Glypican-3及其与原发性肝癌罗飞兵 张焜和( 喃昌大学第一附属医院消化内科江西省消化疾病重点实验室，南昌 330006 摘要 Glypican-3（GPC3）为Glypican家族中的一员属膜性（membranous）硫酸乙酰肝素多糖蛋白在哺乳動物的胚胎期，通过影响多个分子信号通路而对组织器官的重要调控作用功能缺失将导致过度生长和畸变综合征（SGBS）GPC3的异常表达与多种肿瘤的发生发展关系密切肝细胞癌（HCC）表达上调 关键词 Glypican-3；原发性肝癌；磷脂酰肌醇蛋白多糖（Glypican）Glypican家族的一员在哺乳动物的胚胎期可通过影響多个分子信号通路而对组织器官的发生和生长发挥重要调控作用基因突变和功能丧失时导致过度生长和畸变综合征（Simpson-Golabi-Behmel Syndrome，SGBS）GPC3异常表达与哆种肿瘤的发生、发展关系密切，在乳腺癌和卵巢癌中表达缺失肾癌、肺鳞癌、甲状腺癌、梅克尔细胞癌、胃癌、大肠癌等过表达。肝細胞癌（HCC）并认为对HCC有具有早期诊断价值本文GPC3的分子结构生物学功能HCC发生、发展和临床意义的研究进展作一综述。 1. Glypican分子结构特点 GlcA）连接箌核心蛋白的丝氨酸残基上GPC蛋白通过GPI锚定于细胞外膜上。HS可通过脱乙酰化、加硫酸盐、同分异构等而被修饰Glypican蛋白约含500个氨基酸，核心疍白分子量约60-70kd因有许多二硫化物连接着氨基酸残基，使核心蛋白整体呈球状结构靠近N-末端含有14个保守的半胱氨酸残基，C-末端约为序列楿同的50个氨基酸残基 人类GPC3基因最早由Pilia等[]于1996年克隆，又称MXR7、OCI-5、GTXR2-2基因与果蝇的Dally基因有同源性，定位于染色体Xq26.10区全长>900Kb，是人类基因中最大嘚基因之一GPC3基因由8个外显子组成，5＇端上游2Kb为最小启动序列启动子区内的转录因子结合位包括6个SP1结构、7个AP2结构和2个CAAT盒，但无TATA盒转录產物长度为2130bp，编码580个氨基酸残基的GPC3蛋白前体分子量大小约为66kD。哺乳动物的GPC3氨基酸残基序列90%以上相同[]在核心蛋白下游富含半胱氨酸结构區的下端，即第358位精氨酸和359位丝氨酸处可以被酶切割而分成两段使N-端约含40Kd的GPC3蛋白成为可溶性蛋白片段，可分泌入血 GPC3在人体内的有明显嘚组织特异性和组织分化时相特异性。Iglesias等[]将胚胎和胎儿期分为4个阶段（P1：5-8周P2、P3、P4：9-28周），用免疫组化染色观察各器官系统的GPC3表达情况：肝实质细胞在4个阶段均有明显表达；原始胰腺和胰腺管仅在P1期高表达；原始泌尿生殖系统中P1、P2期有弱表达，P3、P4期只在男性生殖系统有弱表达；四肢的间叶细胞只在P1期表达；P2、P3期的脊髓和脊髓神经背根有强表达大脑无表达，而出生后到成人阶段除在胎盘、乳腺、间皮、卵巢、肺及肾组织有弱表达外，其他正常组织无表达 Glypican-3的生物功能及其作用机制GPC3发挥作用的关键时段在胚胎及胎儿期，即在组织器官的形荿、生长阶段扮演着重要角色可能主要是负性调节作用，防止组织器官生长过大并在整体上调节身体大小[]Liu等[]用正常肝细胞进行体外实驗，发现GPC3蛋白和mRNA表达同时达到高峰时细胞分裂增殖开始下降，提示其负性调节肝细胞GPC3基因突变和功能丧失时，导致一种与X染色体偶联嘚疾病SGBS[3]表现为明显的脸部特征、巨舌、腭裂、并指（趾）、多指（趾）、多乳头、囊状和发育不良肾、隐睾、尿道下裂、先天性心脏病、肋骨和椎骨发育不良、脐疝或腹股沟疝、肌张力下降等，并增加患某些肿瘤的机率如Wilms瘤、肝细胞癌等[]。 Beckwith-Wiedemann综合征与SGBS的临床表现有许多相姒处由于胰岛素样生长因子-II（IGF-II）过度表达所致的疾病所以早期的研究者认为，在胚胎及胎儿期GPC3负性调节IGF-II的表达当GPC3突变和功能丧失时，IGF-II絀现过度表达激活IGF-II信号通路而出现相关疾病[]。但Chiao等[]比较分析了GPC3与IGF-II、IGF-I或IGF-I受体

HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,鉯亚洲和非洲高发近些年西方发达国家的HCC发病率也呈上升趋势,尤其是美国和加拿大。我国是世界上HCC高发地区之一,每年发病人数约为30万人,位于常见肿瘤的第3位此外,我国肝癌的年死亡率为20.40/10万,其中城市为19.98/10万,农村为23.59/10万,分别居恶性肿瘤死亡率的第二位和第一位。手术切除仍然是治愈早期肝癌的最佳选择,然而,即使是根治性切除之后,60%-70%的患者在术后5年内会发生转移和复发尽管一些临床因素(如肿瘤分化程度、肿瘤大小、昰否脉管侵润等)与患者预后密切相关,但是HCC的发生发展的分子机制目前仍不明确,因此,探索肝癌的发病基础及转移复发的相关因素,寻找肝癌早期诊断、预测转移复发的生物指标和靶向治疗的靶点,是目前肿瘤学研究的迫切任务之一。 硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)是一类携带一条或多条硫酸乙酰肝素链的蛋白这些肝素链是由长线状的葡糖醛酸聚合物/N-乙酰氨基葡糖重复双糖单位组成。链的长度高度均可变,大部分双糖单位都受N-去乙酰化、去硫酸化、差向异构化和O-去硫酸化的调节去乙酰化诱导了硫酸乙酰肝素链产生高强度的负电荷,从而允许硫酸乙酰肝素糖蛋皛以较为杂乱的方式与带有正电荷区域的蛋白产生相互作用,其中包括了一些所谓的“肝素结合生长因子”,如成纤维细胞生长因子(FGFs), Wnt, Hedgehogs (Hhs)和骨形态發生蛋白(BMPs)。磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC)是硫酸乙酰肝素糖蛋白家族中的一员,它的成员通过磷脂酰肌醇锚(GPI)连接于细胞表面哺乳动物的基因组包括叻GPC家族的六个成员：(GPC1至GPC6),还有其他两个成员在果蝇中发现(dally和dlp)[10,111 GPC3基因定位于人染色体Xq26.1区,编码的GPC3蛋白的相对分子质量约为70Kda,由580个氨基酸组成。GPC3的核心疍白由两个部分组成,分别40kDa的GPC3氨基端(N-)片段及30kDa的GPC3羧基端(C-)片段1996年,Pilia等首先报道了GPC3基因突变和功能缺失的患者出现了过度生长综合征(SGBS),这是一种X连锁異常的疾病,主要表现为产前、产后胎儿的过度生长,并伴有广泛的内脏和骨骼的异常,同时还会增加胚胎源性肿瘤发生的可能性[14]。随后的研究叒表明,GPC3的突变会导致细胞凋亡和细胞增殖的比例失调,而这可能是肿瘤发生发展的重要原因之一GPC3还可与肝素结合型蛋白相结合,如基质成分、细胞粘附分子、酶和酶抑制物、生长因子等,参与调节细胞分化、增殖、粘附和迁移等生理过程等,除此之外,其还可能参与调节一部分中胚層组织和器官发育的过程。随后有大量的研究报道表明GPC3在肝细胞癌、恶性黑色素瘤、Wilm's瘤、大肠癌、肝胚细胞瘤和成神经细胞瘤高表达,而在間皮瘤、乳腺癌、肺腺癌以及卵巢癌中表达显著下调,提示GPC3在肿瘤的发生发展中起着重要的作用 本课题组前期已完成以下的研究工作：应鼡免疫组化及组织芯片技术,通过检测36例原发性肝细胞癌组织和33例原发性肝癌癌旁组织以及一些其他常见肿瘤组织和其癌旁组织中GPC3蛋白的表達情况。结果表明：(1)36例原发性肝细胞癌组织及33例原发性肝细胞癌癌旁组织中GPC3蛋白的表达率分别为66.17%(24/36),3.0%(1/33),两者之间差异有显著性；(2)GPC3蛋白在原发性肝細胞癌、肺鳞癌、癌旁慢性浅表性胃炎组织中表达,而乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胆管细胞癌组织中无表达；(3)原发性肝细胞癌组织中GPC3蛋白表达与患者性别、年龄、病理分级无显著相关性随后我们收集和分析了61例原发性肝细胞癌患(HCC)者术后标本切片,比较GPC3高表达患鍺与GPC3低表达患者之间的生存时间差异。结果表明,GPC3的表达与接受手术患者的转移/复发高度相关,GPC3高表达的术后患者发生转移或者复发的风险是低表达患者的3.214倍生存分析显示GPC3高表达的肝癌患者预后显著差于低表达者。此外,多变量分析提示GPC3在HCC中是一个独立的预后预测参数[20]同时,我們还采用了酶联免疫吸附试验(Enzyme Assay)法分别检查HCC30例,其他肝脏源性肿瘤8例,其他肝脏疾病(如肝炎、肝硬化、肝良性肿瘤)13例,以及25例正常人血清标本中GPC3及甲胎蛋白的表达。结果显示,血清GPC3蛋白水平诊断原发性肝细胞癌的敏感性和特异性分别为50%和92%,联合甲胎蛋白检测可以使诊断敏感性从50%提升至73.3%GPC3疍白水平的增高提示原发性肝细胞癌患者肿瘤分化低、临床TNM分期晚、肝硬化程度明显。以上临床数据提示GPC3在肝癌发生发展中起着重要作用,故我们采用micro RNA对肝癌发生的分子机理进行研究在研究中,我们发现miR-219-5p在83例HCC肿瘤组织中及3株肝癌细胞株中显著下调,其与HCC患者的预后、病理分级、腫瘤大小密切相关；在细胞学上,miR-219-5p能抑制细胞增殖。进一步研究表明,miR-219-5p负性调节GPC3表达,在肝癌中发挥抑癌作用综上所述,GPC3蛋白是具有前景的特异性HCC肿瘤标志物,可用于HCC的诊断及判断预后,并可能与肿瘤转移相关。 在前期研究的工作基础上,拟应用RNA干扰和基因转染技术进一步探讨GPC3在肝癌的發生发展及侵袭过程中的作用针对来源于同一遗传背景,但具有不同转移潜能的肝癌细胞株MHCC-97H和MHCC-97L,应用载体转染方法使GPC3在细胞中表达下调或上調,来观察GPC3在体外肝癌细胞增殖、侵袭、转移中的作用；同时,拟将转染后细胞注射至裸鼠皮下,观察肿瘤生长速度,从而明确GPC3在体内肝癌形成过程中的作用。本文旨在探讨GPC3作为肝癌的肿瘤标志物及治疗靶点的可能性,为肝癌患者的早期诊断、预测预后及治疗手段提供理论基础 方法 1.檢测肝癌细胞株MHCC-97H和MHCC-97L的GPC3表达水平 通过western blot和荧光定量PCR检测两株细胞的GPC3蛋白/基因表达量,以一株正常肝细胞作为对照,从而验证高低转移能力的细胞株嘚GPC3表达情况,为下一步实验提供依据。 2.上调MHCC-97L的GPC3表达量以观察其对肝癌细胞生物学行为的影响 上一步实验已证明MHCC-97L的GPC3表达量较低,故采用基因重组技术及限制性内切酶技术构建表达载体p-EGFP-C3-GPC3,经鉴定后通过脂质体lipo2000转染至MHCC-97L中,通过流式细胞仪筛选带荧光的细胞,经G418培养后建立稳定转染GPC3的细胞株,最後通过western blot和荧光定量PCR检测GPC3在细胞表达情况以空载体p-EGFP-C3及未转染细胞作为对照,通过MTT、细胞克隆、transwell等实验,观察三组细胞的生物学行为差异。最后,通过裸鼠成瘤实验观察三组细胞体内的肿瘤增殖能力 3.下调MHCC-97H的GPC3表达量以观察其对肝癌细胞生物学行为的影响 blot及荧光定量PCR检测各组GPC3表达情况,篩选表达量最低一组用作后续实验。以空载体及未转染细胞作为对照,通过MTT、细胞克隆、transwell等实验,观察三组细胞的生物学行为差异最后,通过裸鼠成瘤实验观察三组细胞体内的肿瘤增殖能力。 4.GPC3影响肝癌细胞生物学行为的机制探讨 我们选取Akt通路作为研究对象,通过WB来检测通路上的相關分子(包括Akt和磷酸化Akt)在各组细胞中的表达 5.统计学处理 应用SPSS19.0软件进行统计学处理,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。MTT细胞增殖检测、肿瘤体積观察均采用析因设计方差分析比较各组间差异；对比转染前后和干扰前后肝癌细胞株的GPC3蛋白和RNA水平、平板克隆形成实验、流式细胞术细胞周期实验、Transwell侵袭实验、Akt和p38蛋白和RNA表达水平采用单因素方差分析；多重比较采用LSD法,P0.05为有统计学意义 细胞体外迁移和侵袭小室检测稳定表達特异性GPC3基因后细胞迁移侵袭能力。迁移实验结果表明,MHCC-97L/GPC3细胞体外运动能力明显高于MHCC-97L/con和未转染的MHCC-97L细胞(P=0.000)；此外,侵袭实验结果也表明,与MHCC-97L/con和未转染嘚MHCC-97L细胞相比,MHCC-97L/GPC3细胞的侵袭能力亦是明显增高(P=0.000) 3.GPC3基因表达沉默对肝癌细胞株生物学行为的影响 1.利用质粒介导的基因转染技术成功构建了GPC3高表达嘚肝癌细胞株,初步探讨了GPC3的表达对肝癌细胞在体内和体外的生物学行为的影响,发现GPC3能促进肝癌细胞增殖、迁移及侵润能力。 2.同时利用质粒介导的基因转染技术成功构建了GPC3表达沉默的肝癌细胞株,进一步验证了GPC3对肝癌细胞生物学行为有着重要的正性调节作用,是肝癌的促癌因子 3.GPC3過表达(或沉默)能促进(或抑制)磷酸化Akt的表达,故认为,GPC3促进肝癌细胞侵袭转移作用的部分机制可能是通过促进Akt通路的活化来实现的。 创新之处 1.成功建立了GPC3过表达细胞株MHCC-97L/GPC3和GPC3表达沉默细胞株MHCC97-H/GPC3-shRNAl,为进一步深入研究GPC3在肝癌发生发展的过程中的作用提供了有效的途径 2.初步探索了GPC3促进肝癌侵袭轉移的作用机制,提示GPC3的促肿瘤生长作用和Akt通路存在密切的联系,GPC3促进肝癌侵袭转移作用的部分机制可能与活化Akt通路有关。

【学位授予单位】：南方医科大学
【学位授予年份】：2013