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中华蜜蜂转录组测序及雌性蜜蜂基因表达分析
本论文得到国家蜂产业技术体系项目（Ｎｏ．ＣＡＲＳ－４５）、江西省 自然科学基金（Ｎｏ．２０１０ＧＺＮ００４４）和教育部博士点基金项目（Ｎ ０．２０１０３６０３１１０００３）资助Ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ ｗａｓ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂ）ｔｈｅ Ｂｅｅ ｌｎｄｕｓｔＤ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ蛩 Ｎａｔｕ。３Ｉ Ｓｖｓｔｅｍ Ｓｔａｔｅ ｐｒｏｊｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（Ｎｏ．ＣＡＲＳ－４５），ｔｈｅ Ｓ。ｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｊｉａｎｇｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ（Ｎｏ．２０１０ＧＺＮ００４４）ａｎｄ Ｃｈｉｎａ ｏｆ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｘ Ｆｕｎｄ Ｄｏｃｔｏｒａｌ
独刨性声明 本人声明，所呈交的学位论文，是在指导教师指导下．通过我的努力 取得的成果．并且是自己撰写的。尽我所知．除了文中作了标注和致谢中 己经作了答谢的地方外，论文中不包古其他人发表或撰写过的研究成果． 也不包台在江西农业大学或其它教育机构获得学位或证书而使用过的材 料。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明井表 示了谢意。如被查有严重侵犯他人知议产权的行为．由本人承担应有的责任。学位论文作者亲笔签名：副李孽论文使用授权的说明阿期：理堡』本人完全了解江西农业大学有关保留、使用学位论文的规定．即学校 有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借闻；学校可以公布论文的全 部或鄹分内容．可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密，在年后解密可适用本授权书。口口不保密．本学位论文属于不保密。 （请在方框内打“～一）学位论文作者亲笔签名：宣！Ｉ至叠指导教师亲笔签名：，日期：ｚ旦丝』期：王必王＆盘氢嶝日，＿Ｊ¨． ｈ１．＿－１一． ＿！．１‘呻ｆ．＿ｊ目录 摘要…………………………………………。Ａｂｓｔｒａｃｔ第一章文献综述…………………………………．．．………………………………………．１ Ｉ中华蜜蜂的概况…………………………………．．．………………………………………．１ ：雌性蜜蜂基因差异表达研究进展……………．．．………………………………………．１３ＤＮＡ甲基化转移酶………………………………………………………～………………２４蜜蜂中Ｄｎｍｔ３的研究进鹾………………………………………………………………．３５ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ６ＲＮＡ测序技术……………………………………………………………………．３ＤＧＥ?－．．．－．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．４７本论文的研究内容…………………………………………………………………………．４第二章中华蜜蜂转录组测序和数字基因表达谱分析…………………５１｛】；…………………………………………………。………………………．………………．５２材料与方法………………．¨…………………………………………………………………５ ：１实验材料２１ ２１ ５ ５１实验蜂群 ２实验器材及试剂 … …５ ５ ５２．２实验方法 ２．２１创建ＣＤＮＡ文库和转录组序列…２．２ ２ ２．２Ｉｌｌｕｍｉｎａ序列结果的分析…７３剖建ＤＧＥ文库并测序…８ ９ １０ 】二２．２ ４ ２．２ＤＧＥ测序文库与参考转录组数据库比对分析５差异表达基因的筛选及功能注释 ０ＲＴ．ＰＣＲ验证２．２ ６３结果．．……………………．…………………………………… ３】Ｉｌｌｕｍｉｎａ测序和序列组装３ ３１３１ ３ １４ １６２预测蛋白质的功能注释 ３ＤＧＥ标笠测序文库目录３．４ＤＧＥ标签数据库与参考标签数据库进行比对３…… ………１８ １９５中蜂蜂王与工蜂间差异表达基因……３．６差异表达基因的ｑＲＹ―ＰＣＲ验证 ４刊论…２２２３第三章１引言中华蜜蜂Ｄｎｍｔ３基因克隆及表达分析２５ ２５ ２５２５２材料与方法２Ｉ实验材料…２１ ２１ ２ ２１实验蜂群……………… ………二５ ２５２实验试剂及仪器１．３培养基和主要溶液的配制………２６２６２实验方法…２………………２１总ＲＮＡ的提取２……２６ …２】】实验器具的处理与准备２试剂配制和准备……２６２６２ ２ｌ ２．２１ ２ ２１ ２ ２ ２２……３提取步骤…………………．２６…４ＲＮＡ质量检测…… … …２７ ２７２反转录台成第一链ＣＤＮＡ… ３引物设计与合成 …… … ……………２８ ２８ …２８２．２ ４ ２ ２ ５ＰＣＲ扩增ＰＣＲ产物回收……２ ２ ６２ ２ ２．２ＰＣＲ产物的克隆………… …………２９７序列的测定和分析８荧光定量ＰＣＲ２ ２２９３０ ３０８１定量引物设计 ２反转录反应 ３标准品的制作 ４实时荧光定量ＰＣＲ…２ ２ ８ ２ ２ ８ ２ ２ ８ ２ ２…… …… …３０…３０ …３１ ３１９数据统计与分析目录３结果与分析………………………………………………．¨……………………………．３１３ ３１中蜂Ｄｎｍｔ３基因的扩增与鉴定３１ ３ｌ ３４２中蜂Ｄｎｍｔ３基因与其编码蛋白比较分析３，３中蜂Ｄｎｍｔ３基因的转录表达４讨ｊｅ…………………………………………………………………………………………３６第四章结论与展望………………………．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３８１主要结论……………………………………………………………………………………３８ ２研究展望……………………………………………………………………………………３８参考文献……………………………。 附件１ Ｕｎｉｇｅｎｅ代谢通路………………………………………………４４攻读硕士期间发表论文情况…………… 致谢………………………………………………………………………５３
摘要摘要本研究以中华蜜蜂（Ａｐｉｓ ｃｅｒａｎａｆｄｗ”ｄ）为材料．通过转录组测序技术获得了中华蜜蜂的转录组信息，并通过数字基因表达谱（ＤｉｇｉｔａｌＧｇｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰｒｏｆｉｌｅ．ＤＧＥ）测序分析比较丁中华蜜蜂蜂王和工蜂的基因表达差异。另外克隆了中华蜜蜂ＤＮＡ甲 基化转移酶３（ＤＮＡｍｅｔｈｙｌｔｎｍｓｆｅｒａｓｅ３．Ｄｎｍｔ３）基因及分析了其ｍＲＮＡ的表达。通过转录组删序技术．获得丁５１．５８１．５１０条ｃｌｅａｎ ｒｅａｄｓ对应４ ６４Ｇｂ核苷酸。这 些ｒｅａｄｓ组装成４６．９９９个Ｕｎｉｇｅｎｅ，平均长度６７６ ｂｐ。基于五个数据库（衄、Ｓｗｉｓｓ―Ｐｒｏｔ、 ＧＯ、ＫＥＧＧ和ＣＯＧ）用Ｂｌａｓｔｘ进行相似性比对（Ｅ值＜１０。），共有２４．６３０个ｕｎｉｇｅｎｅｓ 被注释。将获得的转录组数据作为参考数据库，用ＤＧＥ方法分析比较中华蜜蜂蜂王 和工蜂的基因表达差异。分别从蜂王和工蜂中获得５．９６２．７３５和５．６６３．９５２标签。检 测到４１４个基因有差异表达．蜂王与工蜂相比．其中１ ８９个是上调．２２５个是下调。 我们选择了１０个差异表达的ｕｎｉｇｅｎｅｓ，用ｑＲＴ．ＰＣＲ验证了在蜂王和工蜂中的表达．结果显示这些基因的ｑＲＴ－ＰＣＲ结果与ＤＧＥ数据相符台。采用ＲＴ．ＰＣＲ技术克隆丁Ｄｎｍｔ３基因：采用荧光定量ＰＣＲ检测不同发育时期工蜂和蜂王头部的Ｄｎｍｔ３基因ｍＲＮＡ的表达量。结果表明：该基因ｃＤＮＡ序列全长２２７７ｂ口．编码７５８个氨基酸残基．预测的蛋白分子量为８８２４ ｋＤ．等电点为７８５。经氮基酸亭列比对，与西方蜜蜂加打ｍｅｌｌ；ｆｅｒａＤｎｍｔ３有９９％的同源性。该基因在工蜂和蜂王不同发育时期均有表达．１日龄工蜂与７日龄工蜂中没有显著差异（Ｐ＞Ｏ ０５），３０日龄工蜂中的表达量显著高于１日龄与７日龄工蜂（代０ ０５）：蜂王蛹中的表达量显著高于工蜂蛹（尸（ｏ ０５）：１日龄的蜂王中的表达量显著高于１日龄的工蜂（Ｐ＜０ ０５）：产卵工蜂与产卵蜂王中的表达量没有差异（Ｐ＞０ ０５）。这表明Ｄｎｍｔ３可能与工蜂劳动分 工及蜜蜂卵巢发育有关。关键词：中华蜜蜂：转录组测序：数字基因表达谱测序：Ｄｎｍｔ３：表达分析ＡｂｓｔｒａｃｔＷｉｔｈｔｈｅ Ａｐｉｓｃｅｒａｎａ ｃｅｒａｎａ ａｓ ｃｅｒａｌｌａｍａｔｅｒｉａｌｓｌｎｔｈｉｓ ｓｔｌＪｄ、『＿ｗｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｅ ｔｌａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｌｎｆｏｍｍｔＪｏｎ ｏｆ Ａｃｅｒａｎｕｂｙ ＲＮＡ．ｓｅｑ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｅｅｃｅｒｄＨａ ｅｅｌⅡ＂ａｂｅｔｗｅｅｎａｎａｌｖｓｉｓｑｕｅｅｎｓａｎｄ ｗｏｒｋｅｒｓｏｆ Ａｂｙｄｉｇｉｔａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＤＧＥＩｃｅｒａ”ａｌｎ ａｄｄｉｔｏｎ．ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ』ｃｅｇａｎｏＤＮＡｍｅｔｈｖｈｒａｎｓｆｅｒａｓｅ３（Ｄｎｍｌ３）ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ Ｕｓｉｎｇｈｉｇｈ―ｔｈｉ＇ｏｕｇｈｐｕｔｉｌｈｉｍｉｎａＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ５１ ５９１．５１０ ｅｌｅ２ｍ ｒｅａｄｓｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｕｎｉｑｕｅｓ ｗｉｔｈ ｐｕｂｉｉｎ Ｂｌａｓｔｘａ ｔｏ４ ６４Ｇｂ ｔｏｔａＪ ｎｕｅｌｅｏｆｉｄｅｓ ＢａｓｅｄｏｎＴｈｅｓｅ ｒｅａｄｓ ｗｅｒｅ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｉｎｔｏ ４６９９９ｍｅａｎ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ６７６ ｂｐｍ ａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｃｕｔ―ｏｆｆ Ｅ－ｖａｌｕｅ ｏｆ １０’ｕｓｉｎｇａｓｄａｔａｂａｓｅｓ州Ｒ．Ｓｗｉｓｓｐｏｒｔ．ＧＯＣＯＧ．ＫＥＧＧｌａｗｉｔｈｔｏｔａｌ ｏｆ ２４．６３０ ｕｎｉｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ａｎｎｏｔａｔｅｄＵｓｉｎｇ ｔｈｅｓｅ ｔｒａｎｓｅｒｉｐｔｏｍｅ ｄａｔａｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｑｕｅｅｎｓ ａｎｄ ｗｏｒｋｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡｃｅｒａＭｏ ｃｇｒⅡｎｄｕｓｉｎｇａｔａｇ－ｂａｓｅｄ ｄｉｇｉｔａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｔａｇｓｗｅｏｂｔａｉｎｅｄａｂｏｕｔ ５．９６２ ７３５ ａｎｄ５．６６３ ９５２ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｑｕｅｅｍｓａｎｄ ｗｏｒｋｅｒｓ ｓａｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｅｒ＾＇ｅｅｎ ｔｈｅｍ．ｗｉｔｈ ｗｏｒｋｅｒｓＡ ｔｏｔａｌ ｏｆ ４１４ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎ ａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ１８９ ｕｐ－ｒｅｇｕｌｍｅｄ ａｎｄ ２２５ ｄｏ＇ｗｍ－ｒｅｇｕｌｍｅｄｔｅｎｉｎ ｑｕｅｅｎｓ ｃｏｍｐａｒｅｄｄｅｔｅｃｔｔｏＷｅｃｈｏｓｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｕｎｉｇｅｎｅｓｔｏｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎ ａｄｕｌｔ ｑｕｅｅｎｓ ａｎｄ ｗｏｒｋｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ―ＰＣＲ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ ｒｅｓｕＲｓｏｆａｌｌｔｈｅｓｅ ｇｅｎｅｓ ａＴｅ ｅｏｎａｌｓｔｅｍｗｉｔｈｔｈｅＤＧＥ ｄａｔａＴｂｅ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ３ ｆＤｍｎｔ３１ ｉｎ Ａｃｅｒａ＂ａ ｃｅｒａｌＴａｗａｓ ｃｌｏｎｅｄｌｎｂｙ ｕｓｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔＲＴ－ＰＣ艮ａｎｄ ｔｈｅ ｑｕａｎｄｔａｔｉｖｅ ａｎａｌ）ｒｓｉｓ ｏｆｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆＤｒｌｍｔ３ ｍＲＮＡ６ｅｖｅｌｏｐｍｅｍａｌ ｎａｇｅｓ ｏｆ，＾，ｏｒｋｅｒ ａｎｄ ｑｕｅｅｎ。ｔＭｅｒｅ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｌｍｅ ｑＰＣＲ Ｔｈｅ ＾１１１．１ｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｏｆ Ｄｎｍｔ３ ｇｅｎｅ ｗａｓ ２２７７ ｂｐｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ７５８ ａ／ｌｌＪｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅＭＷａｎｄ Ｐ１ ｗｅｒｅ ８８ ２４ ｋＤ ａｎｄ ７ ８５．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｍＴｈｅ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｄｎｍｔ３ｉｄｅｎｔｉｔｙ∽嘲诵ｔｈｔｈａｔ ｏｆ Ａｐｉｓ ｍｅｌｌ！ｆｅｒａ ＴｈｅｓｔａｇｅｓＤｎｍｔ３ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｗａｓ ｃｌｅａｒｈ，ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｏｆ ｗｏｒｋｅｒ ａｎｄｑｕｅｅｎ．ａｎｄｉｔｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉ窑ｈｅｒｉｎ ３０ ｄ－ｏｌｄｗｏｒｋｅｒｔｈａｎｉｎ】ｄ－ａｎｄ ７ ｄ－ｏｌｄｗｏｒｋｅｒ（ｐ＜０ ０ｓ）．ｗｈｉｌｅｎｏｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｅｘｉｓｔｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ】ｄ―ａｎｄ ７ ｄ－ｏｌｄ ｗｏｒｋｅｒ ｆＰ＞Ｏ ０５）Ｔｈｅ Ｄｎｍｔ３ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｑｕｅｅｎ ｐｕｐａｅ ｔｈａｎ ｉｎ ｗｏｒｋｅｒ ｐｕｐａｅ ｒＰ＜０ ０５）． ａｎｄ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ １ ｄ－ｏｌｄ ｑｕｅｅｎ ｔｈａｎ ｉｎ １ ｄ－ｏｌｄ ｗｏｒｋｅｒ ｆ尸＜０ Ｄｎｍｔ３ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌａｙｉｎｇ ｗｏｒｋｅｒ ａｎｄ ｌａｙｉｎｇ ｑｕｅｅｎ ｈａｄ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ Ｄｎｒｎｔ３ｎｏ０５）Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆｓｉｇｎｉｆｉｃａｒＣｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓｍａｙ ｂｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｌａｂｏｒ ｉｎ ｗｏｒｋｅｒｓａｎｄｏｖａｒｙｄｅｖｅｌｏｐｍｅｍ ｉｎ ｈｏｎｅｙｂｅｅｓＫ“ｗｏｒｄｓ：Ａｐｉｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓｃｅｒ口ｎｎｃｅｒａｎａ：ＲＮＡ―ｓｅｑ：ＤＧＥ；ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ３（Ｄｎｍｔ３）；第一章文献综述第一章文献综述 １中华蜜蜂的概况中华蜜蜂（Ａｐｉｓ ｃｅｒａｎａ ｃｅｒａｎａ）是东方蜜蜂的指名亚种．简称中蜂。在我国．除新疆尚未发现外，其它各省均有分粕。其授粉行为对全球生态及农业生产起到至关重要的作用．给养蜂人带来显著的经济效益。与西方蜜蜂｛Ａｐｉｓｒｅｅｌ＆ｅｒａ）相比．中蜂对蜂螨的抵抗能强、嗅觉灵敏…．也能采集零星蜜粉源植物”】等优势。我国土生土长 的中蜂，在长达数千万年的进化中，具有了西方蜜蜂不可取代的优点，对于发展我国 的蜂业生产．保持物种的多样性和维持生态平衡等方面，能起到西方蜜蜂不能起到的 重要作用。 但随着经济的发展和交通日益改善．农民过多的使用农药，对生态坏境的破坏． 生物资源的过度利用及转地放牧西方蜜蜂的数量的逐渐增加．导致中蜂分布区域和种 群的数量在大幅度的减少．使山林植物授粉总量减少，导致生物多样性降低。 在２００６年１０月２６日出版的Ｎａｔｕｒｅ杂志上，公布了西方蜜蜂基因组测序口１和分析结果，这标志着蜂学研究进入了一个全新阶段。中蜂具有西方蜜蜂不可替代的种质特性和资源优势，因此对中蜂开展相应的基因组学研究和功能基因挖掘很有必要。但目前为止中蜂的基因组信息还没有公布，杨喻晓等已构建中蜂头部ｅＤＮＡ文库和获得了７１７个有效ＥＳＴ探针Ｍ】。在ＮＣＢＩ数据库中也仅有１２４个中蜂ｍＲＮＡ序列。２雌性蜜蜂基因差异表达研究进展目前已有西方蜜蜂中雌性蜜蜂蜂王和工蜂基因差异表达的研究报道。Ｓｅｖｅｒｓｏｎ等 第一次大规模的对意大利蜜蜂（Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆ．ｒｃｌ￡）级型分化的差异基因表达进行分子生物学研究”ｌ，通过ｍＲＮＡ的体外翻译和ｓＤｓ―ＰＡＧＥ方法分析证明在蜂王和工蜂幼虫期和前蛹期ｍＲＮＡ图谱有差异。Ｅｖａｎｓ和Ｗｈｅｅｌｅｒ通过消减杂交法第一次筛选出７ 个甥型特异性表达基因位点，其中２个可能在级型分化中发挥核心作用｜６】。用芯片进 行分析发现．工蜂幼虫和具有双重发育潜力的早龄未分化幼虫在基因表达上很接近， 而蜂王幼虫下调了许多早龄幼虫表达的基因，井上调了一套与级型相关基困的表达。 蜂王和工蜂大多数差异表达的基因与代谢过程相关，尤其是蜂王上调了许多代谢酶．而工蜂上调了一些细胞色素Ｐ４５０家族、六聚储藏蛋白、二氢二酵脱氢酶和一个脂肪酸结合蛋白１７１ ＣｏｒｏｌｌａＭ等发现了多个与缎型分化有关的基因．它们在蜂王和工蜂幼虫分化时的表达水平有明显差异¨Ｉ。Ｂａｒｃｈｕｋ等使用蜜蜂的ＥＳＴｓ＞６０００的ｅＤＮＡ微阵列分析，发现蜂王和工蜂之间有２４０个不同表达的基因（ＤＥＧｓ）…Ｊ，许多ＤＥＧｓ似乎 在级型特异性结构发育过程中起重要作用，像大脑、足、卵巢。Ｌｉ等通过蛋白质组 学方法比较了蜜蜂幼虫级型分化期间总蛋白、线粒体蛋白和核蛋白之间的不同表选 Ｌｉｏ－１２ｌｏ其他的研究显示在蜜蜂级型分化期间蜂王和工蜂之『刚许多表达差异基因涉及缺 氧途径㈦、ＴＯＲ选径１１４１”、胰岛素信号转导途径¨６”］、抗氧化途径㈣和生殖状况１１９．２１】。中华蜜蜂转录纽驯序厦雌性蜜蜂基固表述分析３ＤＮＡ甲基化转移酶ＤＮＡ甲基化【ＤＮＡ ｍｅｔｌｌｙｌａｆｉｏｎ）是一种很广泛的遗传学调节机制．在真梭生物 体中普遍存在瞄卫】，ＤＮＡ甲基化是通过ＤＮＡ甲基化转移酶（ＤＮＡｍｅｔｈｙｈｍｎｓｆｅｒａｓｅ Ｄｎｍｔ）催化和维持的。该酶家族专一地作用于ＣｐＧ二核苷酸上。 般认为，哺乳动物的Ｄｎｍｔ有４种，分为两个家族：Ｄｎｍｔｌ和Ｄｎｍｔ３（另有一 种Ｄｎｍｔ２，主要是ｔＲＮＡ的甲基转移酶，有报导称Ｄｎｍｔ２也具有微弱的ＤＮＡ甲基转移酶活性１２４１）（图１．１）。Ｄｎｍｔｌ（持续性ＤＮＡ甲基转移酶）通过Ｎ端ＰＨＤ结构域直接靶向ＤＮＡ复制位 点．参与ＤＮＡ复制中新合成链的甲基化口５Ｉ，也可直接与组蛋白去乙酰基转移酶 （ＨＤＡＣ）联合作用阻断基因的转录口“”。Ｄｎｍｔｌ家族的主要作用是在ＤＮＡ复制和 修复中维持ＤＮＡ甲基化，这种维持作用可以将ＤＮＡ甲基化信息传递给予代细胞。 Ｄｎｍｔ３（从头甲基转移酶）包括从头甲基转移酶ＤｒＬｒａｔ３ａ、ＤｎｍＧｂ和调节蛋白 Ｄｎｍｔ３Ｌ１２８］。Ｄｎｍｔ３ａ与Ｄｎｍｔ３ｂ的结构域基本相同，它们可通过ｐＷＷＰ结构域直接 与ＤＮＡ结合，也可与转录抑制因子或其他蛋白质发生蛋白－蛋白相互作用而募集到ＤＮＡＣｐＧ位点［ｔｇｌ，可甲基化ＣｐＧ。Ｄｎｍｔ３Ｌ是一种Ｄｎｍｔ３类似蛋白，具有半胱氨酸 富集的锌结合区域（ＡＴＲＳ），但缺少Ｃ端的酶催化活性域，因此没有单独的催化活 性。但却是ＤＮＡ从头甲基化的调节因子．通过与Ｄｎｍｔ３ａ和Ｄｎｍｔ３ｂ的Ｃ端相结合． 提高它们的催化活性，正向调节ＤＮＡ的从头甲基化ｍ】。 Ｄｎｒｎｔ３是ＤＮＡ甲基化转移酶家族的重要组成部分，直接导致特定基因启动子 区域ｃ口Ｇ位点发生异常甲基化，进而使基因失活，Ｄｎｍｌ３可能参与细胞生长分化调控１３０Ｊｌ】。｛ｌ一琳ｆ：（。ｊ‘Ｄ№Ｐ。’?…‘Ｉｈ／Ｊ一ｌ¨¨ ¨ＤｎｍｆｌＤｎｍｆ２ｌ¨Ｄｎｍｔ３ａＩ．ｆｆ图１－１ＦｉｇＩ一１Ｄｎｍｔ３ｂ¨Ｉ １Ｄｎｍｔ３ＬＤｎｍｔ的家族成员及其结｝旮ａｎｄｉｔｓ ５ｔＴＵＣｔＵｒｅ ｏｆＤｎｍ ｒＦａｍｉｂ＇ｍｅｍｂｅｒｓ２第一章文献综连Ｄｎｍｌ的结构由Ｎ端调廿Ｒ、Ｃ端催化区和呻间连接医三部分组成。Ｎ端调¨区育多个不同 的结构域目ｌ起始密码千．包括核定位信号（ＮＬＳ）、细胞核增埴抗原绱台匣（ＰＢＤ）、多澳同游 Ｒ（ＰＨＤ）、富台’ｎ胱氮酸锌指ＤＮＡ结台基序【ＡＴＲＳ）、ＰＷＷＰ四肚染色质结台Ｒ。Ｃ端｛莅化区有１０个不同特性的基序，罗马数字表示酶结翰中的一些保守序划．１医结台甲墓供体即Ｓ一 腺茁甲硫氨酸（Ａ６０Ｍｅｌ）．ＩＶ区能够童ｉ＝ｉ台雇物胞嘧啶；４蜜蜂中Ｄｎｍｔ３的研究进展随着西方蜜蜂基因组的公布，科学家首次在昆虫中拉现了一个完善的功能性ＤＮＡ甲基化系统”习３【。蜜蜂拥有３种ＤＮＡ甲基化转移酶．分别是Ｄｒｔｍｔｌ，Ｄｎｍｔ２和Ｄｎｍｌ３，与哺乳动物的ＤＮＡ甲基化转移酶非常相似，同源性高１３２，３４ Ｊ。ＤＮＡ甲基化在 意蜂基因组进化上确关键性的作用．与重要的发育过程有关．其中包括级型分化口ｏ”】。 Ｋｕｅｈａｒｓｋｉ等利用显微注射和ＲＮＡ干扰技术抑制了Ｄｎｍｔ３基因的表达．经Ｄｎｍｔ３ ｓｉＲＮＡ处理过的蜜蜂幼虫大多数发育成具有成熟卵巢的蜂王，其卵巢管数与蜂群中自 然发育的处女蜂王无显著差别ｐ“。Ｓｈｉ等通过人工饲喂蜜蜂雌性幼虫．发现随着蜂王 浆饲喂量的增加幼虫头部Ｄｎｍｔ３ ｍＲＮＡ相对表达量显著下降，蜜蜂朝着蜂王方向发 育口”。石元元等通过对３日龄的蜜蜂雌性幼虫人工注射Ｄｒａｎｌ３ ｓｉＲＮＡ．使其Ｄｎｍｔ３表 选沉默，测定出房蜜蜂的形态指标，发现幼虫也显著朝着蜂王方同发育【３”。５ ＩｌｌｕｍｉｎａＲＮＡ测序技术转录组是特定组织或细胞在某一功能状态或发育阶段下转录出来的所有ＲＮＡ的 集合。主要包括ｍＲＮＡ和非编码ＲＮＡ（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ．ｎｅＲＮＡ）。整个转录组分析的 如起始位点５‘ 主要目的是：①对所有的转录产物进行分类；②确定基因的转录结构及３味端．剪接模式和其他转录后修饰：③量化各转录本在发育过程中和不同条件下表达水平的变化”¨…。ｌｌｌｕｍｉｎａＲＮＡ测序，即ＲＮＡ测序又称转录组删序，是近几年发展起来的一种高通量测序技术进行转录组分析ｏ”，这种测序技术首先是将细胞中的所有转录产物反转 录为ｅＤＮＡ文库｜４”．然后将ｅＤＮＡ文库中的ＤＮＡ随机剪切为小片段（或将ＲＮＡ片 段化后再反转录１，可产生成千上万的短ｃＤＮＡ ｒｅａｄｓ。用参考基因组校对这些短ｒｅａｄｓ， 或无参考基因组时组装他们从头合成，从而获得包括转录结构和每个基因的表达水平 的基因组转录图谱ｍ】。该技术能够在单核苷酸水平对任何物种的整体转录活性进行检 测，对转录本的结构和表达水平进行分析．也能检测到未知转录本和稀有转录本，精确地识别ｃＳＮＰ（编码序列单核苷酸多态性）和可变剪切位点，提供更为全面的转录组 信息１４”。Ｉｌｌｕｍｉｎａ的测序数据具有高度的重复性，技术的变化相对较小。在许多生物体中这种技术已广泛的用于从头组装，例如白粉虱Ｈ、褐粉虱㈤、紫衫『４５】和巴西橡胶…。 已被用来准确地监测酵母减数分裂Ｍ、酵母营养生长㈣、白粉虱发育过程㈣和小鼠胚胎干细胞分化Ｈ‘Ｉ期间的基因表达，来追踪发育过程中基因表达的变化，并提供不同中华蜜蜂转录纽剥序厦雌性蜜蜂基固表选分析组织之间基因差异表达的“数字化测量一 ６ＤＧＥ ＤＧＥ即数字基因表达谱，新近开发的一种重要基因表达分析方法，也是基于第 二代高通量测序技术，它是基于标签的转录组溯序方法，产生短的原始标签，使用内 切核酸酶在每个ｍＲＮＡ分子３。来端产生２１ ｂｐ的标签（特异性标已该基因）；后通过高 通量测序技术产生许多标签序列．不同标签序列的数目就代表了相应基因的表达水 平。通过生物信息学分析得到标签代表的基因、基因表达水平、及样品间基因表达差 异等信息。样品中几乎所有基因的表选水平都可通过每个基因的单个ｍＲ．ＮＡ分子的 计数统计来确定；与ＲＮＡ―ｓｅｑ相比．ＤＧＥ更适合于基因图谱的比较。这两种技术已 经在转录组图谱上进行各种应用的研究，包括细胞发育，癌症．各种生物体的免疫防 御ｐ“”】。ＤＧＥ也已用于蜜蜂营养学及行为学的研究．获得多种有关蜜蜂的ＤＧＥ数掘 库一。。６１。除蜜蜂外，在其他社会性膜翅类昆虫间也已经进行基因表达差异分析的研究， 包括熊蜂ｌ”Ｉ，蚂蚁眦”Ｊ。７本论文的研究内容本研究，用Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＮＡ测序技术构建了中蜂工蝗ｃＤＮＡ文库，获得高质量的短ｒｅａｄｓ序列。这些短ｒｅａｄｓ组装成ｕｎｉｇｅｎｅｓ和在没有基因组参考的前提下通过同源 性比对进行注释。获得丁蜂王和工蜂的ＤＧＥ数据库并比较了它们之间的基因表达图 谱。还以中蜂为实验材料，对Ｄｒｕ－ｎ１３基因进行克隆及测芹．并比较不同发育时期工 蜂和蜂王头部Ｄｎｍｔ３基因ｍＲＮＡ的相对表达量。所有的数据和结果将提供一种途径 去识别中蜂新的功能基因和为蜂王与工蜂级型分化的分子生物学研究提供有用的信 息。开展本项研究，不仅是对传统中蜂生物学内容的突破和创新，而且对保护、开发 和利用我国中蜂这一宝贵资源，有望提供新思路与方法。第二章中华蜜蜂转录组刹序和数字基因表速谱分析第二章中华蜜蜂转录组测序和数字基因表达谱分析 １引言中蜂在其经济上有重要作用．但是中蜂的基因维信息还没有公布。目前，在ＮＣＢＩ 数掘库中仅有１２４个中蜂ｍＲＮＡ序列，这些不足以实现对中蜂功能基因的研究。因 此，获得更多的转录组和基因表达信息对中蜂基因功能及生物学机制的研究是至关重要的。本研究以中蜂为材料．用Ｉｌｉｕｍ／ｈａ ＲＮＡ测序技术进行转录纽测序，并通过ＤＧＥ 方法分析比较中蜂蜂王和工蜂的基因表达差异，２材料与方法２．１实验材料２１１实验蜂群 取自江西农业大学蜜蜂研究所饲养的中蜂。分别取３日龄工蜂幼虫．３日龄工蜂 蛹，刚出房的成年工蜂，哺育蜂（头部不断的伸入巢房中，并且巢房中有幼虫１和采 集蜂（在巢房门口收集腿部带有花粉粒的蜜蜂）各作为一个样品。每个样品单独提取 总的ＲＮＡ，后台并为一个样品用于转录组测序。再分别提取５只刚出房的工蜂和蜂 王的总ＲＮＡ．用于ＤＧＥ删｜芋。 ２．１．２实验器材及试剂Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ７”２０００系统和Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｓｔａｔｉｏｎ．Ｒｅａｌ―Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓ、，ｓｔｅｍ，Ｓｏｌｅｘａ测亭芯片【ｆｌｏｗｃｅｌｌ）和ｌｌｌｕｍｉｎａＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓａｍｐｌｅ ＰｒｅｐＫｉｔ．ＱｉａＱｕｉｃｋ ＰＣＲ 试剂盒，分裂缓冲液（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）．Ｍ－ＭＬＶ反转录酶及ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ】荧 光定量试剂。２．２实验方法２．２．１创建ＣＤＮＡ文库和转录组序列用ＳＶ总ＲＮＡ分离系统分别提取５个中蜂样品的总ＲＮＡ，将５个ＲＮＡ样品台 并为一个样品（每个时期取相同质量的ＲＮＡ）用于转录组测序及获得尽可能多的基因表达信息。根据ｌｌｌｕｍｉｎａ设计说明把２０ｕｇ ＲＮＡ用带有Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）的磁珠纯化获得ＲＮＡ＋ｐｏｌｙ（Ａ）。纯化的ｍＲＮＡ在高温下（即９４℃５分钟）用ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ裂解成短片段。以ｍＲＮＡ为模板．用六碱基随机引物和反转录酶合成第一链ｅＤＮＡ。后加入缓冲液，ＲｎａｓｅＨ，ｄＮＴＰｓ和ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ５１合成第二链ｃＤＮＡ。用ＱｉａＱｕｉｃｋ中华蜜蜂转最姐州序厦雌性蜜蜂基固表速分析ＰＣＲ提取试剂盒对这些短片段进行纯化、加ＥＢ缓冲液洗脱后进行米端修复、加ｐｏｌｙ（Ａ） 尾巴和连接铡序接头．然后用琼脂糖凝胶电泳对片段大小进行选择，最后进行ＰＣＲ 扩增，ＰＣＲ产物用ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ纯化试剂盒进行纯化获得最终的ＣＤＮＡ文库，建好的测序文库用Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑｍ‘２０００（１ｌｌｕｍｉｎａ ｌｎｃ．ＳａｎＤｉｅｇｏ ＣＡ．ＵＳＡ）进行测序．片段大小大约在２００如（图２，Ｉ）。测序过程中，质量胜过产量，小片段（２００－５００ｂｐ） 直上】８万尽量缩小波动范围，Ｑ２０（０２０表示过滤后质量不低于２０的碱基的比例， 泼参数反映总体质量情况）都应高于８０％。图２－１转录组铡序实验流程Ｆｉｇ ２－Ｉ ＰｉｐｅＩｉｎｅ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅａｔｓｏｆｄｅｎｏｖｏｔｍｓｃｒｉｐｔｏｍｅａｓｓｅｍｂｌｙ第二章中华蜜蜂转最组测序和数字基固表连谱分析２．２．２ｌｌｌｕｍｉｎａ序列结果的分析藿量嘲能显著牲富集分析ｒ――――一曲出”ｑ愠著性富集分蚓圈２－２信息分析流程Ｆｉｇ ２－２Ｐｉｐｅｔｉｎｅ ｏｆｂｌｏｌｎｆｏｒｍａｆｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ测序得到的原始图像数掘经读取删审峰图（Ｂａｓｅ ｃａｌｌｉｎｇ通过分析测｜芋峰图文件． 读取ＤＮＡ碱基序列信息以及各个碱基的测序质量）转化为序列数据（图！一２）．即 原始ｒｅａｄｓ或原始数据．结果以ｆａｓｌｑ文件格式存储，此文件为得到的撮原始文件．里 面存储ｒｅａｄｓ的亭列以及ｒｏａｄｓ的测亭质量。结果中每个ｒｅａｄ都由四行来描述： ＠ｒｅａｄＩＤＴＯＧＣＧＧＡＧＧＧＡＴＴＴＧＡＡＣＣＣｂｂｂｂｂｂｂｂａｈｂｂｂｂｂｂｂｂｂｂ第１行与第３行是其序列名称（为节省存储空间常省略第三行“斗‘后面的序列名 称）：第２行是ｒｅａｄｓ序列；第４行是ｒｅａｄｓ序列的测序质量，其中的每个字符相对应 于第２行的碱基．每个字符对应的ＡＳＣＩＩ值减去“，即为对应的该碱基的测序质量 值，比如ｈ对应的ＡＳＣＩＩ值为１０４，那幺其对应的碱基质量值是４０。从ＩｌｌｕｍｉｎａＧＡＰｉｐｅｌｉｎｅ ｖｌ ６开始．碱基质量值范围为０到４０。在进行生物学信息分析之前，这些原始数据经过数据过滤，数据处理的步骤如下： 去除Ｎ的比例大于５％的ｒｅａｄｓ，去除只台接头的ｒｅａｄｓ．去除低质量ｒｅａｄｓ／质量值０１１０ 的碱基数占整个ｒｅａｄｓ的２０％以上）。我们使用短ｒｅａｄｓ组装软件Ｔｒｉｎｈ｝，…做转录组从头纽装，ＴｆｉｎＪ寸首先将具有一定长度重叠片段的ｒｅａｄｓ连成更长的片段，通过这些ｒｅａｄｓ重叠关系获得的不古Ｎ的组 装片段称之为Ｃｏｎｔｉｇ。然后，我们将ｒｅａｄｓ比对回Ｃｏｎｔｉｇ，通过ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｒｅａｄｓ能确定来自同一转录本的不同Ｃｏｎｔｉｇ以及这些Ｃｏｎｔｉｇ之间的距离，Ｔｒｉｎｉｔｙ再将这些Ｃｏｎｔｉｇ 进一步通过ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｒｅａｄｓ连在一起．最后得到台Ｎ撮少，两端不能再延长的序列．我们称之为Ｕｒｆｉｇｅｎｅ（髑２－３）。中华蜜蜂转录姐别序厦雌性蜜蜂基因表这分析……ｒ…：；…＝：…一ＩＦｉｅ２－３｛兰；÷善掣“＂二兰；兰：．望…∞２―Ｕｍ口口ｎＢ｛差塑一…一，！竺：竺”Ｃｏ“ｎ”ｔｉｆｌ｛；呈２ｅａｄｓ［一一，Ｉ‰……Ⅷ。｛＾ｓ５ｅｍ“…ｎｇ㈣ｎ日。ｎｃ酉２－３短鞋步骤圈Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｐｒｏｃｅｓｓＳｗｉＳＳ．Ｐｉｎｔ，Ｎｒ是两个著名的蛋白数掘库，其中ＳｗｉＳＳ―Ｐｒｏｔ是经过严格筛选去冗 余的。ＣＯＧ是对基因产物进行直系同源分类的数据库，假定每个ＣＯＧ蛋白都来自祖 先蛋白，ＣＯＧ数据库是基于真核生物、藻类、细菌具有完整基固组的编码蛋白、系 统进化关系而进行构建的。ＫＥＧＧ数据库是系统分析基因产物的功能以及这些基因产 物在细胞中的代谢途径的数据库，可以用ＫＥＧＧ进一步来研究基因在生物学上的复 杂行为。我们能根据ＫＥＧＧ注释信息进一步得到Ｕｎｉｇｅｎｅ的Ｐａｔｈｗａｙ注释。 将Ｕｎｉｇｅｎｅ序列与蛋白数据章Ｉｌｌ＂、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｌ、ＣＯＧ和ＫＥＧＧ做ｂｌａｓｔｘ比对（Ｅ 值（】０４），取比对结果最好的蛋白来确定Ｕｍｇｅｎｅ的序列方向；如果不同数据库之问 的比对结果相互矛盾，则按ｎｒ、Ｓｗｉｓｓ―Ｐｍｔ、ＫＥＧＧ和ＣＯＧ的优先级来确定Ｕｎｉｇｅｎｅ 的序列方向，跟以上四个数据库都比对不上的Ｕｎｉｇｅｎｅ我们用软件ＥＳＴＳｃａｎｌ６Ｉ］确定序 列的方向和它的编码区。对于能确定序列方向的Ｕｎｉｇｅｎｅ我们给出其从５＋到３。方向的 序列，对于无法确定序列方向的Ｕｎｉｇｅｎｅ我们给出组装软件得到的序列。组装后．将 Ｕｎｉｇｅｎｅ序列通过ｂｌａｓｔｘ比对到虽白数据库ｎｒ、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ、ＣＯＧ和ＫＥＧＧ（Ｅ值（１０４）． 从而获得￡Ｅ给定的Ｕｎｉｇｃｎｅ具有虽高序列相似性的蛋白，进一步得到该ｕｎｉｇｅｎｅ的蛋 白功能注释信息。我们根据ｎｒ注释信息，使用Ｂｉａｓｔ２ＧＯ软件ｍ“得到Ｕｎｉｇｅｎｅ的Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ．（简称ＧＯ）注释信息。ＧＯ来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。 得§ｑ每个Ｕｎｉｇｃｎｅ的ＧＯ注释后，用ＷＥＧＯ软件１６”对所有Ｕｎｉｇｅｎｅ做ＧＯ功能分类统计，ＧＯ总共有三个ｏｎｔｏｌｏｇｙ，分别描述基因的分子功能、细胞组分、参与的生物过程，进而从宏观上认识该物种的基固功能分布特征。 ２．２．３创建ＤＧＥ文库并测序 用ｓＶ总ＲＮＡ分解系统分９０提取１日龄工蜂和１日龄蜂王样品的总ＲＮＡ。把６Ｐｇ总ＲＮＡ用带有ｏ［ｉｇｏ（ｄＴ）磁珠吸附纯化获得ＲＮＡ＋ｐｏｌｙ（Ａ）ｔ并以引物ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）７３１导 反转录合成双链ｅＤＮＡ。ＮｌａＩｌｌ识别并切断ｃＤＮＡ的ＣＡＴＧ位点，利用磁珠沉淀纯化第二章中华蜜蜂转录组ａ４序和数字基因表连谱分析带订ｅＤＮＡ３’端的片段，将其５’木端连接ｌｌｌｔｍｆｉｎａ接头ｌ。ｌｌｌｕｍｉｎａ接头１与ＣＡＴＧ位 点Ｉ；｜（】结合处楚Ｍｍｅｌ １；｜勺识别位点，Ｍｒｎｅｌ是一种识别何点与酶切位点外离的内切酶，脯切ＣＡＴＧ Ｆ游的１７ｎｔ片段，产生乜禽ｌｌｌｕｍｉｎａ接头¨手列的Ｔａｇ。通过磁珠沉淀上掉３懈段历，在Ｔａ９３＋术端连接Ｉｌｌｕｍｉｎａ接头２，从啊获得两端连有不同接头序列的 ２１ｂｐ标档文阼。再加入引物ｐｒｉｍｅｄ和面Ｆｉｌｅｒ ２避行ＰＣＲ扩增。经过ＰＣＲ线性扩增（１ ５个循环）后。通过６％ＴＢＥ琼脂糖凝腔电泳纯化９５ｂｐ的条带。解链后，单链分Ｆ被加到ｌｌｌｕｍｉｎａ测序芯片Ｌ掉嘲定，每条分子经过原位扩增后成为‘个单分子簇测 序模板，加入４也佚光标记的４种核苷酸后，采用边台成边测序洼（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ的测序读ｋ为４９ｂｐ。ｂｙｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ＳＢＳ）进行测序（图２－４）。每个通道将产＿＿Ｉ三成干卜盯条臆始ｒｅａｄ．缚条ｒｅａｄ．１１’ａｆ’ｍ…ｔ?…ｏ…４ｔＮｌａｍ■㈣‘――∞＊＿＿＿ｇ∞－＿＿－＿－－－－－－。＿．一ｆｌｌＪ……ｌ?砩ｔ。ｒ．墨＝＝＝＝＝＝＝＝：―●Ｉ……ｆⅫ＊?．ｉ！ｉ型＝＝墨＝：？纱Ｉ’％２０ｌ岫…二＝＝＝＝暨盈ｇ匦图ｌｌ………， 岫－ｍ ｚ＝＝＝盏２夏至自固～。一图２－４Ｔａｇ制备的原理和步骤Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｆｔａｇ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ一Ｕｍｍ一…一一ｃｒｔ２．２．４ＤＧＥ洲序文库与参考转录组数据库比对分析 删序甜到的原始图像数把经瘦取测序峰阁转化为序列数据，称之为原始数据或原始ｒｅａｄｓ，结果以ｆａｓｔｑ文件格式存储。驻面存储ｒｅａｄｓ的序列以及ｒｅａｄｓ的测序质量。啡个ｒｅａｄ山叫行描述： 国Ｂ８１６５ＭＡＢＸＸ：８：】：２４９０：２１２６＃ＮＮＮＮＮＮＮＮ／Ｉ ＴＴＴＣＣＣＣｌＴｒＴＡＴＧＡＡＧＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣｒ广ｒＧＡ ｆｄｆｆｆｄｅｅｆｆｄｅｄｄｋｃｂｅａｄｅａｄｄｋｃｃｃｃｃｃｃｃｄｄｄｄｃｂ”ｂ、ａ每个序列ｊｔ有４行．第１行与第３行魁序列名称：第２行足序列：第４行是序列中华蜜蜂转录组剥序厦雌性蜜蜂基因表达分析的测序质量，每个字母对麻辣２行每个减基，辞个字母对应的ＡＳＣＩＩ值减出６４，戡ｌ 为峨碱基的测序质量值．比如ｃ对应的ＡＳＣＩＩ值为９９，那么其对应的碱摹质量值是 ３５。１１］ｕｍｉｎａ碱基质量值范幽为２到３５。 原始序列带有一段３’接头序列，并Ｈ禽有少量低质量序列以及各种杂质成分， 原始序列数据需经过去除杂质后得到可供测序的序列。数据库的原始数据通过去除空 载ｒｅａｄｓ（只禽３。接头而找不§Ⅱ标签序列的ｒｅａｄｓ）、去除３’接头序列（由于标签强 有２Ｉｎｔ而测序ｒｅａｄ长度为４９ｎ１．原始ｒｅａｄ上带有一段３．接头序列），去除低质量 标签（台有未知碱基Ｎ的Ｔａｇ）、去除睦度ｋｔｄ，Ｒ大的Ｔａｇ，取比变为２Ｉｎｔ的Ｔａｇ、 去除拷凡数为ｌ的Ｔａｇ‘可能是测序错误），从而获得包台ＣＡＴＧ的２１ ｂＤ标签序列 的ＣｌｅａｎＴａｇ，用于信息分析（图２－５）。Ｃｌｅａｎ Ｔａｇｓ数捌中，Ｔａｇｓ的拷贝数反映了相 应毓Ｉ司的表达量，其分布统计可以从整体Ｌ评估数｛５ｊ】是甭一常。 根据组装的中蜂转录本序列数槲库．利用软件检索ｍＲＮＡ上所有的ＣＡＴＧ位＾， 生成ＣＡＴＧ＋ＩＴｏｐ的参考标签数据阼馥ｌ后将全部Ｃｌｅａｎ Ｔａｇ与参考标箍数据库进行 比对．最多允许一个碱雉错配，对唯。比对到一个肇凼的标签（ＵｎａｍｂｉｇｕｏｕｓＴａｇｓ）进行螭Ｉ虱，ｌ释，统汁每个基田对应的原始ＣｌｅａｎＴａｇ数，然后对原始ＣｌｅａｎＴａｇ数做标 准化（ＴＰＭ，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ＰｅｒＭｉｌｌｉｏｎ ｃｌｅａｎｔａｇｓ）处理，ＴＰＭ是一个标准化的指标，指每一百万ｃｌｅａｎ ｔａｇ中包青该种转采本的拷虬数。标准化方法为：每个基因包含的原始ＣｌｅａｎＴａｇ数／该样本中总ｃｌｅａｎ Ｔａｇ数＋１，０００，０００．获得标准化的基因表达量。从而更准 确、科学地衡量基因的袭达水平。Ｌ―．――。―――，―。―――――――Ｊ‘――――――――――――――――――――――――――――一图２－５数字化基因表达谱信息分析游程Ｆｉ９２－５ Ｐｒｏｃｅｄｕｍｏｆｂｉｏｉａｆｏｒｍａｌｉｃｓａｎａｌ：ｅｓｌｓｆｏｒ ｄｉｇｉｌａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｗｌｉｎｇｒ――――――――――――――――――］ｒ―――――――――一――一 ∞功能显著性富集分析卜＿――Ｌ――＋肚曲啪ｙ显著性富集分析ｌ２．２．５差异表达基因的筛选及功能注释 统计分十斤蜂王和工蜂的数榭库－ｐ差异表达基冈。根据Ａｕｄｉｃｌ６４Ｉ等描述的数字化基 圜隶达谱差异基因检测方法，筛选两样奉恒ｌ的羲肄表选基囡。去统计分析斑每个ＤＧＥＬ。 ‘―。 ’。 。 ‘’。 。 。 ’。 ’。 。 。 。一１原始数据ＩＪＴａｇ表达量及分布统计卜――――丁－―――＿１测序饱和度分析Ｉ．－－－－―－－．．．．．．－－－－－―．．．．！！．－－．－－．．．．．．．．―－一 匿因注释、标准例―．，－－－－－－－－．．－－，：－－－－－－－－－一 ＪＣｌ，ｗ，ｍｔａｇ数据ｌｒ―――――１一．．．．．．．．．．，．．．．』――『差异表选基因筛选Ｉ第二章中华蜜蜂转录姐刹序和敷字基因表连谱分析数掘库的标签频率。在多重假设检验校正和分析中ＦＤＲ（ＦａｌｓｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｒａｔｅ）被用 束确定Ｐ值的域值。 假设观测到某基因对应的ｃｌｅａｎ标签数为ｘ，已知在文库中，每个基因的表达量 只占所有基因表达量的一小部分，在此情况下，Ｄ（ｘ１的分布服从泊松分布：ｐＩｒ?＝！≠（，为基因Ａ的真实转录数）已知，样本一总ｃｌｅａｎ标签数为Ｎｌ，样本二总ｃｌｅａｎ标签数为Ｎ２，菜基因Ａ在 样本一中对应的ｃｌｅａｎ数为ｘ，在样本二中对应的ｃｌｅａｎ数为ｙ，则此基因Ａ在两样本 中表达量相等的概率由以下公式来计算：二＝爿‘』， 或２ｒ（１―＝ｐ（：，０柚叫÷≥神）蚀口果二ｐ（：曲＞ｏ．ｓ）ｆｘ一１、’假设挑选了Ｍ个差异表达基因，其中０个是真正有差异表达的基因，另外Ｎ个 是其实没有差异表达的基因，为假阳性。锗误比例Ｓ＝Ｎ／Ｍ平均而言不应超过某个临 界值，在统计时预先设定其ＦＤＲ值不能超过】％１６”。在获得差异检验的ＦＤＲ值时， 我们也根据基因的表达量（ＲＰＫＭ值）计算此基因在不同样本问的差异表达倍数。差 异倍数越犬．ＦＤＲ值越小，就表明表达差异越显著。在此分析中，差异表达基因被 定义为ＦＤＲ＜Ｉ％０且倍数差异在２倍咀上（古２倍）的基因。获得的差异表达基囡进～步做ＧＯ和Ｋ０富集分析。Ｇｅｎｅ ＧｅｎｅＯｎｔｏ］ｏ舒）功能显著性富集分析 Ｏｎｔｏｌｏｇｙ．（简称ＧＯ）是一个国际标准化的基因功能分类体系，求全面描述生物体中基因和基因产物的属性。ＧＯ功能显著性富集分析，在差异表达基因中显著 富集的ＧＯ功能条目．进而给出这些差异表达基因与哪些生物学功能相关联。ＧＯ总 共有三个本体．分别描述基因的分子功能、所处的细胞位置、参与的生物过程。ＧＯ的基本单位是ｔｅｒｍ（词条、节点）．每个ｔｅ珊都对应～个属性。此分析首先把所有差异表达基因向ＧＯ数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｍｏｌｏｕｖ，ｏｒｇ！）的各ｔｅｒｍ映射，计算每 个ｔｅｒｍ的基因数，然后利用超几何检验．与整个基因组背景相比．找出在差异表达 基因中显著富集的ＧＯ条目．其计算公式为中华蜜蜂转录蛆剥序及雌性蛮蜂基固表这分析Ｐ１Ｉｌ～Ｍ，？１．Ｖ｝｝－一Ｍ，¨∑铷㈣其中ｔ Ｎ为基困组中具有ＧＯ注释的基因数目；ｎ为Ｎ中差异表达基圆的数目： Ｍ为基因组中注释为某特定ＧＯ［ｅｎ＇ｎ的基因数目：ｍ为注释为某特定ＧＯｔｅｒｍ的差 异表达基因数目。计算得到的Ｐ值利用Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ校正之后，以Ｐ值５０ ０５为阚值． 满足此条件的ＧＯ ｔｅｒｍ定义为在差异表达基因中显著富集的ＧＯ ｔｅｒｍ。通过ＧＯ功能 显著性富集分析能确定差异表达基因行使的主要生物学功能。ＫＥＧＧＰａｌｈｗａｙ显著性富集分析在生物体中，不同基因之Ｉ刈相互协调进而行使其生物学．基于Ｐａｔｈｗａｙ分析可有 助于更进一步了解其基因的生物学功能。ＫＥＧＧ是有关ｐａｔｈｗａｙ的主要公共数掘库 ｍＪ，Ｐａｔｈｗａｙ显著性富集分析是以ＫＥＧＧＰａｔｈｗａｙ为单位，应用超几何检验，与整个 基因组背景相比，找出在差异表达基因中显著性富集的Ｐａｔｈｗａｙ。该分析的计算公式 同ＧＯ功能显著性富集分析，在这里Ｎ为芯片中具有Ｐ越ｈｗａｙ注释的基因数目：ｎ为 Ｎ中差异表达基因的数目：Ｍ为芯片中注释为某特定Ｐａｔｈｗａｙ的基因数目：ｍ为注释 为某特定Ｐａｔｈｗａｙ的差异表达基因数目。ＦＤＲ＿＜０ ０５的Ｐａｔｈｗａｙ被定义为在差异表达 基因中显著富集的Ｐａｔｈｗａｙ。通过Ｐａｔｈｗａ）显著性富集能确定差异表达基因参与的最 主要信号转导途径和生化代谢途径。２．２．６ｑＲＴ－ＰＣＲ验证 提取１日龄蜂王和１日龄工蜂的总ＲＨＡ，用变性琼脂糖凝胶电泳监测其完整性．用紫外分光光度计检测ＲＮＡ浓度值和纯度ＯＤ２６０佗８０值（１８－２ ０之间）。ＲＮＡ样品（１ｐｇｍＩ）用于反转录。根据试剂盒说明用ＭＬＶ反转录酶合成ｅＤＮＡ。乒口ｏ，抽作为内参日［物ｎ”凄于保守ｔｕ、Ａｇｅｎｅｓ的氨基酸序列的ｑＰＣＲ引物用Ｐｒｉｍｅｒ反应条件：９４℃２ ｍｉＪＬ接着进行４０个循环循环条件：９４℃】５５．０软件台成。ｓ．６３℃３０ ｓ，７２。Ｃ ３０ｓ。每个样品的ＰＣＲ产物特异性用溶解曲线进行分析。ＰＣＲＯ々扩增效率通过标准曲线 的绘制获得（标准品为６个１０倍系列稀释的点）；对于每个ｕｎｉｇｅｎｅ有ｓ个生物学重复 （每个生物学重复包括３个技术重复）。每个样品的内参基因和目的ｕｎｉｇｅｎｅ在同一个 板上进行（消除板问的差异）。每个基因在样品中的相对表达量用以下公式计算；灿，／Ｒｏ．Ｒ；【生！Ｂ皇！（１＋Ｅ．）ｏ７Ｅ Ｒ＇内参基因的扩增效率，ＥＴ：目的基因的扩增效率，ＣＴ．Ｒ：内参基因的ＣＴ值，ｃＴＴ：目的基因的ＣＴ值。 为了标准化相对表达量，计算得来的ｍＲＮＡ表达数据先经过开方转换，再进第二章中华蜜蜂转录组＊博和数字基固表违谱分析｛丁Ｏｎｅ“ａ３ ＡＮＯＶＡ方差分析。３结果３．１Ｉｌｌｕｍｉｎａ铡序和序列组装通过｜ｌｌｕｍｉｎａ ＲＮＡ测序技术，莛获得５５．３０３．３３２原始他ａｄｓ（表２．Ｉ）。数据过滤后．获得５１．５８１．５１０ｃｌｅａｎｒｅａｄｓ累计长度为４．６４２．３３５ ９００ ｂｐ，进一步进行分析。Ｑ２０含量９７ ５５％．ＧＣ含量４１ ９２％。这些ｃｌｅａｎ ｒｅｄｓ组装成９９．２５０个ｃｏｎｔｉｇｓ．平 均长度３３２ ｂｐ。Ｃｏｎｔｉｇｓ的Ｎ５０是５１８ ｂ口。这些ｃｏｍｉｇｓ最终被组装成４６．９９９个ｕｎｉｇｅｎｅｓ，包括５．２４３种ｃ｝ｕｓｔｅｒｓ和４１ ７５６条不同的ｓｉｎｇｌｅｔｏｎｓ．平均长度６７６ ｂｐ， Ｕｎｉｇｅｎｅｓ的Ｎ５０是９９８ ｂｐ。组装出来的亭列长度是组装质量的一个评估标准。我们 对组装出来的Ｃｏｎｔｉｇ和Ｕｎｉｇｅｎｅ做一个长度分布统计，大小分布显示有９１ｊ４个ｕｎｉｇｅｎｅｓ长度超过丁１０００ｂｐ（图２－６）。 表２－１中蜂转录组敦据统计原始Ｉ瑚ｔｄｓ的总数量ｃｌｅａｎ ｃｌｅａｎ ５５ ３０３ ３３２ ５１．５８Ｉ ５１０ｒｅａ６ｓ的总数量ｒｅａｄｓ总的碱基数４．６４２．３３５．９００９７ ５５％Ｑ２０的百分比ＧＣ的百分比４Ｉ ９２％ ｃｏｍｉｇｓ的总数目９９．２５０ ３３２ｃｏｎｔｌｇｓ的平均长度ｅｏｎｔｉｇｓ的Ｎ５０５１８ｕｎｉｇｅｎｅｓ的总数目４６．９９９蚰ｊｇ∞蚪的平均长度ｕｎｉｇｅｎｅｓ的Ｎ５０ ｃｌｕｓｔｅｒｓ的种类６７６ ９９８ ５．２４３７５６ｓｉｎｇｌｅｔｏｎｓ的杂数４ｌ――――――――――――！兰里兰竺墨望兰！：坚苎’竺童竺垄里查兰坌堑、ｎ㈨－●‘＾【Ｊ－ｒ】ｐ‘。；”虻‰ＪＪＩＪＩⅢⅢⅢⅢｍ¨…ｃｎ‘ｔｊｌ２ｆ…“ｔＥＦｉｇ一。＝“…篙嚣…ｄｅ ｃｏｎｔｉｇｓ ａｎｄ２《Ｔ¨“酣ｄｉｓｔｄｂ㈣ｔｉ。ｆｔｈｅ ｎｏｖｏｍｍｂｌｙｆｏｒ图２南ｃｏｎｔｉｇｓ和ｕｎ嘻ｅｎｅｓ从头组装的长度分布ｕｎｉ∞ｓ３．２预测蛋白质的功能注释将ｕｎｌｌ。“。序列与ＮＲ、Ｓｗｉｓｓ－Ｐ埘、ＫＥＧＧ、ＧＯ和ＣＯＧ数据库做ｂｌａ呶比对（Ｅ俚…ｉ＜１０…４）－通过该方法，总共获得２４ ６３０ ｕｎｉｇｅｎｅｓ（所有ｕｎｉｇｅｎｅｓ的５２ ４％）符合ｂｌ‘ａｓｔｘ些翌譬蛋。！孳２－２）ｅ其中通过ＮＲ、Ｓｗｉｓｓ―Ｐｒｏｔ、ＫＥＧＧ、ＧＯ和ＣＯＧ数菇莓菇对到 的结果分别是２４００１（５１０７％），１ ８１３８（３８ ５９％】．１５６０７（３３２】％）８０６４ｆ１７１６％）。和。７８…６０―ｉｉ――＝０坚生塑型竺型塑ｓ＿ 数据库 注释㈣ｉｇｅ ｅｓ的数日注释ｕｎ．ｇ。。。－鬲吾石瓦～行分类。基乏壹型同源性，８０６４ ｕｎｉｇｅｎｅｓ被分成三大主要类别共有５７个功磊孬。；昔 ２出－７）．，：Ｇｏ竺苎的三大主要类别（参与的生物过程，细胞组分和分子功能）；：。磊… 璺篓孽：■：：眢竺？翼“分子键联”关系分别占主导地位。同时我们也发现代谢过≤、；”ｊ―鼍ｉ五五ｉ―等等＿：―――一型！丝 卜，、篓据兰曼篓曼璺得到ＧＯ功能注释。ＧＯ分类是对磊面磊再面虿ｉ忑品＝‘酉历能进胞组分和催化活性的基因也占有很高的比例。第二章中华蜜蜂转录组测序和教字基因表达谱分祈口㈣≈ｅ■ｔⅧＨ凰２―７Ｆｉｇ ２－７＊＋９＆ｕｎｉｇｅｎ龅的ＧＯ分类ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆｔｈｅ ｕｎｉｇｅｎｅｓ＾迎纵罐杯表１；扯禁特定功能分类中ｕｎｉｇｅｎｅｓ所Ｉ ｏ】的比例，ｔ一边纵坐札发小住袋一竹类－１，ｔｉｆｆ嘶ｎｅｓ的牡…数Ｈ。ＴｈｅｌｅＲｙ－ａｘｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃａｔｅｇｏｒｙ ｏｆｕｎｉｇｅｎｅｓｉｎｔｈａｔａｍａｉｎ ｃａｔｅｇｏｒｙＴｈｅｆｉｇｈｔ ｙ－ａｘｉｓｉｎｄｉｃｍｅｓｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｏｆｇｅｎｅｓｉｎｃａｔｅｇｏｒｙＨ１ ＣＯＧ搜索这屿有ｔｉ：释序列的攮因。已注解的２４，６３０ｕｎｉｇｅｎｅｓ巾有７８６０ｕｎｉｇｅｎｅｓ柯ＣＯＧ分类（翻２―８）。这些ｕｎｉｇｅｎｅｓ婵有２５个ＣＯＧ分类，其中罐人群体楚～般助能预测”（３１９８），萁次址“转求”（１５４０），“复制．重组和修复“（１４６８）．“翻阵，核糖 体结构车¨’１：物起源”（１４４２），然而核结构（６）、真核细胞们细胞外结构（２４）嗣Ｉ ＲＮＡ的加川ｊ修饰ｒ７８惺最小的英群。ｉ；驰＾日ＣＤ㈨Ⅲ＾―∞ ㈨■…ｅＦ― Ｃ自ｅ■Ⅲ∞ｗ∞ｍ― Ｏ“ｍ∞…■…Ｈ～ｑ ￡……ｍ ……“ｍ●目～ ｃ■―…… ｃ∞…ｍ―ｍ ……Ⅲ～ｍ Ｊ…自＆…●日口日■一 Ｌ～…ｆ∞■ ¨㈣ｂ目一 ０晰■㈣，…ｄ■＿一 Ｐ㈣…ｍ自～ Ｏ“∞枷嗍■＊Ｐ…… Ｒｈ…¨ ｝…¨∞＿ｏＨＨｎ■口口ｂ却…ｍ№Ｅ…ＪＫ…ＭＮ………功齄分类ｍ… ｕ㈣Ｈ■ｆｂＨ∞ａ…Ｈ…＂【ｍｊｄ＿一 ⅣＥ４’■＾■，■“Ａ蝌＊【Ｈ＋＊ｍｔＦｕｎｃｔｌｏｎＣｌａ铝０㈨ｔ№……图２｛ｕｎｉｇｅｎｅｓ的ＣＯＧ分类Ｆ《２－８ ＣＯＧ ｃｌ砸ｓｉｇｉｃａｆｉｏｎｏｆｔｈｅｕｎｉｇｅｎｅｓｌＳ中华蜜蜂转录组剥序殪雌性蜜蜂基固表速分析将中蜂２４，６３０已注解的ｔｍｉｇｅｎｅｓ序列比对到ＫＥＧＧ数掘库并做进一步注释。比 对到的１５６０７序列分为２４２条信号通路（附件１）。这些通路ｒ｜ｌ毋富集的是代谢途径 （１８８２），其次是细胞骨架的调Ｙｉ（６０３），肿瘤转移途径（５５７）和ＲＮＡ运输（５４２）。这些注 释为进一步研究ｔ”蜂中特殊的发行、功能和途径提供有价值的资源。３．３ＤＧＥ标签测序文库分别构建中蜂峰王和工蜂们ＤＧＥ文库片通过Ｉｌｌｕｍｉｎａ基因表达测序法删序，获得了大约６柚５７，３１０和５．７５７，００６个麒始Ｔａｇ。过滤掉低质最标签后，每个数据库牧得 的总ｃｌｅａｎ Ｔａｇ数是５．９６２，７３５和５，６６３，９５２个（表２－３），这些ｃｌｅａｎ Ｔａｇ分别占原始 Ｔａｇ的９８“％和９８．３８％（圈２－９）。在ｃｌｅａｎＴａｇ中．能够比对到参考ｕｎｉｇｅｎｅｓ序列 的数闷是３．７７０，３２３和３，９５８．６０３个，分别占６３ ２３％和６９ ８９％。拷贝数大ｒ １００的 ｃｌｅａｎＴａｇ所占的比例超过了８４％，而ｃｌｅａｎＴａｇ种类的分布不超过７％．相反．拷贝数 在２和５乏问的ｃｌｅａｎＴａｇ种类的分巾比较广（崮２－１０）。――坠坐丝型ｉｆ－！！！鲤！幽！卿监――一表２ｄ ＤＧＥ序列统计笨二章中华蜜蜂转录衄剥片和敷字基因袁达谱疗哳Ｄ｝，ｍｂｕｔｉｏｎａｆ＂＾ｏｒＡ Ｄｕｄｎｆｔ Ｔ＿＂目Ｆｉｇ ２?９ ｉｎ Ａ；麟糕烈享－；蕊糕粼：！勰㈣蛳％☆“１ ：２品黼懿０黜私：ｙ■－Ｃ蕊㈣ｔＴｈｅ国２－９每个样品中不同类鹏的标签在腻始ｔａｇ中的分靠Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆｒａｗｔａｇｓｏｖｅｒ ｄｉｆ％ｒｃｎｔｔａｇ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓｉｎ ｅａｃｈ ｓａｍｐｌｅ禽求且】碱塾的杯箍．只禽接头的序列，拷叽数小］：２ｆｎ标签和Ｊ驻始序列｝５【姑经过上昧尔质Ｊ ａｊ 褂划的ｃｌｅａｎ粕、笠所Ｉｉ【的比例。括号内的数字表示ｎ总的原始标签中罐个类刊的杯锭所ｒ‘Ｉｆｎ白分【匕。Ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ ｏｆｔａｇｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｒ４．ａｄａｐｍｒｓ．ａｔａｇ ｃｏｐｙ ｒｎ＝ｍｐｅｅ＜２ ａｎｄ ｃｌｅａｎｔａｇｓｎｕｍｈｅｃｓｐａｒｅｎｔｈｅｓｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｇｅ『ｃｅｎｔａｇｅ ｏｆｃａｃｈｔｙｐｅ ｏｆｔａｇ ａｍｏｎｇｔｈｅｔｏｔａｌ ｒａｗｔａｇｓ嗍ｍ岫“袖＾ＡＴ眦ｍｃＩ…ＴａＤ“∞ｈｕ‘…㈣ＰｐＡ％ｄＭ‘ｃｋ∞Ｔ’口▲酬｜｜｛；嚣㈨ｍｍ“…＾ＴａｌａｌＣｌａｎ一糕一惭¨¨ｍⅫ蝴¨Ｔ＊‰蘸徽 兮。～兮Ｆ呕２－ｔＯＴｏｔａｌ Ｃｌｅａｎ＝糕一＿羞¨∞％哺蚍¨ｅａｃｈ ｓａｍｐｌｅ圈２．１０每个样品中不同类型的标签在ＣｌｅａｎＴａｇｓ中的分布Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｒｃｋ趼罐ｓｏｗｒｄｉｆｆｅｒｅｍ‘ａｇ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓｉｎＴａｇｓ丧１ｉ所有Ｃｌｅａｎ Ｔａｇｓ的总数：ＤｉｓｔｉｎｃｔＣｌｅａｎＴａｇｓ表示所有Ｃｌｅａｎ Ｔａｇｓ的种类。盘方括时内的数字表示某一特定种粪标箍的拷口Ｉ数的范隔。在括弧山的数字表示在这一类圳。”杯档的总个数＿及Ｉ‘Ｉ的比例，Ｎｕｍｂｅｒｓｉｎｔｈｅｓｑｕａｒｅ ｂｒａｃｋｅｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓｆｏｒａｉｎ ｔｈａｉ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃａｔｅｇｏｒｙ ｏｆｒａｇｅ Ｎｕｍｂｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｒｅｎｔｈｅｓｅｓ ｓｈｏｗ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆｔａｇｓ ｃａｔｃｇｏｒｙ１７―――――――――――主兰童兰堕墨垫塑苎些！竺苎！查苎坌堑表达谱测序饱和度分析用ｆ检盘检测到的基因数Ｈ是否随着测序量（标签数量，Ｔ川。诅１…Ｔａ。ｇ Ｎ…ｕｍｂｅｒ）的增加而增加。如图２一Ｉ Ｉ所水．当两数据库的澜４序量达到接近３刚?捡测到的基闻数目趋ｆ饱和。：４乜萼，；ｐ荤啦：警１姻１盎黧燃熟害慧，。Ｍ￡｛Ⅱ￡日ｍ“￥ｌ｛一Ｅ６ｂ≈ｌ‘１严一』酬厂一ｆ ’卜ｉ囊－。卜Ｉ―ｊ３?４ＤＧＥ标签数据库与参考标签数据库进行比对主篓量氅苎亨标签数据库（上述提到儿ｌｕｍｉｎａ序列）进行比对。首先通过转录磊赫荨 兰篓鉴获望牌４６，９９９个不问的ｕｎｉｇｅｎｅｓ嗬获得５９．７６２个明确的参考标箍ｆ；！｜】荔；谋蒜 蝥掣库。在蜂正和中蜂ＤＧＥ标箍数掘库ｒｐ分别扶得了７８，７７３和７７，８４３种ｃ】ｅａｒｉ五；： 蛮？：曼箩警数掘库中能唯‘比对到个堪脚的标签大多越ＤＧＥ标签数据库中的关键 竺杯篓警亭们能ｆ！Ｊ：｜确的确定个转采牟。在蜂１：和Ｊ一蜂ＤＧＥ杯档数据库‘只，所暑。ｃｌ：二 ２６％和３６６０％能比刘到单一序列．其ｒＩ，大约中比对到ｕｎｉｇｅｎｅｓ的 １．８１ Ｉｒ义链ｔ另半比对到反义链（图２一１２）。总的ｃＩｅａｌｌＴａｇ的３６ ７７％承１。，，苎们通芒１Ｉｌｕｍｉｎａ基冈表达测序法构建了ｔ”蜂蜂】二和工蜂的ＤＧＥ标签数据库片１：！｜类粤３６３０ｌＩ磊即所箸第二章中华蛮蜂转录组目｛序和数字基固表选谱分析户；黪‰Ａ”＂．崦．ｆ………坤Ｃ”＂山Ⅱ吣脚ｔｈ■． １ｊ■Ｂ户霆嚣黧ｉ沌蓖漩№，ｋ“一…“４ⅫＤ…ｔ＇¨ｄ１∞１“”Ｐ吣‘‘…“～’…’耶～黔ｃｈ－’甲’。ｊ：：絮篙１：油批辨ｒ…、Ｉ斟２－１２Ｆｉｇ ２．１２。ｊ：嚣豁器１篇二恐；；甜”川“ＣｌｅａｎＴａｇｓ的比卅统计分析Ｓｔａｔｉｓｔｉｃ ａｎａＬｙｓｉｓ ｏｆＣｌｅａｎ Ｆａｇｓ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ囤２－Ｊ２中备项的含义如下轰：ＰＭ（Ｓｅｎｓｅｌ１ ｔａｇ－＞ｌ ｇｅｎｅ袭ｑ硫仝比对剑正义链的ｔａｐ．表示一个ｔａｇ比对刨一个丝田 农小个【ａｇ比对到多个毖眦Ｉ ｌａｇ－’ｎ ｇｅｎｅ１ＭＭ（Ｓｅｎｓｅ）＾：ｌＬ义链Ｌ１：；『Ｉｎｔ错配的Ｉａｇ 挺求完令比对到反义链ｎ勺１ａｇ 扯反义链Ｉ｝仃Ｉｎｔ错配的ｔａｇ个ｔａｇ比埘剑苹洲卦１个何胤 一个１ａｇ比对到麟Ｌｑ纠１多个何矬 舡雎Ｉｑ卦ｌ￡订ＪⅢ错删曲‘皑ＰＭ（ＡｎｔｉＳｅｎｓｅ、Ｉ ＭＭ【ＡｎｔｉＳｅｎｓｅｌＰＭ Ｇｅｎｏｍｅ ｌ ｉ雒。１ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ＰＭ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉ ｌａｇ－＞ｎ ｐｏｓｉｔｉｏｎＵｎｋｎｏｗ Ｔａｇ部没竹比对』．的‘ａｇ比对划线粒体 比盯ｉｌｆｆ『ｆ绿体３．５中蜂蜂王与工蜂问差异表达基因为了检测刚ｍ房的蜂王和：Ｌ蜂之刚的差异表达基因，我们擞捌Ａｕｄｉｃ等描述的 数字化基因表达谱差异螭闳检；ｌ｜ｌｌ方法，筛选两样本蜘的差异表达标签。在蜂ｊ?和工蜂 数榭库巾，总』≮检测到４１４个茇＿肆表达基删，蜂王与Ｊ蜂干Ｈ比有】８９个上调桀因和中华蜜蜂转录组剥序及雌性蜜蜂基因表达分析２２５个ｒ调基幽，其ｒｔ唷２１４个罐吲没有被注释或注释为“假定的蛋白“啡确定性蛋白“，即它们的功能还习；明确（图２，１３）。 用ＧＯ分类去对这些差异表达基因的功能进行分类。对于４１４个差异表达基心， 仪有７２个基因有ＧＯＩＤ并在三大主要类别叶ｌ被分为１７２个功能性群体（图２―１４）， ＧＯ分类的三大主要类别中，“细胞”，“起催化作＿｜＿｝ｊ的”．吖Ｅ谢过程”分别占主导地位。此外，在“生物学进程’’这一类别中，啊两个ｔｅｒｍ娃著性富集（Ｐ＜０．０５），然而祀、细胞组分”和“分子功能”类别中没有履著性富集的ｔｅｒｍ。 进一步研究这些差异表达基脚所涉及的生化调节途径，把这些差异表达基因与 ＫＥＧＧ数据库进行比对并与整个转蒙组数据库进行比较，４１４个不同表达的基因，１ｓ７ 个基岗有ＫＯ ＩＤ并被分类成１４０条途径，其中．１６条造径显著性富集．发现与代谢 调节逢｛¨；：有关的基因最富集。 矗：这些差异表达基【＾ｊ中．有许多Ｌ二经被报道称在蜂１二和工蜂ｔｐ有表达差异。卵黄 蛋Ｉ＇２（ＣＬ５１６１ Ｃｏｎｔｉ９１）．被报道足‘ｏ生虾沸Ｉ级Ｊｄ分化有关的芙键蛋白质［６８，６９Ｉ，在蜂ｌ 中是ｔ调的，具有高表达水平。Ｈｅｘｌｌ０（ＣＬ］１４３Ｃｏｎｔｉ９１）和Ｈｅｘ ７０ａ（ＣＬｌ６５３ ＣｏｎｒｉｇＩ） 也宵报道称足与社会性昆虫ｌ；ｆ】衅二Ｅ和』：蜂级型分化有天的重要凶ｆ－ｔ７０，７３１．在蜂ｑ｛?也 是Ｉ二调的。我们也发现报道的与蜜蜂纽型分化有关的其他基因，包括核糖体蛋白，细 胞包索Ｐ４５０、表皮蛋自””和气味站台蛋白等。我们技现６种核糖体蛋白肇崮（Ｕｎｉｇｅｎｅ３５５６３，Ｕｎｉｇｅｎｅ２４２２．Ｕｎｉｇｅｎｅｌ４８１６，Ｕｎｉｇｅｎｅ７１５８．Ｕｎｉｇｅｎｅ３４１６０．ａｎｄＣＬ３９１７，Ｃｏｎｔｌ９１）在工蜂中是上调的．３种细胞色素ｐ４５０基ｆ，ｆＩ（ＣＩＡ４８７ Ｕｎｉｇｅｎｅ３５２８７１在蜂王Ｌ｛＿ｌ是Ｌ渊的。（Ｕｎｉｇｅｎｃｌ６６９９，ＣＬ８１６ ＣｏｉｎｔｉｇＩ，ＣＬ７８２ｓＣｏｎｔｉ９１．Ｕｎｉｇｅｎｅ４０２５２．种表皮蛋白基因Ｃｏｎｔｉｇｌ，Ｕｎｉｇｅｎｅ６７５２．Ｕｎｉｇｃｎｅｌ５８５１）在蜂王和工 蜂中裘选差异显著，其中４种（ＣＬ８１６ Ｃｏｎｔｉ９１，ＣＬ７８２ Ｃｏｎｔｉ９１．Ｕｎｉｇｅｎｅ６７５２ Ｕｎｉｇｅｎｅｌ５８５１）在』蜂中是Ｌ调的，ｌ乖ｌ＇（Ｕｎｉｇｅｎｅｌ６６９９）在蜂壬中Ｌ谰。我们发现２种 气ｌ味结台蛋Ｉ＇１（Ｕｎｉｇｅｎｅｌ５２０２，Ｕｎｉｇｃｎｅｌ６６９４）≠ｔ！蜂王ｑ。上调的，１种信息索结合蛋白 ｌＵｎｉｇｅｎｅｌ５７９１）在工蜂、扣是ｌ二调的。除此２外．涉及氧化ｊ；；Ｅ原酶、线粒体基因和转运 蛋门的基因在蜂王和亡蜂中也有表达差异（表２＿４）。∞ｉ；删７ｌ∞。篇蹴。图２一”蜂王和工蜂之间差异表达基因的数目Ｆｉｇ ２。Ｉ ３ Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｆａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｑｕｅｅｎ ａｎｄｗｏｒｋｅｒ！三主！兰！竺！！墨丝型生主垫！墨旦查兰堂坌堑―――――――一ｌ口１０ ］ｚ图２－１４筹异表达基因的ＧＯ分类ＦｉＢ ２－１４ Ｇｅｎｅ Ｏｎｌｏｌｏｇ，ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆｌｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅ。ｐ”５５。ｄＦ”“以诎的纵毒怀戒示扯ｊｌ！＝个类别－｝】的＾ＬⅢ数Ｈ。左边的纵啦杯收小杠这个特定类刖Ｉ。琏…所一。‘的Ⅱ升比Ｔ№ｒｉｇｈｌ㈣ｅｎｙ．ａ）（ｉ；ｉ㈣ｄｉｃａｔｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆｇｅｎｅｓ ｍａ１ｈ。 ｃａｔｅｇｏｒｙ Ｔｈ。Ｉ。ｎ ｙ。ａ）【１３…ｄ１。“。５ｒａｇｅ ｏｆａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃａｔｅｇｏｒｙ ｏｆｇｅｎｅｓｉｎｔｈａｔｍ８ｍ。８【。ｇｏｑ表２－４差异表选基因Ｔａｂｌｅ ２－４ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ ＧｅｎｅＩｏ薛Ｒａｔｉｏ―――――――――（ｑｕ―ｅｅ―ｎ／ｗ―ｏｒ―ｋ）一Ｎｒ－ａｎｔｔｏｔａｔｉｏｎ―――――――――――――――一 ｔｗｃｅｄｌｅｍｍｉｆｃｕｌｉｃｌｌＩ”Ｐｍ。…２Ｕｎｉｇｅｎｅｌ６６９９ １０ ３５３Ｉ ＣＬ３４６７Ｃｏｎｄｇｌ ＣＬＩ ｔ４３ Ｃｏｎｒｉｇｌ Ｕｎｉｇｅｎｅｌ５２０２ ＣＬ５１６１ Ｃｏｎｔｉｇｌ ９．８４８６２ ５．９９１９６ ５ ２２９５７ ４ ３２５６８ ｖｅＮｏｍ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅＡｃＰｈ。ｌ ｐ”ｃｔｌｎｏｒ ｈｅｘａｍｅｒｉｎ ｌ １０ ｏｄｏｒａｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ ３ ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ中华蜜蜂转录组剥序厦雌性蜜蜂基因表达分析ＣＬ８１６Ｃｏｎｔｉｇ】ＣＬ７８２Ｃｏｎｆｇｌ－ｌ ９７５４９Ｃｕｔｉｃｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ８ ｒＨｓａｌｔａｔｏｒ］－１．８５２６１一Ｉ ６３７］２ －Ｉ ４９６２７ ?１ ４７９７６ －Ｉ ４０６２７ ?ｔ３２１１３ －ｌ ２３８４６ 一ｌ ２１０３２ 一Ｉ ２０３６２ｅｕｔｉｃｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｄｌａｌｏｇｏｕｓｌｏ ｐｅｒｉｌｒｏｐｈｉｎｓ ３－Ｃ ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ：ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｋｅｏｕｔ―ｌｉｋｅＵｎｌｇｅｎｅｌ５７５５ Ｕｎｉｇｅｎｅ３５５６３ Ｕｎｉｇｅｎｅ２４２２ Ｕｎｉｇｅｎｅｌ４８１６ Ｕｎｌｇｅｎｅ６７５２ Ｕｎｉｇｅｎｅ７１５８ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ：３９Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ４４，ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ：２８Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ１８ｂ．ｍｉｔｏｃｂｏｎｄｒｉａｌ ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ：６０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ４ ｉｓｏｆｏ九Ｔ１ ＩＬａｒｖａｌ ｃｕｔｉｃｌｅｐｒａｂｍＡｌＡｆＨ ｓａｈａｔｏｒｊＰＲＥＤＩＣＴＥＤ：３９Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ１９ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＰＲＥＤＩＣ ＦＥＤ：３９Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ４３．ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ４０Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ８Ｕｎｉｇｅ他３４ｔ６０ ｄ．３９ｌ ７Ｃｏｎｔｉｇ『．．Ｕｎｉｇｅｎ―ｅ―１５８―５１―――――－―Ｉ―．―０―１―８――５―４――――――――――Ｐ――Ｒ―．Ｅ．Ｄ―――ＩＣ――Ｔ．．Ｅ．．Ｄ――：ｅ．．ｎ．ｄ．ｏ．．ｃ．ｏ．ｔ．ｉ．ｃ．１．ｅ．．ｓ．１．ｒＵ．．ｃ．１．ｕ．ｒ．ａ．１．．ｇ．１．ｙ．ｃ．．ｏ．ｐ．ｒ．ｏ．．ｔｅ．．ｉｎ．．．Ｓ．ｇ．Ａ．．ｂ．．ｄ．－．２．－．１．ｉ．ｋ．ｅ．．．．――３．６差异表达基因的ｑＲＴ．ＰＣＲ验证为了验ｉ正ＤＧＥ数据。我们选择了ｔＯ个謦异发选曲ｕｎｉｇｅｎｅｓ，嗣ｑＲＴ－ＰＣＲ占螗 饪它们ｄ：蜂王和工蜂中的表达（嵌２－５）。提墩蜂王和ｊ蜂的总ＲＮＡ为模板．ｒ＿蜂 Ｂ―ａｃｔｉｎ基凼作为内参。结粜鼹示这些基删的ｑＲＴ－ＰＣＲ结粜畸ＤＧＥ数据棚符☆（阁２一ｌ ５）。表２－５定量引物．ｔａｂｌｅ ２＋５ Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ琏ⅢＣＬＩ １４３ Ｃｏｎｆｇ…物５＋ＣＴＧＧＣＧＧＣＴＧＧＣＡＡＡＧＴＡＴＣ ３’５’ＣＴＴＧＧ ＦＧＧＡＡＧＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴＣ ３。一ｕｎｉｇｅｎｅ【５２０２５’ＣＣＧ丌ｃＡＴＣＡＧＡＯＣＣＡＴＣＣ５。ＴＧＴＴＣＧＣＡ邢ＣＣＡＡＧｎＴＣ３‘ ３‘５’ＴＴＴ６ＴＣＴ℃ＧＴＴＧＧＴＡｌｌｌｃＴＧ ３。５’ＣＧＴＣＴＧＣＴＴＴＣＴＧＴＡＧＧＴＣ ３‘ ５’ＣＡＣＧＣＴＣＣＴＣＡＧＧＣ ＦＣＡＡＣ ３。 ５’ＣＡＣＧＣＡＴＣＡＣＧＡＡＴＡＣＧＡＣＴＡ ３’ ＣＬ５６８ Ｃｏｎｔｉｇ５。ＧＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＡｃＡ ３‘ ５’ＴＧＡＴＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＯＡＴ＾．Ｃ ３’５＋ＣＡＣｌ７ｒｃ ＦＡＡＣＧＣｌｑ＂Ｃ１Ｔｃｌｌ￣ＧＴ ３― ５’Ｇｒｒｃｌｌ℃ＣＡＣＧＣＴＡＣＣＣｌＴＣ ３’ＣＬ８１６ ＣｏｎｔｉｇＣＬ７８２ Ｃｏｎｌｉｇ５５：“ＧＡ”ＡＣＡ”ＴＣｑ２Ａ“ＣＣ。Ｇ”ＴＣＣ”ＡＴ“ＣＧ ３ｊ℃＋ｕｎｉｇｅｎｅｌ５３９０；：器怒镭ＡＡＣＡＣＡｏ＾ＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＣＴｃＣ３ＡＡ３＇．ｕｎｉｇｅｎｅ６７５２５。ＡＴＧＣＴＧｌｌＧｒＰＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣｃＴ ３’５’ＧＣ ｒＧＴｂＧＣＧＡＴＡＡＣＣＧＡＴＧＴ ３。 ５’ＴＣＡｌ７『ｌＧ ｒＧＧＧＡＣＡＣＧＡＣＣＧＡ ３， ５１ ＣＡＴｌ℃ＡＣＣＡｌＴＣｃｒｒＡＣＴＧＣＣＴＣＴ ３＋ｕａｉｇｅｎｅ】５７９１！三兰！兰！竺竺垂垄型生主茎！茎兰堕ｉ望！坌堑――――――――一６４２ ０８皑划骷＃粤６一ｏｉ一§ｌ｝；｛ｔｇ４ ２ ０１２３Ｄｉｆｆ㈣ｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇ∽蠹‘５６７８９１０煞瑟蒸黯曩曩鬻徽一囊耀一 鬻黧篡一中华蜜蜂转录姐测序厦雌性蛮蜂基因表达分析能。将所有的ｕｎｉｇｅｎｅｓ与西方蜜蜂基因（包括选择性剪切变异型，从ｆｔ：／／ｆｔ．ｎｃｂｉｎｉｈ．ｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／Ａｐｉｓ（Ｅ值＜】０。ｏ）．发现西方蜜蜂的１１７３６基因中１０１０４基因（８６ ０９％１能与中蜂的ｔｍｉｇｅｎｅｓ 比对上。比对结果间接表明我们的转录组序列在所有的中蜂基因上有很高的覆盖率。 通过ＤＧＥ分析，我们在蜂王和工蜂间获得４１４个差异表达基因．这是到目舸为 止报道的鼋多的数掘。其中有一些是在以前研究中就已报道是涉及蜂王和工蜂绒型分 化的关键因子．例如卵黄蛋白原和Ｈｅｘ。Ｂａｒｃｈｕｋ等使用蜜蜂的ＥＳ／ｓ＞６０００的ｃＤＮＡ 微阵列分析，发现蜂王和工蜂之间有２４０个不同表达的基因（ＤＥＧｓ）Ｉ训。通过微阵列 表明Ｈｅｘ在蜂王中过量表达¨…，我们的结果与其相一致。这些结果不仅表明我们的 ＤＧＥ分析结果是可信赖的，也说明ＤＧＥ是一种能确定蜜蜂与级型相关基因的有效方涟。ｍｅｌｌｉｆｅｒａ／ＲＮ燃上下载）进行ＢＬＡＳＴｎ比对分泌蜂王浆是工蜂最重要的特征．也是蜂王和工蜂最主要的区别之一。我们发现 ６个核糖体蛋自基因，它们编码核糖体的主要组分和在蛋白质合成中起重要作用．在 工蜂中是上调的。这可能是因为工蜂需要合成蜂王浆，蜂王浆主要由王浆蛋白组成， 但是蜂王不需要。虽然工蜂样品仅取自刚出房的工峰，但在这个教育阶段．工蜂可能 已经开始上调这些核糖体蛋白基困的表达从而促进王浆蛋白的合成。 除了上述已报道的与中蜂或膜翅类昆虫缴型分化有关的差异表达基因外，我们也 发现了许多蜂王和工蜂的其他差异表达基因，例如，４种涉及“毒液”的基因（ＣＬ３４６７ Ｃｏｎｆｉｇｌ，ＣＬ４１５ ｃｏ―９１．Ｕｎｉｇｅｎｅ６９６４ Ｕｎｉｇｅｎｅ７６６６）在蜂王中是上调的：更有趣的是．我们发现２种生理节奏基因，周期（ｃＬ４００８ Ｃｏｎｔｉ９１）和进出巢房（Ｕｍｇｅｎｅｌ５７５５’ 相关的基因在工蜂中是上调的。这可能是园为蜂王通常呆在蜂箱里．而工蜂需要外出 采集。因此，工蜂与蜂王相比有较强的生理节奏，这些与生理节奏有关的基因在工蜂 中的表达水平也比在蜂王中的高。虽然我们仅采取的刚出房的蜂王和工蜂，没有任何 的飞行行为．但是这些基因的转录在这个阶段可能已经开始。这表明蜂王和工蜂的生 理节奏是有差异的。 除了这些注释的功能基困外，还有２１４个差异表达基因的功能还不明确，这些基 因可能涉及蜂王与工蜂的级型分化和许多生理学特征的差异。虽然它们的功能还不明 确，但却有重要的研究价值．其中一些可能是决定蜂王和工蜂级型分化的关键基因。 通过高通量测序我们第一时间获得了中蜂的整个转录组宇列，分析中蜂蜂王和工 蜂的基因表达差异。这些结果为研究中蜂生理特征的分子机制提供了可靠依据。第三章中华蜜蜂Ｄｎｍｔ ３基因克隆及表速分析第三章 １引言中华蜜蜂Ｄｎｍｔ３基因克隆及表达分析尽管我们通过ＤＧＥ技术获得丁大量的差异表达基因，但是有关ＤＮＡ甲基化的 相关基因却没有检测出来，然而随着对ＤＮＡ甲基化研究的不断深入，其重要性也越 来越明显。但目前关于蜜蜂ＤＮＡ甲基化的研究主要集中在西方蜜蜂上，人们对中华 蜜蜂‘Ａｐｉｓｃｅｒａｎａｃｅｒａｎｕ）的甲基化模式知之甚少。中华蜜蜂作为我国特有宝贵蜂种资源．了解它的甲基化模式对于保护和利用中华蜜蜂这一宝贵资源具有重要意义。 本研究克隆丁中华蜜蜂Ｄｎｒｎｔ３基因，并比较丁工蜂和蜂王个体内Ｄｎｍｔ３ ｍＲＮＡ表达 特征，分析中华蜜蜂雌性级型分化与ＤＮＡ甲基化联系．以期揭示中华蜜蜂雌性级型分化的分子机理。２材料与方法 ２．１实验材料２１１实验蜂群 取自江西农业大学蜜蜂研究所饲养的中蜂。选用蜂种和蜂群群势～致的中蜂５群．随机分为５个重复。工蜂和蜂王按咀下龄期进行取样。 工蜂（Ｗ）：４同龄蛹（蛹期，ＷＰ），１日龄幼年峰（Ｗｌｄ）．７阿龄青年峰ｆＷ７ｄ）．３０同龄老年蜂（Ｗ３０ｄ）和产卵工蜂（ＬＷ）。蜂王（Ｑ）：４日龄蛹（蛹期，ＱＰ），１日龄处女王（Ｑ１ｄ）和产卵蜂王（ＬＱ）。 每个时期每群蜂取８头蜜蜂，每４头蜜蜂作为１个样品，用于甲基转移酶Ｄｎｍｔ３ 基因ｍＲＮＡ表达量的检测，每个龄期的蜜蜂样品共计１０个重复．克隆所用的ＰＣＲ 样品是在巢房口随机取工蜂样。取样后蜜蜂样品立即放入液氮速冻．．８０℃保存，用于提取总ＲＮＡ。２．ｔ２实验试剂及仪器总ＲＮＡ提取试Fｎ盒¨ｚｏ】，ｐＥａｓｙ―Ｔ３载体，大肠杆菌ＤＨ５ａ感受卷细胞，ｘ．酬．ＩＰＴＧ．ＲＮＡ酶抑制剂购自全式盒公司：ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００．Ｍ．ＭＬＶ反转录酶及ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ】Ｊ荧光定量试剂购自ＴａＫａＲａ公司：ｄＮＴＰ．ＬＡ―ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ及ＤＮＡ凝胶回收试剂盒购自ＰＵＥＸ公司。焦碳酸二乙醋（ＤＥＰＣ）：宝航生物工程有限公司ｆｓｉｇｍａ分装）。其它生化试剂和常规试剂均为超纯或分析纯。普通离心机（飞鸽 ＫＡ一１０００型，上晦安亭科学仪器厂公司产品），台式玲冻离心机（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０Ｒ中华蜜蛙转录妞测序及雌性蜜蜂基因表达分析 公司产品），移液器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司产品），普通ＰＣＲ仪（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｐｅｒｓｏｎａｌ），Ｒｅａｌ―Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓ、，ｓｔｅｍ（Ｂｉｏ―Ｒａｄ公司产品）。Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ２．１．３培养基和主要溶液的配制 （１）ＬＢ培养基：２ ５９蛋白陈，１．２５９酵母粉．２ ５９ＮａＣｌ，溶于２５０ｍＬ蒸馏水中． 调ｐＨ至７．４，高压蒸汽灭菌１２Ｉ℃１５ｍｉｎ（固体培养基中加入１Ｓｇ／Ｌ琼脂粉ｌ。 （２）５０ｘＴＡＥ缓冲液：２４２ ２９Ｔｒｉｓ，５７ １ｍＬＨＡｃ．１００ｍＬＥＤＴＡ ｆ０ ５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ８ 加蒸馏水至１０００ｍＬ。 （３）氨苄青霉素（Ａｍｐ 菌，一２０℃分装保存。１００ｍｇ／ｍＬ）；ｌ０１，００ｍｇＡｍｐ溶于１ ｒ１１Ｌ蒸馏水中，高压灭２．２实验方法２．２１总ＲＮＡ的提取 ２，２．１．１实验器具的处理与准备 （１）塑料制品：将塑料制品逐个浸泡于】％ｏＤＥＰＣ水中２４ｈ，高压灭菌后在８０＇Ｕ烘烤箱中烘干（或置于３７℃中８小时左右烘干１。（２）玻璃制品：在１‰ＤＥＰＣ水中泡６小时左右．高压灭菌，８０‘Ｃ烘干．用蒙锡纸包裹１８０℃干烤过夜。（３）金属制品及瓷研钵：ｆ镊子等）洗干净后１８０℃干烤过夜（不需要泡ＤＥＰＣ水）。 ２．２．１．２试剂配制和准备 ＤＥＰＣ水：】０００ｍＬ双蒸水中加ＩｍＬＤＥＰＣ，放在摇床上３７＂Ｃ过夜后备用。泡实 验器具的ＤＥＰＣ水不需要高压灭菌．配制其它溶液的ＤＥＰＣ水需要高压灭菌。 ７５％Ｚ，醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和ＤＥＰＣ水配制（ＤＥＰｃ水：无水乙醇 ＝１：３），然后放于一２０℃备用。 Ｔｆｉｚｏｌ、氯仿、异丙醇：放八棕色瓶。 氯仿：放入棕色瓶。２．２．１３提取步骤 （１）３０％双氧水棉球擦净工作台，开启冷冻离心机４℃预冷转子。 （２）液氮预冷研钵、研棒，缓慢加入少量液氯，１ ５ ｒｎＬＥＰ管插冰上预冷。 （３）向１．５ ｍＬＥＰ管中加入１ ｍＬＴｒｉｚｏｌ，插到冰上。（４）取４只蜜蜂头部，液氮研痞卮转移到Ｔｒｉｚｏｌ中，漩涡混匀器上高速震荡裂 解，匀浆后样品于１５～３０。ｃ孵育５分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离．后黄于冰第三章中华蜜蟑Ｄｎｍｔ ３基因克隆厦表违分析Ｌ５）４℃Ｉ ３０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ，上清液转移到另一个ＥＰ管ｔ已冰上预冷）。 （６）加入２００９Ｌ氧仿．用力摇晃１５ ｓ．室温放置２～３ｍｉｎ。４℃１ ３０００９ ｒｐｍ离心１５ ｍｉｎ，混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中问层和上层的无色水相，ＲＮＡ全部被分配于水相中。将上清转移至另一个ＥＰ管中【己冰上预冷）。‘７）加入５００ ｐ．Ｌ异丙醇．轻轻混匀，室温静置１０ｍｉｎ。４℃１３０００ ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ．此时离心前不可见的ＲＮＡ沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块．移去上清液。（８）加入１ ｍＬ７５％乙醇（０ ０１％ＤＥＰＣ配制）．用移液器反复吸打乙醇，洗涤 ＲＮＡ沉淀。４℃８０００ ｒｐｍ离心５ ｍｉｎ，弃乙醇：重复操作一次。（９）用迷你离心机将ＥＰ管内壁上的乙醇甩至管底，用小枪头吸出．开盖置超 净台内晾十几秒．但不能让ＲＮＡ全部干透，内壁上没有永珠即可。 （１９）视ＲＮＡ的量加入无Ｒｎａｓｅ水３０＂～５０Ｉ．ｔＬ，轻弹管壁．充分溶解ＲＮＡ．混 匀后分装出少许用于测定ＲＮＡ浓度和电泳检测。其余获得的ＲＮＡ溶液保存于．８０。ｃ。２．２．１．４ＲＮＡ质量检测①取３止总ＲＮＡ进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。②紫外分光光度计下读ＲＮＡ浓度值和ＯＤ２６０／２８０值（Ｉ８－２ ０之间表示ＲＮＡ纯度较好，小于１，８说明含提取的ＲＮＡ中可能有蛋白质的污染，可以用酚或氯仿抽提 去除．大于２．２表示ＲＮＡ降解）．每个样品读数３扶．取平均值作为最终数掘。ＲＮＡ 原液浓度＝Ａ２６０ｘ稀释倍数ｘ４０（ｎ９４ｔＬ）。２．２．２反转录合成第一链ＣＤＮＡ用反转录试剂盒对总ＲＮＡ进行反转录．在ＰＣＲ扩增仪进行ＲＴ反应 操作方法：｛１）ＲＮＡ ８９Ｌ ７０＇Ｃ ５ｍｉｒｉ（１１制各ＲＴ混合反应液：试剂（ｆ）反应液 ＲＮＡ酶抑制剂１４０ｕ：ｕＬＩｄＮＴＰ（２ ５ｍＭ ｅａｃｈ】体积（ＩｌＬＯＩｉｔｚｏ（ｄＴＩＭ．ＭＬＶ反转录酶（１０Ｕ／ｕＬ 无ＲＮＡ酶水 总体积体系混匀后，４２＂Ｃ反应ｌｈ，７０＂Ｃ灭活５ ｍｉｎ，一个循环；反应结束后，将反转录―――――――――――！兰皇堡壁墨塑型生型苎！兰兰！查釜坌堑产物放在冰上待用或．８０。Ｃ保存。 ２．２３引物设计与合成未ｉ Ｊ物ｊ妻¨）（ＤｎｍｔＦｌ和ＤｎｍｔＲＩ一，，．銎掘Ｇ。“Ｂ８ｎｋ登录的西方蜜蜂Ｄｎｍｔ３ ｍＲＮＡ的序列及ＥＳＴ比划．设计３对简ＤｎｍｔＦ２和ＤｎｍｔＲ２ ＤｎｍｔＦ３和ＤｎｍｔＲ３）由上海生工生物工程公司怠成?进行ＰＣＲ扩增，用于克隆中蜂的Ｄｎｍｔ３ ｍＲＮＡ片段。寰３－１中蜂ＤＮＡ甲基化Ｄｎｍｔ３基因克隆引物Ｐ…㈨ｅ一Ｐｒｉｍｃｒｓｅｑｍ…５?一３―１―――――――――ＤｎｍｔＲ３――――――――ＣＧ―Ｔ―ＴＣ―ＡＧ―Ｏ―ＴＴ―ＴＧ―ＡＴ―Ｃ―ＧＧ―ＴＣ―Ｃ―Ａ―～篓嚣赫豢 撇胶块充分溶解。反九呲骼㈣篙裟辄爱一一．．粤孕过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的ＤＮＡ片段与其它片段分开，用干净的手术 ！兰箜苎呈的．Ｄ．ＮＡ片段的琼脂糖凝胶块切下，尽量将多余的部分切除．放入提前称 重的干净离心管内，称得胶重。 …．竺尊塞：！！：管置于５０。ｃ水浴５－１０ｍｉｎ，其间不断温和地上下翻转离心管，以使 。一倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。…。竺鉴篓三娄堡型的溶液加入到吸附柱内ｔ室锰下放置３ｍｉｎ，１２０００。ｐｍ离心６０ｓ，‘废液ｔ将吸附柱放回收集管中，将此步骤重复一次。…，＠皇竺曼｛亭胄加入５００止漂洗液ＷＢ，１２０００ ｒｐｍ离心６０ ｓ，倒掉收集管中的＠为尽量除去残留的漂洗液，将空吸附柱和收集管放入离心机。１２０００ ｒｐｍ离心茅三章中华蜜蜂Ｄｎｍｔ ３基因克隆强袁遮分析２ｍｉｎ．而后将吸附柱在室温下放置数分钟，彻底地晾干，防止歧留的漂沈液影响后 续实验。 ⑦将吸｜｝｜寸柱故八干净的１ ５ｍＬ离一ｔＬ，管中．在吸附膜中央加入３０．５０此洗脱液 Ｂｕｆｆｅｒ，室温静赶ｌ一２ｍｉｎ，１２０００Ｅｌｕｔｉｏｎｒｐｍ离一１３，１ ｒａｉｎ。将所得到的ＤＮＡ溶液置于一２０。ｃ保存或用于后续试验。２．２ ６ＰＣＲ产物的克隆重组质粒的转化及鉴定１１克隆反应体系的建立 在微型离心管中依次加入溶掖： ＰＣＲ产物０ ｓ．４乩（根据ＰＣＲ产物量可适当增减，撮多不超过４Ｔ３ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ １ ＦＬ），ｐＥＡＳＹ．ｇＬ，轻轻混台室温（２０℃．３７℃）反应５ ｍｉｎ。反应结束后，将离心管置于非上， ２）转化（】）加连接产物于５０止ＤＨ５ｃｔ感受态细胞中（在感受志细胞刚刚解冻时加入连接产物），轻弹混匀，冰浴２０―３０ｍｉｎ。 ｆ２）４２℃热激３０ ｓ，立即置于冰上２ｍｌｎ。（３）加２５０止平衡至室温的ＳＯＣ／ＬＢ（不台Ａｍｐ－），２００转、３７ ０Ｃ孵育１小时。（４１取８ ｇＬ５００ ｍＭ ＩＰＴＧ，８０９Ｌ２０ ｍｇ／ｍＬＸ－ｇａｌ混台．均匀地涂于准备好的平板 上，在３７℃放置３０分钟。ｆ５）待Ｘ－ｇａｌ，ＩＰＴＧ被吸收后，取２００止菌液铺板，培养过夜（为得到较多克 隆ｔ ４０００ ｒｐｍ离心】ｒａｉｎ．弃掉部分上清，保留１００－１５０乩，轻弹悬浮菌体．取全部菌液涂扳，培养过夜）。 ３）ＰＣＲ方法鉴定阳性重组子（１）挑选白色克隆至１０儿无菌水中，涡旋混台。（２）２５｝ＩＬ反应体系中取１“ｌ混台液用作ＰＣＲ反应的模板，用Ｍ１３正向引物和反向引物鉴定重组子。（３ ＪＰＣＲ反应条件：９４＂Ｃ预变性】Ｏ分钟（裂解细胞，失火核酸酶）．９４＂Ｃ变性３０秒，５５℃退火３０秒，７２℃延伸３０个循环，７２后延伸１０分钟。确定包含重组子的克隆。（４）将验证的包含重组子的白色克隆，接种子ＬＢ／Ａｍｐ＋的液体培养基中，过夜培 养。序列测定由上海生工生物技术有限公司完成。２．２７序列的测定和分析利用ｓｅｑＭａｎ软件将测序后获得的小片段序列进行拼接获得完整的Ｄｎｍｔ３基因的 ｍＲＮＡ序列：利用Ｂｌａｓｔ在ＮＣＢｌ网站进行序列相似性比对分析：采用Ｂｉｏｅｄｉｔ对ｍＲＮＡ 序列进行六读框翻译成氨基酸｜芋列；采用ＣｌｕｓｔａｌＸ多重序列比较程序将中蜂Ｄｎｍｌ３２９中华蜜蜂转录蛆测序厦雌性蜜蜂基因表述分析基固核苷酸序列及其编码的氨基酸序列．与其他物种的进行同源性比鞍：采用ＭＥＧＡ４１软件中的邻位相连法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒｚｉｏｉｒｔｉｎｇ）对已报道的物种的Ｄｒｍｌｔ３基因氨 基酸序列构建系统进化树，系统发生树进行了２４００次重复构建。 ２２．．８荧光定量ＰＣＲ ２．２．８．１定量引物设计 在中蜂Ｄｎｍｔ３基因阅读框区设计多对特异引物用于定量ＰＣＲ反应．根据Ｌｉｖａｋ 和Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ（２００１）的方法ｆ７州，本研究对设计的特异性袭光定量引物进行了筛选， 获得符台要求的特异性引物，用于后续的实时荧光定量ＰＣＲ反应。１３－ａｃｔｉｎ在蜜蜂 的发育过程中表达稳定，本研究以Ｂ－Ａｃｔｉｎ基因作为内参基因（引物为ｌｌａｃｔＱＦ和 ｐａｃｔＱＲ）Ｉ删。荧光定量所用引物序列ｒ表３＿２）。表３－２ 引物名｛｝Ｉ：Ｐｒｉｍｅｒ ｎ帅Ｐ荧光定量引耢序列引物序列ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５１―３’１塑坐醒！型！?坐！鲣凹婴兰Ｄ衄忭３ＤｌａｍｔＲ３ＴＣＴＧｌ丁ＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＧＧＣＡＣ ＣＧＴｌ℃ＡＧＧｌｌＴＧＡＴＣＧＧＴＣＣＡＤｎｍｔＱＦ ＤｎｍｔＱＲ 陆ｎＦＢａｃｔＲＣＡＧＡｒ眦ＴＣＧＣＣＣＣＡＧＣＡＴＴＣＣＡＧｌｌｌｃＧＧ’厂ｒＡＴｃｃＡｃＡＡＧ６ＣＯＣＣＧｒｒｒｒＣＣＣＡＴＣＴＡＴＣＧＴＣＡＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＣＧＡＡＴＣＣＡＡＴＡＣ ＧＧＣＴＣＣＣＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＣ ＴＯＣＧＡＡＡＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＣｐａｃＩＱＦ｛ＢａｃｔＱＲ２．１，８．２反转录反应 提取不同时期工蜂和蜂王头部的总ＲＮＡ，台成第一链ｅＤＮＡ，方法同２．２ ２。 ２．２．８．３标准品的制作ＰＣＲ反应总体积为２５虬，包含４Ｉ．ｔＬ ｅＤＮＡｔ ２．５ＩｔＬｌｏｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ，２ ｐＬ ｄＮＴＰ． 引物各１止ｔ Ｏ ３此ＬＡ－Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，１４ ２血ｄｄＨ２０。反应条件：９４℃预变性５１０ｍｉｒａ９４℃变性３０ ｓ．６１℃退火４５ ｓ，７２＂０延伸ｌ ｍｉｎ。３５个循环：７２℃延伸ｍｉｎ：４＂０保存。将扩增产物置在１ ０％的琼脂糖凝胶电泳中检测。扩增片段的回收，２ ５。同步骤２第三聿中华暨唯日ｎｍｌ ３基目克隆厦表过分析２．２．８．４实时荧光定量ＰＣＲ荧光定量ＰＣＲ采用２０止体系．各反应成分的台量为１０ ｇｍｏｌ／Ｌ的上、下游引物各０ ４乩．】０ ｕＬ ＳＹＢＲ．ｃＤＮＡ模板５止，灭菌超纯水４ ２皿，混匀．离心，故入定 量ＰＣＲ仪中扩增。ＰＣＲ反应条件：９４℃预变性３０ ｓ：９５＂Ｃ ５ ｓ．６５ ５℃３０ ｓ．４０个 循环。扩增反应结束后继续从６５℃缓慢加热到９５℃（每６ ｓ升高ｌ℃）．建立ＰＣＲ 产物的熔解曲线。反应结束后收集目的基因与内参基因的ＣＴ值。同时，将回收得到 的ＤＮＡ溶液依次稀释成１０、１０：、１０３、１０４、１０、、１０。，这６个不同浓度的ＤＮＡ溶液．反应条件同上，制作标准曲线．得到扩增效率。２．２．９数据统计与分析 每个生物学样本的ｃｔ值通过计算三个技术重复的平均值得来。ＰＣＲ的扩增效率 通过标准曲线的绘制获得（标准品为６个１０倍系列稀释的点）。基因在样品中的相 对表＿达量用以下公式计算：Ｒ ｏ，／月。月（１＋Ｅ Ｒ）。“ （１＋Ｅ，）。７ＥＲ：内参基因的扩增效率，ＥＴ：目的基因的扩增效率，ＣＴ、Ｒ：内参基因的ＣＴ值，ＣＴＴ：目的基因的ＣＴ值。各基因在不同发育阶段表达量差异，用ＳＰＳＳ】７．０软件对原始数据Ｓｑｒｔ方法转换 后，再进行Ｏｎｅ―ｗａｙ}