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做RT-PCR设计内参引物要注意哪些方面
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回答者：匿名用户
几种主要的内参&&beta-actin,alpha-tubulin,G3PDH,18SrDNA,一般来讲都可以选用，但它们所谓的恒定表达都是相对的。
不同处理中alpha－tubulin、beta－actin、g3pdh的表达水平比值（不同处理组beta-actin比值、alpha－tubulin比值、g3pdh比值）是不同的，也就是说3个gene中至少有两个的表达水平在不同处理组是不同的。
有篇文章（Utility
of the Housekeeping Genes 18S rRNA, b-Actin and
Glyceraldehyde-3-Phosphate-Dehydrogenase for Normalization in Real-Time
Quantitative Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction Analysis of Gene
Expression in Human T
Lymphocytes），结论是18SrDNA的表达水平要比beta-actin和G3PDH稳定的多，可参考一下。
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【心得】引物设计重点考虑因素、设计技巧及引物设计软件推荐
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这个帖子发布于9年零48天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我最近合成了几十对引物，，在实战中多多少少有些心得，拿出来给大家分享。我感觉想把引物合成的比较好，除了前引物和后引物的Tm不能相差太大，我们还要重点考虑以下因素：一、GC% GC含量对于PCR反应来说GC含量在40%—60%，一般50%左右比较合适；而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%。产物中GC含量最好大于引物中的GC含量。二、Degeneracy 多义性当设计多义引物时应尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，应尽量避免3末端的多义性，因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。三、3’ End Stability 3 末端稳定性引物稳定性影响它的错配效率，一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对稳定性较弱的3 末端。如果引物3 稳定性强，有可能在即使5 末端不配对的情况下造成错配，形成非特异性扩增条带（secondary bands） 。而3 末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时，由于3 末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。四、GC Clamp GC钳引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5 末端。这一段有较强稳定性的5 末端称为GC钳。它保证引物与模板的稳定结合。选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度。五、Secondary Structures 二级结构二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素。二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量，发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力，从而降低扩增效率，形成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用。六、Hairpin 发卡结构发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构，并由于发卡结构的形成是分子内的反应,仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成。发卡结构的稳定性可以用自由能衡量。自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量，如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应，如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应。七、Dimer 二聚体引物之间的配对区域能形成引物二聚体，它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结构。它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物，二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向引物之间形成，如果配对区域在3 末端问题会更为严重，3 末端配对很容易引起引物二聚体扩增。八、False Priming 错配如果引物可以结合除目的位点外的其他区域，扩增效率将明显降低目的产物带将减少或出现涂布（smear）。3 末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量的碱基配对，在使用引物设计软件时，您可以分别设定确认为错配的3 末端或引物全长形成连续碱基配对的数量。顺便说一下，如果是新手，刚开始接触引物设计，推荐使用Primer Premier 5.0，因为它界面简单，易学易用；如果你想把引物设计得尽善尽美，公认的首选软件是Oligo，其次我认为是DNAstar。Oligo功能强大，所以使用起来就没有Primer Premier 5.0那么简便。先用Primer Premier 5.0设计，然后把设计好的引物拿到Oligo里去检测这对引物的优劣，我想这对大多数引物设计者是一个不错的选择！
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补充一：具体说一下引物中GC含量问题引物的GC含量一般为40-60%，以45-55％为宜，过高或过低都不利于引发反应。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T比例过高，则同样在5’端增加Gs或Cs。但也有认为：原来普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率的观点其实是不对的，以人基因组DNA为模板，用81%AT的引物可以产生单一的、专一的、长250 bp，含有70% AT的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。
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补充二：关于自由能问题（如何根据自由能判断引物质量）1、ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。3′末端双链的ΔG是0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%、到－8时少于20%、而－10时接近于0。2、引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG 或CCC 会导致错误引发。二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。虽然有些带有发夹环，其ΔG为－3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。
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补充三：关于产物需要测序的PCR引物的设计问题在DNA测序的PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。其3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成，所以不会产生假产物。因此，为了有效地引发反应，引物的5′末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。与此相反，带有稳定的、GC丰富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3′末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物。无论如何，寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于－9 kcal/mol的，通常就是专一性的探针或引物。寡核苷酸3′末端越不稳定，假引发的可能性越低。以上内容基本涵盖了我设计引物的全部心得和体会，现在全部拿出来给大家分享，希望对大家有所帮助！
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多谢了，刚开始接触PCR，所以到这学学
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thanks for sharing
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谢谢urbest，我想请问1.设计多重PCR，有什么经验可询吗？2.在GENEBANK中找到mRNA序列，有CDS，STS分别代表何意？设计引物时要考虑外显子、内含子的位置吗？谢谢指教！
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多谢，我也是刚开始做pcr，到这里来学习，但是在网上下载的软件，按说明安装了之后为什么不能使用呢？
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很可能是你下载的软件不行，或者是需要注册，你还没有注册，到网上找个注册机就好了
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zyb301214 谢谢urbest，我想请问1.设计多重PCR，有什么经验可询吗？2.在GENEBANK中找到mRNA序列，有CDS，STS分别代表何意？设计引物时要考虑外显子、内含子的位置吗？谢谢指教！1、多重PCR，我没设计过，也不敢多说。2、在GENEBANK中找到的mRNA序列，其中CDS代表翻译成蛋白的序列，STS是序列标签位点。至于设计引物是否要考虑外显子内含子的位置，这要取决于你的试验目的了，看你研究的目的片断是什么。现在世界范围的研究中，研究启动子和外显子的比较多，相对来说研究内含子的要少很多。
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很好，谢谢分享！
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谢谢楼主，获益匪浅。我想请问一下楼主，在设计REAL TIME引物时应该注意哪些因素？好象REAL TIME引物与普通跑胶的引物除了扩充长度不一样以外，还要多考虑很多因素。还有用sybr染料和taqman探针检测时，引物设计也不一样。sybr特异性要求更高，有没有什么比较好的软件。
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比Primer5 还好的生物软件就是oligo了，这两个结合着使用应该没有什么大问题的，你问的问题在软件的说明书里面都有提到的，你可以下个说明书自己看一下。
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学习了,谢谢olige设计引物好象要注册,请问有没有***版啊?
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楼主你好,附件是我用primer5筛选的引物序列,可不可以麻烦你用olige帮忙验证一下,不胜感激.反向引物后数值为预期产物片段大小.谢谢
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barrey你好，谢谢你对我帖子的关注。 你提到让我帮你比对引物，可惜你发的附件里没有谈到那个基因，也没有给出基因序列，只有引物序列，这样我就很难下手了。上面你提到oligo要注册的问题，我想你还没有注册成功，故而没有学会使用oligo。现在我把oligo的注册机发到这里，你可以自己安装上oligo，（安装文件和教程容易下载到，我就不上传了），你自己看一下引物怎么样。我想你学会它的使用肯定比我帮你做出结果更有意义。随便提一下，我觉得各种指标的顺序为：错配、发卡结构、二聚体。其他考虑因素参考最上面的帖子。注册机：
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不错，不错，看了楼主的帖子之后对引物设计有些概念了。
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:),谢谢楼主
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好帖呀，学习了。谢谢楼主。
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我正在读primer premier 的 primer design guideline 结合你文中所提问些问题：1。Guideline里说“Primers with melting temperatures above 65oC have a tendency for secondary annealing.”
这个“secondary annealing”如何理解？2。GC Clamp和3端稳定性：可以这样简单理解吗：5端要GC多，3端要GC少。 Guideline里讲3端最后5个碱基里要避免3个G或3个C。但是对5端没有谈。3。发卡结构：Guideline里说Optimally a 3' end hairpin with a ΔG of -2 kcal/mol and an internal hairpin with a ΔG of -3 kcal/mol is tolerated generally。其实第一还是G/C在3端的比例问题，第二是G/C配对问题。不好意思，有事，先下了。
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urbest总结的不错！Degeneracy 多译为“兼并性”补充几点：1、除了上面的因素还要考虑产物的自由能或待扩区域的自由能，通过引物退火温度同产物退火温度的差值来衡量，20度左右就可以。2、要保证足够的长度，这是引物设计的首要原则，只有足够长度才能保证引物的特异性，25个左右。可以blast检验引物的特异性。3、多重引物的设计关键是两点：1、引物间尽量无聚体形成，特别是头部。2、引物间长度不能相差太大，但应能分开在跑胶时，100－200bp左右。才能保证扩增效率的接近。
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感谢楼主。好心人呢
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谢谢，收益非浅！
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能传我oligo 软件吗？ 我下载不到呀！
多谢了！！
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我感觉Primer Premier 5.0这个软件设计的引物一般,OLIGA没用过,不敢妄下评论,推荐大家使用在线的引物设计网站,prime 3,这个里面设计的不错， 我做realtime引物设计的时候用Primer Premier 5.0设计了好几对都不能用(有杂带,可能是我RNA里面有基因组的污染),用prime 3设计了一对却很好，至少是没有杂带,一家之言~~
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楼主说的好像都是常识！最好说一些个人的体验！
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奇怪，我回复的帖子底下为什么会有“【资料】我的 56邮箱（内含大量有用的资料） ”这样的东东，这可不是我贴的！打开一看，是网友发的资料！支持，支持！
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谢谢!很有帮助!
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用primer5设计出来的引物（必要时更改个别碱基）对于常规PCR一般是没有问题的，我和我舍友做常规PCR的时候，都是用Primer5设计的，跑出来的条带都很漂亮，并且没有杂带。目前为止，我还没有跑过很很复杂的PCR，所以如果PCR对引物要求很高的话，Primer5的设计是不是合适，我真不敢说了。但我想，根据最基本的原理，我们尽量多考虑几个方面，设计起来问题应该也不大。顺便说一下，我认为减少错配最简单有效的办法就是把引物长度适当延长，当然不能过长，呵呵。
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谢谢楼主指导!
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不错，谢谢楼主
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谢谢，很有帮助
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我现在正自己学者设计引物，看了楼主的帖子真是受益匪浅啊！太感谢了！
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关于丁香园引物设计上有不懂得问题 求助(引物设计,引物) - PCR实验 - 生物秀
标题: 引物设计上有不懂得问题 求助(引物设计,引物)
摘要: [引物设计上有不懂得问题 求助(引物设计,引物)] 我用VECTOR NTI设计的引物但是对dH,
dS和dG不知道什么意思,对了 还有TaOpT不明白求教高手
3: Product of length 1656 (rating: 171)
Contains region of the molecule from 124 to 1779
Tm: 79 4 C
TaOpt: 56 4 C
Sense 关键词:[引物设计 引物]……
我用VECTOR NTI设计的引物但是对dH,
dS和dG不知道什么意思,对了 还有TaOpT不明白求教高手.#3: Product of length 1656 (rating: 171)
Contains region of the molecule from 124 to 1779
Tm: 79.4 C
TaOpt: 56.4 C
Sense Primer:
CTCCAGTCTCCAAAGCCGAT
Similarity: 100.0%
Length: 20
Tm: 53.2 C
dH: -154.5 kcal/mol
dS: -397.3 cal/mol
dG: -34.3 kcal/mol
Antisense Primer:
GCTGACCATTGTGGTTCCATA
Similarity: 100.0%
Length: 21
Tm: 52.3 C
dH: -153.0 kcal/mol
dS: -394.2 cal/mol
dG: -33.7 kcal/mol
Tm Difference: 1.0
GC Difference: 7.4
一些反应热动力学上的东西，也不太清楚，同问，呵呵。怎么没有回音啊 痛苦啊dH 是焓变，dS是熵变，dG是Gipps函数变 这些都是热动力学方面的，你可以不管它们。TaOpT推荐（最优化）的退火温度，你PCR时可在此温度上下浮动1-2度谢谢 朋友 我还是想了解 能详细的解释一下吗http://202.113.66.66/xjjpkpx_2005/gchhx/wlkejian/derzh/erzhsanjie.htm/c?word=%EC%D8%3B%B1%E4&url=http%3A//estar%2Erdfz%2Ecn/Resource/GZ/GZHX/HXBL/XDHXJC/zw%5F0044%2Ehtm&b=0&a=23&user=baidu/xjc/Html/Article/Class910/xxx/Class5083/Class5146/Class.html一. 吉布斯函数Ｇ的势能属性1.自发过程及其特征z以水自发地从高处（ｈ1）流向低处（ｈ2）为例 z推动力：位差Δｈ＝ｈ2－ｈ1&０ z特征：随着自发过程的进行，势能不断降低，重力势能转变为功；当Δｈ＝０即ｈ2＝ｈ1时，势能降到最低，达平衡态，无作功能力； z反向自发进行，Δｈ&０，需外力作功支持．
2.化学反应的自发性z反应：　Ｚｎ＋ＣｕＳＯ4　＝　Ｃｕ＋ＺｎＳＯ4 　　　　　─────────────→
　　　　　　　自发从左向右进行 z若该反应在电池中进行，正反应方向为放电过程， z可作电功，反向自发进行需外力作功，为充电过程．反应自发进行的推动力应是体系中某一具有势能性质的物理量（状态函数）的变化（ΔＧ）． *吉布斯函数Ｇ的势能属性 1878年，美国化学家Gibbs提出，恒温，恒压下的化学反应之所以能够自发进行，是由于反应中存在状态函数Ｇ，Ｇ在反应中不断降低（即ΔＧ&０）,Ｇ的降低转变为功(ΔG=W)，反应自发地进行下去，一直到Ｇ降至最低达到平衡．因此，Ｇ具有势能属性．
§２.３吉布斯自由能变化ΔＧ和反应方向的判断 二. 吉布斯自由能变判据（ΔＧ判据）1.G和DG的含义、G和DG的性质(1)定义
G ≡ H–TS
, 又DG =G2–G1
DG = (DH – TDS) & 0
正向自发 (2)吉布斯自由能变判据（ΔＧ判据） 恒温，恒压下，ΔＧ＝Ｗ′
ΔＧ&０　　　正向自发反应　　　　Ｗ′&０ 　　ΔＧ＝０　　　平衡态　　　　　　　Ｗ′＝０ 　　ΔＧ&０　　　反向自发反应　　　　Ｗ′&０ 最小自由能原理。2.吉布斯函数变（ΔＧ）判断反应的自发性对公式ΔＧ＝ΔＨ－ＴΔＳ的讨论 ΔＨ
Ｔ对ΔＧ的影响
ΔＨ&０（放热）
ΔＳ&０ （熵增）
任何温度下，都有ΔＧ&０ （正向自发）
ΔＨ&０ （吸热）
ΔＳ&０ （熵减）
任何温度下，都有ΔＧ&０ （反向自发）
ΔＨ&０ （吸热）
ΔＳ&０ （熵增）
升高温度，ΔＧ&０ （高温下正向自发）
ΔＨ&０ （放热）
ΔＳ&０ （熵减）
降低温度，ΔＧ&０ （低温下正向自发）
ΔＨ和ΔＳ同号时，存在转折温度。 正确理解反应热△H的单位的含义深圳市龙华中学
518109化学反应都伴随着能量的变化，通常表现为热量的变化。人们用热化学方程式来表示化学反应中放出或吸收的热量，用焓的变化来描述与反应热有关的能量变化。如N2
+ 3 H2 ≒2 N H3
△H = -92.2 kJ/mol。那么，我们怎样正确理解反应热△H的单位的含义呢？新世纪版《化学反应原理》（选修）第5页“资料在线”中“△H的单位中mol-1的含义”部分内容，用两个例子对“反应热△H的单位的含义”阐述得很清楚。但是“反应焓变单位中的mol-1表明参加反应的各物质的物质的量与化学方程式中各物质的化学式的系数相同”，语言过于抽象与罗嗦，着实让学生不得概念的要领，学生们在具体运用时也感到无所适从。对于反应热△H单位的含义，孟庆珍、胡鼎文等的《无机化学》(上册，北京师范大学出版社出版)第358页上的解释是：反应热△H的单位是kJ/mol，为每摩尔反应的热效应。对于a A+b B→c C+d D的反应，每摩尔反应是指a mol A与b mol B作用生成c mol C和d mol D的反应。从微观来看，它是反应式中所示的物质粒子以基本单元数N0为单位按其化学计量数的量进行的反应。因此，不能离开相应的具体反应式来说反应热△H。由上面的内容我们可清楚的这样理解反应热△H单位的含义：焓是容量性质，△H的大小与物质的量成正比，反应热△H的单位是kJ/mol。在书写反应化学方程式时须注意△H值应该与一定的反应式相对应(如在298K)。H2 + 1/2 O2
△H= -286 kJ/mol而 2 H2 + O2
═ 2H2O(l)
△H= -572 kJ/mol。此mol -1 已不是指1 mol H2或1mol O2 ，而是指“1mol反应”。所谓1mol反应可以是1 mol H2和1/2 mol O2起反应，也可以是2 mol H2和1mol O2起反应，前者放热286 kJ，后者放热572 kJ。所以△H应和某个热化学方程式相对应，从而使“1mol反应”有明确的含义，笼统地说反应热是多少kJ/mol容易引起误解。 同时，“燃烧热”和“中和热”是两种特殊反应热△H的概念，燃烧热是以1mol物质完全燃烧生成稳定的氧化物所放出的热量来定义的，而中和热是以生成1mol H2O(l)所放出的热量来定义的。因此在书写它们的热化学方程式时，应以燃烧1mol物质或生成1mol H2O(l)为标准来配平其余物质的化学计量数。
教学中我们还可以把反应热△H概念的涵义变通为：在对应的化学反应中，其中的某种物质的物质的量为1mol变化量时的热量变化值。如对于合成氨反应的热化学方程式可以有如下三种形式：
+ 3 H2 ≒2 N H3 △H1 = -92.2 kJ/mol
+ 3/2 H2 ≒ N H3 △H2 = -46.1 kJ/mol
+ H2 ≒ 2/3 N H3 △H3 = -30.7 kJ/mol
我们可以这样分别可看作：⑴式的△H1表示合成氨反应中每消耗1 mol 氮气可放出92.2kJ的热；⑵式的△H2表示合成氨反应中每生成1 mol氨气可放出热量46.1 kJ的热；⑶式的△H3表示合成氨反应中每消耗1 mol 氢气可放出30.7 kJ的热。三者的关系是 △H1 = 2 △H2 = 3 △H3 。
如此，在热化学方程式中的化学计量数不再是任意数比了，而是至少有一种物质(反应物或产物)前面的计量数要等于1，这时的△H (kJ/mol)才是与热化学方程式对应的确切值。当然其余物质的计量数可以是分数或整数。http://202.113.66.66/xjjpkpx_2005/gchhx/wlkejian/derzh/erzhsanjie.htm/c?word=%EC%D8%3B%B1%E4&url=http%3A//estar%2Erdfz%2Ecn/Resource/GZ/GZHX/HXBL/XDHXJC/zw%5F0044%2Ehtm&b=0&a=23&user=baidu/xjc/Html/Article/Class910/xxx/Class5083/Class5146/Class.html
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