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小叶同学在研究蚕豆叶片上、下表皮气孔密度（单位面积气孔数目）时，采用了以下三种方案进行实验．方案一：用显微镜观察同一张蚕豆叶片的上、下表皮装片．方案二：把新鲜的蚕豆叶片浸没在60℃左右的热水中（如图所示），观察叶片两面的气泡数目．方案三：在一株生长旺盛的蚕豆植株上选取一片蚕豆叶，用滤纸把它上、下表皮的水分吸干，将两张浸有氯化钴溶液的蓝色滤纸（遇水会变红）相对应地贴在叶片上、下表皮的表面，并用回形针将其固定，观察贴在叶片上、下表皮上的滤纸，哪一张先变色，哪一张的颜色深一些．（1）采用方案______可以观察到叶片的保卫细胞．（2）方案二中观察到______现象，说明叶片下表皮气孔密度比上表皮大．（3）小叶采用方案三进行实验，贴上滤纸后经过较长时间，发现两张蓝色滤纸颜色都变为一样红．小叶同学认为蚕豆叶片上、下表皮气孔同样多，与方案二实验结论不一致．于是去问老师，老师询问了小叶的实验过程后，指出小叶用方案三所做实验的结论不可靠．你认为老师这样判断的理由是______．
题型：填空题难度：中档来源：衢州
（1）叶的保卫细胞很小，只有在显微镜下才能够看达到．（2）把新鲜的蚕豆叶片浸没在60℃左右的热水中（如图所示），观察叶片两面的气泡数目．下表皮气泡的数目比上表皮多．（3）在一株生长旺盛的蚕豆植株上选取一片蚕豆叶，用滤纸把它上、下表皮的水分吸干，将两张浸有氯化钴溶液的蓝色滤纸（遇水会变红）相对应地贴在叶片上、下表皮的表面，并用回形针将其固定，贴上滤纸后经过较长时间，发现两张蓝色滤纸颜色都变为一样红．小叶同学认为蚕豆叶片上、下表皮气孔同样多，与方案二实验结论不一致．原因是，实验时间过长导致两张滤纸都吸收了足够的水分．故答案为：（1）一 （2）下表皮气泡的数目比上表皮多（其他合理答案，酌情给分）（3）实验时间过长导致两张滤纸都吸收了足够的水分（只回答“吸收了足够的水分”或“时间过长'”得1分；其他合理答案，酌情给分）
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据魔方格专家权威分析，试题“小叶同学在研究蚕豆叶片上、下表皮气孔密度（单位面积气孔数目）时..”主要考查你对&&科学研究方法&&等考点的理解。关于这些考点的“档案”如下：
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科学研究方法
科学探究的定义：科学探究是指为了能积极主动地获取生物科学知识，领悟科学研究方法而进行的各种活动。通俗地说，就是让我们自己去发现问题．主动去寻找答案，而不是被动地接受知识。科学探究重在探索的过程，而不是只注重答案本身。科学探究的过程：
探究实验遵循的一般原则：单一变量原则和对照原则①单一变量原则：控制其他因素不变，只改变其中一个因素(要研究的因素)，观察其对实验结果的影响。遵循单一变量原则，既便于对实验结果进行科学的分析．又能增强实验结果的可信度和说服力。 ②列照原则：通常一个实验分为实验组和对照组。实验组是接受实验变量处理的对象组。对照组，也称控制组，对实验而言，是不接受实验变量处理的对照组。从理论上说，由于无关变量对实验组与对照组的影响是相等的，故实验组与对照组两者的差异。则可认定为是来自实验变量的效果，这样的实验结果是可信的。按对照实验的内容和形式上的不同．通常可分为：空白对照、自身对照、相互对照和条件对照。 探究实验设计的思路：操纵实验变量，控制实验变量，捕获反应变量①实验变量(自变量)：实验中由实验者操纵的因素或条件。例如：温度(60℃、沸水、冰块)等。 ②反应变量(因变量)：由实验变量而引起的变化结果。例如：淀粉遇碘后的变蓝现象。 ③无关变量：实验中除实验变量外的影响实验结果与现象的因素或条件。例如：试管的洁净程度、实验的时间长短等。 ③额外变量：由无关变量引起的变化结果。 特别提醒：①并不是所有的问题通过一次探究就能得到正确的结论。有时，由于探究的方法不够完善，也可能得出错误的结论。因此，在得出结论后，还需对整个探究过程进行反思。 ②在科学探究中要坚持实事求是的科学态度，既要以一定的科学知识为基础，又不能被原有的知识所束缚。当科学探完的结论与原有的知识发生矛盾时，应大胆地修正原有的知识。&科学探究的基本方法：①观察法观察法是科学探究的一种基本方法。生物科学的很多重大发现或发明都源于细致的观察。观察法就是在自然状态下，研究者按照一定的目的和计划。用自己的感观外加辅助工具，对客观事物进行系统地感知和描述，以发现和验证科学结论。 a. 观察的类型b．科学观察的特点：第一．要有明确的目的。第二．要掌握正确的观察方法，即从宏观到微观、从整体到局部。第三．观察时要全面，细致和实事求是。第四.& 及时做好观察记录。 ②调查法调查是科学探究常用的方法之一，是了解生物种类、生存环境和外部形态等常用的研究方法。调查者以正确的理论与思想作指导，通过访谈、问卷、测验等手段．有计划地，广泛了解．掌握相关资料．在此基础上进行分析、综合、得出结论。科学调查的步骤：明确调在的目的和调查对象一制订合理有序的调查方案→实施实验调查方案。并如实做好记录→对调查情况和结果进行整理和分析→写出调查报告。生物调查活动的注意事项：调查是一项科学工作。对于所看到的生物，你不管是否喜欢它，都要认真观察，如实记录；不要损伤植物和伤害动物，不要破坏其生活环境；注意安全，集体行动。 ③实验法生物学是在实验的基础上建立和发展起来的一门自然科学。利用实验的方法进行科学探究是现代生物学的重要方法。实验法就是利用特定的器具和材料，通过有目的、有步骤的实验操作和观察，记录、分析，发现或验证科学结论。 ④测量法(略)规律总结：①科学探究是认知的主要途径、方法和过程，适用于自然科学和社会科学。 ②认知生物的形态、行为的方法主要是观察法。 ④认知生物的结构、生理的方法主要是实验法。④认知未知且周围不存在的生物的方法主要是文献法。
细胞结构不等于严整结构：&&&& 严整结构是指生物结构的完整性和严格有序性。有的同学认为病毒没有细胞结构，也就没有严整的结构，这是不对的．因为：①病毒也是生物，生物都具有严整的结构；(②病毒几乎都是由蛋白质和一种核酸（DNA和RNA）构成的。在病毒中蛋白质总是构成外壳，核酸位于外壳包围围的核心，因而核酸受到蛋白质的保护。研究表明，将病毒的两大成分分离开，用单纯的核酸去感染寄主，感染的能力下降，这说明病毒的结构也是完整有序的。总之，严整的结构是所有生物的结构特征。
辨析生物各种基本特征之间的关系：除病毒外生物都是由细胞构成的。细胞是生物进行生命活动的结构基础，是生物进行新陈代谢前基本场所。新陈代谢是生物体进行一切生命活动的基础。应激性、生长和繁殖都是在新陈代谢的基础上表现出来的，生物通过应激性来适应周围环境，生长发育和繁殖使生物物种得以延续。应激性，反射和适应性的区别：&&&& 应激性是指一切生物在生长发育的过稃中，对外界各种刺激所发生的反应，它是牛物的基本特征之一，生物体对刺激发生反应是需要定的结构来完成的，单细胞动物通过原生质来完成。而多细胞动物则主要通过神经系统来完成，对后者而言，通过神经系统对各种刺激发生的反应称为反射。可见，反射是应激性的一种表现，但它所包含的范围较窄，只有高等动物和人类才具有。植物虽然没有反射活动，但仍具有应激性，如茎的向光件、根的向地性等。&&& 适应性也是生物的基本特征之一，它是指生物体与环境相适应的现象。例如，肉食动物有锐利的牙齿、尖锐的爪、盲肠退化等适应性特征。适应性的形成是生物体在一定环境条件下产生的有利变异经过长期的自然选择，并通过遗传逐代定向积累而来的。牛物体所表现出的适应特征，如保护色、拟态，警戒色等，都是通过遗传传递给子代，并非是生物体接受某种刺激后才产生的，这点与应激性是不同的。对生物进行归类是生物学中常用的一种方法。归类有以下几种不同依据：（1）根据生物的形态结构特点归类，生物可分为植物、动物和其他生物三大类。（2）根据生物的生活环境，可分为陆生生物和水生生物。（3）根据生物的用途，可分为家禽、家畜、宠物、作物等。
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蒙古荚叶片解剖结构及其在城市景观和环境保护中的生态学意义
&&?o?o利用光镜和扫描电镜观察了蒙古荚的叶片表皮形态和解剖结构特征,对比欧洲荚,对其叶片结构的分化、气孔器与表皮毛、腺毛的密度和分布、角质层及蜡质纹饰等特征进行了研究。结果显?o示,其叶片形态和解剖结构与生态适应性之间有很强的相关性。蒙古荚落叶迟,且抗寒、抗旱、
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植物组织器官培养技术
第十二章 植物组织器官培养技术植物组织培养包括根、茎、叶、叶柄、花器、 茎尖、幼胚、花药、花粉、果实等的无菌培养。 §1. 植物脱毒及快速繁殖技术 §2. 花药及小孢子培养 §3. 植物胚胎培养 §4. 组织培养常见问题及对策§1.植物快速繁殖及脱毒技术一、基本概念 离体无性繁殖(propagation in vitro) ：利用
离体 培养技术，将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、 鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，在短期内 获得大量遗传形状一致的个体的方法。也称之为微 繁(micropropagation)、快速繁殖（rapid clone progagation）。 单株无性系或单芽无性系：用上述方法得到的植株 群体来自一个单株或单芽，他们的遗传组成相同， 称为单株无性系或单芽无性系芽（单芽、丛芽）植物脱毒（virus elimination）：利用植物组织 培养技术，脱除植物细胞中浸染的病毒，生产健康 的繁殖材料。 体细胞胚或胚状体：离体培养下没有经过受精过程， 但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管 培养的细胞是体细胞还是生殖细胞）。繁殖系数（breeding coefficient）：也 叫增殖率，指每块外植体在一个培养周期 内增殖的倍数二.研究意义（1）繁殖速度快，经济效益高 （2）占用空间小，不受季节限制，便于工厂化育苗， （3）保持植物种性 （4）繁殖各种珍稀、濒危、名贵、突变物种。三、离体无性繁殖的程序（一）离体无性繁殖程序：（1）无菌培养物制备（2）培养物的增殖（3）生根培养（4）炼苗和移栽（5）再生植株的鉴定芦荟的植物组织培养过程1234567891011（1）无菌培养物的建立 无菌培养物的建立程序包括：外植体的选择－ 外植体灭菌－接种－培养等基本过程。（2） 培养物的增殖腋芽增殖； 不定芽增殖； 胚状体增殖; 愈伤组织增殖 原球茎增殖腋芽增殖 其特点是：培养方法简单，能高度保持遗传稳 定性，能长期继代繁殖。目前采用这一方式快 速繁殖的植物有石竹、马铃薯、甘薯、草莓、 葡萄、月季等。这一繁殖方式一般不需要添加 外源激素，如果某些植物需要使用激素，一定 要严格控制浓度，以防止产生愈伤组织。腋 芽 增 殖不定芽增殖特点：繁殖系数高，非洲紫罗兰用常规叶插法，每片 叶只能产生几个或十几个芽，但在组培条件下可一次 形成几十至几百个芽，一年可以培养成千上万个小植 株。遗传稳定性较好。但继代次数有限。培养物继代 一定次数以后，不定芽形成能力即减弱，需要重新建 立起始无菌培养物。此外，不定芽需要进行生根培养 才能形成真正的植株。 诱导不定芽一般需要同时加入外源生长素和细胞分裂 素，二者的配比一般是细胞分裂素要略高于生长素， 其二者的总体使用浓度应尽可能的低，以免产生过多 的愈伤组织。以保证繁殖品种的遗传稳定性。
分离胚状体增殖特点：增长率高，双极性免去生根环节，但胚状 体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率仍不 高。目前除一些特殊用途外(人工种子)，这一途径还没有用于快繁技术。
愈伤组织增殖所有的植物通过组织培养的方法均可以诱导愈伤组织， 再进一步分化即可获得小植株。这一途径经历了组织 培养技术的所有过程(愈伤组织诱导－愈伤组织增殖 －芽分化－生根－完整植株)，它属于真正意义上的 组织培养。一切通过其它增殖方式不能成功的植物， 均可以通过此途径获得组培苗。其特点是成功率高， 繁殖系数大，但遗传稳定性较差。对品种要求遗传稳 定性高的作物一般不采用这一途径快繁
原球茎增殖 细胞或组织培养经原球茎途径分化成植株。 大部分兰花属于这一类型，即兰花的各个部分 的离体组织都能诱导形成原球茎，再经培养分 化形成植株。原球茎是兰花种子萌发时产生的 呈珠粒状、缩短的、类似嫩茎的器官。（3）生根培养生根是获得完整植株的一个关键。通过腋芽、不定 芽、愈伤组织途径产生的芽长成试管苗，必须诱导 生根才能移植。促使试管苗生根的方法通常有两种。 一种是在固体培养基上诱导生根。当试管苗长到2～ 3厘米高时，将它从基部切下，转移到固体培养基上 生根（生根培养基一般要求降低矿物营养的浓度， 提高生长素的浓度，具体应根据植物不同而定） 。另一种是浸泡的方法，将切下的无根试管苗泡在 含有高浓度生长素溶液中，生长素浓度为100毫 克/升左右，浸泡时间从几小时到1天，然后取出 接种于不加任何激素的MS培养基上或者扦插在人 工基质上，十天左右即可生根。移栽前的工作 a、培养瓶生壮苗 加入生长控制剂，如多效唑， B9（丁酰肼）， CCC（矮壮素），其作用是使苗粗壮，叶绿素增加。b、炼苗 将瓶盖打开，打破无菌环境，湿度 逐渐下降，光照逐渐加强，使之形成新的功能强 的根和叶片。一般炼苗时间为10―30D。移栽时应注意的问题 a、防止菌类滋生 ①苗底部培养基要洗干净 ②杀菌剂处理苗的根部 ③定时用杀菌剂处理种植基质 常用杀菌剂： KMnO4,百菌清、多菌灵、托不津，使用浓度0.1 ％b、保持小苗水分供给平衡 在移栽后5-7d内，应给予较高的空 气湿度条件（90%），使叶面的水分 蒸发减少，尽量接近培养瓶的条件， 让小苗始终保持挺拔的状态。保持 小苗水分供需平衡首先营养钵的培 养基质要浇透水，所放置的床面也 要浇湿，然后搭设小拱棚，以减少 水分的蒸发，并且初期要常喷雾处 理，保持拱棚薄膜上有水珠出现。 当5―7d后，发现小苗有长趋势，可 逐渐降低湿度，减少喷水次数，将 拱棚两端打开通风，使小苗适应湿 度较小的条件。约15d以后揭去拱棚 的薄膜，并给予水分控制，逐渐减 少浇水，促进小苗长得粗壮。c、移栽时选择合理的种植基质基质要疏松透气，有适宜的保水性，易于灭菌处理，不利于杂菌滋生：常 用珍珠岩，椰糠，蛭石，细沙，泥炭、锯木屑等。蛭石锯木屑泥炭珍珠岩椰糠红薯电热温 床育苗圃d、注意一定光照，温度条件 试管苗移栽以后要保持一定的温光条件，适宜的生根温度是 18―20℃ ，冬春季地温较低时，可用电热线来加温。温度过 低会使幼苗生长迟缓，或不易成活。温度过高会使水分蒸发， 从而使水分平衡受到破坏，并会促使菌类滋生。 另外在光照管理的初期可用较弱的光照，如在小拱棚上加盖遮 阳网或报纸等，以防阳光灼伤小苗和增加水分的蒸发。当小植 株有了新的生长时，逐渐加强光照，后期可直接利用自然光照。 促进光合产物的积累，增强抗性，促其成活。（5）鉴定再生植株的鉴定是指用细 胞学或形态学等方法检查 再生植株是否有遗传变异。（二）、应用领域（1）珍稀植物资源和育种原始材料，如工程植株、果 树芽变分离 （2）经济效益高，但难于繁殖的植物，如名贵花卉、 （3）用于有性繁殖变异范围大而自然条件下又不易无 性繁殖的植物，如非洲菊、花竹、紫罗兰等。 （3）用于自然繁殖极易感染病毒的植物，如马铃薯、 甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等等。 （4）繁殖销量大，但用常规的方法难以满足数量上需 要的植物，如草皮。四.植物的脱毒技术－基本原理当前脱除植物病毒的方法有：茎尖培养脱毒法；热 处理脱毒法；微体嫁接离体培养脱毒法；珠心组织 培养法；愈伤组织脱毒 （一）、茎尖脱毒 1、茎尖脱毒的依据。 病毒在植物体内分布是不均一的，越接近生长点约 （0.1-1mm区域），病毒浓度越稀，因此有可能采用 小的茎尖离体培养而脱除植物病毒。2、茎尖培养法脱除植 物病毒的技术关键 （1）、被脱毒植物携 带病毒的诊断及其在 体内的分布 再脱 毒之前，应了解植物 携带何种病毒，病毒 在体内的分布位置， 以确定培养茎尖的大 小（2）.母体植株的选择和预处理 母体的选择： 欲脱毒材料的品种典型性：关系到脱毒以后 的脱毒苗是否保持原品种的特征特性 植体健康程度选择：应选感病轻、带毒量少 的健康植株作为脱毒的外植体材料，这样更容 易获得脱毒株。外植体预处理：? ? ? ?香石竹在38～40℃条件下经两个月处理可除去全部病毒。 菊花在35～38℃的条件下处理60天可使病毒失活。马铃薯在37℃条件下处理10～20天能除去卷叶病毒。柑橘－速衰病毒/黄化病毒40℃/30℃条件下处理7～12周。 鳞皮病毒需要在40℃/30℃条件下处理8周。啐叶病毒需要在50℃条件下处理3～22小时。洲青果病毒在50℃条件下处理30～40分钟。（3）、茎尖的剥离 在切取外植体之前茎芽进行表面消毒。叶片包被 严紧的芽，如菊花、兰花，只须75%酒精中浸蘸一下， 而叶片包被松散的芽，如香石竹、蒜和马铃薯等， 则要用0.1%次氯酸钠或升汞表面消毒10分钟。对于 这些消毒方法，在工作中应灵活运用，如在大蒜茎 尖培养时，可将小鳞茎在75%酒精中浸蘸一下，再用 灯火烧掉酒精，然后解剖出无菌茎芽。
在剥取茎尖时，把茎芽置于解剖镜下（8~40倍），一只手用镊 子将其按住，另一只手用解剖针将叶片和叶原基剥掉，解剖针 要常常蘸入90%酒精，并用火焰灼烧以进行消毒。但要注意解 剖针的冷却，可蘸入无菌水进行冷却。当一个闪亮半圆球的顶 端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组织切下来， 为了提高成活率，可带1-2枚幼叶，然后将其接到培养基上。 接种时确保微茎尖不与其他物体接触，只用解剖针接种即可。 剥离茎尖时，应尽快接种，茎尖暴露的时间应当越短越好，以 防茎尖变干。可在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作， 有助于防止茎尖变干。将接种好的茎尖置于25℃左右的温度下。每 天以16小时 lx的光照条件下培养。由 于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所 以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎 尖需数月才能成功。 继代培养得到足够的检测苗、进行病毒检测。矮 牵 牛千 日 红（4）. 脱毒效果检测 A 指示植物鉴定(indicator test plants) 所谓 指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状 的寄主植物。 每种病毒都有自己敏感的植物，例如： 马铃薯病毒的敏感植物有千日红、黄花烟、心叶烟、 毛叶曼佗罗 大丽花病毒的敏感植物为：矮牵牛、黄瓜、苋色蓠 菊花病毒：矮牵牛、豇豆指示植物鉴定病毒的方法 a.摩擦接种法： 取培养植株的叶片置于研钵中，加 入少量的水和等量的0.1mol/L磷酸缓冲 液（pH 7.0），磨成匀奖，将其涂抹在 指示植株叶片上，在指示植物的叶片撒 上金刚砂，通过轻轻摩擦使汁浸入叶片 表皮细胞而又不损伤叶片。5分钟后用 清水清洗叶面。将指示植株放于防蚜虫 网罩的温室内。然后视其病斑的有无， 来判断是否脱除了病毒。 例如：植物液接种后如使千日红叶片枯 斑，黄花烟、心叶烟呈花叶，证明该植 物体内具有马铃薯X病毒b、嫁接法 有些病毒不是通过汁液传播，而是通过专门的介 体传播的，例如草莓黄花病毒、草莓丛枝病毒是 通过一种特殊的蚜虫为介体进行传播的。这种病 毒的鉴定，需将培养植株的芽嫁接在敏感植物上， 根据敏感植株的病症来判断是否脱除了病毒B 血清鉴定(serologic test) 试管沉淀反应； 免疫双扩散；酶联免疫吸附测定(ELISA)。病毒感染 动 物 人工注射 异体蛋白 动 物 免疫球蛋白 植 物带该种病毒（抗体） 血清反应 （抗原）a、试管沉淀反应 在抗原-抗体最适比例的条件下，观察有无沉 淀的产生来确定被测植株是否带病毒。试管沉淀 反应操作简单，需注意的问题： ①、叶绿体的自发凝聚 可用磷酸缓冲液提取汁液，再用氯仿处理除去 叶绿体，pH 保持在6.5-8.5） ② 、抗原抗体的比例要适当，当抗原过量时回 抑制沉淀的形成
b、免疫双扩散 在半固体凝胶中测定在其中扩散的抗原和抗 体间的沉淀反应的方法。与沉淀法比较起来有两个 优点：一是节约血清，二是汁液不用特殊处理。 步骤： ①倒胶，一般厚2mm ②打孔，多打成梅花型 ③加样，加血清和汁液。 一般加样后在37℃恒温过夜，即可进行结果观察。 有扩散沉淀的即为带毒株，没有则为不带毒株
c、酶连免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA） 它是将抗原、抗体的免役反应和酶的高效催化 反应有机结合起来的一种综合性技术。即通过化学的 方法将酶与抗体或抗原结合起来，形成酶标记物。然 后将它与相应的抗原或抗体起反应，形成酶标记的免 疫复合物。结合在免疫复合物的酶，在遇到相应的底 物时，催化无色底物生成有色底物，通过比色计可以 准确测定。优点是灵敏度高，测定快速，每次可以同 时测定多个样品。
人T淋巴细胞电镜照片C 电镜检查法 采用电子显微镜，可直接观察样品材料有无病 毒存在，还可以进一步鉴定病毒颗粒大小、形状和 结构，这些特征相当稳定，因此电镜检查法即准确 又有效，但需要有一定的设备和技术。D 分子检测法 例如RT-PCR（Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reation）将待测的样品的总RNA 与cDNA合成的试剂盒进行反应，合成cDNA，然后利 用病毒DNA特有的序列设计引物进行PCR反应，即可 知道在寄主中是否有病毒基因的表达(5).脱毒苗的保存与繁殖?脱毒苗的离体保存与繁殖:一般是在实验室进行，一般每月继代一次，可以在培养基中加入生长延缓剂，如B9和矮壮剂可2-3 个月继代一次，也可放到液氮或4℃冰箱中保存?建立脱毒种苗生产繁殖网络体系：如果试管苗生产成本过高或移栽困难，可将试管苗选择种植在一定的控制区域，从繁殖技 术和环境隔离上保证较高水平，使得繁殖的种苗能有效的防止 病毒的再侵染（6） 影响脱毒效果的因素?母体材料病毒侵染的程度:单一病毒感染的植株脱毒 较容易,而复合浸染的植株脱毒较难 外植体的生理状 态:顶芽的脱毒效果比侧芽好,生长旺盛的芽比休眠芽 或快进入休眠的芽好 起始培养的茎尖大小:不带叶原 基的生长点培养脱毒效果最好,带1-2个可获得40%脱 毒苗? ?茎尖大小对马铃薯脱毒效果的影响茎尖长 (mm)0.12 0.27 0.6叶原基 数1 2 4小植株 数50 42 64脱毒植株 数24 18 0脱毒率 （％）48 42.9 0(二)热处理脱毒法1、原理 ①病毒进入植物细胞后，随植物细胞的DNA一起复制 ②热处理是一种物理效应，可以加速植物细胞的分依据病毒对高温的敏感，寄主耐高温。利用 这一差异，选择适当的温度和处理时间，进 行高温处理，就能使寄主体内病毒浓度降低， 传递速度减慢或失去活性，而寄主细胞仍然 存活，并加快分裂和生长。2、热处理方法 （1）温水浸渍处理 适用于休眠器官、 剪下的接穗或种植的材料，在50℃左右的温 水中浸渍10分钟至数小时，方法简便易行， 但易使材料受伤。（利用较早，二十世纪二 十年代对甘薯一种病毒脱除效果较好。50－ 52℃温水浸渍30分钟）（2）热空气处理 热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好，将生长的盆栽 植株移入温热治疗室（箱）内，一般在35-40℃。处理时 间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。香石竹于 38℃下处理两个月，其茎尖所含病毒即可被清除。马铃 薯在35℃下处理几个月才能获得无病毒苗。草莓茎尖培 养结合36℃处理6周，比仅用茎尖培养可更有效地清除 轻型黄斑病毒，亦可采用变温法，如马铃薯每天40℃处 理4小时，可清除芽眼中马铃薯的叶片病毒，而且保持 了芽眼的活力。热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒。 例如在马铃薯中，应用这项技术只能消除卷 叶病毒。一般来说，对于球状病毒和类似纹 状病毒以及类菌质体所导致的病害才有效； 对杆状和线状病毒的作用不大。因此热处理 需与其他方法配合应用才可获得良好的效果。（三）微体嫁接离体培养脱毒法木本植物茎尖培养难以生根形成植株，可以采用 此法。将极小的茎尖（0.14mm-1.0mm）作为接穗嫁接 到种子实生苗砧木上，然后将砧木、接穗一起在培养 基上培养。接穗在砧木上易成活，且去除病毒几率大， 故有可能获得无病毒苗。 点接法的具体操作： （1）砧木苗的培养：采集充实无病的种子，漂洗晾 干低温处理后进行表面灭菌，在无菌条件下接入固体 培养基中，每试管2-3粒种子，27℃恒温暗培养10-14 天的白化苗，即可作为小砧木（2）接穗的准备与嫁接：摘去叶片促使枝条 绽发新芽，待芽长到0.5-1cm时即可做接穗。 表面灭菌后，在无菌条件下借助解剖镜切取 0.1-0.2mm的茎尖作接穗；切去砧木苗的顶端， 以根部和1cm的上胚轴做砧木，在其顶端用刀 尖切1-2mm的切口，将接穗垂直而无损的镶进 小切口，然后将其移入适合接穗生长的液体培 养基中培养
（四）珠心组织培养法 柑橘类除合子胚外还有多个珠心胚。珠心组 织与维管系统没有直接联系，而病毒一般认 为是通过维管组织传播的，因此珠心组织培 养可获得无病毒植株（五）愈伤组织脱毒植物各种器官和部位组织经诱导可产生愈伤组织， 再分化培养产生芽，最后产生小植株，其中有可能 得到无病毒小苗。这一脱毒途径已在马铃薯、天竺 葵、大蒜、草莓等植物上获得了成功。通过愈伤组 织培养获得再生无病毒植株的原因有以下几种可能： （1）病毒在植物体内不同器官或同一器官不同组织 中分布不均匀，由那些无病毒细胞产生的愈伤组织 就是获得无病毒苗的基础。如烟草、康乃馨产生的 愈伤带病毒和不带病毒的愈伤组织颜色不同（2）有些愈伤组织细胞病毒浓度较低，在愈伤 组织细胞快速分裂的过程中，病毒的复制能力衰 退或丢失 （3）愈伤组织产生抗性变异细胞。§2.花药及花粉培养 一. 花药培养 二. 花粉及小孢子培养
一、花药培养1．概念 花药培养(anther culture):把发育到一定 阶段的花药接种在人工培养基上,使其发育 和分化成为植株的过程.Tobacco anther with developing haploid plantlet, arising from the microspore2、花药培养 的基本程序是： 外植体选择－ 外植体(花蕾) 预处理―外植 体消毒―剥取 花药―接种― 诱导培养―分 化培养-移栽?（1）外植体的选择基因型的选择 通过花药培养成功获得单倍体植株最多的是茄科植 物，其次是十字花科、禾本科、百合科等植物。 同一植物的不同类型、不同品种对花药培养的反应 也是不同的。 因此在进行花药和花粉培养时，应选择那些容易培 养成功的材料来做。?供试材料的生理状态在多年生植物中，幼年植株比老龄植株的花药诱导频率高。草本植物生长健壮、且处于生殖生长高峰期的花药诱导频率高，徒长或营养不足的植株花药培养的诱导频率低。?花粉的发育时期四分体 ― 小孢子 ― 单核花粉 ― 双核花粉 最适期 涉及到具体的植物，花药培养的取材时期并不绝 对相同，如番茄以减数分裂期的幼嫩花药为好， 而云苔属植物的某些材料则以花粉成熟时的花药 为好。在花药培养中，如果每次取材时都要进行花药发育时期观察是 很不方便的，一般是在试验之前，对花药的发育时期和其相对 直观的生长发育特点进行相关研究，通过直观的对应性状来确 定花粉的发育时期，如花粉发育时期与花药大小、花蕾大小、 花冠展开程度、旗叶与倒二叶之间的距离等的关系，然后根据 这些直观特征判断花粉发育时期，取材。例如： 柑橘在花冠露白时大多数花药处于单核晚期 马铃薯在花冠漏出萼片一半时大多数处于单核晚期 烟草则在花冠漏出1/3-1/2，花冠和花萼等长时为花药培养的 最佳时间。 小麦：幼穗中部在倒二叶的叶耳的上下1厘米之间。(2)花药预处理为了提高花药培养的成功率，需要在接种前对实验 材料进行各种预处理，已经证明有效的预处理方法 有： A低温预处理 低温预处理可以明显提高花粉胚的诱导效率。但各 种植物要求的温度和处理时间有差异：烟草 10～14天 马铃薯4℃7～9℃7-14天 柑橘 2天水稻 3℃10℃ 5～10天低温预处理的作用机理，学者们提出以下几点： 1）预处理引起花药、花粉内源激素发生变化，改变了小孢子 （花粉粒）第一次有丝分裂的轴向发育（正常发育时，两次有 丝分裂形成三核花粉粒），进而形成愈伤组织或胚状体。 2）提高小孢子的生活力，延缓退化速度，而提高了诱导率。 3）引起小孢子孤立化，即小孢子从花药中分离。因为低温处 理过程中，花药内薄壁细胞和绒毡层逐渐退化，从而切断与小 孢子之间的联系。 无论哪种机理正确，但结果是预处理能促进花粉启动，提高 诱导率和再生率。?B热处理 在一些物种中（芸苔属），将花芽或完整植 株在30℃下处理24h或40℃下处理1h，能够 刺激花粉的胚胎发生。或者接种以后将其放 在高温下处理3-8天，可以显著提高花粉植 株诱导率。已在小麦，甜椒中得到应用。C、离心预处理 Tanaka将单核后期的烟草花药在r/min的速度下离心30min，产生小植 株的频率从30.5%提高到38.2%D乙烯利预处理 培养基中较低浓度的乙烯利（40mg/L）对花粉愈伤 组织的形成有明显的促进作用。可能原因促使花粉 的分裂。E甘露醇预处理 将花药在0.3mol/L甘露醇溶液预培养3-5d，可以提 高花粉胚的诱导率。重蒸水表现出与甘露醇相似的 结果。这可能是由于这种处理方式使小孢子处于碳 饥饿状态，导致花粉从正常发育途径转向雄核发育 途径。(3)外植体的消毒 挑出适宜培养的花蕾或幼穗，一般先将花蕾或幼 穗的表面用70%乙醇浸泡1min，然后在0.1%升汞中 浸泡3-5min，用无菌水冲洗3-5次。如果花蕾包裹 严密，内部一般是无菌的，比如小麦，只需用沾 有70%酒精的纱布对叶鞘进行表面擦拭就可达到灭 菌的目的。（4）接种将消毒过的材料置于超净工作台上，无菌剥取花药 进行接种，在剥取花药时，应注意在整个操作过程 中尽可能避免花药受到损伤，否则常常会刺激花药 壁形成愈伤组织，如果是花药较大的材料，可用镊 子剥开花蕾，夹住花丝，取出花药。如果花器很小， 则可以借助解剖镜夹取花药，或只把花被去掉，将 其余部分接种在培养基上，接种时尽量减少花药在 空气中的暴露时间。（5）培养基及培养条件培养基花药培养常用的基本培养基：H 、C17、MS（Murashigc & Skoog，1962）；Nitsch(Nitsch，1969)；N6(朱至清，1974)；B5(Gamborg et al.， 1976)。 附加成分：蔗糖, 植物生长调节物质。培养条件－温度和光照 温度：不同植物对温度的要求不同，如:柑 橘在20℃以下，完全不能形成胚状体，且愈伤组 织形成亦很少，当将温度提高到21～25℃时便会 有胚状体形成，而当温度提高到26℃以上时又完 全不能形成胚状体。 油菜若将接种后的花药在30℃条件下培养 2～3天，可显著提高花粉胚的形成率，小麦在 33℃条件下培养3～5天，可提高成愈率和绿苗 率。 光照：先弱后强?（6）移栽移栽看来容易，其实不然。例如小麦等越冬作物， 花粉植株生长至适合于移栽的大小时，适值盛夏， 自然气温很高，按期移栽很难成活，应当在4℃冰箱 中冷藏越夏。9月底将试管苗取出在自然光下炼苗57d，然后洗净琼脂，进行移栽，移栽后在苗床上搭 盖塑料薄膜棚。 移栽前如果根系不发达，可以将试管苗的老根剪除 干净，移入生根培养基中诱导生根。禾本科植物在分蘖期，将花粉植物从土壤中挖出， 洗净根部泥土，浸泡在含有1%-2%二甲基亚砜秋 水仙碱溶液中，注意一定要将分蘖节没入药液中。 不同植物处理浓度和时间不同，小麦：0.04% 8h 水稻：0.2%24h，处理期间的温度最好保持 在8-15℃，处理后用流水冲洗数小时，重新移栽。3影响花药培养的因素①基因型 ②发育时期 ③植株的生理状态 ④预处理 ⑤培养基和培养条件 ⑥花药的接种密度（密度效应） ⑦培养的方法与方式：固体培养、液体培养 （Ficoll）、双层培养、分步培养、条件培养固体培养Anther and haploid plantlets on a solid medium containing activated charcoalA、液体培养法液体培养液层0.5mm左右，可以加入一些Ficoll作为 漂浮剂，使花药全部不下沉而漂浮在液面上，这样通 气良好，提高了培养效果，要注意及时转移沉于瓶底 部的长大的愈伤组织，否则会影响再分化培养的效果 液体培养具有一定的优越性： 在液体培养中不存在位置效应；可以在培养过程中补 加新鲜培养基和重新调整培养基的成分；液体培养有 利于花粉粒的释放及分裂形成愈伤组织 但如何掌握转分化的时期等细微环节直接影响到花 药培养的效果Anther and haploid plantlets on a liquid medium containing activated charcoalB、双层培养 在35mm*10mm的小培养皿中铺加一层（1ml） 琼脂培养基，固化后，在其表面再加入0.5ml 的液体培养基。 优点在于： 花药在培养的早期可以从活性高的液体培养 基中汲取营养，花粉胚长大后又不会沉没， 可以在通气良好的条件下分化成植株。Anther and haploid plantlets on a double layer medium. The solid lower part contains charcoal while the upper liquid layer contains the growth regulatorsC、条件培养基培养 用预先培养过花药的液体培养基再次进行 花药培养，可使花药培养效率大大提高。 条件培养基不存在种的特异性，例如培养 过小麦花药的培养基对大麦同样有效。4、花药培养中单倍体形成的途径 A、通过胚状体形成单倍体植株B、通过愈伤组织形成植株高浓度生长素产生愈伤组织，低浓度利 于胚状体的诱导。 通过愈伤易产生混倍体4、花药培养中单倍体形成的途径 A、通过胚状体形成单倍体植株B、通过愈伤组织形成植株高浓度生长素产生愈伤组织，低浓度利 于胚状体的诱导。 通过愈伤易产生混倍体马铃薯花药培养中胚状体和愈伤组织的倍性植株来源 倍性 细胞类型embryoidcallusnn / 2n / 2n+单个花粉粒单个或多个花粉粒、花粉 细胞与花药壁细胞等5、花药培养的意义 a、缩短育种年限 常规育种，杂种F2代开始分离，继续自 交，通过不断选择和淘汰，一般需到F5―F6 代能得到纯合后代。 用花药、花粉（n）培养，得到单倍体植 株，染色体加倍后，获得纯合二倍体（2n）。 这样，从杂交到获得纯合株系，只需二个世 代。因此，可缩短育种年限3―4个世代。
b、提高选择效率 F1花粉母细胞减数分裂形成各种各样配子类型， 进而发育成花粉。用花粉培养获得单倍体再生 植株（n），配子基因型在再生植物体中完全 表达，即再生植物基因型是多种多样的，为育 种选择提供了广泛的变异类型。并且隐性基因 可以得到充分表达。单倍体植物经染色体加倍 可获得二倍体植物。因此，花药、花粉培养与 常规育种相结合，可以大大提高育种选择效率。6、现阶段花药培养存在的问题①诱导频率低。频率最高的烟草也只有30%， 低的只有百分之几，千分之几 ②体细胞（花丝、药壁、药隔）干扰问题 ③倍性变异 ④药壁毡绒层细胞对花粉发育的作用，如何 用合成培养基代替毡绒层的作用，还不十分 清楚，目前培养基成分带有一定的盲目性。 ⑤白化苗问题二.花粉及小孢子培养1、概念 花粉培养(pollen culture):也叫小孢子培养 (microspore culture),是从花药中分离出花粉 粒,使之成为分散的或游离的状态,通过培养使花 粉粒脱分化,进而发育成完整植株的过程.优点（与花药培养比）： a、花药培养容易受药壁、花丝、药隔 等体细胞组织的影响，再生植株会出 现不同倍性的个体，而分离的花粉培 养可以克服这一不足。 b、能更好调节控制核发育的各种因子， 而且可以直接从单细胞开始观察整个 雄核发育的过程，为研究雄核的生理 生化等问题提供方便。 c、原则上将，从花粉培养能得到更多 的花粉植株。2．花粉培养的一般方法 ①预处理或预培养 要取得花粉培养的成功，必须在分离花 粉前，先对花粉进行一定时间的预处理或预培 养。②花粉粒的游离分离花粉粒，应达到以下标准 a：成活率较高，发育齐整b：达到一定的数量c无菌， 无杂质 常用的分离方法有： A是自然散粉法 a固体培养 把花药从未开的花中在无菌条件下，直接插接在无 菌培养基上，当花药自动裂开时，花粉散落在培养 基上，移走花药，使花粉继续培养生长。b液体培养 这一方法可以和预培养结合进行，一般是将消毒 后的花药接种在液体培养基中，在一定的温度条 件下进行振荡培养，让花粉从花药中自行散落到 培养基中，过筛再除去花药壁等，离心收集花粉 将其重新培养在新鲜培养基上。B机械分离花粉粒 a：挤压法。 此方法是将花药消毒后，加入少量的分离溶液，用 镊子或小玻璃棒将花粉从花药中挤压出来，通过不 锈钢网或尼龙网筛去组织碎片，收集悬浮液，然后 用30％蔗糖离心收取悬浮在蔗糖溶液上层的完整花 粉粒，再用培养基洗涤几次后用于培养。 注意 （a）挤压时用力要适当而且均匀（b）选 用合适的筛网孔径（c）分离液的渗透压要合适b、搅拌器或超速旋切机法 将小花放在含有一定培养液的微量搅拌器中， 在高速条件下搅拌一定时间，匀浆用筛网过滤， 滤液在1000g离心，用培养液洗涤数次，用 percoll（包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒） 密度 梯度离心收集花粉③．培养方法?看护培养概念：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞 使其生长增殖的一种单细胞培养方法。
条件培养 双层培养3、影响花粉培养的几个关键 与其他器官的培养技术相比，花粉粒培养还不成熟， 影响培养的效果可能很多，要非常系统归纳还不可 能，简述： A、在培养前分离的花药应多次洗涤，否则其生长 和形态发生将受影响，不洗涤的花粉不能生长或只 能形成愈伤组织 B、冷处理已广泛用来提高花粉雄核发育的频率 C、培养基中增加蔗糖和肌醇的浓度能明显提高雄 核发育的频率。§3.植物胚胎培养P163胚胎培养是指使胚或具胚器官在离体无菌条件 下发育成幼苗的技术。?根据在培养中所取的外植体的部位不同，植物 胚胎培养包括胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子 房培养。? ?胚珠和子房培养由于取材的时期不同，又包括：受精以后的胚珠子房培养未受精胚珠和子房胚胎培养的意义和类型p163A 克服远缘杂交的不育性，获稀有杂种植物 B 打破种子休眠，缩短育种年限。 主要有以下两种： （1）使种胚发育不全的植物获得后代。例如天麻、 兰花种子成熟时，胚只有6-7个细胞，利用离体培 养可以打破休眠提早萌发。 （2）使含抑制性物 质不发芽的种胚发芽。苹果属离体胚培养48h即可 萌发，而用种子则要9个月C、使柑橘类植物合子胚正常发育 这类植物种子内存在大量的珠心胚，珠心胚生 活力很强，因而往往得不到合子胚后代，影响杂交 育种结果，利用胚培养可以尽早取出合子胚进行培 养，从而获得杂种后代。D、获三倍体或单倍体植株 因被子植物胚乳细胞大多为三倍体，胚乳培养可以获 得三倍体植株，从而使植物胚胎培养成为一种新的育种 途径，用于果树、瓜类等经济作物产生无子果实。另外， 对远缘杂种的胚进行培养时，可以通过染色体消失法获 得单倍体。 E、快速繁殖特殊植物(椰子，山楂） F、用于基础研究 研究胚胎发育过程、胚胎发生的条件以及影响因素，胚 乳生长发育及形态建成过程。一.植物胚培养(embryo culture of plants) P165 1、胚培养的概念与类型 概念：在无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离 出来，置于培养基上进行离体培养的方法?（1）成熟胚培养 成熟胚一般指子叶期后至发育完 全的胚。它培养较易成功，在含有无机大量元素和糖 的培养基上，就能正常生长成幼苗。由于种子外部有 较厚的种皮包裹，不易造成损伤，易于进行消毒，因 此，将成熟或未成熟种子用70%酒精进行几秒种的表 面消毒，再用无菌水冲洗3-4次，然后在无菌条件下 进行解剖，取出胚并接种在适当的培养基上培养。（2）幼胚培养 幼胚是指 子叶期以前的幼小胚，由于 幼胚培养在远缘杂交育种上 有极大的利用价值，因此， 其研究和应用越来越深入和 广泛。随着组织培养技术的 不断完善，幼胚培养技术也 在进步，现在可使心形期胚 或更早期的长度仅0.10.2mm的胚生长发育成植株。 现在幼胚培养成功的有大麦、 甘蔗、甜菜、胡萝卜等。2．幼胚培养 (1) 幼胚培养的关键技术： ①取材(A)globular (B) heart shaped, (C) torpedo取材时期大多数幼胚培养成功的实例证明，适宜于幼胚培养的胚发育时期多为球形胚至鱼雷形胚。（原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体）以幼胚抢救为目的的胚培养取材，必须在胚退化衰败之前。②幼胚剥离胚剥离的成功与否是幼胚培养成功与否的关键。幼胚 是一种半透明、高粘稠状组织，剥离过程中极易失水干 缩，一定要注意保湿，且操作要迅速。有关胚发育的细 胞学和生理生化研究表明，胚柄积极参与幼胚的发育， 特别是球形期以前的幼胚培养，胚剥离时应带胚柄。另 外胚柄促进幼胚离体生长的作用能被浓度为5mg/L的GA 有效取代。③培养条件的控制（是否需要特殊处理）剥离出来的幼胚要立即接种到培养基上进行培养。在培养之前必须对所培养的对象在自然发育条件下的特性充分了解，比如胚的休眠问题、是否需要春花作用、胚萌发的温度等。?（2）幼胚离体培养的生长发育方式 P166①胚性发育(embryonal development)幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内的发育方式发育，最 后形成成熟胚(有时甚至可能类似种子)，然后再按种 子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚 一般一个幼胚将来就是一个植株。②早熟萌发(early mature sprouting) 幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在 培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发（未 经完成正常的胚胎发育过程而形成幼苗的现象叫早熟 萌发）。在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株， 但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形 成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就 是所谓的丛生胚现象。③愈伤组织(callus)在许多情况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。（3）离体幼胚培养的影响因素①培养基 胚的成熟程度不同，所用培养基的类型也不同。成 熟胚的培养基有：Tukey、White等。未成熟胚有： Rijven、Nitch、MS等。 培养基的渗透压对幼胚培养至关重要，渗透压的调 节主要依赖糖。常用的是蔗糖，不同发育时期的胚 要求蔗糖的浓度不同，胚龄越小糖浓度要求越高。 确定适宜蔗糖浓度的方法是在接种前将幼胚剥出后 放入若干浓度的蔗糖溶液中，观察质壁分离现象， 以确定等渗溶液的浓度。②附加物： a、AA类，无论是单一的还是复合的AA都能刺激胚的 生长。最有效的是Gln，常用的有Gly、Ala、Glu、 Asp。CH是一种AA复合物，有抑制早熟萌发和促进未 成熟胚发育的作用 b、维生素类。维生素对初期幼胚一般是必需的，但 有时也有抑制作用，最好在实验证实后使用。 c、天然提取物。常用各种胚乳汁、酵母提取物 d、生长调节剂③环境条件 对于幼胚培养，初期弱光和黑暗更适宜， 幼胚启动发育后给予和其自然光周期一致的光照 条件有利于幼胚发育。 培养的温度一般以该植物种子萌发的适宜 温度为好。④培养材料 植物培养材料的基因型和胚发育程度对离体胚 培养有重要影响。显然，材料基因型不同，胚 培养的难易程度也不同。 胚发育阶段以越幼嫩的胚越难以培养。二.子房培养(ovary culture)P175子房培养包括授粉前和授粉后的子房培养。 授粉前子房培养是为了获得孤雌生殖的单倍体植株， 适用于那些胚囊分离特别困难的植物；?授粉后子房培养适用于那些获得种子特别困难，胚分 离不易操作的植物，以获得种子或果实或植株。?1．材料的选择（1）品种间的差 异 （2）胚囊发育时 期：以八核胚囊 和成熟胚囊期的 子房培养具有较 高的诱导频率。?大麦胚囊发育时期与花粉发育时期的相关性 花粉发育时期 单核中期 单核靠边期 二核花粉期 三核花粉期 胚囊发育时期 大孢子四分体 单核至四核胚囊 八核胚囊 成熟胚囊2．培养基（1）基本培养基 不同培养基对于子房培养产生愈伤组织的诱导率 有直接影响，比较常用的培养基是N6、BN、MS，禾 本科作物以N6培养基较常用，其它植物则多用MS和 BN。（2）植物生长调节物质的影响 未授粉的子房培养必须加入适宜种类和浓度的植物 生长调节物质 （3）蔗糖浓度 蔗糖浓度多在3～10％之间，因不同植物材料而异， 一般是诱导培养阶段蔗糖浓度要高一些，分化培养 时蔗糖浓度要低一些。3.接种方式 主要考虑两个方面的问题：极性；营养吸收 花柄直插比平放效果好三.被子植物胚乳培养( endosperm culture)P1691．概况胚乳培养的研究主要集中 在以下一些问题的探讨： A、胚乳细胞的全能性。 B、能否通过胚乳培养获得 三倍体植株而得到无籽结 实； C、研究离体培养条 件下胚和胚乳的关系。 Triticum grainPlantlets arising from isolated endosperm tissue到目前为止，已有40多种植物的 胚乳进行了培养。其中苹果、柚、 橙、檀香、枸杞、猕猴桃、玉米、 大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、 梨、核桃等的胚乳培养得到了再 生植株。其它有的分化出芽、根、 叶等或得到愈伤组织。2．植物胚乳的发育特性植物胚乳可以分为两大类：被子植物胚乳和裸子植物 胚乳。?被子植物胚乳是双受精的产物，它由二个极核和一个雄配子融合形成，所以，在染色体倍性上它属于三倍体组织。?裸子植物胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳为配子体的一部分，由大孢子直接分裂发育而成，因此它属3．影响胚乳培养的因素（1）胚乳的发育时期： 胚乳发育时期大致可分为早期、旺盛生长期和成 熟期。旺盛生长期为最佳时期，这时的胚乳细胞处 于细胞形成期并保持旺盛的分裂能力。 几种植物胚乳培养的最佳时间(授粉后天数 玉 米 8-12天 大 麦 10～12天 黄 瓜 7～16天 小黑麦 7～14天 （2）基因型（3）培养条件：常用培养基是MS和White， 需要附加水解酪蛋白和酵母提取物。在诱导 期一般需要高浓度的生长素、较高的pH，分 化期需要较高浓度的细胞分裂素。 （4）胚因子 ：胚对胚乳的培养有一定的 影响4．胚乳培养的形态发生?愈伤组织形成最适发育时期的胚乳在离体培养条件下经过一定时间即可形成愈伤组织。?直接进行器官分化§4. 组织培养常见问题及对策P69 一、污染及控制 1、污染的含义：指在组培过程中培养瓶内滋生菌斑，使培养材料 不能正常生长发育，从而导致培养失败的现象。2、污染原因（从病原菌分析） （1）．细菌污染：菌斑呈黏粘液状，界限比较明显， 一般接种后1―2天即能发现。主要是大肠杆菌和链 球菌。 （2）．真菌污染：菌斑呈绒毛状、絮状，界限不明 显，伴有不同颜色的孢子接种后3―10天才能发现。 主要是霉菌污染。3、污染途径： （1）．外植体带菌 （2）．培养基及接种器具灭菌不彻底 （3）．接种操作时带入 （4）．环境不清洁4、污染的预防措施： A、 防止外植体带菌 （1） 选择好外植体采集时期和采集部位 ● 外植体采集以春秋为宜； ● 优先选择地上部分作为外植体； ● 阴雨天勿采，晴天下午采集； ● 采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋。 （2）室内或无菌条件下进行预培养。 （3）外植体严格灭菌 灭菌效果实验 多次灭菌和交替灭菌B、保证培养基及接种器具彻底灭菌 1． 分装时，注射器勿触瓶口。培养基勿粘瓶口 2． 检查封口膜是否破损 3． 扎瓶口要位置适当，松紧适宜 4． 保证灭菌时间和高压锅内温度 5． 接种工具用前彻底灭菌 6． 工作服、口罩、帽子等布质品定期进行湿热灭 菌C、操作人员严格遵守无菌操作规程D、 保证接种与培养环境清洁 （1） 污染瓶经高压灭菌后再清洗 （2）接种环境定期熏蒸消毒、紫外灯照射，或用臭氧灭菌机消 毒 （3）定期清洗或更换超净台初过滤器，进行带菌实验；接种前 15―20min打开风机，风速调整到20――30m/min，并对台面用 75%酒精喷雾消毒 （4）定期对培养室消毒，防止高温二、培养物的不良表现及改进措施 （一）、初始培养阶段1、培养物水浸状、变色、坏死、茎断面附近干枯 可能原因：表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当（部位或时 期）。 改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用其他部位，生 长初期取材。 2.培养物长期培养几乎无反应 可能原因：基本培养基不适宜，生长素不当或用量不足，温度不适宜。 改进措施：更换基本培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐离子浓度，增 加生长素用量，试用2,4-D，调整培养温度。3.愈伤组织生长过旺、疏松，后期水浸状可能原因：激素过量，温度偏高，无机盐含量不当。 改进措施：减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵 盐）含 量，适当提高琼脂用量增加培养基硬度。 4.愈伤组织太紧密、平滑或突起，粗厚，生长缓慢 可能原因：细胞分裂素用量过多，糖浓度过高，生长素过量。改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长 素比例，降低糖浓度。 5.侧芽不萌发,皮层过于膨大,皮孔长出愈伤组织 可能原因:枝条过嫩,生长素、细胞分裂素用量过多。 改进措施：减少激素用量，采用较老化枝条。6、初代培养外植体的褐变 外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时 甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出现是由于 植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢 发生变化所致。在褐变过程中，会产生醌类物质， 它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其 他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。（1）、褐变的主要原因如下： ①植物品种 研究表明，在不同品种间的褐变现象是 不同的。由于多酚氧化酶，而有些花卉品种的外植体 在接种后不容易褐变。因此，在培养过程中应该有所 选择，对不同的品种分别进行处理。 ②生理状态 由于外植体的生理状态不同，所以在接 种后褐变程度也有所不同。一般来说，处于幼龄期的 植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的 外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。 一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显， 而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。③培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植 物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高 也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使 褐变现象加深。 ④培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养 时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而 加速被培养的外植体的褐变程度。（2）、减轻褐变现象发生的方法 ①选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处 于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。 ②合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水 平、适当降低培养基温度，及时继代培养均可以减 轻材料的褐变现象。③使用抗氧化剂 半胱氨酸及其盐酸盐、二硫苏糖醇、 谷胱甘肽、抗坏血酸等。该类药剂一般需用浓度为 50-200mg/L。用经过滤灭菌的药液洗涤刚切割的外 植体伤口表面，或加入固体培养基的表层，或将刚切 割的外植体浸入其中一定时间。另外，使用0.1%0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。 ④连续转移 对容易褐变的材料可间隔12~24h的培养 后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7l0d后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。（二）、继代培养阶段 1.苗分化数量少、速度慢、分枝少、个别苗生长细高 可能原因：细胞分裂素用量不足，温度偏高，光照不足。 改进措施：增加细胞分裂素用量，适当降低温度，改善 光照，改单芽继代为团块（丛芽）继代。 2.苗分化过多，生长慢，有畸形苗，节间极短，苗丛密 集，微型化 可能原因：细胞分裂素用量过多，温度不适宜。 改进措施：减少或停用细胞分裂素一段时间，调节温度。3.分化率低,畸形,培养时间长时苗再次愈伤组织化 可能原因:生长素用量偏高,温度偏高。 改进措施：减少生长素用量，适当降温。 4.叶粗厚变脆 可能原因：生长素用量偏高，或兼有细胞分裂素用量偏高。 改进措施：适当减少激素用量，避免叶片接触培养基 5.再生苗的叶缘、叶面等外偶有不定芽分化出来 可能原因：细胞分裂素用量偏高，或表明该种植物适于该种再生方式。 改进措施：适当减少细胞分裂素用量，或分阶段地利用这一再生方式6.丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽可能原因：细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当，温度过高，光照 短，光强不足，久不转移，生长空间窄。 改进措施：减少细胞分裂素用量，免用赤霉素，延长光照时间，增强 光照，及时转接，降低接种密度。 7.幼苗淡绿，部分失绿 可能原因：无机盐含量不足，PH值不适宜，铁、锰、镁等缺少或比例 失调，光照、温度不适。 改进措施：针对营养元素亏缺情况调整培养基，调好PH值，调控温度、 光照。8.幼苗生长无力、发黄落叶、有黄叶、死苗夹于丛 生苗中 可能原因：瓶内气体状况恶化，PH值变化过大， 久不转接导致糖已耗尽，营养 元素亏缺失调，温 度不适，激素配比不当、缺铁等。 改进措施：及时转接、降低接种密度，调整激素 配比和营养元素浓度，改善瓶内气体状况，控制温 度。9、继代培养时材料的玻璃化 实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物 的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻 璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。 玻璃化为试管苗的生理失调症。 因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，因此，使繁殖系数大 为降低。在不同的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有 所差异。当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易出现玻 璃化现象。在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质， 能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合 物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常 移栽。这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性 较差造成的，其具体解决的方法为： ①增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势； ②减少培养基中含氮化合物的用量； ③增加光照； ④增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃 化的现象有明显的作用； ⑤降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化 的现象发生； ⑥降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。两个“增加”：增加琼脂浓度；增加蔗糖含 量； 两个“增强”：增强溶器通风；增强 光照； 两个“加入”：加入渗透剂；加入 ABA； 一个“减少”：减少培养基氮含量（三）、生根阶段 1、培养物久不生根，基部切口没有适宜的愈伤组 织 可能原因：生长素种类、用量不适宜；生根部位 氧气不良；生根程序不当；PH值不适，无机盐浓度 及配比不当。 改进措施：改进培养程序，选用适宜的生长素或 增加生长素用量，适当降低无机盐浓度，改用滤纸 桥液培养生根等。2.愈伤组织生长过快、过大，根茎部肿胀或畸形，几 条根并联或愈合。 可能原因：生长素种类不适，用量过高，或伴有细 胞分裂素用量过高，生根诱导培养程序不对。 改进措施：调换生长素种类或几种生长素配合使用， 降低使用浓度，减少愈伤，改变生根培养程序等。
第五章 植物组织培养技术实验方案_理化生_高中教育_...体的植物器官(根,茎,叶,花,果实等) 、组织(形成...2、菊花接种与培养: (1)取材: 取菊花生长旺盛的...第2章 植物组织培养技术_农林牧渔_专业资料。第2章一、授课章节 第二节 植物...的植物器官、组织、细胞以及原生质体培养在 人工培养基上,给予适宜的培养条件,使...(2)技术特点 无菌培养和外植体培养 (3)生产特点 ...双子叶&单子叶、草本&木本 12、外植体的接种主要有...17、各种植物组织器官的灭菌方法。 消毒程序 外植体 ...第一章 1、 植物组织培养: 是指在离体条件下,利用人工培养基对植物的器官、...6、操作技术 一、洗涤技术 1、玻璃器皿洗涤 新购置玻璃 器皿 已用过的玻 2...使其发育成完整植株的科学技术 2、脱分化(...7、胚状体发生: 在植物细胞、组织或器官体外培养过程...11、试管苗:通过组织培养产生的植株。 12、看护培养...基本技术 植物主要组织器官培养技术 原生质体培养和体细胞杂交 植物细胞培养及次...难点:细胞工程在生物技术中的地位和作用 第二章 细胞工程的理论基础 主要知识点...2、根据培养的外植体材料不同,可将植物组织培养分为以下几 种类型:愈伤组织培养、器官培养、胚培养 、 细胞培养 、原生质体培养 、遗传转化。 3、 植物组织培养...酒精和氯化钠 2、( B)大多数植物组织培养最适温度...B、利用细胞工程技术培养“番茄一马铃薯”杂种植株 C...进行培养, 又可以分化形成根、芽等器官,这一过程称...可以利用该植物的一部 分器官或组织进行离体培养,...12.下列关于对花药培养的有关认识,错误的是( ) A...若某二倍体植物同时进行这两项技术,结果都能得到...这节课我们来学习研究植物的组织培养技术。 (二)...组织、器官 (脱分化)愈伤 (再分化) 组织 (又叫...6～8 CAC 必修 1 教材第六章第二节 《细胞的...
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