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酪素平板法检测临床分离a族链球菌致热外毒素b活性研究
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10g/L的酪素溶液是什么颜色的
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溶解度不好。若溶解的话，应该是略带土黄色
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97酶工程论文
生物体内的大部分化学反应都是在酶的催化下进行的；蛋白酶是应用最广泛的一种酶，了解其活性尤为重要，；而各种酶都有相应的活力测定方法,用溶解的酪素作为；酶活力测定的基本步骤：；酶活力的测定方法有多种多样，对其要求是快速，简便；酶活力测定一般包括两个阶段；（1）根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配置；（2）根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度，；（3）在一
生物体内的大部分化学反应都是在酶的催化下进行的。要检查酶的存在及其含量, 不能像检查化学药品那样直接用重量或体积来表示, 而只能用它催化某一特定反应的能力即酶的活力来表示。因此, 测定酶活力是研究酶的特性以及搞好酶制剂生产与利用的一项必不可少的工作, 是衡量酶制剂质量的一项重要指标。但是, 酶制剂作为一种生物催化剂, 它的活性的发挥受多种因素影响, 如底物浓度、酶解温度、p H 值、酶解时间、激活物、抑制剂等。因而酶活力的示值是一定条件下的相对数量, 测量之前必须先确定衡量数量的单位。统一认为，在特定条件下（温度可采用25℃，pH等条件均采用最适条件），每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位，这个单位称为国际单位（IU）。蛋白酶是应用最广泛的一种酶，了解其活性尤为重要，其活力是酶的主要性能指标之一。酶活力由实验测量结果推导得到,它表示在给定的条件下酶催化一个反应的能力。也就是在单位时间内由于反应而使底物消失或者产物生成的量。蛋白酶的活力是酶制剂生产厂家控制批与批之间质量稳定性的主要方法,也是在应用酶制剂时所必须要考虑的主要性能指标之一。而各种酶都有相应的活力测定方法,用溶解的酪素作为底物是最常见的蛋白酶活力的测定方法,其优点是测定结果的可重复性高,该方法的测定结果主要用来衡量酶制剂产品的质量的稳定性。对于同一种酶制剂,以酪素为底物的酶活力的大小能反映其对同种底物作用的强弱;但对于不同种类的酶制剂,对底物酪素的作用性能并不能完全反映酶制剂对其他底物的作用性能,因为,酶制剂对底物的作用具有专一性。酶活力测定的基本步骤：酶活力的测定方法有多种多样，对其要求是快速，简便，准确酶活力测定一般包括两个阶段。首先在一定条件下，酶与底物反应一段时间，然后再测定反应液中底物或者产物的变化量。一般经过如下几个步骤。（1）根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配置一定浓度的底物溶液。所使用的底物必须均匀一致，达到酶催化反应所要求的纯度。在测定酶活力的时候，所使用的底物溶液一般要求新鲜配制，有些反应的底物溶液也可预先配置后置于冰箱中保存备用。（2）根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度，pH、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。温度可以选择室温（25℃）、体温（37℃）、酶反应最适温度或其它选用的温度；pH应是酶催化反应的最适pH；底物浓度应该大于5Km等。反应条件一旦确定，在整个反应过程中应尽量保持恒定不变。故此，反应应在恒温槽中进行，保持pH的恒定是通过采用一定浓度的酶激活剂等，应适量添加。（3）在一定得条件下，将一定的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。（4）反应到一定得时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。为了准确地反应酶催化反应的结果，应尽量采用快速、简便的方法，立即测出结果。若不能及时检测出结果的，则要及时终止反应，然后再测定。终止酶反应的方法很多。常用的有：①反应时间一到，立即取出适量反应液，置于沸水浴中，加热使酶失活；
②加入适宜的酶失活变性剂，如三氯乙酸等，使酶变性失活；③加入酸和碱溶液，使反应液的pH迅速远离催化反应的最适pH，从而使反应终止；④将取出的反应液立即置于低温冰箱、冰粒堆或冰盐溶液中，使反应液的温度迅速降低至10℃以下而终止反应。在实际反应过程中，要根据酶的特性、反应底物和产物的性质以及酶活力测定的方法等加以选择。 首先是蛋白酶的提取首先应使酶溶于提取溶剂之中, 利用酶溶液进行活力测定。为尽量减少酶活力的损失, 蛋白酶的提取宜在低温下进行, 一般为0一5℃ , 且在整个提取过程中不进行过度搅拌, 以免产生大量泡沫, 使酶变性。同时, 为使酶尽可能地溶解于提取溶剂之中, 但又要防止时间过长导致一些重金属离子、酶蛋白中的一s H 被氧化而使酶活力丧失, 提取时间选择12 小时。精确称取1.0 克左右酶制剂, 用提取溶剂溶解定容至50 毫升, 于4 ℃ 冰箱中浸取12 小时。浸取液经过滤, 取滤液测其酶活力。测定时应将酶液用提取溶剂进行适当稀释。其次的各种蛋白酶酶活力测定原理和方法讨论一： 福林法（因为上学期做过相关实验，所以过程叫其他方法详细）蛋白酶在一定的温度下和pH 条件下水解酪素底物,产生含有酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等) ,在碱性条件下,将福林试剂( Folin) 还原,生成钼蓝和钨蓝,用分光光度计测定,计算其酶活力。福林法反应条件如下。温度:1398 和166 蛋白酶的反应温度为30 ℃,其他酶为40 ℃(国标) 。 pH 值:由酶的种类决定。反应时间:10min1g 固体酶粉(或1ml 液体酶) ,在一定温度和pH 值条件下,1min 水解酪素产生1μg 酪氨酸为一个酶活力单位,以μ/ g (μ/ ml) 表示。1、福林试剂的制备：于2000ml磨口回流装置中加入二水钨酸钠100g、二水钼酸钠25g、水700ml、86％磷酸50ml、浓盐酸100ml，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂50g、水50ml和数滴浓溴水99％，再微沸15min、以除去多余的溴（冷后仍有绿色需要再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1000ml，混匀，过滤，制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶中。
使用液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。2、碳酸钠溶液c=0.4mol/L称取无水碳酸钠42.4g,用水溶解并定容至1000ml3、三氯乙酸c=0.4mol/L称取65.4g三氯乙酸，用水溶解并定容至1000ml4、氢氧化钠溶液c=0.5mol/L称取20.0g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000ml5、盐酸溶液c=1mol/L及0.1mol/L6缓冲溶液a 磷酸缓冲液（pH=7.5):适用于中性蛋白酶称取12水磷酸氢二钠0.5g，加水溶解并定容至1000ml。b硼酸缓冲液（pH=10.5):适用于碱性蛋白酶甲液：称取硼砂19.08g，加水溶解并定容至1000ml.乙液：称取氢氧化钠4.0g,加水并定容至1000ml.使用液：取甲液500ml.乙液400ml,混匀，用水稀释至1000ml.上述各种缓冲液均需pH计校正。7.10g/L酪素溶液称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加入适量的各种适宜pH缓冲液约80ml，在沸水浴中边加热边搅拌，至完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中，用适宜的缓冲液定容至刻度线，溶液在冰箱里保存，有效期为三天。8.L-酪氨酸标准液a称取预先于105摄氏度干燥恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g用1mol/L盐酸60ml溶解定容至100ml，即为酪氨酸标准溶液b吸取1mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml。用0.1mol/L盐酸定容至100ml.即得100 μg/mlL-酪氨酸标准溶液。测定：A先将酪素溶液放入30℃±0.2℃恒温水浴中，预热5min.B按下列操作：试管A(空白）
试管B（酶式样，操作三个平行式样）
1.00ml↓30℃±0.2℃ ，2min
↓30℃±0.2℃,2min 加三氯乙酸
2.00ml(摇匀）
加酪素 1.00ml（摇匀）↓
↓加酪素1.00ml（摇匀）
加三氯乙酸
2.00ml(摇匀）
↓取出静止10min ,过滤
取出静止10min ,过滤↓
↓取1.00ml滤液
取1.00ml滤液↓
↓加碳酸钠溶液5.0ml
加碳酸钠溶液5.0ml↓
↓加福林试剂使用液1.00ml
加福林试剂使用液1.00ml↓30℃±0.2℃,显色20min
↓30℃±0.2℃,显色20min于680nm波长，用10nm比色皿，试管A为空白测其吸光度1、计算X=A×K×4／10×n=2／5×A×K×n式中：X----样品的酶活力,μ／gvμ／ml);A-----样品平行试验的平均吸光度；K-----吸光常数；4------反应试剂的总体积，10----反应时间10min.N-----稀释倍数；所得的结果表示至整数。2、结果允许误差平行试验相对误差不得超过3％。 二 Lohlein - Volard (LVU) 法(诺维信公司提供)碱性酪素溶液在标准条件下进行酶降解反应,加盐酸使反应终止,当酪素被蛋白水解酶分解之后,用硫酸钠沉淀未降解的酪素。滤液用氢氧化钠溶液滴定,滤液中的酸包括加入终止反应的盐酸和酪素降解产生的酸。酪素降解越多,滤液中的酸就越多,沉淀就越少,滴定用氢氧化钠溶液的量增多。滴定所耗氢氧化钠的量直接反映蛋白酶活力大小。通过耗用的碱量即可测得酶制剂的活度。LVU 法反应标准条件如下:温度:37 ℃
pH 值: 8. 2反应时间:60min1LVU 定义为在上述标准条件下(37 ℃,pH 8. 2) 下,酶与酪素反应60min 降解1.725mg 酪素所需酶的量。 三
胰酶转化倍数法胰酶能促进酪蛋白的水解作用,胰酶量越多水解的酪蛋白越多。因此,用定量的酪蛋白和不同量的胰酶作用,水解一定时间后,用醋酸盐(或醋酸) 指示剂调节反应溶液的pH 值到酪蛋白的等电点附近,未被水解的酪蛋白呈白色沉淀析出,而水解产物则不会沉淀,规定恰好使定量的酪蛋白完全水解的胰酶量为确定活度的据。根据此时胰酶的体积和浓度,可计算出胰酶对酪蛋白的转化能力(以倍数计) 。控制胰酶水解反应最适的条件为pH8～9 ,温度为40 ±1 ℃ 另外附加一部分福林法和LVU 法的比较由于影响酶活力测定结果的因素很多,包括酶粉的均匀性、酶的溶解性、酶液的放置时间、反应时间和取量操作误差等,通常同一种酶的活力测定结果误差在包含各类专业文献、生活休闲娱乐、应用写作文书、高等教育、中学教育、97酶工程论文等内容。　
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