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病理复习题答案
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请教：绒毛膜细胞直接制备染色体
请教：绒毛膜细胞直接制备染色体
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这个帖子发布于10年零159天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
您好：　　绒毛膜细胞不经培养能否直接制备染色体标本？
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绒毛染色体直接制备是可以的，但分裂相不多，且形态不太好。以下方法摘自《产前遗传病诊断》，陆国辉主编，广东科技出版社，2002年第1版。绒毛细胞实验室操作程序
绒毛细胞培养包括直接收获和长期培养。直接收获是收获细胞滋养层(cytotrophoblast)中的朗汉氏细胞(Langhan's cell)。朗汉氏细胞在第一孕期时自我分裂能力强，所以只需2—3小时的处理就可以得到中期细胞以用于染色体分析。绒毛细胞从经过酶处理后的绒毛组织中分离出来，绒毛核心(villous core)中的间充质细胞(messenchymal cell)可以在培养过程中分化，得到足量的中期细胞用于核型分析。由于经过对直接收获得到的细胞进行核型分析所得到的结果，对某些特殊情况的鉴别(如母体细胞污染和限制性胎盘镶嵌体)具有特别重要的参考价值，故在每一例绒毛细胞进行培养时都尽可能将其中的小部分进行直接收获处理。
1．直接收获
(1)将绒毛组织移至佩特里培养皿中，并在倒置显微镜下小心地将表面光滑的母源性脱膜(decidua)组织和血块清除干净，必要时可以用HBSS溶液洗涤绒毛组织。将绒毛分成两部分，一部分(2—3根绒毛组织)用于直接收获，其余部分则用于长期培养。
(2)将供直接收获的绒毛放在盛有3mL经过预温的RPMl l640培养液(含20％的小牛血清，1％庆大霉素)的佩特里培养皿里，然后放到培养箱(箱内供应5％二氧化碳，湿度为100％，温度为37℃)培养3小时。
(3)细胞生长同步化
往培养皿加入0.1mL浓度为10—5mol／L的FUdR溶液，FUdR溶液的最终浓度为3.3X10^-7mol／L，然后隔夜培养(约15小时)。第二天早晨往培养皿中加入0.1mL浓度为10^3mol／L的胸苷(thymidine)溶液，并使其最终浓度为3.3X10^-5mol／L。继续培养5小时后，加入秋水酰胺(最终浓度为10ug／mL)，然后再培养1小时。
1)用移液管将培养液从培养皿中吸出，再将经过预温的3mL浓度为1％的枸橼酸钠溶液加入培养皿，放回培养箱静置20分钟；
2)小心地将0.5mL固定液加入培养皿中，以终止低渗液的作用；
3)将固定／低渗混合液吸出，随后逐滴加入2mL新鲜配制的固定液，在加固定液的同时将培养皿轻轻来回水平摇动；
4)更换固定液一次，然后放在4℃冰箱中过夜。若急需结果，可以在更换固定液20分钟后滴片；
5)次日早晨将固定液吸出，稍等l—2分钟后，让固定液尽量蒸发；
6)视绒毛组织量的多少，加入100—200uL 60％的冰醋酸。在倒置显微镜下注意细胞从绒毛组织中分离的情况，同时轻轻摇动以利于细胞的分离。
(5)用移液管将分离出来的细胞连同冰醋酸吸出，然后均匀地滴在经70℃预热的玻片上。冰醋酸在室温下会自动挥发。将玻片放在60℃电热板上隔夜干燥，然后显带染色。
注意事项：
1)用FUdR溶液对细胞进行生长同步化处理可以收获到较多的中期细胞，其染色体形态也较理想，缺点是占用时间较长。如果不使用同步处理，可以将绒毛组织放在培养液中37℃下培养1小时，即可完成余下的低渗、固定以及冰醋酸处理等步骤，在当天收获；
2)在制片时可用移液管将绒毛在玻片上轻轻地来回拖动，这样可以分离出更多的细胞。
2．长期原位培养
长期培养的时间并不长，仅7—10天。绒毛组织由外层的滋养层细胞和内层的间充质核心组成，其中间充质核心含有丰富的间充质细胞和细胞间物质。滋养层细胞属上皮细胞，进行体外培养时其分裂能力差。间充质核心含多种不同的细胞，其中包括纤维细胞、内皮细胞以及巨噬细胞。纤维细胞在体外培养分化能力强，所以能从中得到足量的中期细胞用于核型分析。因此，在长期绒毛细胞培养之前，必须首先把绒毛组织外层的滋养层细胞分离出去，然后将间充质核心中的细胞间物质分解以使纤维细胞分离出来。这个过程靠胶原酶(collagenase)的作用来完成。
(1)培养液及其他材料
与羊水细胞培养所需材料基本相同，另外还要准备用于分离绒毛细胞时用的胰蛋白酶-EDTA溶液和胶原酶溶液。胰蛋白酶-EDTA溶液配制：将10mL胰蛋白酶-EDTA溶液与70mL无钙、镁离子的HBSS溶液混合。
(2)胶原酶溶液配制
将50mgIV型胶原酶用100mLHBSS溶解，混匀过滤后分成10管，在—20℃保存。一般可在2个月内有效使用。
(3)操作程序
1)清洗和净化绒毛组织，操作与直接收获法相同；
2)将绒毛组织加到盛有3mL0.25％胰蛋白酶的培养皿中(35mm X 10mm)，然后放到培养箱中培养2小时。如果标本送来太迟而来不及处理，可将绒毛组织放在的Amnio Max／胶原酶(1：1)混合液中在培养箱内隔夜存放；
3)将绒毛和培养液移至离心管内离心10分钟：
4)除去上清液，将细胞团摇匀；
5)加入7.5mL的IV型胶原酶溶液，再放回培养箱处理90分钟；
6)离心后将细胞团轻轻打松，与培养液混合后种植到1个T型培养瓶和6个佩特里培养皿巾的培养玻片上(与羊水细胞原位培养相同)；
7)48小时后加入培养液1.5mL，以后每隔48小时换一次培养液直到收获。收获操作程序与羊水细胞原位培养法相同。也同样可以使用T-Scan收获仪。绒毛取样
绒毛取样(chorion villus sampling，CVS)于1975年在我国鞍山钢铁公司铁东医院首次问世。虽然当时所用的仪器简陋，在没有超声仪指导的情况下绒毛取样的准确率仍达95％左右，而且出生婴儿随访未发现异常，由此引起的自然流产率也仅为9.3％。后来莫斯科产科研究所也尝试了类似的方法，并在超声仪的配合下使绒毛取样技术得到很大改进。直到1983年Ward和Brambati分别在英国和意大利发表文章介绍绒毛取样及绒毛细胞核型分析后，绒毛取样才在西方开展起来。经过20多年的发展，目前绒毛取样已被公认为是一种安全可靠的孕早期产前诊断方法。
绒毛取样包括经腹部(transabdominal)取样和经宫颈(transcervical)取样两种，均在超声波引导下进行(图6-2)。用经宫颈法取得的绒毛量比经腹部稍多，但两者都能取得足够的绒毛组织以完成核型分析。两种方法引起的流产率基本相同。至于使用哪一种方法，要视不同的实际情况和操作者的习惯而定。通常，对于后位胎盘和子宫后倾的病例用经宫颈法取样较容易，而对于前位胎盘和有阴道活动性疱疹的病例则用经腹部取样为好。[img][/img]
经宫颈绒毛取样法使用25cm长、1.5～2.0mm外径的多聚乙烯导管，经阴道和子宫颈管插入子宫腔内，在正处于发育中的胎盘绒毛叶(chorion frondosum)处将绒毛取出。由于导管柔软，在进管时操作宜轻巧温和。从超声仪屏幕可以清楚观察到导管插入的过程，控制导管的走向，使导管能插到令人满意的取样部位。在导管插到合适的取样部位后，将与导管接头相连的10～20mL的注射器回抽，将绒毛组织吸出。注射器必须事先加入5mL含抗凝剂的组织培养液。一次取样通常可以得到10—20g的绒毛组织。将绒毛组织放在佩特里培养皿，在低倍显微镜下确认已有足够量的绒毛组织之后再将导管拔出。取出的绒毛组织必须迅速送到产前诊断实验室，经清除母体组织和血块、净化胎儿绒毛之后，进行细胞培养及其他DNA分析。
经腹部绒毛取样法与羊膜腔穿刺方法相似，但所用的导管直径较大(通常为20号管)。应特别注意的是，在整个操作过程中必须通过超声波屏幕仔细观察导管顶端的走向，以确定最佳的抽样部位。
绒毛取样通常在孕早期10—12孕周进行。由于本法可用于孕早期诊断，所以很适合一些需要及早进行诊断的应急病例以及某些需要进行酶测定或DNA诊断的疾病。与羊膜腔穿刺方法相比较，绒毛取样的缺点是技术难度大，不能做羊水生化分析，而且染色体形态不太理想，还要注意避免所取的绒毛材料被母体组织和外源DNA污染或双胎妊娠中受另一胎儿组织污染而引起产前诊断的错误。绒毛的收集和处理
绒毛组织收集和处理的要求基本与羊水相同，但要根据绒毛组织的特点，进行如下特殊处理：
(1)现场即时处理
绒毛细胞培养包括两种方法，即具有自我分裂能力的滋养层细胞的直接收获(direct harvest)和常规的长期培养(long term culture)。直接收获不需要细胞培养，而是经过酶处理使单个细胞各自分离后就可以在当天收获。长期培养则需要7—10天的培养，得到足量的中期细胞才收获。在条件允许的情况下，应该要求诊断实验室技术员参与绒毛取样时的标本收集，现场显微镜下对绒毛进行检测，以确保绒毛标本的质量。通常，每例所要求的纯净绒毛量应该不少于10g。只有在确定已有足够量的绒毛组织后才结束绒毛取样手术。必须把绒毛标本迅速送到诊断实验室进行细胞培养前的处理。
(2)胎儿绒毛净化
母体细胞污染是绒毛取样过程中常见的的现象，约占全部绒毛细胞培养病例的1.9％。为避免或减少母体细胞的污染，必须进行胎儿绒毛净化，把来源于母体的、表面光滑的脱膜(decidua)从绒毛组织中分离出来并将之弃去。此外，在绒毛净化过程中还必须将血凝块和其他杂质清除掉。
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以下方法出自我同事进修时的笔记，方法较老，希望有用：一、绒毛染色体简易制备法1、取一级绒毛10mg剪碎；2、放入预温好的培养基（F10、1640）中，37℃培养1小时（培养基5ml，加入秋水仙素0.2ml，其终浓度0.4～0.8ug/ml）；3、离心，1500rpm 8min；4、去上清；5、加低渗液8ml，15min；6、加固定液1ml预固定，轻混匀；7、1000rpm 5min；8、去上清，加8ml固定液，固定大于30min；9、1000 rpm 5min；10、反固定20min，（反固定液，甲醇：冰醋酸＝1：3）；11、1000 rpm 5min；(反固定15min后离心，使总的反固定时间为20min)12、去上清，加适量固定液悬混细胞；13、滴冰片，75～80℃烤片1～3h；14、0.25％胰酶1ml＋100ml NS ＋4滴酚红＋1滴0.1M NaOH，消化15min；15、Giemsa染色15～20min。二、苏州一步法1、取绒毛10mg，不剪，置入外周血培养小瓶；2、2％柠檬酸钠低渗液2ml，37℃ 15～20min，在加低渗液的同时加秋水仙素0.1ml；3、预固定5min；4、去上清，加入固定液2ml，10min；5、去上清，加入固定液2ml，30min；6、去上清，加60％乙酸0.5～1ml，3min；7、滴冰片，过火焰；8、75～80℃烤片1h；9、显带同上。三、somoni法1、取绒毛10mg，不剪，NS漂清；2、培养液5ml＋秋水仙素（终浓度0.4～0.8ug/ml），37℃培养1小时；3、去上清；4、低渗15～20min；5、预固定0.5ml；6、去上清；7、固定8ml，10min；8、60％乙酸0.5～1ml，3～5min，不能吹打；9、滴冰片，75～80℃烤片1～3h。四、哈尔滨绒毛直接法1、5～10mg绒毛；2、5ml 1640培养液＋秋水仙素（终浓度0.5～1ug/ml），混匀；37℃培养15～20min，不吸去培养液，加入0.8％柠檬酸钠6～8ml，37℃低渗23min；3、加2ml固定液预固定6～8min；4、去上清，马上加入60％乙酸1ml，间或轻摇，2min后加2ml甲醇，混匀，然后继续加入已配好的固定液5ml，混匀；5、室温固定1h，挑出绒毛支；6、1500rpm 10min，去上清，加入8ml 新配固定液，混匀后至4℃冰箱过夜；7、第二天离心，重复固定1h；8、离心，滴片。
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下面是夏家辉的中国医学遗传学国家重点实验室的“细胞遗传学实验室技术操作规程”，不是直接法，但也可以参考。绒毛细胞培养和染色体分析㈠材料：⑴绒毛细胞培养基，包括培养基、秋水仙素．
⑵常规检测试剂和器材，⑶5-10毫升注射器㈡操作方法：⑴挑选孕6～8周孕妇，询问病史，进行妇科检查，以确定早孕，了解子宫大小，位置，弯曲情况及胚胎着床情况。⑵拭去宫颈粘液，严密消毒宫颈及宫颈管下段，一般可不用宫颈钳，如子宫过度前屈或后屈，则有助手用宫颈钳轻拉子宫向下固定。⑶用消毒塑料吸管按子宫的自然弯曲方向，沿着子宫壁轻轻进入子宫腔，直至有阻力感为止，一般进入子宫颈外口6-10CM（根据妊娠天数及宫颈长度而定）切记反复进退，以防剥离面大，然后用空针抽吸，同时退出塑料管，大多吸出少许血液，绒毛枝便夹在其中，将吸取物立即置于盛有无菌生理盐水反复冲洗数次以助其绒毛与血液及蜕膜分离，然后送实验室培养或置4度冰箱中保存。㈢培养及细胞学处理⑴培养在无菌条件下，用含过量的双抗的生理盐水反复冲洗绒毛组织2-3次以去除血液，然后吸去并吸净生理盐水，经低倍镜下鉴定为绒毛枝后，用眼科手术剪剪成1-2mm3小枝或小块，放入25cm2培养瓶中，分散于瓶的一边，于对侧加入含50%血清的培养基，PH为7.4，37度培养1～3小时待其贴壁后，即可翻瓶，使组织块泡在培养液中，每天观察，一般3-7天可见上皮样或成纤维样细胞生长。根据生长情况每隔5-7天换液一次。⑵一般培养6-20天，待细胞生长旺盛时，按下列程序处理。加入秋水仙素0.2-0.4ug/ml,让其过夜，约14小时左右，将培养液倒入离心管中，加入生理盐水2-3毫升，用弯头吸管将贴壁的细胞吹打下来，置离心管中以1200转/分离心10分钟，去除上清液，加0.075M氯化钾4ml吹打低渗，37C低渗15min；加3：1固定剂固定，离心，去上清液．加固定液，离心弃上清，如此反复固定3次，去固定液，轻轻混匀，滴片，一般滴3～5张，75-80℃烤片3小时，自然冷后，常规和显带处理及进行染色体分析。
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"加入秋水仙素0.2-0.4ug/ml,让其过夜，约14小时左右"？ 0.2-0.4ug/ml 的秋水仙素作用14小时，时间过长。过度的秋水仙素的作用将使中期染色体过分短小而无法辨认。一般情况下， 0 .02ug/ml 的秋水仙素作用8-10小时；0.04-0.08ug/ml作用4小时；0.2-0.4ug/ml作用1-2小时;1-3ug/ml作用15分钟（此浓度作用时间不宜长）。上述的秋水仙素浓度均为终浓度，可以根据需要选择相应的秋水仙素浓度和作用时间（以上的数据是本人在实际工作中积累的经验，供参考）。另外，当秋水仙素浓度过低，将会使分裂中期的细胞逃逸秋水仙素的作用，同样无法收获染色体。
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