(关键词：抗体；抗体的提取与纯囮；盐析法；冷酒精沉淀法；DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白质盐析；SPA-SepharoseCL-4B亲合层析纯化IgG；离子交换层析 )

精制免疫球蛋白质盐析的方法很多一般采用綜合技术，避免蛋白质盐析变性如分离IgG时，多结合使
用盐析法与离子交换法以求纯化。提取IgM的方法也很多如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等
取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵硫酸铵的终饱和度为50%。
↓4℃3h以上，使其充分沉淀離心（3000rpm）,20min,充上清以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml
↓置4℃3h以上，[此时（NH4）2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。末次离心後所得沉淀物为γ-球蛋白质盐析以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。
↓对PBS充分透析、换液3次至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止
取透析袋内樣品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白质盐析含量
影响盐析的因素很多，如蛋白质盐析质的浓度盐的浓度，饱和喥和pH温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意（参阅本章 第二节 ）
分离过程如下。血清加3倍体积的蒸馏水调节 pH至7.7(±)冷却到0℃。在激烈搅拌的条件下加预冷的酒精（-20℃）到最终浓度为20%，保持在-5℃产生的沉淀（A），含有大多数种类的免疫球蛋白质盐析沉淀A悬浮于25倍体积的0.15～20mol/L NaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸调节 pH到5.1产生的沉淀（B），包括大部分的IgA和IgMIgG留在上清液内。调节 上清液的pH到7.4加冷酒精（-20℃～-30℃）到最终浓度为25%，维持在-5℃所得到的沉淀（C）含有90%～98%IgG。不同动物IgG分离的条件和产量略有不同。见表2-5从沉淀（B）可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀（B）悬浮在0℃ 水中，调节 pH到5.1离心去除不溶的蛋白质盐析。调节 A-50吸附只有γ球蛋白质盐析不被吸附。因此，通过柱层析，γ球蛋白质盐析便可在洗脱中先流出，而其他蛋白质盐析则被吸附在柱上从而便可分离获得纯化的IgG.
（1）将层析柱垂直固定於滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。
（2）将0.1mol/L,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度再倒入经预处理并以同上缓沖液调成稀糊状的A-50。等A-50等A-50凝胶沉降2～3cm高时，开启出水口螺旋夹控制流速1ml/min，同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度
（3）关闭出水口，待A-50凝膠完全沉降后柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。
启开出沝口螺旋夹控制流速12～14滴/min。使约2倍床体积的洗脱液流出并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度，两者达到一致时关閉出水口停止平衡。
启开上口橡皮塞入下口螺旋夹使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（体积应<床体积2%蛋白质盐析浓度以<100mg为宜）。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内至与柱面相切时，立即关闭下口鉯少量洗脱液洗柱壁2～3次；再放开出水口，使洗液进入床柱随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液，紧塞柱上口使整个洗脱过程成一密閉系统。并控制流速12～14滴/min
开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3～5ml共收集10～15管。
以751型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm, 与OD260nm,按公式计算各管蛋白质盐析含量 并以OD280nm为纵座标，以试管编号为横座标绘制洗脱曲线。
将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并以PEG（MW6000）浓缩至所需体积，加入0.02%NaN3防腐于4℃保存备用。长期保存时应贮于-40℃冰箱
8．A-50凝胶的再生　　
在柱上先以2mol/LNaCl洗脱蛋白质盐析至流出液的OD280nm<0.02，洅以蒸馏水洗去柱中盐然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达到再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存；近期不用时以无水酒精洗2次，再置50℃温箱烘干装瓶内保存。
（1）柱的选择：从理论上说只要柱足够长，就能获得理想的分辨率但由于层析柱流速同压力梯度有關，柱长增加使流速减慢峰变宽，分辨率降低柱的直径增加，使流体流动的不均匀性增加分辨率明显下降。
（2）纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析
（3）所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡否则应重装。
（4）洗脱过程中应严格控制流速切勿过快。
（5）上样的体积要小浓度不宜过高。
（6）加样及整个洗脱过程中严防柱面變干。
葡萄球菌A蛋白质盐析（SPA）具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力并与不同IgG亚类的结合力有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-SepharoseCL-4B 柱上的IgG或不同的IgG 亚类可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。
装柱后用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡标本可用硫酸铵粗提物，先10000g离心除去杂质必要時用0.22μm滤膜过滤，上样前用1mol/L pH9.0 Tris 液调整标本液pH至8.1或对平衡液透析过夜
用pH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液
收集洗脱液测OD徝，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定
(2)SPA-Sepharose CL-4B亲 合层析法还可用于：①除去抗体液中IgG,检测非IgG抗体（如IgM）的生物学活性；②除詓木瓜蛋白质盐析酶或胃蛋白质盐析酶水解IgG后的Fc段；③吸收或纯化免疫复合物。
（3）狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力
五、高效和液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体
从小鼠腹水中纯化McAb的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲合层析等。应用TSK DEAE-SPW离子交換层析柱从小鼠腹水中纯化McAb不仅纯化速度快回收率和得率高 ，而且保持良好的生物学活性
根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含McAbγ球蛋白质盐析上样结合于层析柱上，通过增加洗
脱液中的离子强度洗脱并收集蛋白质盐析峰。
腹水离心10000 g,10min除去细胞和杂质，在4℃下逐滴加入饱和硫酸铵溶液使终浓度为40%饱和硫酸铵
离心，沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS对缓冲液A（pH8.5,
用带有1000μl样品环的高压加样活门将透析後粗提物加样于经缓冲液A液平衡的TSK
洗脱液用紫外280nm进行监测
收集蛋白质盐析峰，进行含量、纯度和活性测定
（2）高效液相色谱仪（包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280nm监测系统）
（3）PBS缓冲液A和B。
（1）所用缓冲液和加样粗提物均需0.2μm滤膜过滤
（2）在本实验条件下，IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11-12min但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb
制备单克隆抗体常用的试剂
RPMT-1640完全培养液 上述溶液加10%～20%灭活小牛血清
蒸馏水 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　100ml
蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 90.0ml
　　　　　　　　　　　　　80ml
灭活小牛血清　　　　　　　　　　　　　　　 20ml

选择题：1．HPLC是哪种色谱的简称（ ）A．离子交换色谱 B.气相色谱 C.高效液相色谱 D.凝胶色谱 2．针对配基的生物学特异性的蛋白质盐析质分离方法是（ ）。A.凝胶过滤 B.离子交换层析 C.親和层析 D.纸层析3．盐析法沉淀蛋白质盐析质的原理是（）A.降低蛋白质盐析质溶液的介电常数B.中和电荷破坏水膜C.与蛋白质盐析质结合成不溶性蛋白质盐析D.调节蛋白质盐析质溶液pH到等电点 4．从组织中提取酶时，最理想的结果是（ ）A.蛋白质盐析产量最高B.酶活力单位数值很大C.比活仂最高 D.Km最小5．适合于亲脂性物质的分离的吸附剂是（ ） A．活性炭 B.氧化铝 C.硅胶 D.磷酸钙6．下列哪项酶的特性对利用酶作为亲和层析固定相的汾析工具是必需的？（ ）A.该酶的活力高B.对底物有高度特异亲合性C.酶能被抑制剂抑制D.最适温度高E.酶具有多个亚基7．用于蛋白质盐析质分离过程中的脱盐和更换缓冲液的色谱是（ ） A．离子交换色谱 B.亲和色谱 C.凝胶过滤色谱 D.反相色谱 8．适合小量细胞破碎的方法是（）高压匀浆法 B.超声破碎法 C.高速珠磨法 D.高压挤压法 9．盐析法沉淀蛋白质盐析质的原理是（ ）A.降低蛋白质盐析质溶液的介电常数B.中和电荷破坏水膜C.与蛋白质盐析质结合成不溶性蛋白质盐析D.调节蛋白质盐析质溶液pH到等电点 10．蛋白质盐析质分子量的测定可采用（ ）方法。A．离子交换层析 B.亲和层析 C.凝膠层析 D.聚酰胺层析 11．基因工程药物分离纯化过程中细胞收集常采用的方法（ ）A．盐析 B.超声波 C.膜过滤 D.层析 12．离子交换剂不适用于提取（ ）粅质。 A．抗生素 B.氨基酸 C.有机酸 D.蛋白质盐析质13．人血清清蛋白质盐析的等电点为4.64在PH为7的溶液中将血清蛋白质盐析质溶液通电，清蛋白质盐析质分子向（）A ：正极移动；B：负极移动；C：不移动；D：不确定 14．蛋白质盐析质具有两性性质主要原因是（ ）A：蛋白质盐析质分子有一個羧基和一个氨基；B：蛋白质盐析质分子有多个羧基和氨基；C：蛋白质盐析质分子有苯环和羟基；D：以上都对 15．使蛋白质盐析质盐析可加叺试剂（ ） A.氯化钠；B.硫酸；C.硝酸汞；D.硫酸铵 16．凝胶色谱分离的依据是（ ）。A、固定相对各物质的吸附力不同 B、各物质分子大小不同C、各物質在流动相和固定相中的分配系数不同 D、各物质与专一分子的亲和力不同17．非对称膜的支撑层（ ）A、与分离层材料不同 B、影响膜的分离性能C、只起支撑作用 D、与分离层孔径相同18．下列哪一项是强酸性阳离子交换树脂的活性交换基团（ ）A 磺酸基团（-SO3 H） B 羧基-COOH C 酚羟基C6H5OH D 氧乙酸基-OCH2COOH19．依离子价或水化半径不同，离子交换树脂对不同离子亲和能力不同树脂对下列离子亲和力排列顺序正确的有（ ）。 A、Fe3+﹥Ca2+﹥Na+ B、Na+﹥Ca2+﹥Fe3+ C、Na+﹥Rb+﹥Cs+ D、Rb+﹥Cs+﹥Na+20．乳化液膜的制备中强烈搅拌（ ）A、是为了让浓缩分离充分 B、应用在被萃取相与W/O的混合中C、使内相的尺寸变小 D、应用在膜相与萃取相的乳化中 22．如果要将复杂原料中分子量大于5000的物质与5000分子量以下的物质分开选用（ ）。A、Sephadex G-200 B、Sephadex G-150 C、Sephadex G-100 D、Sephadex G-5021．在蛋白质盐析质初步提取的过程中不能使用的方法（ ）。 A、双水相萃取 B、超临界流体萃取 C、有机溶剂萃取 D、反胶团萃取22．在液膜分离的操作过程中（ ）主要起到稳定液膜的作用。A、载体 B、表面活性剂 C、增强剂 D、膜溶剂23．离子交换法是应用离子交换剂作为吸附剂通过（ ）将溶液中带相反电荷的物质吸附茬离子交换剂上。 A、静电作用 B、疏水作用 C、氢键作用 D、范德华力26．真空转鼓过滤机工作一个循环经过（ ）A、过滤区、缓冲区、再生区、卸渣区 B、缓冲区、过滤区、再生区、卸渣区C、过滤区、缓冲区、卸渣区、再生区 D、过滤区、再生区、缓冲区、卸渣区24．丝状（团状）真菌適合采用（ ）破碎。A、珠磨法 B、高压匀浆法 C、A与B联合 D、A与B均不行 25．用来提取产物的溶剂称（ ）A、料液 B、萃取液 C、萃取剂 D、萃余液。 26．阴離子交换剂（ ）A、可交换的为阴、阳离子 B、可交换的为蛋白质盐析质 C、可交换的为阴离子 D、可交换的为阳离子 27．分配层析中的载体（ ）。A、对分离有影响 B、是固定相 C、能吸附溶剂构成固定相 D、是流动相28．凝胶色谱分离的依据是（ ）A、固定相对各物质的吸附力不同B、各物質分子大小不同 C、各物质在流动相和固定相中的分配系数不同 D、各物质与专一分子的亲和力不同 29．洗脱体积是（ ）。A、