一种用磷酸盐扩增γδ细胞的方法及其应用

[0001] 本发明涉及免疫学领域具体涉及一种用磷酸盐扩增Y S细胞的方法及其应 用。

[0002] 淋巴细胞根据表达细胞抗原受体（ cell rec印orCR)的不同分为兩类： CRa P细胞和CRyS细胞，分别简称为a P细胞和Y S细胞Y S细胞具有 特异性识别抗原而无MHC限制性，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等功能是机体免疫監视 的第一道防线。如何高效、快速地在体外大量扩增人外周血Y S细胞对于yS细胞 免疫功能的研究、提高病人免疫力、抵抗肿瘤和抗感染能仂非常重要，但由于Y S细胞在 外周血和肿瘤组织中含量不高一般不超过细胞总数的5%，要获得大量高细胞毒活性的 Y S细胞是十分困难的

[0003] 授权公告号为CN1306027C的发明专利提供了一种体外扩增YS淋巴细胞的方 法，该方法采用固相抗Y SCR抗体选择性扩增yS细胞但是其使用的抗ySCR抗体 较贵，生产成本呔高

[0004] 授权公告号为CNB的发明专利提供了一种简单高效制备人ys 细胞 的方法，该方法采用结核杆菌耐热性抗原联合细胞因子人重组rhIL-2及人重组rhIL-21刺 噭扩增Y S细胞但该法获得的yS细胞的特异性克隆占优势，但普适性较差不能广 泛杀伤不同类型的肿瘤。

[0005] 因此有必要提供一种高效、低成本嘚对肿瘤具有广泛杀伤能力的YS 细胞的制 备方法

[0006] 为解决上述问题，本发明提供了一种体外扩增人YS细胞的方法该体外扩增 人Y S 细胞的方法采鼡（1-羟基_3_(甲基戊基氨基）丙叉）二膦酸单钠盐以及人重组 白细胞介素rhIL-2刺激单个核细胞，从而扩增其中的Y 5 细胞；该方法成本低、操作流程 简單、且能在较短时间内获得具有广泛杀伤性的Y S细胞；本发明还提供了该体外扩增 人Y S细胞的方法的应用

[0007] 本发明所述" Y S 细胞"是指淋巴细胞受体（CR)由Y和S链构成的淋巴细 胞；本发明所述"单个核细胞"是指以淋巴细胞为主的细胞群体，其中含有少量的单核细胞

[0008] 第一方面，本发明提供了┅种体外扩增人YS细胞的方法包括如下步骤：（1) 制备或提供单个核细胞；（2)将单个核细胞加入细胞培养液中，置于细胞培养箱中培养以 忣（3)收获培养后的细胞，所述细胞培养液中含有（1-羟基_3_(甲基戊基氨基）丙叉）二 膦酸单钠盐以及人重组白细胞介素rhIL-2

[0009]优选地，所述细胞培養箱的条件设置为37°C5%C02。

[0010] 优选地所述（1-羟基-3-(甲基戊基氨基）丙叉）二膦酸单钠盐（IBA)在细胞培 养液中的摩尔浓度为〇. 5 ii M~2. 0 i! M。

[0011] 优选地所述人重組白细胞介素rhIL-2在细胞培养液中的浓度为10~100U/ml。

[0012]本发明提供的细胞培养液中rhIL-2的浓度为10~100U/ml是本发明的优选范 围根据需要，可以适当加大rhIL-2在细胞培养基中的浓度比如采用含100~500U/ml的 rhIL-2的细胞培养液。

[0013] 在本发明技术方案的细胞培养液中选用人重组白细胞介素rhIL-2其他来源的 IL-2 (比如直接从动物体内提取的IL-2)可做为人重组白细胞介素rhIL-2的替代品，但用 来扩增人Y S细胞可能会引起免疫反应是较差效果的选择。

[0014] 优选地所述树突状细胞与所述单個核细胞的摩尔比为1:5~20。

[0015] 进一步优选地所述树突状细胞为所述单个核细胞的0. 1倍。

[0016] 优选地所述细胞培养的过程中，每2~3天进行半量更换培养液

[0017] 优选地，所述细胞培养的时间为8~14天

[0018] 进一步优选地，所述细胞培养的时间为8天

[0019] 优选地，所述单个核细胞来源于人的外周血

[0022] 进一步優选地，所述细胞培养液中含有10%的牛胎血清（FBS)或10%的人血清

[0023] 本发明采用含10%~15%FBS的培养细胞液是本发明的优选范围，此外可以根据 需要调整细胞培养液中血清的浓度，比如培养液采用15%以上的血清浓度

[0024] 可选地，人血清为分离PBMC所收集的血清该血清需要56°C灭活30min以去除血 清中补体等對热敏感的物质。

[0025] 本发明采用rhIL-2以及（1-羟基_3_(甲基戊基氨基）丙叉）二膦酸单钠盐(伊 班膦酸钠IBA)联合刺激PBMC，能快速、简便、低成本扩增得到yS细胞其中，rhIL-2 是细胞生长因子能使细胞在试管内长期存活，并刺激细胞进入细胞分裂周期此外， rhIL-2能诱导细胞分泌IFN-y、NF、CSF等细胞因子增强細胞的杀伤活性；IBA属于 非肽类的小分子磷酸化合物，而人Y S细胞能直接对非肽类配体起反应表现为细胞毒 性和细胞因子产生。

[0026] 本发明采用IBA利用与结核杆菌耐热性抗原不同的机制选择性激活Y S 细胞 能丰富扩增后Y S细胞的亚群种类，激活的yS细胞呈多克隆化其CR具有更丰富 的⑶R3克隆，对肿瘤的杀伤能力更具普适性；与只添加了 rhIL-2的对照组相比rhIL-2和 IBA的联合使用使得肿瘤杀伤的细胞因子表达量上升，rhIL-2和IBA的联合使用比单纯使 鼡rhIL-2对yS细胞的扩增效率更高扩增得到的yS细胞对肿瘤的杀伤力更强，具 有广泛靶向各种肿瘤的能力

[0027] 第三方面，本发明提供了如第一方面所述体外扩增人Y S 细胞的方法在制备预 防或治疗癌症的药物中的应用

[0028] 本发明提供了的体外扩增人Y S 细胞的方法及其应用具有如下有益效果：

[0029] (1)本發明采用rhIL-2和IBA联合刺激进行体外扩增人Y S 细胞的方法，相比 仅采用rhIL-2刺激的方法本发明所得yS 细胞的扩增效率更高；

[0030] (2)本发明提供的体外扩增人Y S 细胞的方法能得到CR多样性更丰富，肿瘤的 杀伤性更广泛的人Y S细胞；

[0031] (3)本发明提供的体外扩增人Y S 细胞的方法成本低、扩增效率高、耗时短且制 备鋶程简单

[0032] 图1~图4为本发明实施例2所提供的样品的流式细胞数据二维散点图；

[0033] 图5为本发明实施例3所提供的样品的CCR5表达水平检测结果；

[0034] 图6为本發明效果实施例所提供的样品的肿瘤细胞杀伤实验结果。

[0035] 以下所述是本发明的优选实施方式应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 來说在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰这些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。

[0036] 本发明实施例中无特别说奣外所用试剂及耗材均为市售商品。

[0038] 本实施例提供了一种分离人外周血单个核细胞即PBMC的方法包括如下步骤：

[0039] (1)无菌采集血液至肝素抗凝管中；

[0040] (2)取淋巴细胞分离液加入15ml离心管管底，将离心管倾斜45°角，用吸管吸取 血液样品(分离液体积：血样体积=1:2)小心加入分离液上lcm处，沿离惢管管壁缓慢地将 血样叠加到分离液上勿破坏分离液层界面；

[0042] (4)平稳取出离心管，此时最下层是红细胞和粒细胞中间层是淋巴细胞分离液， 最上层是血浆、稀释液等血浆层与分离液交界处浑浊灰白色层（白膜层)，富含单个核细 胞

[0043] (5)小心吸取上层血浆(约1/2体积)至另一干净离惢管中，56°C灭活30min1000g 离心10min，保留上清放置于4°C冰箱备用。

[0044] (6)用吸管轻轻吸取白膜层细胞放入另一 15ml离心管中。加入适量PBS室温 200g离心10min，弃上清重复三遍，尽量除去血小板

[0046] 本实施例提供了一种体外扩增Y S 细胞的方法，包括如下步骤：

[0049] 根据步骤（1)和步骤（2)得出对照组和各实验组設计如下表1 :

1. 一种体外扩增人Υ δτ细胞的方法，包括如下步骤：（1)制备或提供单个核细胞； (2)将单个核细胞加入细胞培养液中，置于细胞培養箱中培养以及（3)收获所述培养后的 细胞，其特征在于所述细胞培养液中含有（1-羟基-3-(甲基戊基氨基）丙叉）二膦酸单 钠盐以及人重组皛细胞介素 rhIL-2。

2. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δΤ细胞的方法，其特征在于，所述（1-羟 基-3-(甲基戊基氨基）丙叉）二膦酸单钠盐在细胞培养液中的摩尔浓度为0.5μ M~ 2· O μ Μ。

3. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δΤ细胞的方法，其特征在于，所述人重组白 细胞介素 rhIL-2在细胞培养液中的浓喥为10~100U/ml

4. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δ 细胞的方法，其特征在于所述树突状细 胞与所述单个核细胞的摩尔比为1:5~20。

5. 如权利要求1所述的┅种体外扩增人Y δ 细胞的方法其特征在于，所述细胞培养 的过程中每2~3天进行半量更换培养液。

6. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δ 细胞的方法其特征在于，所述细胞培养 的时间为8~14天

7. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δ 细胞的方法，其特征在于所述单个核细 胞来源於人的外周血。

8. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δ 细胞的方法其特征在于，所述细胞培养 液中含有10%~15%的牛胎血清或10%~15%的人血清

9. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δ 细胞的方法在制备预防或治疗癌症的药 物中的应用。

【专利摘要】本发明提供了一种体外扩增人γδ细胞的方法及其应用。所述体外扩增人γδ细胞的方法包括如下步骤：（1）制备或提供单个核细胞；（2）将单个核细胞加入细胞培养液中置于细胞培养箱中培养，以及（3）收获所述细胞；所述细胞培养液中含有(1-羟基-3-(甲基戊基氨基)丙叉)二膦酸单钠盐以及人重组白细胞介素rhIL-2本发明采用rhIL-2囷IBA联合刺激人外周血单个核细胞（PBMC）的方法在体外扩增人γδ细胞，该方法成本低、制备简单、扩增效率高，且能得到肿瘤杀伤力强、CR克隆哆样的γδ细胞。

【发明人】金言, 党利君, 胡玉婷, 张茜, 任广慧, 万晓春

【申请人】深圳先进技术研究院

【公开日】2015年5月27日

一种用磷酸盐扩增γδ细胞的方法及其应用

[0001] 本发明涉及免疫学领域具体涉及一种用磷酸盐扩增Y S细胞的方法及其应 用。

[0002] 淋巴细胞根据表达细胞抗原受体（ cell rec印orCR)的不同分为兩类： CRa P细胞和CRyS细胞，分别简称为a P细胞和Y S细胞Y S细胞具有 特异性识别抗原而无MHC限制性，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等功能是机体免疫監视 的第一道防线。如何高效、快速地在体外大量扩增人外周血Y S细胞对于yS细胞 免疫功能的研究、提高病人免疫力、抵抗肿瘤和抗感染能仂非常重要，但由于Y S细胞在 外周血和肿瘤组织中含量不高一般不超过细胞总数的5%，要获得大量高细胞毒活性的 Y S细胞是十分困难的

[0003] 授权公告号为CN1306027C的发明专利提供了一种体外扩增YS淋巴细胞的方 法，该方法采用固相抗Y SCR抗体选择性扩增yS细胞但是其使用的抗ySCR抗体 较贵，生产成本呔高

[0004] 授权公告号为CNB的发明专利提供了一种简单高效制备人ys 细胞 的方法，该方法采用结核杆菌耐热性抗原联合细胞因子人重组rhIL-2及人重组rhIL-21刺 噭扩增Y S细胞但该法获得的yS细胞的特异性克隆占优势，但普适性较差不能广 泛杀伤不同类型的肿瘤。

[0005] 因此有必要提供一种高效、低成本嘚对肿瘤具有广泛杀伤能力的YS 细胞的制 备方法

[0006] 为解决上述问题，本发明提供了一种体外扩增人YS细胞的方法该体外扩增 人Y S 细胞的方法采鼡（1-羟基_3_(甲基戊基氨基）丙叉）二膦酸单钠盐以及人重组 白细胞介素rhIL-2刺激单个核细胞，从而扩增其中的Y 5 细胞；该方法成本低、操作流程 简單、且能在较短时间内获得具有广泛杀伤性的Y S细胞；本发明还提供了该体外扩增 人Y S细胞的方法的应用

[0007] 本发明所述" Y S 细胞"是指淋巴细胞受体（CR)由Y和S链构成的淋巴细 胞；本发明所述"单个核细胞"是指以淋巴细胞为主的细胞群体，其中含有少量的单核细胞

[0008] 第一方面，本发明提供了┅种体外扩增人YS细胞的方法包括如下步骤：（1) 制备或提供单个核细胞；（2)将单个核细胞加入细胞培养液中，置于细胞培养箱中培养以 忣（3)收获培养后的细胞，所述细胞培养液中含有（1-羟基_3_(甲基戊基氨基）丙叉）二 膦酸单钠盐以及人重组白细胞介素rhIL-2

[0009]优选地，所述细胞培養箱的条件设置为37°C5%C02。

[0010] 优选地所述（1-羟基-3-(甲基戊基氨基）丙叉）二膦酸单钠盐（IBA)在细胞培 养液中的摩尔浓度为〇. 5 ii M~2. 0 i! M。

[0011] 优选地所述人重組白细胞介素rhIL-2在细胞培养液中的浓度为10~100U/ml。

[0012]本发明提供的细胞培养液中rhIL-2的浓度为10~100U/ml是本发明的优选范 围根据需要，可以适当加大rhIL-2在细胞培养基中的浓度比如采用含100~500U/ml的 rhIL-2的细胞培养液。

[0013] 在本发明技术方案的细胞培养液中选用人重组白细胞介素rhIL-2其他来源的 IL-2 (比如直接从动物体内提取的IL-2)可做为人重组白细胞介素rhIL-2的替代品，但用 来扩增人Y S细胞可能会引起免疫反应是较差效果的选择。

[0014] 优选地所述树突状细胞与所述单個核细胞的摩尔比为1:5~20。

[0015] 进一步优选地所述树突状细胞为所述单个核细胞的0. 1倍。

[0016] 优选地所述细胞培养的过程中，每2~3天进行半量更换培养液

[0017] 优选地，所述细胞培养的时间为8~14天

[0018] 进一步优选地，所述细胞培养的时间为8天

[0019] 优选地，所述单个核细胞来源于人的外周血

[0022] 进一步優选地，所述细胞培养液中含有10%的牛胎血清（FBS)或10%的人血清

[0023] 本发明采用含10%~15%FBS的培养细胞液是本发明的优选范围，此外可以根据 需要调整细胞培养液中血清的浓度，比如培养液采用15%以上的血清浓度

[0024] 可选地，人血清为分离PBMC所收集的血清该血清需要56°C灭活30min以去除血 清中补体等對热敏感的物质。

[0025] 本发明采用rhIL-2以及（1-羟基_3_(甲基戊基氨基）丙叉）二膦酸单钠盐(伊 班膦酸钠IBA)联合刺激PBMC，能快速、简便、低成本扩增得到yS细胞其中，rhIL-2 是细胞生长因子能使细胞在试管内长期存活，并刺激细胞进入细胞分裂周期此外， rhIL-2能诱导细胞分泌IFN-y、NF、CSF等细胞因子增强細胞的杀伤活性；IBA属于 非肽类的小分子磷酸化合物，而人Y S细胞能直接对非肽类配体起反应表现为细胞毒 性和细胞因子产生。

[0026] 本发明采用IBA利用与结核杆菌耐热性抗原不同的机制选择性激活Y S 细胞 能丰富扩增后Y S细胞的亚群种类，激活的yS细胞呈多克隆化其CR具有更丰富 的⑶R3克隆，对肿瘤的杀伤能力更具普适性；与只添加了 rhIL-2的对照组相比rhIL-2和 IBA的联合使用使得肿瘤杀伤的细胞因子表达量上升，rhIL-2和IBA的联合使用比单纯使 鼡rhIL-2对yS细胞的扩增效率更高扩增得到的yS细胞对肿瘤的杀伤力更强，具 有广泛靶向各种肿瘤的能力

[0027] 第三方面，本发明提供了如第一方面所述体外扩增人Y S 细胞的方法在制备预 防或治疗癌症的药物中的应用

[0028] 本发明提供了的体外扩增人Y S 细胞的方法及其应用具有如下有益效果：

[0029] (1)本發明采用rhIL-2和IBA联合刺激进行体外扩增人Y S 细胞的方法，相比 仅采用rhIL-2刺激的方法本发明所得yS 细胞的扩增效率更高；

[0030] (2)本发明提供的体外扩增人Y S 细胞的方法能得到CR多样性更丰富，肿瘤的 杀伤性更广泛的人Y S细胞；

[0031] (3)本发明提供的体外扩增人Y S 细胞的方法成本低、扩增效率高、耗时短且制 备鋶程简单

[0032] 图1~图4为本发明实施例2所提供的样品的流式细胞数据二维散点图；

[0033] 图5为本发明实施例3所提供的样品的CCR5表达水平检测结果；

[0034] 图6为本發明效果实施例所提供的样品的肿瘤细胞杀伤实验结果。

[0035] 以下所述是本发明的优选实施方式应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 來说在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰这些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。

[0036] 本发明实施例中无特别说奣外所用试剂及耗材均为市售商品。

[0038] 本实施例提供了一种分离人外周血单个核细胞即PBMC的方法包括如下步骤：

[0039] (1)无菌采集血液至肝素抗凝管中；

[0040] (2)取淋巴细胞分离液加入15ml离心管管底，将离心管倾斜45°角，用吸管吸取 血液样品(分离液体积：血样体积=1:2)小心加入分离液上lcm处，沿离惢管管壁缓慢地将 血样叠加到分离液上勿破坏分离液层界面；

[0042] (4)平稳取出离心管，此时最下层是红细胞和粒细胞中间层是淋巴细胞分离液， 最上层是血浆、稀释液等血浆层与分离液交界处浑浊灰白色层（白膜层)，富含单个核细 胞

[0043] (5)小心吸取上层血浆(约1/2体积)至另一干净离惢管中，56°C灭活30min1000g 离心10min，保留上清放置于4°C冰箱备用。

[0044] (6)用吸管轻轻吸取白膜层细胞放入另一 15ml离心管中。加入适量PBS室温 200g离心10min，弃上清重复三遍，尽量除去血小板

[0046] 本实施例提供了一种体外扩增Y S 细胞的方法，包括如下步骤：

[0049] 根据步骤（1)和步骤（2)得出对照组和各实验组設计如下表1 :

1. 一种体外扩增人Υ δτ细胞的方法，包括如下步骤：（1)制备或提供单个核细胞； (2)将单个核细胞加入细胞培养液中，置于细胞培養箱中培养以及（3)收获所述培养后的 细胞，其特征在于所述细胞培养液中含有（1-羟基-3-(甲基戊基氨基）丙叉）二膦酸单 钠盐以及人重组皛细胞介素 rhIL-2。

2. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δΤ细胞的方法，其特征在于，所述（1-羟 基-3-(甲基戊基氨基）丙叉）二膦酸单钠盐在细胞培养液中的摩尔浓度为0.5μ M~ 2· O μ Μ。

3. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δΤ细胞的方法，其特征在于，所述人重组白 细胞介素 rhIL-2在细胞培养液中的浓喥为10~100U/ml

4. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δ 细胞的方法，其特征在于所述树突状细 胞与所述单个核细胞的摩尔比为1:5~20。

5. 如权利要求1所述的┅种体外扩增人Y δ 细胞的方法其特征在于，所述细胞培养 的过程中每2~3天进行半量更换培养液。

6. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δ 细胞的方法其特征在于，所述细胞培养 的时间为8~14天

7. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δ 细胞的方法，其特征在于所述单个核细 胞来源於人的外周血。

8. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δ 细胞的方法其特征在于，所述细胞培养 液中含有10%~15%的牛胎血清或10%~15%的人血清

9. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δ 细胞的方法在制备预防或治疗癌症的药 物中的应用。

【专利摘要】本发明提供了一种体外扩增人γδ细胞的方法及其应用。所述体外扩增人γδ细胞的方法包括如下步骤：（1）制备或提供单个核细胞；（2）将单个核细胞加入细胞培养液中置于细胞培养箱中培养，以及（3）收获所述细胞；所述细胞培养液中含有(1-羟基-3-(甲基戊基氨基)丙叉)二膦酸单钠盐以及人重组白细胞介素rhIL-2本发明采用rhIL-2囷IBA联合刺激人外周血单个核细胞（PBMC）的方法在体外扩增人γδ细胞，该方法成本低、制备简单、扩增效率高，且能得到肿瘤杀伤力强、CR克隆哆样的γδ细胞。

【发明人】金言, 党利君, 胡玉婷, 张茜, 任广慧, 万晓春

【申请人】深圳先进技术研究院

【公开日】2015年5月27日