hepes和pbs都是用于细胞培养的缓冲液，它们各有什么特点？各用于什么细胞？谢谢！_百度知道
hepes和pbs都是用于细胞培养的缓冲液，它们各有什么特点？各用于什么细胞？谢谢！
谢谢我是新手，刚刚开始接触细胞培养，请大家多多指教
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如果你做细胞换液、冻存等等特点那些理论的，用hepes把培养液的PH调至你需要的数值.4的PBS，都要移除旧的培养液后，不管是什么细胞、传代，用PBS清洗培养皿而hepes我们一般用在配置培养液的时候，你看下《分子克隆》吧我就跟你说下具体的吧我们一般配PH 7
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没有营养成分。而hepes含有葡萄糖PBS是磷酸缓冲盐。我是这么理解的，一定程度上能给营养
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出门在外也不愁细胞培养液出现很多很小的颗粒，PBS能够冲掉这些颗粒，细胞状态却是正常，这是怎么回事(细胞培养液,子细胞,培养瓶,传代)
23:15:31&&&来源：&&&评论：&&
[细胞培养液出现很多很小的颗粒，PBS能够冲掉这些颗粒，细胞状态却是正常，这是怎么回事(细胞培养液,子细胞,培养瓶,传代)] 如题，前一阵子细胞一直养的很正常，最近几天发现，传完代的细胞再次长满的时候，细胞培养液里有很多非常小的颗粒，晃动细胞培养瓶，颗粒也跟着晃动起来，用PBS洗涤后，背景就会变得非常干净，细胞状态也没什么变化，细胞长的也很快，再次传代还是如此。不知道这种变化时污染吗？后来把其他的瓶子全扔了，只留下一瓶。同时又复苏一瓶，复苏的那瓶没有发现这样的现象，不过复苏的这瓶暂时还没有长满，汇合度大概50%，培养液依 关键词:[细胞培养液 子细胞 培养瓶 传代 培养液]…
如题，前一阵子细胞一直养的很正常，最近几天发现，传完代的细胞再次长满的时候，液里有很多非常小的颗粒，晃动瓶，颗粒也跟着晃动起来，用PBS洗涤后，背景就会变得非常干净，细胞状态也没什么变化，细胞长的也很快，再次传代还是如此。不知道这种变化时污染吗？后来把其他的瓶子全扔了，只留下一瓶。同时又复苏一瓶，复苏的那瓶没有发现这样的现象，不过复苏的这瓶暂时还没有长满，汇合度大概50%，培养液依然清亮。大家帮忙解释一下这是怎么回事？
回复我养的细胞今天也发现有一些小的颗粒，不知道是什么？我看不是污染，细胞长的也很快啊！状态也行。请多指点！！！回复我的细胞长得蛮快的，一般一天一次传代，上次，我推迟了一天，细胞培养液变黄了，颗粒突然发现很多，不知道是否是细胞的代谢物，还是血清的一些灭活时候析出的蛋白。今天那瓶再次传代，换了血清，明早去看看，细胞会不会还有这样的变化。回复细胞生长良好，培养液清凉，基本可以排除细菌污染。但是细胞传代次数多了容易老化，也容易出现漂浮颗粒，建议再次冻存。再使用新复苏的细胞做实验。回复有可能是真菌，真菌污染初期有时不会浑浊的回复应该是死细胞吧，有些细胞长得快，会“挤死”一些细胞，每次换液、传代前用PBS多洗几遍就干净了。回复谢谢各位，今天早上去看昨天传完代的细胞，24小时，又是出现小颗粒，培养液依然清亮，而前天新复苏的细胞无此现象，用的都是相同的培养基和PBS，新复苏的细胞今天传代了。那个以前长小颗粒的细胞给扔了，尽管觉得状态和长的速度和以前没什么不同。回复黑胶虫。洗也洗不掉的，总会复发的。建议用环丙沙星杀一下。回复黑胶虫，同意楼上的，污染了！回复
我的细胞也是这种情况，非常细小的颗粒，PBS洗完就干净，但还是会长。不明白怎么会污染的，***作还是蛮注意的。这种“黑胶虫”感染了，影响细胞状态么，还能用于做下一步实验么？回复1.前几次细胞传代浓度9高了，引起过渡生长和老化，发生死细胞啦。没有做吧？凭感觉传的？2，个别重复使用的玻璃瓶是由于，瓶口残液，烧瓶口时碳化，然后落入瓶内造成的。加高1点双抗（5纳克卡那霉素），12小时换1次液（保持抗菌素浓度）压1压看回复正常不？回复是否是黑胶虫,在高倍下看看可以排除,黑胶虫会做螺旋状运动.有可能是细胞过度生长的原因,这个因细胞而异.回复我觉得可能污染了，因为我培养的也发生这种情况，是那种培养液变成黄色，中间混有细沙样物质么？回复我觉得可能污染了，因为我培养的也发生这种情况，是那种培养液变成黄色，中间混有细沙样物质么？的确，里面混有细沙样的物质，培养液变成黄色。回复唉，新复苏的细胞长满的时候并没有发现那个细小的颗粒，但是传完代之后快长满的时候又发现了那些颗粒，培养基，PBS，都是新的。唉，奇怪，高倍镜发现那个小颗粒并没有做布朗运动，只是会随着细胞的增长而变多，细胞状态正常，生长速度正常。
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【求助】怎样分离活细胞？
【求助】怎样分离活细胞？
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这个帖子发布于10年零73天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
养的细胞每次换液的时候都发现有好多死细胞和残渣，并且离心的时候有好多都去不掉。在镜下看起来特别不舒服，请问有没有哪位知道，有什么办法可以把活细胞和死细胞分开，哪怕损失部分活细胞。修改原因见置顶版规帖
drake015 edited on
回复：怎样分离活细胞？
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你若是贴壁细胞在消化之前可以多洗涤几次以除去死细胞。
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如果细胞状态不好，每次都有新死的，怎么也没有用。否则，换两次液就很干净了。关键是养细胞时，需要保持固定的超作步骤，别乱动细胞。
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我养的是pc12细胞，我发现多洗几次也不行。细胞长的总的来说还是可以，就是有一些死细胞，看起来特别不舒服。我想把细胞转到９６ 孔板中用ngf诱导，想把死的细胞去掉，怕影响下一步实验。不知通过设置离心的转数能不能达到目的，我试了几种不是很理想。不知谁有相关方面的经验。
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一般情况下细胞养的好是不会出现太多死细胞的啦。不过要去掉的话，可以试以下方法，我以前都是这样干的：1. 悬浮细胞：培养瓶拿出培养箱之前竖放1小时左右，尽量吸取中层偏下的细胞液分瓶，看看是不是死细胞少一点？2. 贴壁细胞：死细胞都漂起来了，换液之后应该也没了吧离心：一般是800rpm，要离死细胞可试试设成600rpm甚至更低，这样细胞就可以少而精啦
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低于1000rpm,离心,可减少
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puresea 战友：你好！我认为可以采用下面两种方法除去死细胞：一. 用胎牛血清离心去除死细胞
方法为 ： 1.将 3ml 牛血清放入离心管中，在液面上缓慢加入 3ml 细胞悬液，细胞密度 1-2 × 10 7 细胞 / ml ， 3000 × g ，离心 10 分钟； 2.去除全部上清液，用培养基悬起细胞。 此方法特别适合于荧光染色后去除死细胞。 二. 用Ficoll/Hypaque方法去除死细胞
方法为： 1.配制ρ =1.09 或ρ =1.088 Ficoll/Hypaque 液； 2.试管中加入 Ficoll/Hypaque 液 3ml ，沿管壁缓慢加入细胞悬液 5ml (5-10 × 106 细胞 / ml) ； 3.2000 × g ， 20 度，离心 20 分钟； 4.收集界面上全部细胞，以 PBS 离心洗细胞， 350 × g ， 10 分钟一次，再 250 × g 二次。 这种方法的特点是： 1.此方法可一次去除红细胞及死细胞； 2.为使分离纯净，保持离心时的温度 20 度，并用快速 (20 秒内达到 2000 × g 速度 ) ； 由于小鼠细胞密度在 1.040-1.090 之间，此方法可收集全部活力的白细胞。
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[求助]新手培养Balb/c 3T3细胞的一些疑问
查看完整版本请点击这里：
去年9月21日从协和细胞中心拿回了Balb/C 3T3细胞。
拿回来的细胞培养瓶装满了培养液，我用吸管吸出来了，准备后面用。
9月22日1：4传代。一半用自己的培养液养，一半用协和剩余的培养液养。
养了几代后，协和培养液接种的细胞2天就能长满一瓶，而我自己的培养液要4-5天才长满，而且细胞的状态也不太好。想了以下几个原因：
1、换我自己的培养液与协和培养液的配方虽然是一致的，细微的差别可能导致细胞有一段适应期。但是从细胞状态和传代周期长短看来，差别也太大了。不知道问题出在哪？
培养Balb/c 3T3的培养液配方很确定：高糖DMEM，10%FBS，双抗，4mM L-谷氨酰胺。
DMEM: 我用的Hyclone的高糖DMEM，对比了协和细胞中心使用的DMEM的详细配方，只有细微的差别。
FBS: 血清是GIBCO的，没有灭活。
双抗：solarbio的。
谷氨酰胺：sigma的，三蒸水配了过滤。
2、由于是新手，在消化方面一直都做得不好，消化的方法也和细胞中心给的资料不太一样。
协和细胞中心的资料上写的：用胰蛋白酶润洗一次后，用1ml的胰蛋白酶消化。
但我怕这样消化太快了，就听从同事的建议：用PBS洗，然后用的1.5ml的PBS和0.5ml的胰蛋白酶混合液消化5min左右（培养瓶是25cm2的一次性培养瓶），倒掉约1.5ml，剩余0.5ml继续消化几分钟，然后加培养液终止消化，吹打。
我在显微镜下一看到细胞开始收缩就很紧张，怕消化过头，就急着中止消化吹打。有一次由于太多没有吹打下来，还消化了第二次，离心收集的细胞。估计这样对细胞的损伤很大吧，使传代后的细胞长得很慢？
3、培养到4代以后，原来协和细胞中心的培养液用完了，完全用自己的培养液，细胞越长越慢。有的接种细胞太少的培养瓶，有小黑点，细胞之间间隔大，但没有浑浊。
我上丁香园查了一下，自己判断小黑点可能是细胞碎片，说明细胞状态不好，很可能是消化不好或接种细胞太少导致的。也有同事担心我的培养液污染了（细菌或支原体？不太清楚），让我重新买DMEM，灭活血清，新配培养液后再养。
放假前已经把细胞分几批冻存了，复苏过一只，用自己的培养液养，也能养活，但由于过国庆节和担心后期可能已经污染，还没来得及将复苏的传代就收了。准备找一找养的不好的原因，新买DMEM，重新复苏冻存的细胞。
以上是基本情况，请教各位，1、我的培养液有什么问题，为什么细胞状态差别这么大？
2、细胞消化成什么状态，中止消化和吹打最合适？
谢谢！查看完整版本请点击这里：
gemei0115 ( 15:49:46)
今天上午复苏了1瓶细胞。
gemei0115 ( 15:50:03)
上午去看细胞，准备换液。
结果不妙。
拿出来的培养瓶中的培养液呈橙黄色了，在镜下一看，有很少量的细胞贴壁生长，大量的细胞贴壁但是是圆的，细胞之间有很多小黑点。
肉眼拿到光下看，能看到一层细沙一样的东西，仔细看，能发现培养液已经浑浊了。
问了别人，都告诉我是污染了，很可能是细菌污染。
可能是冻存的问题，可能是复苏的时候污染了。
只能再复苏那一批中的一只。
gemei0115 ( 15:50:31)
总结了一下，上次复苏的污染可能三个方面的原因：
1、冻存时就有问题
2、复苏时污染了
3、培养条件污染
首先做了验菌试验，单纯加培养液到培养瓶中，放入二氧化碳培养箱培养。三天后，未见之前的细沙状浑浊。第三条排除。
然后重新复苏。复苏时，仔细用酒精棉球擦冻存管帽，谨慎操作。
今天上午复苏了，看明天的结果如何。
gemei0115 ( 15:51:03)
今天早上去看昨天复苏的细胞。
肉眼看培养液还是原来的颜色，有一点少量的细沙状物质。
镜下看，细胞贴壁比前一次多多了，状态还行，触角伸展了，死细胞没有前一次那么多。但是细胞与细胞之间的空隙间还是有显而易见的小黑点，可能还有一些小空泡。
做了如下处理：
1、为了防止以前因为倾倒而可能溅起的液体污染培养瓶口，这次采用了用吸管把培养液洗出来，然后扔掉吸管。
2、本来不想洗细胞的，但是为了减少些细沙状物质，还是用另一只吸管吸了一些PBS，小心的吹了两三下，然后吸走PBS。
3、加入5-6ml的培养液。
4、处理后的观察：镜下观察，洗去了大部分死细胞，小黑点仍然存在（看起来也贴壁的？不是流动的），然后放入了培养箱。
分析：这次没有像上次那样产生大量的细沙和死细胞，以及培养液没有立即变黄。可能和以下原因有关：
1、这次复苏加入的培养液比上次复苏多加了2-3ml，所以相应的双抗也多了些，对细菌有了更高的抑制作用。
2、培养液多点，稀释了冻存时的DMSO，减少了DMSO对细胞的毒性。
3、这次的操作比上次更加谨慎，可能也是减少污染来源的原因之一。
4、但仍然有细沙状物质，所以细胞还是脆弱，要继续小心。
希望明天状态好一些。
羊咩咩 ( 15:52:44)
我最近也在养3T3，传10代后，细胞体积出现明显萎缩，核质比变大，胞质不通透···网上看资料说3T3传代8-10代后细胞质量会下降，不知道是这个原因还是出现病原污染，期间培养液一直未出现明显黑点，只是有2次传代第二天培养基迅速变黄。中途换过培养基和血清批号，现在又换回来，细胞情况还是不乐观。希望和楼主交流交流。
羊咩咩 ( 15:53:07)
还请问楼主一个问题，你们自己配置培养基如何保重全过程无菌的？试剂、称重装置全部都放在hood里操作还是全部在普通环境下配完后放autoclave灭菌？
gemei0115 ( 15:53:52)
还请问楼主一个问题，你们自己配置培养基如何保重全过程无菌的？试剂、称重装置全部都放在hood里操作还是全部在普通环境下配完后放autoclave灭菌？
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回答：我的培养基不是自己配制的，开始是买的hyclone的高糖DMEM，细胞长得慢。现在我是直接去协和买的他们配制的培养基，以前用他们的养，状态很好。因为我是新手，很多能买的或者能用一次性的就不自己配制了。
但是个人觉得试剂称重在普通环境下配完，0.1um过滤吧。因为我看我买的DMEM上写的是0.1um无菌过滤。
欢迎交流。
gemei0115 ( 15:54:24)
周一复苏的细胞。
周二看了，有些死细胞和少量小黑点，用PBS稍微洗了下，换液。
周三去看了下细胞状态，和周二差不太多，培养液和原来颜色一样，没有换液。
今天早上刚去看了，细胞状态比昨天好多了，细胞之间的空隙小了些，小黑点看起来没有那么明显了。
准备看明天的状态。
顺便说一下上次复苏污染的事情。
我一个同事说，是细菌污染，另一个同事说，细菌污染是培养液变成米汤状。
我的培养液还有透明度，那些细沙状，可能是支原体污染。如果不严重，双抗可以有些抑制作用，还可以养起来，如果严重的话，影响了试验结果，就只能新换一只了。所以，我也只能走一步看一步。
我的言论只供讨论用，也不要太相信。自己试验结果出来了，有经验了才有一定的可信度。
羊咩咩 ( 15:54:52)
我养的3T3现在出现细胞明显“变瘦”的情况，伸出的细胞突起都变成细丝一样的，看上去不妙啊。
gemei0115 ( 15:55:13)
10月22日，周六白天有事情，晚上去给细胞传代了。
从周一的10月17日上午复苏，到周六10月22日晚上传代，已经长了6天了。细胞看着是大约长了80%的样子，对比文献和同事们养的生长速度，算是很慢的了。
做了如下处理：
1、用吸管吸走培养液，扔掉培养液和吸管。
2、用吸管吸取2ml的PBS，轻吹培养瓶2-3次，吸走PBS，扔掉吸管。
3、用枪吸1ml的PBS+0.5ml的0.25%的胰蛋白酶（含EDTA)加入培养瓶，浸润后放平，放在显微镜下观察。大约4min后，细胞间隙变大，互相脱离。吸走大部分消化液，剩余0.2-0.3ml左右，再消化2-3min，加入培养液停止消化，并吹打数次。
4、1：3传。然后分别加入培养液培养，有一瓶的稍微多一些，有两瓶接种得少，后来还是觉得应该1：2传比较保险。再观察原瓶，基本都吹下来了，只剩下了很小一部分。
今天去观察，已经过了1天半。传代的2号瓶细胞多些，3号和4号传代瓶细胞很少，又成了开始那种有一些小黑点，也许是原来瓶中带来的，也许是死细胞。培养液和原来一个颜色，没有换液。
gemei0115 ( 15:55:37)
传代后第一次换液，这一次是直接倒掉培养液，然后倒着拿在酒精棉球擦了瓶口，烧瓶口，然后加培养液。
换液前明显有死细胞和细胞碎片，换液后大部分的细胞碎片都倒掉了。感觉倒掉培养液（比吸管吸培养液）后，细胞碎片更少，培养瓶更干净。
接种后三天了。
2号和4号状态明显比昨天好多了，但仍有少量小黑点。
3号接种太少，没怎么长。
本来准备今天再复苏一只最早冻存的细胞，但看到有两瓶状态转好，准备明天再等等看。
羊咩咩 ( 15:55:56)
trypsin消化时最好能放在培养箱中
duoduo ( 15:56:16)
我也在养3T3，长得特别快，一天就得换液传代，我准备降低血清浓度看看，接种密度也降一降试一试。
我的经验：
1.拿来的细胞首先状态要好，才从公司拿来的时候，我在显微镜下看，哇，人家公司养的细胞就是好，又干净又整齐。
2.我用的DMEM（高糖）+ 10%胎牛血清。估计血清用得浓了，长得太快。3T3应该是比较好养的细胞，比较好长。
3.消化时，吸弃旧的培养液，PBS洗一遍，PBS要倒干净，0.25%胰酶+EDTA进行消化，室温下一分钟就可以呈沙状，加培基终止消化，一般我会离心后再换上新的培养基，总觉得洗涤一遍好些。
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