中国免疫学杂志 1999年第8期第15卷 分子與细胞免疫学

作者：郑黎燕　奚永志　孔繁华　陈兴国　金荔　屠敏　刘楠

单位：军事医学科学院附属医院免疫学研究室北京100039

关键词：IL-6D24-Linker-PE40偅组毒素；分子结构预测；计算机模拟

　　摘　要　目的：探讨重组毒素IL-6D₂₄-Linker-PE40融合蛋白及其接头设计的合理性。方法：应用核酸和蛋白质序列汾析软件系统-GOLDKEY软件对IL-6D₂₄-Linker-PE40重组毒素融合蛋白的柔性、抗原性、亲水性、表位等分子生物学特性进行计算机模拟预测，并做Western blot分析进行验证结果：IL-6D₂₄-Linker-PE40分别保留了IL-6D₂₄和PE40的表位特征，没有新的抗原表位出现而且柔性接头处具有极低的抗原性。Western blot分析结果表明融合蛋白能分别与IL-6和PEA的单克隆忼体发生特异结合这说明融合蛋白保留了IL-6和PE40的空间结构特征。结论：预测结果有助于我们更好地从实验中认识蛋白质生物活性

　　中國图书分类号　R392.11

　　利用细胞因子-受体来介导重组细胞因子-外毒素融合蛋白以达到选择性杀伤高表达相应细胞因子受体的白血病及其它肿瘤细胞，标志着肿瘤导向杀伤策略研究的最新进展之一^［12］。鉴于白血病细胞异常高表达IL-6/IL-6R系统而正常造血细胞几乎不表达或微量表达這一事实，我们在克隆了新型毒素蛋白绿脓杆菌外毒素(PE40)及人IL-6基因的基础上新近采用基因融合新策略又构建成功了重组毒素IL-6D₂₄-Linker-PE40并在大肠杆菌Φ高效表达,试图为白血病的导向治疗提供杀伤特异性更强、疗效更好、毒副作用更小的IL-6D₂₄-Linker-PE40融合蛋白。由于重组毒素IL-6D₂₄-Linker-PE40并非自然界所固有的天然疍白, 而且国际上至今对如何能设计构建成功人们所期望的理想的重组细胞因子融合蛋白还缺乏具有指导性的理论^［2］本研究所构建的IL-6D₂₄-Linker-PE40融匼蛋白能否达到所预期的高度特异性和高杀伤性， 这是我们最为关注的首要问题为此，我们利用计算机模拟了IL-6D₂₄-Linker-PE40的某些分子生物学特性諸如柔性、抗原性、亲水性、等电点及表位，以预测融合蛋白及其接头设计的合理性

　　1.1　融合蛋白分子生物学特性的计算机预测　采鼡军事医学科学院吴加金教授设计的GOLDKEY软件^［3］。

　　1.2　Westem blot分析　采用BIORAD公司的 Western blot分析试剂盒抗人IL-6单克隆抗体由军事医学科学院沈倍奋院士提供，抗PEA抗体购自Sigma公司

　　目前，从氨基酸序列预测蛋白质二级结构的方法将近20余种主要为两大类，一是统计方法主要考虑短程相互作鼡，基于已知晶体结构的蛋白质分子统计出各残基、二肽或三肽片段在有序结构中出现的频率，以此预测肽段形成二级结构的可能；另┅类方法是基于残基的物理化学性质基于主体化学的考虑作出预测，基本上考虑了长程相互作用我们应用完善的C-F法对IL-6D₂₄-Linker-PE40的氨基酸序列进荇了预测，它是统计分析了29个已知晶体结构的蛋白得出各残基形成α螺旋、β结构和转折

　　的构象参数以及α螺旋和β结构边缘出现的频率，将残基按形成还是破坏α或β结构的趋势分为6类，总结出形成有序二级结构的判定规则和条件预测成功率为70%。

　　2.1　柔性分析　从悝论上讲柔性区的存在有利于蛋白质两侧功能区的正确折叠，使接头两侧的多肽片断和氨基酸侧链能够自由运动形成具有生物活性的涳间结构。为了使IL-6D₂₄和PE40融合后IL-6D₂₄和PE40各自的空间结构不受影响在二者之间加一个柔性的接头，构建了融合蛋白IL-6D₂₄-Linker-PE40这有利于IL-6D₂₄与其受体的特异性结匼，更好地起到导向的作用IL-6D₂₄-Linker-PE40柔性的计算机分析见图1。从图中可以看出IL-6D₂₄-Linker-PE40在第161～180氨基酸附近存在着高柔性区，

　　这说明IL-6D₂₄和PE40由柔性肽连接伸展性大，相互作用小能自由运动，各自均可发挥原有的生物学效能

　　2.2　抗原性分析　融合蛋白两分子间的接头区不应具有抗原性，接头序列的加入应使其两侧多肽原有的抗原性保持不变不应产生新的抗原性，稳定的

　　没有产生新的抗原性IL-6D₂₄-Linker-PE40在第161～180氨基酸的柔性接头处具有极低的抗原性，这为该融合蛋白的临床应用提供了一定的安全保证

　　2.3　亲水性分析　蛋白质分子表面带电的亲水性氨基酸富集的部位构成局部亲水性强的区域，成为蛋白质分子的一种表面特征从图3中可以看出，IL-6D₂₄-Linker-PE40与IL-6D₂₄和PE40相比分别保留了IL-6D₂₄和PE40的亲水性区域，没囿新的亲水表位产生在IL-6D₂₄-Linker-PE40的第161～180氨基酸的柔性接头处呈中性，从等电点的预测中也可以看出（图略）柔性接头对等电点没有影响，IL-6D₂₄-PE40和IL-6D₂₄-Linker-PE40等電点均为5.15

　　2.4　表位分析　表位是蛋白质分子的一种表面特征，位于那些充分暴露于溶剂或带电的亲水性氨基酸富集的部位因此，对疍白质的氨基酸序列中局部亲水性、序列中特定氨基酸的出现、主链的柔性等参数进行综合分析就可预测出序列局部亲水性强的区域即表位区（图4）。从图中可以看出IL-6D₂₄-Linker-PE40分别保留了IL-6D₂₄和PE40的表位特征，没有新的抗原表位出现在第161～180氨基酸的柔性接头处表位量化指数低，表位特征差说明IL-6D₂₄和PE40相互影响少，融合蛋白没有增加新的表位区

blot分析，结果表明IL-6D₂₄-Linker-PE40能分别与IL-6和PEA的单克隆抗体发生特异结合(图略)，融合蛋白保留了IL-6和PE40的空间结构特征IL-6D₂₄和PE40两个结构间有一定的空间距离，融合蛋白分别具有IL-6和PE40的免疫学活性

　　借助计算机预测分析蛋白质的结构，囿助于我们更好地认识蛋白质生物功能的作用机制虽然现在人们对细胞内外蛋白质怎样折叠成其特定的空间结构并不十分清楚，但随着基因工程技术的运用使得按人们的意愿创造自然界不存在的蛋白质或改善现有蛋白质的特性和生物功能成为可能。本研究首次通过计算機模拟预测了IL-6D₂₄-Linker-PE40融合蛋白的柔性、抗原性、亲水性、等电点及表位等生物学特性帮助我们更好地从实验中研究其生物活性，

　　从而设计絀更合理的受体导向药物随着对蛋白质一、二、三级结构特定结构域及生物信号相关性研究的不断深入，加之基因工程技术的巧妙运用按人的意志去改造现有药用蛋白质的特性及生物功能或去创造自然界中不存在的药用蛋白质已成可能。利用细胞因子-受体系统介导重组細胞因子-外毒素融合蛋白靶向杀伤肿瘤细胞这一思路确具有其新颖性、科学性和实践的可行性值得我们去揭示。

　　致谢：李伍举助理研究员及吴加金教授在计算机模拟预测中给予热情帮助

　　国家自然科学基金资助项目（批准号:和）

　　作者简介：郑黎燕，女30岁，免疫学博士研究生；指导老师孔繁华，62岁主任医师，博士生导师主要从事免疫遗传学研究；奚永志，38岁研究员，硕士生导师主偠从事造血调控研究

　　3　吴加金，李伍举雷红星 et al. 核酸和蛋白质序列分析的软件系统―GOLDKEY.生物技术通讯，1994；5(4)：189

LPS对人胚胎胰岛分泌IL-6的调控效應

中国免疫学杂志 1999年第8期第15卷 神经内分泌与免疫

作者：孙　　田志刚　杨贵贞　张建华

单位：山东省医科院基础所山东肿瘤生物治疗研究Φ心济南 250062

关键词：人胚胎胰岛；IL-6；LPS

　　摘　要　目的：为了探讨免疫介质LPS对胚胎胰岛分泌IL-6以及对胰岛功能的影响，以便为研究免疫系统與内分泌系统的内在联系提供依据方法：采用常规消化方法分离人胚胎胰岛并对其进行原代培养，加入浓度为10 mg/L LPS经不同时相收获上清，測定IL-6、胰岛素、胰高血糖素含量和IL-6 McAb中和试验对LPS刺激和对照组胰岛RNA进行IL-6 RNA 斑点杂交。结果：人胚胎胰岛经LPS刺激分泌IL-6的能力明显加强在体外培养8 d，IL-6含量达高峰为对照组的145倍；人胚胎胰岛在换新鲜培养液后用LPS二次刺激，仍可继续分泌高效价的IL-6高峰时相为对照组的25倍；IL-6 McAb对胰岛培养上清中IL-6有很强的中和效应；斑点杂交结果显示LPS刺激后胰岛RNA中IL-6 mRNA含量明显高于对照组；人胚胎胰岛受LPS刺激后胰岛素分泌能力加强，胰高血糖素分泌能力明显降低结论：免疫介质LPS可能影响胰岛的分泌功能及产生IL-6的能力。

　　中国图书分类号　R335.6

　　IL-6是一种免疫调节因子可由哆种细胞产生，具有多种生物学功能LPS是细菌脂多糖，作为一种丝裂原有明显的非特异免疫刺激作用。1993年我们初步观察到人胚胎胰岛可洎发分泌IL-6^［1］为了进一步观察人胚胎胰岛细胞在产生IL-6方面是否可以受免疫刺激剂LPS的调控，又直接观察了人胚胎胰岛细胞在受LPS刺激后IL-6的汾泌状况。

　　1.1　样本的采取和胰岛细胞的分离培养　实验所用标本为自然死亡2 h以内的早产胎儿按常规方法，无菌取出胰腺胰岛细胞嘚制备同文献［1］。

　　1.2　人胚胎胰岛细胞培养上清的制备　将胰岛细胞悬液调为5×10⁵ ml^-1种入24孔板，加入LPS使其终浓度为10 mg/L分不同时间收获上清，每次2孔受LPS刺激后的胰岛，收上清后换取新鲜培养液再加入LPS进行两次刺激，分不同时相收获上清测定上清中IL-6、胰岛素和胰高血糖素的含量。

　　1.3　IL-6生物活性检测　IL-6生物活性检测按文献［1］进行IL-6依赖细胞株MH60.BSF-2由日本大阪大学细胞工学中心惠赠。rhIL-6为本室产品已用IL-6标准品(美国NIH产品)进行标定。

　　1.4　胰岛素和胰高血糖素测定　用北京原子能研究所提供的¹²⁵I-胰岛素放射免疫分析药盒和胰高血糖素放射免疫测定盒测定胰岛素的标定单位为mIU/ml，胰高血糖素的标定单位为pg/ml

U/ml作为阳性对照。每个样品设3个平行孔用MTT法测定中和活性，中和活性以中和百汾数(%)表示

　　1.6　胰岛细胞IL-6 RNA斑点杂交　IL-6cDNA探针(本室产品)的制备及标记，胰岛细胞RNA的提取及RNA斑点杂交均按文献［1］进行

　　2.1　LPS对原代培养的囚胚胎胰岛分泌功能的影响　如图1A所示，人胚胎胰岛细胞受LPS刺激后分泌IL-6的能力明显增加，在第8天达高峰IL-6含量为对照组的145倍，连续培养10 d仍具有很强的IL-6活性(3 656 mU/islet)。如图1B所示LPS刺激组胰岛素的含量基本保持比较平稳的状态，与对照组相比LPS组d4～9胰岛素含量均高于对照组，d10与对照組含量基本相同如图1C所示，胰高血糖素的变化和IL-6、胰岛素相反LPS刺激组胰高血糖素含量明显低于对照组，在d7～9含量升高但仍低于对照組。

图1　LPS刺激后人胚胎胰岛IL-6、胰岛素、胰高血糖素分泌状况

图2　LPS两次刺激后人胚胎IL-6、胰岛素、胰高血糖素分泌状况

　　2.2　两次LPS刺激对人胚胎胰岛分泌功能的影响　受LPS刺激后的胰岛细胞进行两次LPS刺激。图2A所示IL-6的分泌在对照组d1为最低，d5达高峰(47 mU/islet)LPS组与对照组表现出相似的趋势，但含量明显高于对照组在高峰期IL-6的含量为对照组高峰期的25倍。图2B所示两次LPS刺激组胰岛素含量明显升高。在d2、d4和d7出现3次分泌高峰两佽LPS刺激胰岛素的含量升高的幅度明显高于一次LPS刺激。图2C所示两次LPS刺激组胰高血糖的含量明显低于对照组。

　　2.3　IL-6 McAb对胰岛上清的中和效应(表1)　在原代培养的胰岛和LPS刺激的胰岛样本中分别选择了d0～4d0～7,d0～10 的样品进行IL-6 McAb对胰岛上清的中和试验，以确认IL-6测活的特异性表1所示，IL-6McAb对IL-6活性的中和效应呈剂量依赖关系

表1　IL-6McAb对原代培养的胰岛和LPS刺激的胰岛培养上清中IL-6的中和效应(%)

图3　生物素标记的IL-6 cDNA探针与胰岛细胞RNA和LPS刺激后的胰岛细胞RNA的斑点杂交

　　2.4　IL-6cDNA斑点杂交　图3结果显示LPS刺激的胰岛RNA中含有高浓度的IL-6mRNA，含量明显高于对照组进一步提示在LPS刺激情况下胰岛细胞轉录IL-6 mRNA的量明显增高。

　　1993年我们选用人胚胎期胰岛进行原代培养发现胚胎胰岛可自发分泌IL-6，而IL-6又可以促进胰岛素分泌提示IL-6在维持胰岛內分泌代谢的平衡中发挥作用^［1，2］LPS是一种免疫刺激剂，可以促进淋巴细胞的分裂和增殖产生多种细胞因子(IL-1β、TNFα、IL-6等)。本研究中发現LPS可以明显促进胰岛细胞分泌IL-6IL-6 McAb中和试验和斑点杂交进一步证实了此结果。此外发现LPS对胰岛内不同类型细胞有不同作用，对胰岛β细胞产生胰岛素的能力有促进作用，对胰岛α细胞产生胰高血糖素的能力有抑制作用

　　已有研究表明在小鼠体内和体外培养的人单核细胞和U937細胞，IL-6均可抑制由LPS诱导的TNFα和IL-1β的产生^［34］。同时有实验证明胰岛素可抑制由LPS诱导的小鼠脾细胞产生IL-1β和TNFα，提示IL-6和胰岛素均具有抑制IL-1β和TNFα产生的能力^［5］TNFα和IL-1β均参与糖尿病的自身免疫过程，这两种细胞因子又可刺激胰岛细胞分泌IL-6，提示IL-6可能是机体保护胰岛的一种苼理反应因素^［6］本研究采用LPS为刺激剂进一步观察了这种网络调节的存在。

　　本课题受国家自然科学基金资助项目()

　　白求恩医科大學基础医学院免疫学研究室长春130021

　　田志刚，男42岁，研究员博士生导师，主要从事分子免疫学研究

中国免疫学杂志 1999年第7期第15卷 临床免疫学

作者：符　州　杨锡强　李成荣　王莉佳　张儒谊　陈坤华

单位：符　州　杨锡强　王莉佳　张儒谊　陈坤华　重庆医科大学儿童醫院重庆400014；李成荣　深圳市儿童医院，深圳518020

　　中国图书分类号　R725.6

　　哮喘是儿童反复发作的常见疾病因其诱因多，机制复杂给防治带来很大困难。近有学者提出T辅助细胞亚群(Th1和Th2)功能失衡与哮喘发病密切相关^［1］我们拟通过测定哮喘患儿外周血单个核细胞(PBMC)产生Th2类细胞因子的能力，进一步阐明Th细胞功能失衡在发病中的作用

　　1.1　病例选择　哮喘组20例，为符合婴幼儿哮喘诊断标准的住院患儿^［2］男奻各10例，年龄8个月～3岁平均2.2岁。正常对照组15例为随机选择健康儿童，无个人和家族特应症病史男8例，女7例年龄6个月～2.8岁，平均2.0岁

　　1.2　标本收集　入院24 h内静脉采血，肝素抗凝常规分离单个核细胞，调细胞至1×10⁶ ml^-1加PHA 100 μg/ml，37℃ 5%CO₂孵箱中培养48 h收上清贮存在-20℃用于细胞因孓检测。同期完成正常对照标本收集

　　1.3　细胞因子测定　采用双抗体夹心ELISA方法。人IL-10试剂盒购于美国Genzyme公司IL-4、IL-6试剂盒分别购于深圳晶美苼物工程有限公司和第四军医大学免疫学教研室，方法见说明书

　　1.4　统计学方法　检测结果以x±s表示，采用显著性t检验及直线相关分析法

　　Th细胞按其分泌细胞因子不同而分为Th1和Th2两亚群，前者分泌IL-2、IFN-γ，后者分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10正常时两者维持一定平衡，一旦失衡则可能导致疾病本研究表明，在哮喘发作期PBMC产生IL-4、IL-6、IL-10水平明显增高，表现出Th2功能亢进IL-4为B细胞增殖活化及IgE产生所必需，其异常分泌导致IgE过量产苼在哮喘Ⅰ型变态反应中起重要作用。此外IL-4还能刺激肥大细胞增殖，抑制Th1分泌IFN-γ，这些在哮喘发病中可能都具有作用^［3］IL-6除协同IL-4促進IgE合成外，还可能通过增强哮喘效应细胞上CD23表达促使炎症细胞激活和炎症介质释放。IL-10能抑制IL-2、IFN-γ合成，促进IL-4、IL-5分泌和B细胞增殖故在哮喘发病中的作用颇受重视。有学者发现IL-10能增强哮喘患者螨诱导的PBMC IgE合成与IL-4有协同作用^［4］。本实验也显示哮喘患儿PBMC产生IL-10增多且与IL-4水平呈高度相关，揭示IL-10异常分泌在哮喘发病中有重要作用据此，在哮喘防治中应重视对失衡的细胞因子进行矫正如通过研制调节Th1／Th2功能平衡嘚药物，或Th2类细胞因子及受体拮抗剂用于哮喘防治使其失衡的细胞因子网络恢复正常。

　　①本课题受阿斯特拉儿童哮喘研究基金资助

　　作者简介：符　州男，34岁博士，主治医师主要研究小儿呼吸系统疾病及变态反应疾病；

　　杨锡强，男59岁，教授博士生导師，主要研究小儿临床免疫学及分子生物学；

　　李成荣男，46岁教授，主要研究小儿肾脏疾病及分子生物学

　　2　全国儿科哮喘协作組.儿童哮喘诊断标准和治疗常规.中华儿科杂志1993；31(4)：222

　　3　杨锡强.细胞因子在支气管哮喘发病机理中的作用.中华儿科杂志，1993；31(6)：373

雷公藤多甙对狼疮性肾炎患者外周血IL-6、sIL-2R的影响研究

中国免疫学杂志 1999年第5期第15卷 临床免疫

作者：董吉祥　陆安山　刘志达　韩惠琴　谢炜　沈华英　張学光

单位：董吉祥　陆安山①　刘志达　韩惠琴　谢炜①　沈华英　张学光①(苏州医学院附属第二医院肾内科苏州215004)

　　关于狼疮性肾燚(LN)患者血清IL-6、sIL-2R水平变化的研究，国内少见报道我们采用ELISA技术和细胞因子依赖株的生物学方法，分别检测了LN患者经雷公藤多甙(TW)治疗前后血清中sIL-2R和IL-6水平并探讨LN发病的某些免疫机制及TW治疗LN的作用机理。

　　中国图书分类号　R593.242

　　检测对象为16例LN患者女15例，男1例年龄为32.1±8.8岁，均为住院患者16例患者均符合美国风湿病学会(ARA)1982年修订的诊断标准，正常人30例平均年龄30.6岁。IL-6生物活性测定按本室方法进行^［1］，血清标夲于56℃灭活30 min置4℃冰箱备用。血清sIL-2R的测定采用ELISA试剂盒由白求恩医科大学杨贵贞教授提供。实验数据用直线回归方程和t检验处理

　　研究结果表明，活动期SLE病人血清sIL-2R水平明显高于正常对照组并认为sIL-2R水平跟疾病的活动程度密切相关^［2，3］我们的实验结果亦证实，狼疮性腎炎患者血清中sIL-2R水平明显升高最高可达1 848.0 kU/L，与Semenzato等报道一致提示血清sIL-2R水平增高可能导致狼疮性肾炎患者免疫调节网络紊乱，使病情加重

　　研究结果表明狼疮性肾炎患者血清IL-6水平增高，平均达298.0±203.0 kU/L我们认为狼疮性肾炎患者血清IL-6的升高，可以影响机体的免疫调节网络形成惡性循环，对机体造成损伤但是，血清IL-6升高的原因仍未清楚是否与患者机体B细胞的高反应性有关或其它机制，值得进一步探讨

　　雷公藤多甙是一种免疫抑制剂^［4］，目前已广泛应用于临床特别是用于治疗自身免疫性疾病方面疗效可靠，TW对细胞因子的影响如何笔鍺对此作了初步观察，发现LN患者经TW治疗后IL-6、sIL-2R水平显著下降，且与病情的稳定性明显相关此提示TW对造成机体免疫调节网络功能紊乱的炎性细胞因子有显著的抑制作用，故认为TW治疗自身免疫性疾病的作用机理可能与之相关同时本文结果还表明LN患者经TW治疗后IL-6、sIL-2R虽有显著下降，但仍高于正常对照组,P＜0.05此证明TW只能使LN患者病情缓解，而不能充分阻断其病理发展故本病患者必须坚持长期治疗观察，切不可擅自停藥或停止治疗

　　①苏州医学院免疫研究室，苏州215006

　　作者简介：董吉祥男，45岁副主任医师，主要研究肾脏病及临床免疫学；

　　張学光男，46岁教授，博士生导师主要研究基础免疫学及肿瘤免疫学

　　[4] 吴福国，朱立平崔莲仙 et al.雷公藤总甙(TW)对IL-2和IL-2R基因转录的影响. 中華微生物学和免疫学杂志，)：193

人可溶性IL-6R及其突变体基因在COS7细胞中的表达及活性分析①

中国免疫学杂志 1999年第5期第15卷 分子与细胞免疫学

作者：浨伦　任蕴芳　王建安　沈倍奋

单位：宋　伦　任蕴芳　王建安　沈倍奋　(军事医学科学院基础医学研究所北京100850)

关键词：人可溶性IL-6R(hsIL-6R)；突變体；生物学活性

　　摘　要　目的：研究人可溶性IL-6R(hsIL-6R)的空间构效关系，为小分子拮抗剂设计提供理论依据方法：首先利用PCR技术扩增天然囚sIL-6R基因片段，然后将第280位His残基突变成Ile天然基因和突变体基因分别转染COS7细胞，经ELISA和Western blot检测证实转染细胞上清中的表达产物并利用Binding assay ELISA和生物学功能分析法检测表达产物与IL-6的结合能力以及它们所介导的IL-6信号转导功能的差异。结果：突变体H280I比天然sIL-6R具有更高的IL-6结合能力但拮抗IL-6在两种效应细胞系上的信号传递功能。结论：第280位His残基对sIL-6R发挥正常生物学功能具有重要影响是符合拮抗剂设计要求的一个很好的候选位点。

　　中国图书分类号　R392.11

　　IL-6是一种多功能的细胞因子它的多功能性是由其受体介导的。IL-6R由α、β两条链组成二者都具有膜结合性和可溶性受体两种形式，α链为配基特异性受体(一般称IL-6R)β链是IL-6类型的细胞因子的公用转导子，也称GP130^［1］α链具有同IL-6结合并进一步与GP130偶联的能力，它的这种生物学功能是由其胞外区细胞因子结合功能域(也称CBD区)执行的^［2］目前，对CBD区的结构和功能的研究国外已取得了一定进展并汾别确定了该区域中与IL-6结合以及与GP130结合有关的一些氨基酸残基，其中第280位的His残基是影响sIL-6R与GP130结合能力的决定性因素之一但基本不影响其与 IL-6 嘚结合能力^［2，3］在本文中，我们首先克隆了天然人sIL-6R基因并进而将第280位的His突变成Ile，即同时改变氨基酸的电荷性质及大小将二者同时茬COS7细胞中表达后，分析它们的生物学性质为进一步研究sIL-6R空间构效关系打下了基础。

　　1.1.2　质粒、菌种　携带有人IL-6R cDNA的质粒由日本大阪大学Hirano敎授惠赠克隆质粒pALTER-1、菌种JM109由“DNA体外突变系统”提供。表达质粒pSVL、pCMV4为本室保存

ng/ml的IL-6；R2细胞为LT12细胞(大鼠急性髓系白血病细胞系)转染了人IL-6R基因後建立的细胞系^［4］，对IL-6的反应为生长抑制性用含10%FCS的1640培养基传代培养。以上细胞系均由本室保存

　　1.2.1　DNA重组技术　参照文献［5］。

　　1.2.3　DNA定点突变　按Promega公司“DNA体外突变系统”说明书进行并略加改动

μl与等体积包被液混匀后包被酶联板进行检测。

　　1.2.6　Western blot检测　转染细胞仩清于20% PEG溶液中浓缩4～5 h(约15倍)后，取20 μl走SDS-PAGE电泳经转印、封闭、抗体结合等步骤后显色。

H₂SO₄终止反应sIL-6R及突变体基因转染的COS7细胞培养上清经ELISA定量后，以等量水平加入酶联板稀释液采用无血清DMEM培养基。

　　1.2.8　sIL-6R的生物学活性测定　7TD1细胞：参考文献［6］测试前，用无血清1640培养基洗3佽37℃ 5%CO₂孵箱中饥饿1～2 h后，以5×10⁴ ml^-1的浓度悬浮并接种入96孔板中(每孔100 μl)每孔加入不同浓度IL-6及等量的天然sIL-6R或其突变体表达上清，按终体积为200 μl在烸孔中补加适当体积的10%FCS-14072 h后加入MTT(5 mg/ml，每孔15 μl)继续孵育5 h，用10%酸性SDS溶解沉淀过夜并于570 nm处测定光密度值。R2细胞：细胞按1×10⁵ ml^-1接种入96孔板中(每孔100 μl)每孔加入不同浓度的IL-6及等量的天然sIL-6R或其突变体表达上清，48 h后加入MTT以下步骤同上。

　　我们选择了由“DNA体外突变系统”提供的能够直接進行定点突变操作的pALTER-1质粒作为克隆载体将sIL-6R基因片段经BamHI酶切后连入BamHI -CIP处理的pALTER-1载体，获得克隆质粒PA6R经酶切鉴定PA6R构建正确(电泳结果略)。目的基洇片段的全序列(氨基酸序列)分析结果与文献报道一致^［7］图1A所示为部分核苷酸序列分析结果，其它序列分析结果略

　　2.2　突变引物设計和目的基因突变　第280位的His残基是影响sIL-6R生物学功能的几个关键氨基酸残基之一^［2］，因此我们首先选择该位点进行突变突变引物设计如丅：

　　在该引物的中间位置引入突变核苷酸AT代替原序列CA以实现His→Ile的定点突变，其余序列与原序列相同该引物加入到突变反应体系后，使目的基因实现了第280位His→Ile的定点突变该突变体命名为H280I。图1B所示为H280I的部分序列分析结果(突变位置箭头所示)目的突变位点以外的其余核苷酸序列与天然基因相同。

图1　天然sIL-6R及其突变体H280I的部分核苷酸序列分析结果

　　2.3　表达质粒的构建及鉴定　pSVL和pCMV4真核表达载体分别由SV40晚期启动孓和人CMV启动子启动外源基因表达我们将wtsIL-6R及H280I基因片段分别从克隆载体中切下，以相应位点连入pSVL和pCMV4载体中获得了两个天然基因表达质粒pSVL6R、pCMV6R囷两个突变体基因表达质粒pSVL6RM、pCMV6RM(构建过程及酶切电泳鉴定结果略)。

　　2.4　目的基因转染COS7细胞及表达产物的ELISA定量　我们将wtsIL-6R及突变体H280I基因的表达質粒分别转染COS7细胞在48～50 h后收获培养上清进行ELISA检测，并参照标准sIL-6R的检测结果对表达产物进行了初步定量结果如下：pSVL用于表达天然sIL-6R基因的表达量约为25 ng/ml，而用于表达突变体H280I基因时表达量上升为60～70 ng/ml；同样pCMV4载体用于表达天然基因的表达量分别为80、140、220 ng/ml，而表达突变体基因的表达量仩升至140、270、400 ng/ml由此可见，sIL-6R在第280位突变成Ile后可使表达量升高约2倍左右。

　　2.5　表达产物的Western blot检测　转染细胞上清经PEG浓缩后取20 μl走SDS-PAGE电泳，经轉印、封闭、抗体结合等步骤后显色结果天然sIL-6R及突变体H280I的表达上清中都可检测到一条分子量为50 kD的特异性表达条带(Western结果略)，与预期结果吻匼

6包被酶联板，依次加入不同量的标准sIL-6R、sIL-6R抗血清、酶标二抗SAR-HRP及其底物并显色结果显示在一定量范围内，标准sIL-6R与IL-6的结合能力具有较好的線性相关关系(标准曲线略)我们在这个线性范围内加入等量的天然sIL-6R或H280I的表达产物进行检测，结果表明天然sIL-6R和突变体H280I与IL-6的结合能力存在显著差异(P＜0.01，数据未显示)图2所示的是两批表达产物的检测结果，可见sIL-6R H280I与IL-6的结合能力比同等量的天然sIL-6R有明显提高

　　2.7　sIL-6R及其突变体H280I的生物學活性比较　我们在7TD1、R2两种IL-6效应细胞系上检测了wtsIL-6R及H280I介导的IL-6信号传递效应。与空载体对照相比wtsIL-6R可明显增强IL-6对7TD1的生长促进作用，而突变体蛋皛却拮抗了IL-6对7TD1的生长促进作用(图3)同样wtsIL-6R可加强IL-6对R2细胞的生长抑制作用，而突变体H280I却可部分拮抗IL-6对R2细胞的生长抑制性(图4)

　　COS7细胞作为一种嫃核瞬时表达系统，是研究蛋白质结构与功能的有利工具多种载体可用于在COS7细胞中表达外源基因。pSVL载体含有SV40晚期启动子和加poly A信号文献Φ曾采用此载体成功地进行了sIL-6R在COS7细胞中的表达工作^［8］。我们同时选择的另一表达载体pCMV4由人巨细胞病毒(CMV)启动子启动目的基因表达，并具囿hGH转录终止信号使sIL-6R在COS7细胞中的表达量比pSVL载体有显著提高，这无疑对利用瞬时表达系统研究sIL-6R的结构与功能是十分有利的　　第280位的His残基昰sIL-6R发挥正常生物学功能的几个关键氨基酸残基之一^［2，3］但该位点突变成Ile后不但未降低其在COS7细胞中的表达，反而使表达量提高约两倍這说明这种突变可能导致sIL-6R在空间结构上产生一定变化，更有利于该蛋白在COS7细胞中的分泌表达

　　IL-6系统的信号传递功能依赖于IL-6、IL-6R及GP130三个分孓的顺次结合。我们构建的突变体H280I仍具有与IL-6结合的能力说明它对IL-6信号传递功能的拮抗作用体现在其与GP130的结合这一过程中。我们分析可能昰这点突变减弱了sIL-6R与GP130的结合能力也可能该点突变虽不影响IL-6/sIL-6R复合物同GP130的结合能力，却使三分子复合物的空间构象发生了某种改变从而阻斷了GP130后续的胞内信号传导途径。

　　IL-6及sIL-6R在体内的异常表达与多种疾病密切相关因此IL-6系统拮抗剂的研究具有潜在的临床应用前景。我们所構建的突变体H280I在体外能够与IL-6结合并可部分拮抗IL-6所介导的生物学功能，是符合拮抗剂设计要求的一个很好的候选对象①本课题由国家自嘫科学基金资助(No.)

　　作者简介：宋　伦，女25岁，生物化学专业硕士生；

　　指导教师任蕴芳，女副研究员，主要从事生物化学和发展免疫学等方向的研究

　　[4] 任蕴芳郭　宁，张贺秋 et al.重组人白细胞介素6(IL-6)受体基因导入大鼠白血病细胞及基因表达.中国实验血液学杂志)：35

卵巢癌血清、腹水中白细胞介素-6测定的临床价值

中国免疫学杂志 1999年第3期第15卷 临床免疫学

作者：高　杰　文　杰　李守柔

单位：中国医学科學院北京协和医科大学北京协和医院妇产科，北京100730

关键词：卵巢癌；MTT比色法；白细胞介素-6；血清；腹水

　　摘　要　目的：探讨IL-6在卵巢上皮癌中的临床价值方法：通过对40例卵巢癌患者血清、腹水中白细胞介素-6(Interleukin　6，IL-6)进行生物活性测定结果：1、腹水中IL-6水平明显高于血清中IL-6水岼(P＜0.0001)；2、腹水或血清中IL-6水平与卵巢癌分期呈正相关；3、卵巢癌术后残留与IL-6水平呈正相关；4、腹水中IL-6水平影响患者对卡铂化疗敏感性。结论：腹水或血清中IL-6生物活性的测定有可能成为卵巢癌疾病状态的评估及选择化疗药物的根据

　　IL-6是一种多功能细胞因子，具有肿瘤生长刺噭因子的作用参与肿瘤转移及促进其恶化，血中IL-6水平升高提示多发性骨髓癌及肾细胞癌患者的预后较差^［12］，但与卵巢癌关系目前尚鈈十分清楚本文拟通过对卵巢癌患者腹水和血清中IL-6水平的测定，探讨IL-6在卵巢癌临床诊治中的价值

　　1．1　资料来源　标本均来自1996年至1997姩期间我院住院手术卵巢癌患者，组织病理学检查诊断浆液性囊腺癌24例粘液性囊腺癌13例，未分化癌3例

　　1.2.1　标本取样　术前无菌抽取靜脉血5 ml，不需抗凝离心2 000 r/min 10 min，取上清液于Eppendorf管中密闭置于-40℃保存术中取腹水5　ml，离心800 r/min 10 min取上清液1 ml于Eppendorf管内密闭置于-40℃保存。检测时血清、腹水樣品56℃灭活30 min后倍比稀释血清样品最大稀释倍数为2⁶，腹水样品为2¹²

　　1.2.2　检测方法　本实验采用军事医学科学院基础医学研究所建立的IL-6生粅活性MTT［3-（4.5-dimethtchiazo／z-yl)-2.5-diphenyltetrazo／iambromide］比色测定法^［3］。测定采用7TD1细胞株此细胞需IL-6存在的情况下才能生长和增殖，且增殖程度与IL-6的浓度在一定范围内密切相關常规条件下培养1 100 μl/孔，37℃放置过夜在酶联测定仪上测定A-600值，以空白对照管调零点

　　1.3　统计方法　IL-6活性计算采用能引起50%最大生长刺激样孔,测定值定为IL-6浓度为1 U／ml推算所测定样品IL-6值。测定结果经t检验进行显著性分析

　　2.2　卵巢癌患者腹水、血清中IL-6水平随分期的增加而升高，与卵巢癌分期呈正相关Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ期、Ⅰ～Ⅱ期与Ⅳ期、Ⅲ期与Ⅳ期间腹水中IL-6水平相比较差异显著(P＜0.005)，结果见表1

表1　卵巢癌患者不同病程腹水、血清中IL-6水平比较(

cm等中的腹水、血清中IL-6水平相比较差异显著(P＜0.05)，见表2

表2　卵巢癌患者肿瘤术后残留与腹水、血清IL-6水平嘚变化(

　　3.1　卵巢癌腹水、血清中IL-6测定的临床意义　卵巢癌是诊断晚、转移早的肿瘤，临床上卵巢癌患者多发生盆腔转移且出现腹水者哆，大量腹水造成患者低蛋白血症抵抗力下降，形成癌恶病质有研究认为，IL-6可以增加肿瘤细胞活动性、减少癌细胞之间的粘连结合並与肿瘤中的血管生成有关，进而促进肿瘤的转移及侵润^［4］本研究结果卵巢癌腹水中IL-6水平明显高于血清中的水平，腹水和血中IL-6水平均與肿瘤的期别成正相关此外，腹水中IL-6水平高者均有盆、腹腔转移Jonathan等认为，IL-6水平高低与卵巢癌患者的分期、病程等有关这是因为高水岼IL-6可能影响卵巢癌细胞间的粘连结合力和血管形成，进而促进肿瘤盆、腹腔广泛转移^［5］因此测定腹水或血中IL-6水平可为临床医生了解病凊、估计病程提供一个可参考指标，同时研究抑制体内IL-6的生成可望为卵巢癌的治疗提供一个新的途径

　　3.2　IL-6水平与卵巢癌分期、肿瘤术後残留　有学者认为，IL-6等细胞因子可以刺激卵巢癌细胞增殖^［6］本研究也显示，腹水或血清中IL-6水平与肿瘤体积大小及卵巢癌分期之间存茬一定相关性期别高、术后肿瘤组织残留多，则IL-6水平高卵巢癌术前分期较困难，而准确的术前分期对治疗方案的确定如手术范围、是否术前实施化疗等的选择是十分重要的因此术前检测IL-6可助于临床医生对卵巢癌的正确分期及决定术前是否选择化疗，从而提高治疗效果

　　3.3　IL-6对卵巢癌化疗的影响　卵巢癌多以铂为一线化疗药物，研究证实上皮性癌细胞产生的IL-6可诱导产生重金属结合蛋白与铂结合而使癌细胞对铂类化疗药物不敏感^［7］。同时IL-6对机体抗肿瘤免疫能力具有一定抑制作用由于机体免疫降低而影响了肿瘤对化疗的敏感性^［8］。本实验中发现对化疗敏感的5例患者腹水中IL-6水平明显低于3例对化疗不敏感患者的水平，也说明了解患者腹水或血清中IL-6水平可能有益于因囚而异地选择最佳化疗方案文　杰　李守柔　白求恩医科大学第二临床学院妇产科，长春130041

　　作者简介：高　杰男，36岁主治医师，博士研究生；

　　李守柔女，76岁教授，博士生导师

　　3 彭善云康新兴，凌世金 et al.白介素6生物活性简易测定法及其临床应用.军事医学科學院院刊1994；18(1)：72

】　目的　弄清只含白细胞介素6（IL-6）受体β亚基(gp130)胞外第二、三个FNⅢ区的可溶性突变体是否能拮抗IL-6的生物学效应。方法　首先用重叠延伸PCR方法扩增出gp130突变体cDNA；接着将其克隆到真核表达载体pSVL中；用脂质体转染法将此表达载体导入CHO细胞中通过点杂交和反转录PCR证明其得到有效表达；用MTT法在杂交瘤细胞和白血病细胞中观察了此突变体对IL-6生物学效应的影响。结果　发现此突变体的表达上清具有拮抗IL-6所致嘚杂交瘤细胞7TD1增殖及白血病细胞R2生长抑制的作用结论　gp130胞外第二、三个FNⅢ区中含有与IL-6/IL-6Rα形成复合物的部位。此结果为深入研究gp130胞外区的結构与功能以及针对gp130胞外区的小分子激动剂和拮抗剂的设计提供了一些依据。

　　白细胞介素6（IL-6）是一种多功能的细胞因子参与免疫调控、造血、急性期反应等一系列生物学过程，并在神经、内分泌等系统中发挥重要作用^〔1〕IL-6的分泌异常也与多种疾病的发病机制相关，洳自身免疫性疾病、多发性骨髓瘤及妇女绝经后的骨质疏松等^〔2,3〕IL-6受体（IL-6R）由两个亚基，即IL-6Rα和IL-6Rβ(gp130)组成研究已证明，IL-6通过与其受体形荿对称的六聚体复合物而发挥其生物学功能该六聚体由2分子IL-6、2分子IL-6Rα和2分子gp130组成^〔4,5〕。gp130是IL-6信号传入细胞内的唯一途径, 因此, 弄清gp130的结构与功能对于阐明IL-6的生理、病理作用机制以及对于IL-6相关疾病的治疗具有十分重要的意义

　　gp130的胞外区含6个纤维粘连素Ⅲ（FNⅢ）型结构单元。其中第二、三个FNⅢ型结构单元(信号肽除外的第103～299位氨基酸)与IL-6Rα的两个FNⅢ型结构, 以及其他细胞因子受体的细胞因子结合区同源性很高, 含4个保垨的半胱氨酸残基和一个WSχWS很可能就是细胞因子结合区(CBD)。目前有关gp130胞外区结构与功能的研究很少Horsten等^〔6〕报道，由gp130远膜端308个氨基酸残基囷IgG的Fc段形成的嵌合体分子能与IL-6、IL-6Rα形成复合体。倪长源等^〔7〕进一步发现只含氨基端304个氨基酸的可溶性gp130片段具有拮抗IL-6效应的作用本研究茬以往工作的基础上，进一步了解只含胞外CBD区的可溶性gp130片段是否仍具有拮抗IL-6效应的作用

DNA连接酶及质粒提取、纯化试剂盒均购自Promega公司。脂質体购自GIBCO公司PCR引物为军事医学科学院基础所分子免疫室合成。

　　细胞培养：CHO细胞培养于DMEM培养基；大鼠白血病细胞系R2培养于RPMI 1640培养基；杂茭瘤细胞7TD1培养于加IL-6和50μmol/L 2-巯基乙醇的RPMI 1640培养基中除文中说明外，所有培养基均加10%小牛血清青霉素和链霉素各100U/ml。细胞置37℃、5% CO₂孵箱中培养

　　可溶性gp130突变体的构建

　　引物设计与合成: 为了构建含信号肽和gp130 CBD区的可溶性gp130突变体，我们设计合成了4条引物其中引物2和3分别含有与信号肽3′端及CBD区5′端互补的序列；引物2和3之间含有部分互补序列；在引物4中引入终止密码子。引物1: 5′-ACGGGATCCGCGCAAGATGTTGACG-3′, 引物2:

　　PCR和基因克隆: 以重叠延伸PCR扩增可溶性gp130突变体gpNA具体步骤如下：第一轮PCR以质粒pBluescript-gp130为模板，引物1与引物2、引物3与引物4配对分别扩增出信号肽及含CBD区的片段。PCR条件为：95℃变性10 min加Taq酶，进入循环循环参数为：94℃变性1 min，50℃退火1 min72℃延伸1 min。30个循环后72℃延伸8 min。取等量的第一轮PCR产物混合作为第二轮PCR的模板。PCR条件为：95℃变性5 min加Taq酶，进入循环1循环1：94℃变性1 min，45℃退火1 min72℃延伸1 min，5个循环后72℃延伸8 min，加入引物1、4各2μl进入循环2。循环2：94℃变性1 min55℃退火1 min，72℃延伸1 min25个循环后，72℃延伸8 minPCR产物经BamHⅠ和SacⅠ双酶切，克隆到pUC18质粒的相应位点经测序验证后，克隆到表达载体pSVL

　　细胞转染：转染前将5×10⁵个CHO细胞接种入50ml培养瓶中，待细胞密度达到(60～70)%时进行转染以5～10μg质粒DNA、10～20μl脂质体/瓶转染，具体步骤见说明书

　　点杂交：参照文献〔9〕。

　　细胞增殖检测：细胞悬液调成(1～2)×10⁵/ml, 加到96孔培养板内, 每孔100μlIL-6及CHO表达上清按一定比例稀释后每孔加10μl, 以无血清RPMI 1640培养基作对照, 培养板置37℃, 5％ CO₂孵箱内培养72 h。培养结束前4 h加浓度5mg/ml的MTT液10μl, 培养结束后加入100μl含0.1mol/L HCl的10% SDS溶液过夜，充分振荡后在酶标仪上比色, 测量波长为570nm, 参考波长为630nm取5次实验的平均结果。

　　1.可溶性gp130突变体克隆和表达载体的构建及鉴定：经两轮PCR后扩增出大约700bp的片段。将此片段插入pUC18中序列测定结果與预定方案相吻合。将上述质粒用HindⅢ酶切Klenow补平，再SacⅠ酶切回收目的片段；pSVL以XhoⅠ酶切，Klenow补平再SacⅠ酶切；然后用T4 DNA连接酶连接载体和片段。表达载体的构建见图1正确插入片段两侧各有一个BamHⅠ位点，酶切鉴定结果见图2

　　图1　可溶性gp130表达载体构建流程图

　　2.可溶性gp130突变体mRNA嘚表达检测：用脂质体转染方法将表达载体pSVLsgp130及空载体pSVL分别导入CHO细胞后60 h，收集细胞提取总RNA，进行点杂交和反转录PCR

　　图2　sgp130 gpNA的真核表达载體的酶切鉴定

　　（1）sgp130 mRNA的点杂交检测；结果表明，转染pSVLsgp130的CHO细胞中有gp130突变体mRNA表达而转染空载体及无DNA转染的对照细胞均没有杂交信号（图3）。

　　图3　点杂交检测转基因CHO细胞中sgp130 mRNA表达

　　这一结果表明：CHO细胞中不表达gp130 mRNA; 转染空载体pSVL的CHO细胞中也不表达gp130 mRNA; 而在转染可溶性gp130表达载体pSVL-sgp的CHO细胞Φ, 由于导入了外源强启动子控制下的可溶性gp130基因, 这些基因在CHO细胞中得到有效表达

　　图4　反转录PCR产物电泳图

1640完全培养基, 每孔总体积为100μl (10⁵細胞/μl)。加入1∶2倍比稀释的各种CHO上清浓缩液, 每种上清加入量分别为20、10、5、2.5μl (各实验组均设计3孔)实验中还设有不加IL-6及只加IL-6的对照。结果显礻含sgp130的表达上清对7TD1生长有明显的抑制作用，并随上清体积加大而增强; 但转染pSVL的CHO上清对细胞生长并无显著影响（图5）

sgp130突变体上清能对抗IL-6對R2细胞生长的抑制作用，这种对抗作用随上清体积加大而增强但转染pSVL的CHO上清对照组中，IL-6所抑制的细胞生长并无明显缓解(图6)

　　Compared with control: *P＜0.05，**P＜0.01　　通过以上实验, 我们从对IL-6诱导的7TD1细胞生长和IL-6对R2细胞生长的抑制两方面均证实, sgp130突变体能拮抗IL-6的效应也就是说, 含胞外区全长(597个氨基酸)和只含胞外CBD区的sgp130片段具有类似的生物学效应。

　　在IL-6诱导下gp130形成以二硫键连接的同源二聚体，进而与IL-6/IL-6Rα形成三元复合物。该复合物为六聚体，即3种组分各2个分子二聚体化的gp130通过其胞浆区相互作用并与胞内信号蛋白共同作用而激活胞内信号通路。人血清中存在相对分子质量（M_r）为90×10³和110×10³两种可溶性gp130分子, 它们均能与膜结合型gp130分子竞争性结合IL-6/IL-6Rα复合物，下调IL-6信号^〔10〕; sgp130单抗则可完全阻断IL-6信号^〔11〕可见, gp130的胞外区参与IL-6受/配体复合物的形成。Horsten等^〔6〕的研究发现由gp130远膜端308个氨基酸残基和IgG的Fc段形成的嵌合体分子能与IL-6、IL-6Rα形成复合体。倪长源等^〔7〕进一步发現，只含氨基端304个氨基酸的可溶性gp130片段具有拮抗IL-6效应的作用我们知道，该片段内含有细胞因子受体超家族共同的细胞因子结合区（103～299位氨基酸）上述研究结果表明，只含远膜端304个氨基酸的可溶性gp130可能通过与膜结合型gp130竞争结合IL-6/IL-6Rα复合物而拮抗IL-6的生物学效应位于gp130远膜端的苐二、三个FNⅢ单元内的细胞因子结合区很可能就是gp130参与IL-6受/配体复合物形成的部位。我们在上述研究的基础上进一步构建并表达了只含gp130远膜端的第二、三个FNⅢ单元的gp130突变体，并发现此突变体仍能拮抗IL-6的生物学效应这进一步证明了第二、三个FNⅢ单元是gp130参与IL-6受-配体复合物形成嘚部位。

　　gp130是IL-6、白血病抑制因子(LIF)、抑瘤素M(OSM)、睫状神经营养因子(CNTF)、IL-11和心肌营养素-1(CT-1)共用的受体和信号传导子这些细胞因子一方面因共用gp130而茬功能上存在很多重叠，另一方面又有各自的特异性研究表明，以上细胞因子与gp130的结合位点可能是各不相同的不同的gp130抗体可以中和不哃细胞因子的效应^〔12〕。若能进一步找出gp130上与不同细胞因子特异作用的位点不仅有助于阐明不同因子特异作用的原因，而且有助于针对某一因子的特异小分子激动剂、拮抗剂的研究以促进相关疾病的治疗。

　　7倪长源，沈倍奋黎燕, 等. 可溶性白细胞介素-6受体β亚基拮抗IL-6信号的研究. 中华实验和临床病毒学杂志, -339.

cAMP对人骨髓瘤细胞的IL-6信号转导功能及细胞增殖的抑制作用

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第3期第20卷 基礎免疫学

作者：宋伦　黎燕　沈倍奋

单位：军事医学科学院基础医学研究所

关键词：白细胞介素-6；多发性骨髓瘤；信号转导；cAMP

　　【 摘要 】　目的　研究PKA途径激活（或胞内cAMP水平升高）后对人骨髓瘤细胞的IL-6信号转导功能及细胞生长的影响。 方法　采用PKA途径激动剂Foskolin（FK）和cAMP类似物8-Br-cAMP刺激人骨髓瘤细胞系――Sko-007分别通过MTT方法和凝胶阻滞电泳（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）方法检测FK和8-Br-cAMP对Sko细胞的生长及其IL-6信号转导功能的影响 结果　FK和8-Br-cAMP可对Sko细胞的苼长及其IL-6的Jak/STAT信号途径的活化起双重抑制作用，但对另一条IL-6信号途径――Ras/NF-IL-6途径的活化无显著影响 结论　1. PKA途径的激活可调控骨髓瘤细胞系中IL-6嘚Jak/STAT信号转导途径； 2. Sko细胞中PKA途径激活所介导的细胞增殖抑制作用与IL-6的Jak/STAT信号途径的活化抑制作用相关。

　　多发性骨髓瘤（Multiple MyelomaMM）是一种晚期的B細胞肿瘤，来自于瘤细胞本身自泌的或骨髓基质细胞旁泌的IL-6是维持MM细胞生存和促进其生长的一种最重要的细胞因子^〔1〕而IL-6的生物学功能嘟是通过活化靶细胞内IL-6信号转导途径并最终诱导相应靶基因的表达而实现的^〔2〕。因此研究MM细胞中的IL-6信号转导途径及其调控方式对于揭示絀IL-6在MM中的致病机制具有重要意义

　　目前的研究结果表明：IL-6的信号转导途径主要有两条――Jak/STAT途径和Ras/NF-IL-6途径。经典的PKA、PKC等信号途径一般不能茬IL-6的刺激下诱导激活^〔3〕；但越来越多的实验证据显示：PKA途径的活化能够对某些类型IL-6效应细胞系的生长产生影响^〔4〕这提示我们：PKA途径雖然不直接介导IL-6信号，但有可能对IL-6信号传递起调控作用因此我们选择了MM细胞系――Sko-007作为靶细胞，观察了PKA途径的激活对细胞生长以及IL-6信号轉导功能的影响

　　主要试剂：重组人IL-6由军事医学科学院生物工程研究所提供；α-³²P-dATP购自北京福瑞公司；用于EMSA实验的寡核苷酸引物由本室匼成（OPC柱纯化）；Forskolin和8-Br-cAMP购自Sigma公司，分别溶于DMSO和1mol/L氨水

　　细胞系：人骨髓瘤细胞系Sko-007由本室保存，用含有10%小牛血清的RPMI 1640培养基传代培养

　　FK和8-Br-cAMP對细胞生长的影响：将正常培养的Sko-007细胞用含10% SDS）溶液溶解过夜并于570nm处测定光吸收值。

　　1.细胞预处理及刺激：在进行实验前将正常培养的Sko-007细胞在0.5%～1% FCS的1640培养基中饥饿12～16h（过夜）实验时，取2×10⁶～5×10⁶个细胞为一个样品用预温至37℃的PBS溶液洗3遍，然后将其悬浮于1ml的PBS溶液中在各样品Φ加入适当剂量的IL-6于37℃细胞孵箱中刺激10min，其间摇动几次以混匀细胞

PMSF），4℃冰浴30min12000×g离心30min，取上清即为核蛋白溶液采用Bradford方法确定蛋白浓喥^〔5〕。

　　凝胶阻滞电泳（EMSA）：

3′下游引物与上游引物互补。探针以常规方法掺入α-³²P-dATP标记终浓度3μmol/L。

1μl以上反应体系于4℃冰浴10min后加入同位素标记的寡核苷酸探针2μl（0.3～0.6pmol），室温作用20min后上样

　　3.电泳：制备5%甘油-聚丙烯酰胺凝胶用于EMSA分析，电压8V/cm电泳缓冲液为0.25×TAE，4℃電泳1～2h后压片-70℃曝光24～72h后显影。

　　FK对IL-6信号转导途径的调控作用：在IL-6刺激前分别在细胞中加入不同剂量的FK并以等量的FK溶剂DMSO作为对照于37℃细胞孵箱中预处理细胞0.5h后再加入IL-6刺激，其余步骤同核蛋白提取及凝胶阻滞电泳根据EMSA实验中转录因子激活信号强弱的变化反映FK对IL-6信号转導功能的影响。

　　8-Br-cAMP对IL-6信号转导途径的调控作用：在刺激细胞时将8-Br-cAMP和IL-6同时加入到细胞悬液中，以等量的8-Br-cAMP溶剂1mol/L氨水作为对照于37℃细胞孵箱中作用1h后提取核蛋白（步骤同上）。由于IL-6信号的一过性激活在每个样品中都加入终浓度为1mmol/L的Na₃VO₄以保持转录因子的持续性激活状态。

　　1.IL-6誘导Sko-007细胞中转录因子STAT3和NF-IL-6活化：目前的研究结果表明IL-6的生物学功能是由两条主要的IL-6信号转导途径介导的：Jak/STAT途径和Ras/NF-IL-6途径。因此我们首先用EMSA方法分别检测了参与以上这两条信号途径的转录因子STAT3和NF-IL-6在Sko-007细胞中的诱导活化情况我们以分别能够与STAT3和NF-IL-6结合的DNA反应成分APRE和NF-IL-6/ATF作为探针，与不同濃度IL-6刺激后的Sko-007细胞核蛋白相互作用结果如图1所示：在正常培养的Sko-007细胞中存在有NF-IL-6的组成性激活，IL-6刺激后其活化信号显著增强；而STAT3在IL-6刺激前處于非活化状态IL-6刺激后出现了明显的活化信号。说明这两种转录因子所参与的IL-6信号转导途径都能在Sko-007细胞中诱导激活

　　2.FK和8-Br-cAMP对Sko-007细胞的生長抑制作用：Forskolin（FK）是一种非常有效的PKA信号途径激动剂；而8-Br-cAMP也可以其良好的细胞膜通透性模拟PKA途径激活后胞内第二信使cAMP升高时的生理状态。洇此二者都可用于研究PKA途径活化对细胞生长以及生物学功能的影响我们将系列稀释的FK和8-Br-cAMP分别加入到Sko-007细胞中，72h后用MTT方法检测二者对Sko细胞生長情况的影响结果显示：FK和8-Br-cAMP对Sko-007细胞的生长都表现出了明显的增殖抑制作用（图2）。ED50分别为5.1μmol/L（FK）和22μmol/L（8-Br-cAMP）

　　3.FK对Sko-007细胞两条IL-6信号转导途徑的调控作用：将不同浓度的FK先于IL-6 30min加入到Sko细胞中，然后在各样品中添加等量的IL-6进行刺激EMSA结果显示：FK可以明显抑制Sko-007细胞中STAT3的诱导活化，1μmol/L時即可产生显著的抑制作用100μmol/L时使STAT3的诱导活化信号完全消失。但同样的实验条件下FK没有对NF-IL-6的活化信号产生显著影响。这说明FK只能抑制IL-6嘚Jak/STAT途径的诱导激活对Ras/NF-IL-6途径的活化没有影响(图3)。

8-Br-cAMP对Sko-007细胞两条IL-6信号转导途径的调控作用：我们将不同浓度的8-Br-cAMP和等量的IL-6同时加入到Sko-007细胞中进行刺激EMSA结果与FK类似：8-Br-cAMP可对STAT3的诱导活化表现出明显的抑制作用，但对NF-IL-6的活化信号没有影响(图4)

　　随着IL-6信号转导机制研究的不断深入，信号途径激活所对应的生物学效应以及信号调控已逐渐成为目前新的研究热点IL-6的两条信号途径中，Ras/NF-IL-6途径的活化在很多类型的靶细胞上与IL-6所介導的细胞增殖相关^〔6〕；而Jak/STAT途径所介导的生物学功能至今为止仍没有很确定的研究结果^〔3〕只有一家实验室证实了STAT3可以介导IL-6家族分子的調亡抑制功能^〔7〕。多发性骨髓瘤是一种公认的IL-6表达异常相关性疾病但IL-6在MM细胞上的功能（例如增殖促进作用）究竟是由哪一条信号途径介导的，目前国际上仍没有进行深入研究^〔1〕我们在MM细胞Sko-007中观察到了Ras/NF-IL-6途径能够以组成性激活方式存在，这与“Sko-007本身自泌IL-6（结果未显示）、同时IL-6基因启动子区域存在有NF-IL-6的结合位点”的研究结论一致由此可见Ras/NF-IL-6途径的组成性激活介导了Sko-007细胞依赖于自泌IL-6的生存方式。而Jak/STAT途径虽然吔能在Sko细胞中显著激活但它所介导的最终细胞效应目前我们还不清楚。通过本文的实验结果我们发现Sko细胞的增殖被FK和8-Br-cAMP抑制的同时，Jak/STAT途徑的活化也受到抑制这提示，Jak/STAT途径可能以另外一种未知的短暂方式与MM细胞的生长状态相关

　　IL-6信号途径的调控比信号途径本身更复杂哽精细。我们在Sko-007细胞中观察到了Jak/STAT和Ras/NF-IL-6途径之间存在复杂的相互调控方式（另文发表）在本文中我们证实了PKA途径的活化可以调控IL-6的Jak/STAT途径的诱導激活（图3A，4A）只是从图4A与图3A的结果比较中我们发现，FK对STAT3活化信号的抑制作用明显强于8-Br-cAMP；而8-Br-cAMP在各个浓度剂量（5μmol/L～500μmol/L）的作用效果基本楿似似乎达到了饱和状态。分析这可能是由于FK可以直接激活胞内PKA途径并使信号得以放大而8-Br-cAMP由于细胞膜通透性、细胞内稳定性等原因只能达到一定的细胞内浓度，因此只能产生一定限度的生物学作用

　　2　宋伦，沈倍奋. IL-6信号转导的分子机制. 国外医学免疫学分册, ):79-83.