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Western blot 实验技术及常见问题分析
作者：admin
信息来源：达科为
日期：2014年12月11日
Western&blot基本原理：
在电场的作用下将电泳分离的多肽从SDS-PAGE凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western&blot应用：
目的蛋白的表达特性分析；
目的蛋白与其他蛋白的互作；
目的蛋白的组织定位；
目的蛋白的表达量分析；
Western&blot一般流程：
蛋白样品的制备：
1 水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解&&度大，是提取蛋白质最常用的的溶剂，操作相对麻烦，重复性一般；
2&有机溶剂提取法；
3&离心管柱提取法：超快速，易用，高产及重复性强；
4&通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。
Western&blot注意事项和常见问题：
1&我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？
答：有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS&浓度，同时将样品煮沸时间延长；&也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。
2&我做的蛋白质分子量很小（10&KD），请问怎么做WB？
答：可以选择0.2&μm的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。
3 最后显色时用&DAB好还是ECM好？
答：DAB&有毒，但是比较灵敏，是HRP&最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg&级蛋白，具体可以根据你实验的情况。
4&要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western&blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？
答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western &blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定&量，但是不能定位。
& &②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。
5&细胞水平要做western&blot，多少细胞提的蛋白够做western&blot？
答：一般5×106就足够了。
6&同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对western&blot有无影响？
答：能，没有问题。
7 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western&Blot检测吗？
答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
8&蛋白变性后可以存放多久？
答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。
9&二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？
答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点。
10&做组织样品的western的时候，怎样处理样品？
答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性。
11&免疫组化和Western&Blot可以用同一种抗体吗？
答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。
12&在做Western&Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？
答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
13&检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？
答：可以。
14&蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？
答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAGE，湿转120mA，&45-60min就可以了，&可以根据你实验室的经验调节；170kd&用&7%&SDS－PAGE，200mA&90-120min。
15&细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？
答：一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。若有特殊要求可以选择相应的蛋白酶抑制剂。
16&PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？
答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。
17&westernblot内参选择什么合适？
答：这与目标抗原的表达位置有关，对于胞浆和全细胞蛋白，可选择内参β-actin、GAPDH和Tubulin；线粒体蛋白则可选择内参VCDA1/Porin和COXIV；核内抗原可以选择内参Lamin&B1、TBP和histone。
18 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低？
答：转移缓冲液中加入20%&甲醇（终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也能增加转移效率；使用戊二醛交联；降低凝胶浓度，如低至6-7%或提高转膜电压/电流，增加转移时间。
19 转膜时凝胶肿胀或卷曲？
答：可将凝胶在转膜前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min。
20 跑胶的条带歪斜或者漂移？
答：电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致，可更换或者在两块海绵之间垫上少许普通的草纸。
21 转膜后膜上有单个或多个白点？
答：转膜时确保膜和胶块之间没有气泡。
22 转膜缓冲液过热？
答：缓冲液中离子浓度太低，电流或者电压过高，转膜过程中注意降温。
23 显影后胶片背景太高？
答：转膜前PVDF膜没有用100%甲醇完全浸湿；洗膜不充分，可以增加膜洗涤次数；封闭不完全，选择合适的封闭液和提高封闭时间；二抗浓度过高，降低二抗浓度；一抗特异性不强，换用特异性较强的单克隆抗体；曝光时间过长，减少曝光时间。
24 结果没有条带或者条带很浅，杂交信号很弱？
答：样品中不含靶蛋白或者含量太低，可增加蛋白上样量，设置已知标准量蛋白的对照；抗体稀释比例太低，孵育时间不够；转膜不好，转膜后可先用丽春红染色观看染色效果；曝光时间过短，增加曝光时间；抗体保存不当，效价降低。
25 目的条带位置偏低或者偏高？
答：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶，小分子蛋白要用高浓度胶。
26 有非特异性条带？
答：目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带；一抗特异性不好，换用特异性较好的单克隆抗体；二抗非特异性引起的结果，可设立一组不加一抗只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异性结合；样品蛋白质可能降解，提取蛋白时注意冰上操作，加入适当的蛋白酶抑制剂，避免样品反复冻融；抗体浓度过高，降低一抗和二抗的浓度。
27 胶片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。&&&&&二抗的HRP&活性太强，将底物消耗光；ECM底物中H2O2，不稳定，失活；ECL底物没覆盖到相应位置；二抗失活。
28 目的条带是白色，周围有背景？
答：目的蛋白含量太高；一抗浓度偏高，二抗上HRP催化活力太强。
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利用样本目的蛋白的光密度比内参照基因条带的光密度,比较不同样本的相对表达率.
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用Image J软件中的条带灰度分析，很简单的
点个预染marker，看看大小是否正确，WB结果情况很多，描述一下才能帮你分析啊
扫描下载二维码western blot条带为何时有时无 - 实验交流 - 生物秀
标题: western blot条带为何时有时无
摘要: [western blot条带为何时有时无] 求助最近开始做western 发现结果不是很稳定，我的跑的SDS电泳是6%的分离胶，4%的浓缩胶，样本蛋白总量在50ug，彩色marker标记，目的蛋白130kd电泳用150v，大概整个跑下来40分钟到1小时的样子，胶跑好后的转膜过程是：1
膜剪好后先在甲醇中浸泡10分钟左右， 2 铺“三明治”，转膜液用的是20%甲醛的，湿转 3 电泳和转膜用的都是biorad的机子，4 铺好后开始转膜，100 关键词:[转膜 电泳 条带 目的条带 目的蛋白 分离胶 甲醇]……
求助最近开始做western 发现结果不是很稳定，我的跑的SDS电泳是6%的分离胶，4%的浓缩胶，样本蛋白总量在50ug，彩色marker标记，目的蛋白130kd电泳用150v，大概整个跑下来40分钟到1小时的样子，胶跑好后的转膜过程是：1..膜剪好后先在甲醇中浸泡10分钟左右， 2.铺“三明治”，转膜液用的是20%甲醛的，湿转 3.电泳和转膜用的都是biorad的机子，4.铺好后开始转膜，100v 1小时，然后剪膜封闭，用的是碧云天的试剂，封闭2小时，一抗浓度1：300，SANTA CRUZ的多抗，二抗1：3000，现在苦恼的是开始做出过两次目的条带，但都比较淡细，参照做得很漂亮，后面一次什么都没有，一次参照actin很好，但是目的条带没有。考虑是不是转膜时间不够长，还是蛋白抗原量不够，增加蛋白量会不会好点。还有个问题是，我经常一块板做9个样本，但往往有些道会丢失掉，不知道是什么原因。小妹刚做不久，各位前辈多多指教
转移效率怎么样？转膜后可以用丽春红S染液染膜，看看目的蛋白位置有没有条带。大分子量蛋白的转膜缓冲液可以少加些甲醇甚至不加，加些SDS（0.375－1％），有利于大分子转膜（高含量甲醇利于小分子转膜）。可以试试低电压过夜转（50v或者60v，），转移效率可能好些。试试加大一抗浓度（可能会导致非特异条带增加）。或者做个斑点印迹（不用电泳和转膜，直接把蛋白样品点在膜上），找出比较合适的一抗和二抗浓度，也能试出比较合适的上样量。
做WB重要的是摸条件 条件摸好了 结果就容易出来了结果出不来的时候 别着急 一步一步找原因首先你跑完电泳了 可以用考马染个胶看看 以证明你提的蛋白没有问题然后转完摸后 用立春红染色 以证明蛋白是否从胶上成功转到摸上了如果这些没有问题 那以后电泳 转摸的条件就不要变了 摸摸一抗 二抗的浓度 首先还是从抗体的做小稀释比做 即从大浓度开始做尽管会出现非特异性条带 最起码条带出来了 然后再已不同的抗体稀释比做背景深了 可以加大封闭液的浓度和时间总之 试验是慢慢总结出来的 祝楼主试验顺利！！！
蛋白提取是好的，同样的蛋白做95kd的目的条带可以做出来，丽春红也染的，但是大条待的地方普遍比较淡，考马斯试剂没有，所以还没染过胶，浓度梯度做过，1：200的太浓，1：500，没染出来，才调到300
请问斑点印迹具体应该怎么做呢谢谢！
有没有人遇到过一次两块板一起做，一块结果还可以，另一块什么都没有呢？我的意思是同样电泳槽，同样的转膜，我常有这样的现象出现
是的，我的也是，经常同时跑两块胶，一起转膜，完了用丽春红染色，其中一张膜的条带就比较漂亮，一张就较差，应该是溶液在电离过程中浓度不均一的问题吧
是的，我的也是，经常同时跑两块胶，一起转膜，完了用丽春红染色，其中一张膜的条带就比较漂亮，一张就较差，应该是溶液在电离过程中浓度不均一的问题吧
有没有人遇到过一次两块板一起做，一块结果还可以，另一块什么都没有呢？我的意思是同样电泳槽，同样的转膜，我常有这样的现象出现有可能,因为BIO-RAD的转膜仪，转膜的两个胶的位置是不同的，为了达到相同的效果，我们在转膜中途将两块胶换一次位置。我们转膜一般是200mA*120min，转膜液不加SDS.
请教各位高手，染胶的考马斯亮蓝是什么比例配的，这种方法是不是可以确定胶上是否有目的条带？
请教各位高手，染胶的考马斯亮蓝是什么比例配的，这种方法是不是可以确定胶上是否有目的条带？
请教各位高手，染胶的考马斯亮蓝是什么比例配的，这种方法是不是可以确定胶上是否有目的条带？考马斯亮蓝R250 配方：R250：0.5g；甲醇：250ml；冰乙酸：100ml；定容500ml
又摸索了一周甲醛改为10% 反而只有白片增加转膜时间分别 为1.5小时和 2小时 actin 效果很好 但是目的条带还是没出来搞笑的是经常会有很浓的黑点 有时候还在marker附近 背景很干净 不知道出来的什么 用同一张膜做了另一个分子量为150的抗体可以做出来 那说明大分子条带还是能转过去的 考马斯亮蓝染胶也说明转膜没多大问题问：二抗推荐是驴抗羊 我用的是鼠抗羊 这个有没有问题？ 目的蛋白是icam家族的 提取蛋白时是否有什么特别要注意的地方 可以提高提取浓度？ 做出过一次 虽然背景比较高 但是条带还是能认清的 能都说明一抗没问题 郁闷了 下一步不知道怎么改进 呜呜大家有什么好办法 帮忙集思广益下 谢谢
感觉是你sample有问题。怀疑你提取过程中蛋白降解也许比较厉害。目的蛋白130KD应该算是比较大的蛋白了，电泳和转膜的电压不要太高，你用150v电泳太高了，建议用100v-120v左右，时间长些，1-2h。你那个150kd能做出来并不能代表这个130也一定可以，两种蛋白的表达量和稳定性你确定一样吗？
我想问一下β-actin42KD的转膜条件，不想过夜的那种，我以前用的是100MA，90min,但是DAB显色没有条带显出来，请指导一下
我想问一下β-actin42KD的转膜条件，不想过夜的那种，我以前用的是100MA，90min,但是DAB显色没有条带显出来，请指导一下我用半干转，按膜的面积算电流，一般一块胶一张膜26ma，1h就可以了
做了很多Western的实验，不出条带的原因主要从转膜、二抗和一抗考虑（按照重要性排序）。对于130kD的蛋白，转膜时间 100v 1小时是不够的，我们一般是110V，90分钟。LZ可以试试。其二，电泳时150 V ，电压太高。电压越低，蛋白条带分离效果越好。建议采用100V，多跑些时间，这样条带会更清晰。 建议LZ分析下二抗是否坏了。如果是好的，那么就是你 的一抗的问题。分为两个方向：1.浓度不对 2.一抗失效。而且你竟然把甲醛的浓度改为10％，这不是不能随便改的呀。转膜液20％浓度的甲醛是无数前辈验证过的，是最佳浓度。
我做的目标蛋白是45kd的用100v50分钟就转过去了，条带清晰，可以适当调整上样量，转膜液的配制不变
谢谢各位指导150的能转过去应该能说明我的转膜时间是充足的，因为sample用sds煮过，是不是说明蛋白的带电量和分子形状都统一化，差异比较小了，当然如果原本丰度不足的话是另讲 改变甲醛浓度主要是考虑分子比较大的缘故，当然这个尝试失败了，没有再试 用的二抗实验室的没人用过
考虑到我的蛋白是跨膜一次的膜蛋白，想是不是蛋白提取时溶解的比较少，重新换强裂解液再提，转膜1.5小时，其余条件不变，结果压片的时候发现整张膜都发亮，以前没出现这样的情况，不知道怎么解释电泳电压变小条带分的好不好能不能从marker判断啊？如果可以的话，我的marker芬德还是很漂亮的
我以前湿转都是30V过夜的。觉得很耽误时间，最近也想用高电压的湿转，大家能不能给点建议。我的分子量是220KD的。什么条件才能很好的转过去。
电泳先用60V跑20分钟过积层胶，然后90V跑到底；对于130kd的条带，100V转一小时肯定不够，可适当在转膜液中加SDS（1g/L），110V转两个半小时，电泳槽周围不加冰块，使转膜液温度在50°C左右最好。封闭用5%脱脂奶粉1小时就足够了；biorad的电泳槽靠近负极的那一张膜转的比较好，你可以先把靠近负极的那个三明治拿出来，靠近正极的再转20分钟效果最好。
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电话：021-& 【求助】western blot 不出条带,是一抗孵育不上的原因吗?
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【求助】western blot 不出条带,是一抗孵育不上的原因吗?
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【求助】western blot 不出条带,是一抗孵育不上的原因吗?
最近做western blot ,电泳,转膜感觉没问题,转出的膜用丽春红染色,条带清晰,用5%的脱脂奶粉封闭1小时,加一抗,一抗用TBS稀释,另加5%BSA,4度过夜,用TBS洗膜,3次,10分钟/次,加二抗,二抗用TBS稀释,37度孵育1小时,用TBS洗膜,3次,10分钟/次,显影,定影,结果没有任何条带,感觉步骤没有问题,就是不出带,是不是一抗孵育不上的原因吗?谢谢大家.
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条带没有出来 原因可多了 要慢慢排除
“转出的膜用丽春红染色,条带清晰” 说明你转膜是没有问题的
那么一抗 二抗的浓度你要摸摸，建议从大的浓度开始摸
慢慢降低抗体的浓度。
当然也要确保抗体没有失效。
发光液注意不要过期了 可以加少量二抗与发光液混合 在暗室里观察 有无荧光，如有 表明二抗 与发光液是没有问题的
显影 定影是最后一步，如果抗体结合的好 但压片不成功 也是非常遗憾的
所以要确保显影液和定影液是好的
祝你成功！
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我最近做western也是这样，条件跟以前一样。郁闷。
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还要看看你的样品保存的怎么样，不会目的蛋白降解了吧，用新样品试试。
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谢谢,我把二抗和发光液混在一起,发现荧光很亮,看来二抗没问题,不清楚是不是抗体浓度的问题?我一抗1:1000稀释,二抗1:20000稀释,用这个稀释浓度,有一个蛋白可以出条带,但另一个蛋白不出条带,不知道是什么原因?
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是否存在其中一个降解的问题？
两个蛋白的上样浓度是一样的不？
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同一个总蛋白，检测的目的蛋白不同，上样浓度也一样
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我也碰见和你一样的情况，现在我二抗4度过夜可以看到蛋白，我怀疑是一抗和二抗结合能力较差，所以没有条带
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条带没有出来 原因可多了 要慢慢排除
“转出的膜用丽春红染色,条带清晰” 说明你转膜是没有问题的
那么一抗 二抗的浓度你要摸摸，建议从大的浓度开始摸
慢慢降低抗体的浓度。
当然也要确保抗体没有失效。
发光液注意不要过期了 可以加少量二抗与发光液混合 在暗室里观察 有无荧光，如有 表明二抗 与发光液是没有问题的
显影 定影是最后一步，如果抗体结合的好 但压片不成功 也是非常遗憾的
所以要确保显影液和定影液是好的
祝你成功！
您说得很有道理，我有一个问题想请教一下，那如何排除一抗是不是过期失活了的问题呢？谢谢了
信誉分 100
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也有可能是一抗和二抗结合能力太差，我也碰见这样的情况，二抗与发光液混合 在暗室里观察 有荧光，我也怀疑是一抗的问题，后来二抗4度过夜，就有了条带，而且很漂亮，你也可以试一下}