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导读：蛋白分离纯化技术是生物化学研究中的一项重要操作技术，如果要研究某一个特殊蛋白质，那么首相就要将这个蛋白从生物体中分离纯化出来。蛋白质的纯化方法主要是利用不同蛋白质之间的相似性与差异，依据蛋白之间的相似性可以去除非蛋白物质，再根据蛋白质的差异性将目的蛋白分离出来。本专题与大家分享几种常见的蛋白分离技术、蛋白分离试验中的常见问题、注意事项
分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的
蛋白纯化技术
随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变
盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白表面的水化膜，
色谱法又称层析法，是一种依据物质的性质(溶解性、极性、离子交换能力、分子大小等)的不同，当流动相携带样品流经固定
层析技术是利用混合物中各组分的理化性质差异(吸附力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力等)建立起来的技
无机物色谱介质包括：氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙(凝胶型和晶型)、氧化钛和氢氧化锌凝胶等。聚合物色谱介质
在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白样品与上样缓冲液混合变性，上样缓冲液中含有SDS和巯基乙醇使得蛋白质分子中的二硫键
蛋白质的分离纯化方法包括：根据蛋白质分子大小的差异分离—透析和超滤法;根据蛋白质的溶解度差异分离—沉淀、盐析等
离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离的目
实验准备及经验总结
为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。文章集结了200多条常问问题解答，就
HP-RPC的选择首先要看蛋白质的分子量，20kDa左右的一般用C4或C8，再小一点的可以用C18，太大的蛋白并不适于反相分离。C18通用
蛋白纯化试剂盒主要是利用蛋白与亲和介质的亲和能力不同达到蛋白分离纯化的目的。蛋白纯化试剂常见的蛋白标签有GST标签
各种His.Bind基质的产品如何选择：本文介绍带Ni NTA琼脂糖、无Ni IDA琼 脂糖、带Ni的IDA琼脂糖预装柱、无Ni IDA触须甲酰化、带
请问有哪些可能会出现这种原因?怎么解决?测过基因序列，没有问题。细胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶剂提取后，
常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，
首先是对离子交换剂电荷基团的选择，确定是选择阳离子交换剂还是选择阴离子交换剂。这要取决于被分离的物质在其稳定的
离子交换速度的影响因素很多，综合起来主要有以下几个方面：(1)颗粒大小：愈小越快；(2)交联度：交联度小，交换速度快；
离子交换树脂是一种在交联聚合物结构中含有离子交换基团的功能高分子材料。离子交换树脂不溶于酸、碱溶液及各种有机溶
DTT( 二硫苏糖醇)是实验室常用的还原试剂，常被用于蛋白质保存以及蛋白二硫键的还原。DTT的入特点是极易被氧化，稳定性较
蛋白纯化注意事项
超滤技术存在的主要问题是超滤膜污染。超滤膜在使用过程其性能随着时间的增加，膜透过流速会迅速下降，同时对溶质的阻
Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组
层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长
亲和层析纯化生物大分子通常采用柱层析的方法。亲和层析柱一般很短，通常10cm左右。上样时应注意选择适当的条件，包括
装柱前要仔细看填料的使用说明书，每种填料都有自己的特性，以及特殊的装柱方法，针对不同的空柱，也要注意方法可能不
离子交换纯化是利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对各种离子的亲和力不一样人达到分离的目的的一种分离技术。离
蛋白质纯化应用
Purification of GST fusion proteins in E.coli GST Sugden lab,McArdle Laboratory for Cancer Research,University of Wisconsin-Madison Medical School Screen of GST-
亲和层析包括了一整套复杂的底物及其配体与生物大分子之间相互作用时所形成的独特的生物学特性。在亲和结合的过程中涉
本实验利用超氧化物歧化酶的解离性质,在一定缓冲液条件下与离子交换纤维素吸附和解吸的能力不同于溶液中杂蛋白,进而除
综述了离子交换树脂在核苷酸、核酸、抗生素等天然产物分离纯化中应用的研究现状,展望了离子交换树脂在天然产物提取分
亲和层析法纯化多克隆抗体
Copyright(C) All Rights Reserved粤ICP备号-3双组分混合物中目标蛋白在离子交换层析中分离纯化策略(Ⅰ)
以双组分混合物中目标蛋白的柱层析分离纯化为对象,研究了目标蛋白在离子交换层析柱上的分离纯化策略,为中试和规模化分离纯化目标蛋白提供了高效和可行的方案。分别以CM Sepharose Fast-Flow阳离子交换层析和SourceTM 30Q阴离子交换层析分离纯化溶菌酶和猪血红蛋白为例,验证了这种分离纯化策略的可行性,并在此基础上，采用DEAE Sepharose Fast-Flow阴离子交换层析分离纯化了猪血红蛋白单体,纯化后的猪血红蛋白单体经过高效液相色谱检测其纯度在98％以上,蛋白质收率在94％以上,节省时间在30 min 以上。
作者单位：
西北大学化工学院国家微监测系统工程技术研究中心,陕西省 西安 710069
母体文献：
第五届全国化工年会论文集
会议名称：
第五届全国化工年会&&
会议时间：
会议地点：
主办单位：
中国化工学会
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蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化方法沉淀法：原理：是使蛋白质胶体颗粒的表面水化膜或表面电荷破坏，从而使蛋白质沉淀。&&盐析法&&有机溶剂沉淀法&&等点电沉淀法&&选择性变性沉淀法&&聚合物沉淀法在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：&&中性盐沉淀（盐析法）：最大的特点是环境温和，不易造成蛋白质变性。因此适用于各种蛋白质和酶的分离纯化。缺点是分辨率底，且后续处理时需要除盐。&&有机溶剂沉淀：分辨率高于盐析法，但容易引起目的蛋白失活。所以多用于生物小分子的分离纯化比如多肽、寡肽。&&等电点沉淀：其局限是，须事先了解蛋白的；且沉淀过程中可能发生变性和失活，部分蛋白等电点沉淀后不容易溶解，因此较少用于目的蛋白的沉淀。用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。&&选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定值下易变性的杂蛋白。三氯yi醚是比较常用的酸变性剂，尤其在分析样品的浓缩而不需考虑活性的条件下用得多。&&有机聚合物沉淀：是发展较快的一种新方法，主要使用聚乙二醇作为沉淀剂，常用和。它条件温和，不易变性，且沉淀效果强，很少量的可沉淀大量的蛋白。缺点是除去比较困难。根据分子大小不同：超滤法、透析法（膜分离法）、超速离心法、&凝胶过滤法（GF）也称大小排阻层析，是一种根据分子的大小和形状来进行分离的方法。不同的蛋白质分子通过凝胶微孔时因迁移能力不同而被分离。利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，（在其分离范围内）按分子大小将样品中各组份分离开来。大分子先被洗脱，小分子后被洗脱。应用：脱盐、，中间纯化，精纯、。常用填料：系：是以氯代环氧丙烷进行交联的葡聚糖珠状凝胶，经典的凝胶介质。系经过纯化的琼脂糖，含极少的带电集团。型号最多、应用最广。系：有是丙基葡聚糖与亚甲基双丙稀酰胺共聚而成，经济高效。系：是葡聚糖与琼脂糖共聚而成的复合凝胶，最新，选择性强，分辨率极高。&&凝胶类型：葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。&&葡聚糖凝胶：直链的葡聚糖分子和交联剂3氯1，2环氧丙烷交联而成。&凝胶回收处理方法：将样品完全洗脱下来后，继续用三倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶后，将柱下口放在小烧杯中，慢慢打开，再将上口慢慢松开，使凝胶全部回收至小烧杯中，备用。G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表交联度，也代表特水量。X数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子生化产品。X数字也代表凝胶的持水量，如G-25表示1g干胶持水2.5mL，G-100表示&1g干胶持水10mL，依次类推。葡聚糖凝胶和生物胶多以干粉形式保存，使用前需用水或洗脱缓冲液充分溶账。在室温下让其充分溶账胀达到平衡，通常需要较长时间。较快的做法是将干胶往水里加，边加边搅，以防凝胶结块，然后放到沸水浴中加热接近100℃，几个小时就可以使其溶胀，还可起到除去颗粒内部气泡和杀菌作用。新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，一般用3～5倍体积的缓冲液在恒压下流过柱床。新装好的柱要检验其均匀性－可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。也可以对光检查，看其是否均匀或有无气泡存在。&蛋白质的分离纯化方法凝胶用过后，有几种保存方法：湿态保存：在水相中加防腐剂，或水洗到中性，高压灭菌封存（或低温存放）；湿态保存：在水相中加防腐剂，或水洗到中性，高压灭菌封存（或低温存放）；干燥保存：水洗后滤干，依次用50％、70％、90％、95％乙醇脱水，再用乙醚洗去乙醇，干燥（或60～80℃烘干）后保存。加乙醇时，切忌一上来就用浓乙醇处理，以防结块对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋白质的分子量都大于5000D，而无机盐的分子量一般在几十到几百之间。所以常选用Sephadex&G-25凝胶作为分离固定相，因为它的分离范围是1000～5000D。被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧。大分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其Kd值的差可达最大值1。对于分子量小于5000D的肽类进行脱盐操作则常选用Sephadex&G-15凝胶。另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后者对实验条件和操作要求都比较高。下面以最常用的葡聚糖凝胶类为例，分别加以讨论&。葡聚糖凝胶离子交换剂使用方法新购进的阳离子交换剂（如CM-Sephadex&C-25）为Na型，阴离子凝胶交换剂（如DEAE-Sephadex&A-25）为Cl-型，使用前要按一般离子交换剂的使用方法进行转型处理。1g阴离子交换剂约用100mL,0.5mo1/L&NaoH溶液浸泡20min后减压过滤，充分洗涤，再用等量0.5mol／L&HCL处理，洗至中和备用。阳离子交换剂lg约用100mL&0.5mol／L&HCL浸泡20min后过滤，充分洗涤，再用等量0.5mo1／L&NaOH溶液处理20min，洗至中性备用。将以上处理好的葡聚糖凝胶离子交换剂，用20～30倍量与层析时所用的同种缓冲液浸泡（但浓度要高，如0.1～0.5mol／L），再用同种酸或碱调节至所需要pH值，放置1h后，待pH值不变即可减压过滤。
&&根据分子所带电荷差异电泳法、等电聚焦等。离子交换层析法（IEX）：原理：首先是根据蛋白质的带电类型（阳离子或阴离子），然后根据其相对电荷强度进行分离。：阴离子交换层析：蛋白质带负电荷，则要求，但不能高于介质功能基团的；阳离子交换层析：蛋白质带正电荷，则要求，但不能低于介质功能基团的；缓冲溶液：阴离子交换层析：&&&阳离子交换层析：。带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。阳离子交换剂带负电荷，与阳离子交换；阴离子交换剂带正电荷，与阴离子交换。常见问题分析：不吸附：缓冲溶液不对；离子强度太高；峰形不稳或出现奇异峰：柱床中有气泡或缓冲溶液不纯分辨率低：梯度太大；流速太高前沿峰：柱过载；填充效果差；柱需再生峰拖尾：样品在柱滤膜上或凝胶床顶部沉淀基线随梯度上移：盐浓度临近离子交换树脂2.离子交换纤维素&&阴离子交换纤维素如纤维素以下分离中性或酸性物质具二乙胺乙基&&阳离子交换纤维素如纤维素一般条件下使用具有羧甲基3.离子交换凝胶分离大分子物质离子交换剂的选择考虑因素：被分离物质带何种电荷被分离物质分子的大小大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素被分离物质所处的环境被分离物质的物理化学性质被分离物质的大概数量根据疏水性不同：疏水层析（HIC）、反相色谱（RPC）：&原理：是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子迁移速度快而先被洗脱下来。一般使用甲醇、乙腈作流动相，使得蛋白质容易变性失活；常用于分析，与在水有机相中稳定的多肽和低分子量蛋白质的分离。蛋白质的分离纯化方法梯度淋洗装置外梯度利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度一台高压泵通过比例调节阀将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。示差折光检测器：可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；亲和层析（AC）：色谱技术
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离子交换层析法纯化原核表达的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白
摘 要：目的纯化原核表达的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）蛋白。方法将pET28a-TRIAL转入BL21（DE3）,先进行硫酸铵初级分离,然后利用CM Sepharose阳离子交换柱进行离子交换层
【题　名】离子交换层析法纯化原核表达的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白
【作　者】王琼秀 周菁
【机　构】湖北省赤壁市人民医院 湖北赤壁437300 湖北省武汉市结核病防治所 湖北武汉430030
【刊　名】《中国药业》2013年 第10期 51-53页　共3页
【关键词】肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 离子交换层析 纯化
【文　摘】目的纯化原核表达的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）蛋白。方法将pET28a-TRIAL转入BL21（DE3）,先进行硫酸铵初级分离,然后利用CM Sepharose阳离子交换柱进行离子交换层析进行纯化。结果在20℃条件下,使用0.5 mmol/LIPTG诱导8 h,TRAIL蛋白表达量达到最大;经硫酸铵初步分离和离子交换层析纯化后,从1L菌液纯化得到5.8 mg纯净的TRAIL蛋白。结论成功建立了一种原核表达TRIAL蛋白的大规模纯化方法。
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肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体,离子交换层析,纯化
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KL17.HC99-3蛋白纯化系统 ，离子交换层析装置
点击次数：91&&发布时间：[更新时间: 9:50:51]
公司名称：北京多乐仪达科技有限公司
所在地点：中国大陆
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简单介绍：
KL17.HC99-3蛋白纯化系统 离子交换层析装置 KL17.HC99-3蛋白纯化系统 离子交换层析装置 KL17.HC99-3蛋白纯化系统 离子交换层析装置
主&&要&&技&&术&&指&&标
KL17.HA99-3
（普通配置）
自动核酸蛋白
KL17.HD-4电脑核酸蛋白检测仪；KL17.BS-100A自动部份收集器;
KL17.HL-2恒流泵；层析柱：&P1.0&40，&P1.6&50各一支
检测波长：254、280 输液流量：1~10ml／min；双通道
收集试管：100支，12ml／支；定时收集：1秒~9999分
自动绘制层析洗脱图谱、保存、分析计算实验数据
KL17.HB99-3
（高级配置）
自动核酸蛋白
KL17.HD-5电脑紫外检测仪；KL17.HL-2S恒流泵2台；
KL17.CBS-B程控多功能全自动部份收集器；品牌笔记本电脑；
普通层析柱：&P1.6&40一支，中压层析柱：&P2.5&40一支
检测波长：220 nm、254 nm、280 nm、340nm
输液流量：1~10ml／min，双通道，数显
收集容量：100支，12ml／支，X-Y移动方式，可编程控制
定时收集：1秒~9999分；定滴收集：1~9999滴
定峰收集：0~1000mV
自动绘制层析洗脱图谱、保存、分析计算实验数据
KL17.HC99-3
（离子交换
&层析配置）
自动核酸蛋白
KL17.HD-9离子交换层析检测仪；KL17.HL-2恒流泵2台；
KL17.BS-160A自动部份收集器；KL17.TH-1000梯度混合器；
层析柱：&P3.5&30；&P5.5&40各一支
检测波长：254、280nm；电导测量范围：0~200mS／cm
收集试管：160支，5ml／支；定时收集：1秒~9999分
输液流量：1~10ml/min，双通道
梯度溶液：2000 层析固定架：承重2kg，开口18mm；
双坐标界面，同时显示洗脱峰/线性梯度图谱，多种格式数据存储
KL17.HD99-3
（耐有机溶剂配置）
自动核酸蛋白
KL17.HD-4电脑核酸蛋白检测仪；KL17.HL-2N恒流泵；
KL17.BS-100N自动部份收集器；
普通层析柱：&P1.0&30一支，中压层析柱：&P1.2&40一支
检测波长：254，280nm；输液流量：1~10ml／min；双通道；
收集试管：100支，12ml／支
定时收集：1秒~9999分；系统耐有机溶剂
自动绘制层析洗脱图谱、保存、分析计算实验数据
KL17.HE99-3
（恒温层析配置）
自动核酸蛋白
KL17.HD-5电脑紫外检测仪；KL17.HL-2S恒流泵；KL17.CXG-1层析柜；
KL17.SBS-100数控计滴自动部份收集器；
普通层析柱：&P1.6&40一支，中压层析柱：&P2.5&40一支
检测波长：220、254、280、340nm；输液流量：1~10ml／min；
收集试管：100支，12ml／支；定时收集：1秒~9999分；
定滴收集：1~9999滴；系统温度：0~45℃
自动绘制层析洗脱图谱、保存、分析计算实验数据
KL17.HF99-3
（微量样品分
离纯化配置）
自动核酸蛋白
KL17.HD-7电脑高灵敏度紫外检测仪；KL17.HL-1恒流泵；
KL17.BS-160A自动部份收集器；
普通层析柱：&P1.0&20一支，中压层析柱：&P1.2&20一支
检测波长：254、280nm；最小检测量：50ug/ml
输液流量：0.006~20ml／min
收集试管：160支，5ml／支；定时收集：1秒~9999分
软件配置：BP-9600色谱工作站（含层析图谱分析软件）
公司名称： 北京多乐仪达科技有限公司
电　　话： 86-010- /
手　　机：
联 系 人： 郭先生 (联系我时请说明是在阿仪网看到的！谢谢)
传　　真： 86-010-
E-mail： bjaw.
详细地址： 北京市昌平区立汤路188号
邮　　编： 102218
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