for checkpoint-blockade-induced colitis.' Nature communications 7 (2016).文献解读/技术贴/教程贴/前沿资讯，每天一篇干货分享给你~做行业内最具干货的公众号！我们的梦想在未来，基迪奥能助您达到更高的科研领域！
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菌群代谢功能预测：宏基因组的一小步，多样性组成谱分析的一大步！ ... ...
时间： 19:04
摘要：不止是多样性组成谱分析，16S测序也能体验宏基因组研究的快感！...
对菌群16S rRNA基因进行高通量测序，无疑是微生物组研究中最基础也是最常用的研究方法，能以较高的性价比揭示菌群的具体物种组成，从而解答“群落中有谁在？”的基本问题。然而，很多时候，我们更希望知道菌群行使的具体功能，也就是解释“它们在干什么？”。对菌群进行宏基因组测序自然是最佳解决方案，但如此高大上的研究方法，投入成本相对较多，分析方法也相对复杂。如果仅仅知道菌群组成，该怎么把物种的“身份”和它的“功能”对应起来呢？
PICRUStNature Biotechnology[1]PICRUSt“Phylogenetic Investigation of Communitiesby
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1.Langille MGI, Zaneveld
J, Caporaso JG, McDonald D, Knights D, et al. (2013)Predictive functional
profiling of microbial communities using 16S rRNA markergene sequences. Nature
Biotechnology 31: 814-+.
2. WuJ, Peters BA,
Dominianni C, Zhang Y, Pei Z, et al. (2016) Cigarette smoking andthe oral
microbiome in a large study of American adults. ISME J10.1038/ismej.2016.37.
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作者：小小测序君
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