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培养海马神经元原代培养为什么要用孕18d大鼠18d
培养海马神经元原代培养为什么要用孕18d大鼠18d
09-10-30 &匿名提问 发布
1　NTF对中枢神经系统（CNS）变性疾病的神经元特异性　　NTF突出的特性是有选择性地作用于外周和CNS的特定神经元，增强其存活、生长和分化，这种生物效应不仅限于神经细胞发生时期，而且对受损神经元的再生也很重要。这类因子的不足和缺少，便构成神经系统退行性病变的基础。临床常见的早老性痴呆（Alzheimersn disease, AD）、帕金森病（Parkinso disease, PD）等疾病的共同特点就是某种特异性神经元的退化，从而为NTF治疗神经退行性疾病提供了理论依据。目前，一些NTF已进入临床试验阶段，为神经变性疾病的治疗带来了希望。2　AD与NTF［3，4］　　AD是一种最常见的神经退行性疾病，主要的病理变化表现为神经元内出现神经原纤维缠结及老年斑，后者主要成分为淀粉样蛋白。前脑基底部胆碱能神经元出现皱缩、死亡，其原因有可能是因为缺乏了从海马和皮层来的营养输入，即NGF或某些NTF减少或消失所引起。动物实验证明，脑室内给予NGF或将富含NGF的小鼠颌下腺植入大鼠隔区-嗅斜束核，都可以明显减少隔区和纹状体胆碱能神经元的死亡。AD患者的记忆障碍是由于脑内某些区域的胆碱能神经元及其突触前发生病理改变所致。NTF除了增强神经元的存活和分化，它们也在突触可塑性方面起重要作用。 最近的研究表明，NGF 和BDNF可调节长时程电位（LTP），后者被认为是学习和记忆基础的细胞过程。因此，采用NTF及其相关的药物治疗AD是合理的，也是可行的。　　目前应用NGF治疗AD的临床试验虽然取得了令人鼓舞的结果，但是值得注意的是脑室内给予NGF可引起胆碱能神经元和其他神经元异常的轴突出芽，脑内给予NGF也可导致交感功能减退，如局部血流不理想的变化。这些问题都需要进一步研究。　　神经营养素其他成员如BDNF，NT-3，NT-4/5等均能维持胆碱能神经元的存活，且作用广泛。如小脑内注入BDNF使大鼠神经肽Y（NPY）和生长抑素（SS）水平增高，降低海马强啡肽水平；脊神经注入BDNF可增加局部5-HT水平。这些都为神经营养素治疗AD提供了证据。3　运动神经元疾病与NTF［5，6］　　运动神经原疾病是神经系统最常见的变性疾病。大量研究资料证实，NTF对运动神经元具有营养作用。目前，睫状神经营养因子(CNTF）、胰岛素样生长因子(IGF)及BDNF已进入ALS的Ⅰ期临床试验阶段。ALS疾病中发生的脊髓和上运动神经元变性后，中枢胶质细胞就成为CNTF的重要来源。最近还发现CNTF具有肌营养作用，而且不影响正常神经支配的肌肉。因此，采用CNTF治疗ALS，既可以对神经元，又可以对肌肉组织产生营养作用。 BDNF，NT-3和NT-4/5同样也具有营养作用。BDNF可由运动神经元特异性传递并可阻止神经元的自然死亡或轴突离断后的死亡。　　GDNF是目前发现的活性最强的运动神经元营养因子。它能促进体外培养的胚胎运动神经元存活，增强运动神经元中乙酰胆碱转移酶的活性；离断新生大鼠的面神经，在损伤局部对照组给予细胞色素C，而实验组给予GDNF，7 d后对照组面神经核中运动神经元只有6％存活，而实验组则几乎全部存活，并且体积明显大于对照组；成年大鼠面神经离断后，能引起面神经核内乙酰胆碱转移酶的免疫反应下降，在损伤局部给予或皮下注射GDNF，7 d后发现GDNF能以剂量依赖的方式缓解损伤引起的乙酰胆碱转移酶免疫反应的下降。这些结果提示GDNF对体内发育中或存活的运动神经元有很强的营养作用，显示了GDNF对运动神经元疾病如ALS的治疗前景。多种NTF作用存在互补及协同效应，故现在主张临床上联合使用NTF。4　PD与NTF［7，8］　　PD的发生是由于长期、慢性的中脑黑质多巴胺（DA）能神经元变性和丧失，在出现明显症状前，就已有大量的神经元（50%～90%）萎缩或完全变性，这也说明黑质具有超额储存或相当大的可塑性，或者其他基底神经节通路能够部分地补偿尾壳核的DA失神经状态。早期激活DA受体治疗PD，如用左旋多巴，虽然可短期改善患者的症状，但左旋多巴不仅有副作用，而且也不能阻止DA神经元的变性。由于NTF对于神经元发生、发育和对轴突离断后神经元的存活有明显效果，因此，不从病因方面考虑，NTF也可以作为延缓神经元变性及解除临床症状的有效治疗药物。　　发育和成熟期的黑质神经元具有TrkB 和TrkC 高密度受体，而且还发现黑质神经元具有特异的受体介导BDNF和NT-3的逆行轴突转运。目前，虽然尚无充分的依据表明PD是由于NTF水平降低所致，但黑质DA神经元不仅在发育期，而且在成熟期也合成或对BDNF有反应，说明BDNF对DA神经元的维持具有重要作用。近年发现的GDNF是特异性很强的DA能神经元营养因子。GDNF能促进体外培养的大鼠中脑DA能神经元存活、分化以及对DA高亲和力的摄取。成年大鼠单侧纹状体内注射6-羟基多巴（6-OH DA）造成PD动物模型后，在其黑质内注射GDNF，能促进损伤的黑质DA能神经元存活并改善大鼠症状。由于DA神经元上存在GDNF受体，因此，GDNF家族的其他生长因子也可能具有类似作用。一种新的GDNF家族成员neurturin已被克隆，其作用及毒性尚待明确。目前，GDNF对PD的治疗研究已进入Ⅲ期临床试验，极有可能成为首个通过FDA批准的NTF类药物。5　癫与NTF　　癫的主要发病机制尚不明了，癫组织与正常组织的主要区别仅在于癫发作及癫?持续状态所引起的功能上的改变。最近对癫发作时NTF的表达及其在脑靶组织区域的特征性改变进行的研究提示，NTF传递的变化对神经元结构和生化的改变起着一定作用，并与癫的病因有关，尤其发现癫发作可刺激脑区内NTF家族的受体浓度发生明显变化。鉴于上述NTF对培养的神经元生化和形态学的作用，可以推论NTF可以减缓和阻止癫发作引起的神经元的长期改变。癫发作时前脑神经元BDNF mRNA 的表达广泛增加，而且与NGF在产生时间和部 位上均有差异，证明其具有一定的特异性。而BDNF mRNA 高峰的出现与 刺激程度无明显相关，说明BDNF mRNA 的增加是一个全或无过程。癫发作时海马神经元中BDNF mRNA 表达增多，TrkB mRNA 也增加。Bengzon 等人发现大发作2 h后鼠BDNF mRNA 的水平 增加9倍，而TrkB mRNA增加2 倍。培养的海马神经元 ,在含有钙离子的介质中进行钙离子去极化或应 用渗透治疗可以增加NGF，BDNF mRNA 的表达，而在钙通道阻滞剂存在时，则明显抑制其表达 ，对去极化引起的NTF mRNA含量增 加的改变尤其重要。动物实验还证实BDNF和NGF 在37℃下相对稳定，可维持数周，它可以通过植入泵有效地进行灌注。但BDNF不同于NGF，脑室内注射并不能使其广泛分布于CNS，可能是由于室管 膜细胞富含BDNF的TrkB受体所致。6　NTF临床应用方法的研究［9～12］　　由于血脑屏障的影响，NTF的应用受到了一定限制，外周给药影响疗效，而中枢给药难以施行。目前，NTF的临床应用方法学研究主要集中在以下几个方面：（1） 脑内微泵灌注：大分子量的NTF不能通过血脑屏障，最直接的途径就是将纯化的NTF通过能控制速度和剂量的体外微泵直接注入脑室，临床上已采用NTF缓慢灌注治疗AD和PD；（2）微囊化缓释生物多聚体的脑内植入: 作为脑内缓慢灌注的替代物，可将NTF与具有缓释功能的多聚体或微粒结合植入脑内，使特定部位在一定时期内具有NTF的生物效应，在治疗PD时应用其来维持移植的嗜铬细胞的存活和神经元性转化；（3）蛋白载体介导通过血脑屏障：目前最可行的方法就是将NTF（或其他大分子）与载体结合，使其能够通过血脑屏障。据报道，若将NTF及其抗体与转铁蛋白结合，可采用静脉注射通过血脑屏障并保持完整的生物效应。由于CNS血管壁富含转铁蛋白受体，所以该技术可将静脉注射之NTF更多地聚集于脑内 ；（4）基因修饰产NTF细胞的脑内移植：这项技术是将正常情况下能合成和分泌NTF的细胞，如雪旺细胞、鼠颌下腺细胞或经过基因修饰的能合成和分泌大量NTF的细胞移植于脑内相应部位。 如David等人将 基因修饰的能分泌BDNF的成纤维细胞移植于纹状体来治疗PD；（5）基因脑内移植： 这是一项更直接的方法，最近几项研究表明直接将基因植入脑内转染不分裂的神经元或胶质细胞，可达到长期稳定的NTF水平；（6）NTF受体激动剂：随着对NTF 3级结构的不断了解以及对受体结合位点的认识，NTF受体的研究也日见广泛，目前期望能生产出小分子量的能通过血脑屏障的受体激动剂并产生类神经营养因子样作用来达到治疗作用；（7）对内源性NTF进行调控：据报道非蛋白类激素可调节NTF的表达，如糖皮质激素可防止外周神经中NGF的减少，并刺激海马BDNF，NT-3的表达。当我们对NTF的合成、储存和释放有了更深入的了解，就可以对内源性的NTF进行药物学调控。　　目前 NTF的研究主要着重于NTF的信号调控及其对神经元可塑性的影响，NTF与神经系统疾病的内在联系，治疗方案的可行性和安全性，基因治疗的载体选择和持久性，NTF的表达和纯化。新的NTF及其受体的发现，不仅对基础研究具有重要意义，而且也将导致新的治疗方法的诞生。
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研究某一生理现象和疾病可能需要特殊的细胞，如研究疼痛和外周感觉就需要研究感觉神经元，为深入研究这些细胞功能，最好能体外培养这种细胞，但是这些神经元过去一直无法体外培养，最近有两个美国科学家小组通过诱导成纤维细胞，解决了这一困难。两篇论文11月24日同期发表在《自然神经科学》，两个美国科学家小组分别采用不同的技术培养出小老鼠和人类的感觉神经元，这是历史上第一次成功体外培养出感觉神经元，给这一领域的研究奠定了重要技术基础，能提高人们寻找不同个体疼痛和痒敏感性差异的原因，促进疼痛和痒治疗药物的开发。两个小组都是使用的成纤维细胞作为原料，使用不同的技术诱导成为疼痛敏感神经元。外周感觉神经都表达特定的受体，这些受体能感受化学和物理刺激，并把这些信息传递到大脑。这些疼痛感受的受体也有不同类型，有的可以感受辣椒油，有的可以感受其他化学刺激。编码这些受体的基因突变可以导致某些患者出现慢性疼痛或疼觉不敏感。为在实验室培养出这种细胞，Baldwin和CliffordWoolf分别带领各自小组鉴定出一些蛋白组合，当这些蛋白在成纤维细胞内表达时，几天后这些细胞会分别转化为神经细胞。Baldwin团队培养的神经元能感受疼痛、痒和温度。Woolf团队只关注了疼痛感受特征。两个团队培养的细胞在形态上符合感觉神经元特征，而且都对辣椒素敏感。人类和小鼠可通过外周感觉神经感受疼痛、痒、温度、压力、牵拉和肢体位置等内外刺激。根据功能，这些神经元可以分成三类，疼痛敏感神经元、机械敏感神经元和位置敏感神经元，可根据这些神经元分别表达TrkA、TrkB 或 TrkC作为标记区分。研究发现，如果人类和小鼠成纤维细胞一过性表达Brn3a或同时表达Ngn1／Ngn2，这些细胞就可以获得这三种感觉神经元特征。这些被诱导的感觉神经元能够放电、形态特征和基因表达类型符合感觉神经元特征。另外这些神经元的钙离子变化特点分别符合痒敏感和疼痛敏感神经元特征。这一研究提供了快速方便制作感觉神经元的方法。该研究来自加州cripps研究所。&另外一项研究发表在24日《自然神经科学》的研究来自哈佛大学儿童医院。该研究确定了3种能够使人类和小鼠成纤维细胞重新编程为疼痛敏感神经元的转录因子，这些经过诱导的细胞能特异表达疼痛敏感功能受体和离子通道，这些细胞表现出对炎症介质前列腺素E2和化学药物奥沙利铂的TrpV1敏感化，说明这些细胞能表现出炎症和化学药物导致的疼痛敏感特征。使用来自遗传性三型感官和自主神经病变患者的成纤维细胞，研究人员证明这种技术能识别出过去不知道的一些人类疾病类型。
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成年SD大鼠脊髓背角神经元原代培养中，如何有效分离得到形态活力好的神经元
虫友们，大家好。最近在做关于成年SD大鼠脊髓背角神经元原代培养。在实验的过程中遇到了些问题，想请教虫友们，请高手不吝赐教，多谢了！
& & 先简单说一下我的protocol，材料：2 weeks SD大鼠；取材：戊巴比妥钠麻醉，小心解开脊髓腔，取出脊髓彭大部分，放至到冰冻的过滤除菌的ACSF中，剥离软脊膜，将脊髓移入4%FBS+DPBS中，剪刀剪碎。消化过程：先用DPBS洗两遍，用37℃ 0.125%Trypsin/EDTA消化2分钟，10%FBS终止消化。用1ml移液枪轻柔吹打脊髓，吹打过冲中添加0.1mg/ml DNase I。待溶液稍浑浊，静止，接种于24孔板，放至于37℃ CO2 incubator。
& & 虫友们看一下我的protocol有没有严重理论错误？我的问题是，接种2天后换液，第三天能看到少量活的神经元和胶质细胞，但胞体较脏，胞体不知附着什么类似于组织碎片的东西，达不到试验要求。并且24孔板底部有大量组织碎片贴在孔底部，导致背景较脏。第五天后神经元就死亡了，坚持不了几天。
& & 如何能使组织碎片较少，如何使细胞胞体干净通透？是从消化过程改进还是吹打方法上改进？请大家积极回帖，高手们不吝赐教。如果有较好的方法学文献更好了，我的金币不多，就100个金币，还请大家详细说说如何改进，谢谢！
:hand:………………………… 我去，没人回复呀。。。 :tiger05::tiger05::tiger05:祝福顶贴赚金币:tiger28::tiger28::tiger28:
楼主不会对我这样敬业的选手只给一两个金币的！ : Originally posted by 小苦孩纸 at
神作！ 简单回复没法给金币 好巧！我也做这个！有相同疑问！忘以后多多交流！:D 成年的做起来活性都不高的，只有乳鼠高 : Originally posted by windbells636 at
成年的做起来活性都不高的，只有乳鼠高 嗯，是的 这个没做过，我们做乳鼠心肌细胞的培养，消化那一步是最重要的。你认为组织碎片较多，可以试试过筛吧，这个我没做过，具体步骤不太懂，我是从我的培养心肌细胞方面说的，呵呵
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脑缺血灶周围组织提取液对培养神经元的神经营养作用
摘　要：本文用线栓法制备鼠右侧大脑中动脉闭塞模型。分离新生鼠前脑皮质、基底节神经元进行原代培养，以维持神经元存活的总数和长出神经突出超过１００μｍ的神经元数目分别来反映脑缺血灶周围组织提取液（ＩＢＴＥ）中神经营养因子（ＮＴＦｓ）和促进神经元突起生长的神经营养因子（ＮＰＦｓ）的存在及其活性。结果显示：缺血对侧ＢＴＥ和ＩＢＴＥ维持神经元存活的总数和长出神经突超过１００μｍ的神经元数目均较空白对照组明显增加（Ｐ
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作者：佚名
来源：生物通
Anna M. Krichevsky* and Kenneth S. KosikCenter for Neurologic Diseases, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA 02115Edited by Solomon H. Snyder, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD,&and approved July 8, 2002 (received for review May 7, 2002)
在众多有机体中，双链RNA能触发转录后基因沉默或RNA干扰（RNA interference，RNAi）。这种生理途径的媒介，小的干扰RNA：21nt的双链RNA，已经成为敲除特定基因在哺乳动物细胞系中表达的强大工具，对分析功能显性缺陷型也非常有用。在基因操作非常困难的哺乳动物原代神经元培养物，RNAi很可能发展成为研究特定基因在神经元发育及功能中的高效工具。而此前，神经元曾被认为最能抵抗RNAi。我们在这儿报道RNAi在有丝分裂期后的原代神经元培养物中的应用：合成的能导入神经元并有效地抑制内源及转基因的表达。&&& 双链RNA（dsRNA）通过RNAi或序列特异性转录后基因剪切途径（1-3）有效地抑制线虫（Caenorhabditis elegans）, 果蝇（Drosophila melanogaster）, 锥体虫（Trypanosoma bruce）及植物中特定基因表达。DsRNA被ribonuclease III剪切为21-22nt的RNA双链或小的干扰RNA（siRNA）。这些分子触发同源mRNA的降解（4,5）。尽管dsRNA导致哺乳动物细胞中整体性的蛋白合成关闭，如果直接导入小于30nt的siRNA就能抑制哺乳动物细胞系中特定的内源和异源基因的表达（6，7）。从这些研究中得出的结论是RNA干扰能够在哺乳动物细胞中发生，但siRNA触发的RNAi机制还有待阐明。现存的一些抑制哺乳细胞特定基因表达的方法（mainly antisense and dominantCnegative）的效果和重复性都不理想。而RNAi，由于能在极低浓度，微量（nmol范围）siRNA存在情况下显示出特殊有效性，在研究哺乳动物物的基因功能方面有极大的应用前景。许多基因已被成功地从哺乳动物体细胞和胚胎细胞系中敲除，包括常用的HeLa, HEK293, 和 P19细胞（8，9）。但由于一些尚不清楚的原因，神经元比其它细胞类型显示出对RNAi更强的抵抗力，可能这些细胞中RNA进入细胞膜或RNAi途径方面不太一样。在线虫（C. elegans）中，尽管通过喂食或注射dsRNA到整个动物体诱导RNAi的方法已经比较系统，甚至能抑制子代的基因表达，虫体的神经元却表现出RNAi抗性（10）。但，高浓度的dsRNA（15ug/ml）能够抑制增殖和分化的线虫神经元培养物靶基因的表达（11）。在D. melanogaster中，cDNA杂交链（推测它能用于合成dsRNA）能作用于神经元中的靶基因表达（12）。本文中，我们将阐述导入极低浓度的siRNA到从大鼠海马和前脑中制备的解离的有丝分裂后培养物中，能有效抑制其内源和异源基因表达。
材料和方法皮层和海马（Hippocampal）物。&&& 怀有18天胚胎（E18）的SpragueCDawley大鼠通过注射CO2杀死，剖腹，迅速取出胚胎。取出大脑皮层和海马，37°C下，在含0.25%胰岛素的HBSS（Hepes-buffered Hanks’ balanced salt solution）溶液中消化15分钟。用HBSS洗组织三次，在火边，用巴斯德吸管（Pasteur pipette）手工解离。在含DMEM及5%（vol/vol）的FBS种植培养基中，将细胞以/cm2的浓度种植在多聚赖氨酸包被的盖玻片上。3h后，将培养基换为Neurobasal，含B27添加剂和0.5mM谷氨酸盐。所有实验在细胞种植后5-8天开始。在这些培养物中几乎观察不到神经胶质细胞。siRNA制备和转染。&&& pEGFP或dsRed2报告基因和MAP2或YB-1 mRNA相应的siRNA根据文献（13）推荐，每条链的5’端为磷酸盐，3’羟基化，有两个碱基外悬，通过化学合成而得。下列为实验成功的基因特异性序列：si－GFP正链：5’- CAAGCUGACCCUGAAGUUCUU-3’反链：5’ -GAACUUCAGGGUCAGCUUGUG-3’；si－DsRed正链：5’ -AGUUCCAGUACGGCUCCAAUU-3’反链：5’ -UUGGAGCCGUACUGGAACUUG-3’MAP2 siRNA1正链：5’ -CGAGAGGAAAGACGAAGGAUU-3’反链：5’ -UCCUUCGUCUUUCCUCUCGUG-3’siRNA2正链：5’ -CAGGGCACCUAUUCAGAUAUU-3’反链：5’ -UAUCUGAAUAGGUGCCCUGUG-3’形成双链siRNA的退火处理参见参考文献（6）描述。
&&& 报告质粒和siRNA的共转染用转染Lipofectamine 2000 (Life Technologies)转染试剂在6孔板中进行。先用Opti-MEM稀释Lipofectamine，加到质粒/dsRNA中形成混合物，这个过程需25分钟。每孔加1ug pEGFP-C2，1 ug pDsRed2, 及 0.01C0.2 ug 21-bp dsRNA (siRNA)，与2ul Lipofectamine形成终体积为1.7ml的混合液。转染2小时后换上Neurobasal，细胞固定后培养后24-48小时分析结果。转染效率通过1% 到8%的4’，6-diamidino-2- phenylindole染色检测。&&& 内源靶基因的siRNA的转染用TransMessenger转染试剂(Qiagen, Chatsworth, CA)。根据厂家说明书，siRNA（每孔1ug）通过Enhanser R试剂浓缩并与4ul TransMessenger形成复合物。转染复合物稀释到900ulNeurobasal中，与细胞混合；2小时后它被Neurobasal替代。转染48-68小时后染细胞分析。分析结果通过三个独立的实验证实。免疫细胞化学。&&& 对MAP2和几种蛋白进行双标记免疫荧光标记。生长在玻璃盖玻片上的神经元用PBS洗，4%（w/vol）多聚甲醛固定，0.25% Triton X-100穿透，再用PBS洗两次以上，用10%（vol/vol）山羊血清封闭。细胞用一抗 （1:200稀释到含1%山羊血清的PBS中）4°C敷育过夜，PBS洗三次。MAP2的小鼠单抗由实验室自制（14），YB1的兔多抗由V. Evdokimova (McGill Univ., Montreal, QC, Canada)馈赠；cortactin的兔多抗由Santa Cruz Biotechnology公司提供。MAP2通过Alexa 488或 Alexa 594荧光偶连的山羊抗小鼠的二抗（Molecular Probes公司）检测。其他抗体通过488- 或Alexa 594-偶连的山羊抗兔的二抗(1:100; Molecular Probes)检测。最后，细胞用PBS洗，用抗萃灭的封片剂在显微镜下封片。
显微镜和成像分析。&&& 荧光显微镜结合配套的共聚焦激光扫描系统（Zeiss Axiovert S100）检测结果。在相等曝光时间下记录所有特定报告质粒或特定抗体成像结果（非饱和条件）。每个共转染实验，至少随机选择分析了50个的转染神经元。针对MAP2靶蛋白的实验，每种实验条件至少分析了70个随机选择的神经元，对对照和靶细胞的基因表达都进行了定量。通过AdobePHOTOSHOP对像素密度定量，并进行扣除背景标准化处理。
&结果&&&&& 首先，为验证培养神经元RNAi的有效性，针对EGFP－C2和DsRed2报告的21nt正义和反义ssRNA选自编码区，具体设计和描述见材料和方法。每条链分别合成，退火形成具有siRNA特点的dsRNA（13）。原代神经元种植后5-8天转入这两种质粒及相应dsRNA。转染后两小时，培养基换为Neurobasal；固定细胞，24-48小时后观测EGFP和DsRed2的表达。荧光显微镜观察，几乎所有转染的神经元中EGFP或DsRed2表达明显被相应dsRNA特异性抑制，而不被无关dsRNA抑制。共转染这两种质粒24小时后大多数转染的神经元（效率1-8%）高水平表达GFP，DsRed水平略低一些，混在一起呈现出黄绿色。针对绿色荧光蛋白的siRNA（siGFP）明显降低了增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的表达，而对dsRed表达无影响，因此细胞呈现红色。为了量化siRNA对GFP表达的影响，对特定的报告质粒在非饱和条件下记录曝光时间相等的影像，并随机选择了转染细胞作进一步的绿色和红色荧光检测。对每个细胞，绿色和红色荧光都进行了扣除背景的标准化处理。每次实验，至少比较了50个随机选择的转染对照和靶神经元。这些分析表明GFP表达被相应dsRNA特异性抑制，在红色荧光强度不变情况下，检测到的绿色荧光强度下降了42%。对每个分析的细胞，红色和绿色荧光的比例计算为arctangent值；结果分布如图B。分布的迁移代表siGFP对GFP表达的特异性抑制。此外，对照和靶细胞几乎没有重叠分布清楚地表明siGFP即便浓度最低（6ng/ml）也能影响几乎所有转染神经元。这是dsRNA的特异性抑制，无论正链和反义链ssRNA都不能抑制报告基因的表达图C.
&&& 同样的对DsRed2与相应dsRNA的分析表明对照与靶细胞有一些重叠，抑制了约30%的DsRed2的表达。这由于后期表达的DsRed2的影响以及它在不同对照细胞中表达水平存在较大的差异所致。&&& 我们还检测了siRNA对微管结合蛋白2（MAP2）和RNA结合蛋白YB-1（也称为p50）内源性mRNA的作用。在这些实验中，我们注意到siRNA相对于报告能很容易地导入神经元。因此无需导入报告基因作为细胞转入siRNA的标记。针对MAP2内源性mRNA的相应21nt dsRNA通过TransMessenger转染试剂转染细胞。转染后48-68小时，双免疫荧光标记MAP2和三个无关蛋白（cortactin，肌动蛋白，YB-1）。在70-80%的细胞中MAP2表达被相应的dsRNA特异性抑制，而无关蛋白的表达不受影响。在这些细胞中，MAP2荧光强度降低了4倍。在总的细胞中，由于转染效率及神经元对siRNA的敏感度不同荧光强度变化很大。不过，就从总细胞的统计荧光强度来说，MAP2荧光的降低还是很容易检测到。非常明显的是，统计分析说明两种针对MAP2的不同siRNA（siRNA1和siRNA2）对MAP2有同等的抑制作用。&&& MAP2抑制在培养神经元中的表型影响可通过神经元种植后纤维加固，出现许多丝状伪足等早期观察而得。已经有文献（15,16）表明MAP2是神经炎从早期进一步发展所必须的。我们用相应siRNA处理种植3小时后的原代神经元，在28-40小时左右分析结果。在这个短一些的时间段中，神经元MAP2表达抑制极少。但，MAP2抑制水平与观察到的丝状伪足缺乏程度一致。转染针对YB-1 RNA结合蛋白的不同dsRNA，即使敷育68小时条件下也不能抑制靶蛋白。这种情况下RNAi无效的原因可能由于YB-1蛋白丰度很高，又非常稳定或YB-1mRNA的特殊性质。
&讨论&&&&&& 小的干扰RNA已经作为敲除特定基因表达的强大工具在很多细胞中运用。在果蝇裂解液中，dsRNA触发识别和靶向性剪切同源细胞mRNA（4）。在哺乳动物细胞中，siRNA介导的基因导向机制还不明确；可能影响RNA或翻译或转录稳定性。在培养的哺乳动物细胞中，化学合成的siRNA能通过亲脂性转染试剂导入细胞。最近，许多研究组发展了另一个通过转染质粒DNA胞内表达siRNA抑制基因表达的方法（17-20）。众所周知，转染有丝分裂后期的原代神经元效率非常低，通常有毒性，因此还没有报道过如本文所述的对神经元有效的siRNA介导的基因靶向性技术。原则上，RNA能通过阳离子脂类导入单个的神经元（21）。我们已经阐明合成的21nt dsRNA（siRNA）很容易通过阳离子的TransMessenger转染试剂导入到原代皮层和海马神经元中。因此，RNAi途径看来在原代哺乳动物神经元中是可行的。即使在简单敷育（2小时）在低浓度siRNA（0.006-0.6ug/ml）下也能导致内源和外源基因表达的抑制。同样浓度的反义ssRNA不能抑制基因表达。更高浓度的siRNA/转染试剂看来对神经元培养物有毒性。siRNA对MAP2表达的作用较慢，在转染后两天逐渐可观测到。我们推测更好的抑制转入的GFP和DsRed基因需要更长的细胞敷育时间；但我们用Lipofectamine 2000转染超过48小时后，神经元不能保持正常状态。除此之外唯一的RNAi有效的神经元培养系统，线虫类， RNAi作用也非常慢（dsRNA处理后3-4天不等），并需要量大得多的dsRNA（15ug/ml，而不是0.006-0.6ug/ml）。
&&& 目前，我们不知道是什么因素决定RNAi诱导的转录后基因抑制作用的速率和强度。比较清楚的是，靶mRNA（导致一些RNAi失效的“防卫性”二级结构和结合的转录因子）和蛋白（不同的生命周期）的特性影响RNAi效果。此外，细胞特异性因子可能参与不同细胞类型中不同siRNA运输和RNA干扰的调节。近来发现了一种以前没有明确分类的非编码RNA，主要分布在脑中的特异性微小RNA（microRNA）与siRNA共享一个生理途径（22），结合我们的数据显示RNAi相关机制在神经元发育和功能中对基因调控方面的作用。在基因操作非常困难的神经元中，敲除特定基因表达的技术方法将有广泛的应用。
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