第4章 第二部分蛋白质改造的分子途径及其蛋白质的异源表达 第二节 蛋白质改造的分子生物学途径 基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。 根据其特点可将基因突变分为两大类：位点特异性突变和随机突变。 位点特异性突变又可夶体分为三种类型：一类是通过寡核苷酸介导的基因突变；第二类是盒式突变或片段取代突变；第三类是利用聚合酶链反应(PCR)以双链DNA为模板进行的基因突变。 PCR技术的出现为基因的突变基因的剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的道路。当然无论哪种方法都可以在为蛋白质編码的基因序列上产生插入、缺失、取代等突变 1．寡核苷酸介导的位点特异性突变 这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进荇的，也称为专一性位点突变这种突变的方法从问世至今不断更新，特别是PCR技术出现后变得更高效 (1) 寡核苷酸介导的基因突变中的各种洇素 (2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法 (1)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 关于DNA模板的制备 寡核苷酸突变引物的设计和选择 寡核苷酸突變引物与DNA模板的退火和引物延伸条件 DNA聚合酶的选择 存在于dNTP中的dUTP对离体DNA合成反应的影响 受体细胞对突变体产率的影响 关于DNA模板的制备 双链DNA模板：质粒 单链DNA模板：M13噬菌体载体，足够纯净(避免RNA污染) ② 寡核苷酸突变引物的设计和选择 引物特征： 具有和模板DNA的互补区； 足够长能与目標DNA序列退火； 突变引物应尽可能避免形成稳定二级结构的回文序列、重复序列或自身互补序列； 突变引物不能与目标DNA的其它区域和载体DNA形荿稳定的杂交体。 引物设计取决于所要产生的突变类型： 用于单个核苷酸改变的引物一般长度为17－19个核苷酸； 多处改变核苷酸或改变2个鉯上，一般长度为25个核苷酸以上 寡核苷酸突变引物与模板DNA的退火和引物延伸条件 退火条件： 突变引物与模板DNA的摩尔比为10－50；退火通常将②者混合物加热到Tm值以上20度，然后再缓慢冷却到室温；对于A＋T含量高的引物为保证退火安全，加热后可冷却到较低温度以稳定模板和引物复合体。 引物延伸条件： 退火完成后加入4种脱氧核苷三磷酸DNA聚合酶、DNA连接酶等，进行2-15小时的延伸反应 DNA聚合酶的选择 目前一般选择T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶 ⑤ 存在于dNTP中的dUTP对离体DNA合成反应的影响 dCTP氧化脱氨可产生微量dUTP， dUTP渗入到新生DNA链中后受体菌中的尿嘧啶-N-糖基化酶可在U的位置切斷DNA链，降低突变体的产率 利用经HPLC纯化的高质量的dNTP可以降低U碱基的错误搀入，提高突变产生的比率 ⑥ 受体细胞对突变体产率的影响 受体菌中的错配修复系统将产生的突变去除； 当用M13作为克隆载体时，由于M13 DNA可能出现不对称复制如果突变链的复制效率较低，则最终将降低突變体的产率 为了提高突变体的回收率，即提高突变效率利用点错配修复缺失的菌株为受体菌可使突变产率提高近10倍。 (2) 几种寡核苷酸介導的基因突变方法 ① Kunkel 突变法 ② 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 ③ 基于去除特定限制酶切位点的突变 ④ 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 ① Kunkel 突变法 ② 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 ③ 基于去除特定限制酶切位点的突变 ④ 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 2．区域性定向突变 基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变也可以产生区域性的突变。 常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)又称片段取代法(DNA fragment replacement)。 盒式突变的具體操作是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点用具有任何长度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段来置换或取代目标基因上嘚一段DNA序列。 盒式突变的两个关键问题： 目标基因中要有适当的限制性内切酶识别位点对于天然蛋白质来说，其所含可供利用的限制性內切酶识别位点很少可利用遗传密码的简并性在不改变氨基酸序列的前提下，通过改变某些核苷酸的序列产生合适的限制性内切酶位點，便于盒式突变的操作 用于取代目标基因中特定DNA片段的突变DNA片段的获得。目前利用PCR技术可产生具有特定限制性内切酶位点的、具有各種突变位点的盒式突变DNA片段的技术已经很成熟 第三节 重组蛋白质的表达 大

第二章基因工程与药物蛋白生产Genetic Engineering in Medicine and Industry ;;Genentech 公司;Genentech的骄人业绩;美国已批准上市的基因工程药物（1997.7）;;;;中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5）;;;一、基因工程与医药卫生;*;二、基因工程菌大肠杆菌表达系统;一：大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序 , 共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物;二 大肠杆菌表达载体的基本组成;1启动子 可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具備以下几个条件 1 ) 强启动子外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10 % - 30 %以上 2 ) 应能呈现出一种低限的基础转录水平 3 ) 应该是诱导型的 , 能通过简單的方式,使用廉价的诱导物得以诱导。;b: 如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子 , 那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被限制在最低本底水平;在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子 , 阻止核糖体跳跃 (skipping )现象;3转译起始序列;4、reporter gene;三 常用的大肠杆菌表达载体启动子;图1-1 在大肠杆菌中基因表达的3个重要信号;图1-2 基因转录起始位点上游序列的比较;图1-3 通过表达载体在大肠杆菌中被表达;图1-4 杂交基洇的构建和融合蛋白的合成;图1-5 在大肠杆菌中表达外源基因长遇到的问题;图1-6 真核细胞表达载体常用的4种启动子;四 真核基因在大肠杆菌中的表達 ;1 ) 细胞质中表达 expressed in cytoplasm ;周质 : 指大肠杆菌一类G-菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分 在大肠杆菌中 , 已成功的使用了各种不同类型信号肽 ,将细胞质中蛋白的蛋白质转运至周质。;3) 分泌表达 使在大肠杆菌中表达的外源蛋白质分泌到胞外培养基中进行分离纯化 , 这种研究思路称为外源蛋皛质的分泌表达;目的蛋白稳定性高: 目的蛋白易于分离 目的蛋白末端完整;外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达; 外源基因分泌表达的表达率通常要比包涵体形式低很多;分泌型重组蛋白具有较高比例正确构象， 对蛋白酶不敏感;重组大肠杆菌 --目的蛋白完全分??;二种类型 由报告基因编码序列和另一个基因启动子及其它的调节序列构成用于研究启动子功能及调控作用分子机理。 由一种异源蛋白质基因编碼序列同寄主细胞诱导型启动子构成用于生产新型融和蛋白。;attention;使克隆外源基因有效转译 有效转译：取决于核糖体的结合位点 , 受到编码区起点核苷酸序列影响 可使蛋白质产物稳定 , 免受寄主胞内酶的降解作用 ,因此可以得到较高的产率。 可能构成一种信号肽指导大肠杆菌蛋白質分配到细胞的正确位置 能够使用亲和层析技术分离纯化融合蛋白。;3 整合型异源蛋白的表达;转位因子依赖型的体内重组;生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNA可移动因子 , 不同生物种群拥有结构不同的转位因子;转位因子的结构;整合形式; ;1基因结构存在很大差异大多数真核基因含有内含子，细菌细胞中没有除去内含子机制；;结构不稳定性 重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰 导致其表观生物学功能的喪失;受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解;以构建稳定性高质粒: 将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中: 其表达产物可以选择性地杀迉由于分配不均匀所产生的无质粒细胞;根据载体上的抗药性标记 , 向培养系统中添加相应的抗生素(药物和食品生产时禁止使用抗生素);使用可控型启动子控制目的基因定时表达及表达程度;1982年 , 美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素 , 成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年 , Novo公司 , 成为世界上第一个上市的基因工程药物1987年 , Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。;;基因工程菌的构建战略：化学合成A鏈和B链的编码序列;由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基体外二硫键的正确配对率较低 , 通常只有10% - 20%. 采用这条工艺路线生产正确配对率较低 , 采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。;基因工程菌的构建战略