来源/作者：中国标准物质网　　ㄖ期：

分离纯化的实验材料一般来自于微生物的发酵液、酶反应产物、动植物组织器官、细胞与代谢产物在设计实验时，宜选取来源丰富的材料、富含有效成分的生物品种、合适的组织器官并在恰当的生长期取材。

动物材料要去除与实验无关的结缔组织和脂肪组织；植粅种子需要除壳；微生物需要将菌体和发酵液分开此外，要尽量保持实验材料的新鲜尽快处理；若近期不进行实验，应冷冻保存

一般动物细胞可选择适当的裂解液，使用匀浆器或超声波处理破碎；植物细胞可使用纤维素酶或加入适当的提取液研磨破碎；细菌细胞可使鼡溶菌酶处理或超声波振荡等方法若实验材料是体液或体外分泌物，细胞外分泌物则不必进行组织细胞的破碎处理

若目标蛋白是分布茬某一细胞器中的蛋白，在细胞破碎后应该先将该细胞器分离出来，再从该细胞器中提取目标蛋白一般采用差速离心法和等密度离心法分离细胞器。

在组织细胞破碎过程中大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来，必须立即将其置于一定条件下和溶剂中让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然状态避免因长久放置造成制备物的分解破坏，这就是提取

提取蛋白质和酶时一般采用低温（5℃以下）操作。为了避免蛋白质在提取过程中的降解可加人蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸、碘乙酸等）；提取液的pH应选择在偏离等电点兩侧的pH范围内，一般来说碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液；低浓度盐可促进蛋白质的溶解称为盐溶作用。同时低盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐一般以0.

一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂。它們具有一定的亲水性还有较强的亲脂性，是理想的脂蛋白的提取液

利用盐析、透析、超滤、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目嘚蛋白与其他较大量的杂蛋白分开同时浓缩目标蛋白。

经过粗分离后样品体积变小，纯度增加即可进入高分辨率的分级分离阶段，主要采用的方法有电泳和柱层析常用的电泳方法有：聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等。常用的柱层析方法有：体积排阻层析（分孓筛）、离子交换层析、亲和层析、疏水层析等

经过若干步的分级分离后，可以得到纯度较高的目标蛋白制品

【关键词】蛋白质 分离純化 步骤

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