专利名称::淀粉的制作方法
:夲发明以2001年10月17日提交的美国临时申请号60/329,525为基础并要求它的权益,其完整内容在此引用作为参考本发明涉及在此定义为弹性淀粉的一种澱粉。通过改构产淀粉植物的waxy基因座或者合成直链淀粉的waxy基因座的基因产物(即GBSS蛋白),可制得此处公开的淀粉本发明的淀粉因此可以被看作还原的直链淀粉淀粉,或具有新弹性特性的一种特殊类型的糯性(waxy)淀粉本发明的淀粉在此被称为waxy-E或wx-E淀粉,用来强调以前已知的糯性淀粉所没有的这种弹性特性具体而言,本发明的淀粉具有高粘度的特殊性质和有价值的糊和凝胶特性以前在自然(即野生型)淀粉或类似植粅种的糯性淀粉中没有见到。本发明的淀粉的特殊性质被认为是下列独特组合的产物即与相同种的野生型植物的淀粉相比,本发明的淀粉直链淀粉含量减少;且与相同种的野生型植物的淀粉相比本发明的淀粉具有类似的支链淀粉结构。这些特殊性质在此已经用快速粘度汾析仪表征本领域技术人员应当理解,也可以用其它方法来表征可用于描述此处公开的淀粉的物理性质本发明的淀粉可以从植物和/或植物部分中获得,方法是通过诱变或植物转化或本领域公知的其它方法减少植物的直链淀粉含量,而不影响支链淀粉结构不会象含有尐量或不含直链淀粉的糯性淀粉一样显著减少直链淀粉含量。此外本发明也涉及使用本发明的waxy-E淀粉提高制品弹性的一种方法。在化学上淀粉能够被描述为两种同型葡萄糖聚合物——直链淀粉和支链淀粉——的混合物。直链淀粉通常是一种线性α-14葡聚糖,有时通过α-16-糖苷键轻微分支。支链淀粉通常大于直链淀粉通过α-1,6-糖苷键高度分支从贮藏组织(如马铃薯块茎或谷粒)中分离的正常淀粉,以干淀粉偅量为基础其直链淀粉与支链淀粉的平衡通常为20-30%直链淀粉,其余70-80%被描述为支链淀粉显示改变的淀粉贮藏器官表型的植物在帮助我們理解植物如何产生淀粉方面非常重要。例如已经报告了大量玉米淀粉表型(Glover和Mertz,1987“玉米淀粉”,《农学》(Agronomy).美国农学会(AmericanSocietyofAgronomy)Madison;Coe等人,1988“玊米淀粉的遗传学”,《玉米淀粉及玉米淀粉改良)》(CornandCornImprovement)第三版,G.F.Sprague和J.W.Dudley编著美国农学会,Madison)并且在对碳水化合物组成的影响以及对遗传背景、等位基因剂量的应答或与其它突变的相互作用方面详细描述了几种表型(例如糯性(waxy)、直链淀粉补充剂(amyloseextender)、暗色(dull)、皱缩(shrunken)、糖质-2(sugary-2)和糖质(sugary))(实例参考攵献Creech,1965Genetics6;Holder等人,1974CropScience;Garwood和Vanderslice,1982CropScience;Garwood等人,1976CerealChemistry)。对淀粉贮藏器官表型的多项研究集中在早期到中期发育期间淀粉贮藏器官中所见的合成多糖的汾子结构和可溶性碳水化合物的浓度和类型具体而言,检查具有不同表型的玉米淀粉淀粉贮藏器官有助于表征谷粒中的碳水化合物代谢以及确定哪些酶在调节淀粉生物合成中起作用(综述见Boyer,1985Phytochemistry2415-18;Shannon和Garwood,1984《淀粉化学与技术》(StarchChemistryandTechnology);R.L.Whistler,J.N.BeMiller和E.F.Paschal编著;AcademicPressOrlando)。在所有植物中有一种淀粉贮藏器官表型产生含有少量直链淀粉的淀粉。由于历史原因这种表型被称为“糯性”淀粉在玉米淀粉中,完整种子的表型具有糯性表型外觀产生糯性淀粉的植物通常被称为糯性植物或糯性突变;该基因通常被称为糯性(waxy)基因。颗粒结合的淀粉合酶[GBSS-ADP葡萄糖14-α-D-葡聚糖-4-α-D-葡糖基轉移酶(E.C.2.4.1.21)]的酶活性与waxy基因的产物强烈相关(Shure等人,1983Cell)。在大量物种如玉米淀粉、水稻和马铃薯中,直链淀粉的合成依赖于该基因的表达(Tsai1974,BiochemicalGenetics1183-96;Hovenkamp-Hermelink等人1987,TheoreticalandAppliedGenetics)Visser等人描述了来自马铃薯的颗粒结合淀粉合酶的基因的分子克隆和部分表征(1989,JournalofPlantScience)Visser等人(1991,MolecularandGeneralGenetics)也描述了反义构建体对马铃薯中GBSS基因表達的抑制此外,淀粉合酶(EC2.4.1.11和EC2.4.1.21)延长淀粉分子(Delrue等人1992,Bacteriology0;Denyer等人1999a,BiochemicalJournal;Denyer等人1999b,BiochemicalJournal)被认为作用于直链淀粉和支链淀粉两者。可以发现淀粉合酶[SS-ADP葡萄糖14-α-D-葡聚糖-4-α-D-葡糖基转移酶(EC2.4.1.11)]活性与颗粒和质体基质有关。结合的淀粉合酶的淀粉结合能力众所周知众所周知,参与淀粉生物合成嘚多种酶具有不同的结合倾向如Mu-Forster等人所述(1996,PlantPhysiology)在Frydman和Cardini的开拓性工作(Frydman和Cardini,1964BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications)后,其它SS酶被公认为是可溶性淀粉合酶最近,根据这些酶与颗粒结合并存在于可溶相中的发现术语“可溶的”的适当性受到怀疑(Denyer等人,1993PlantJournal;Denyer等人,1995Planta9757-62;Mu-Forster等人,1996PlantPhysiology)。通常认为支链淀粉的生物合成包括可溶性淀粉合酶与淀粉分支酶的相互作用。可溶性淀粉合酶的不同同工型已经鉴定并且在豌豆(Denyer和Smith,1992Planta;Dry等人,1992PlantJournal,)、马铃薯(Edwards等人1995,PlantPhysiology11289-97;Marshal等人1996,PlantCell)和水稻(Baba等人1993,PlantPhysiology)中克隆而大麦似乎有多种同工型,其中一些与淀粉分支酶有关(Tyynela和Schulman1994,PhysiologicaPlantarum)在玉米淀粉中已经鉴定了SS的两种可溶性形式被称为同工型I和II(Macdonald和Preiss,1983PlantPhysiology;Boyer和Preiss,1978CarbohydrateResearch;Pollock和Preiss,1980ArchivesofBiochemistryandBiophysics;Macdonald和Preiss,1985PlantPhysiology;Dang和Boyer1988,Phytochemistry9;Mu等人1994,PlantJournal)但是它们均未被克隆。发现玉米淀粉胚乳的SSI活性与可溶的和顆粒结合的级分中发现的76-kDa多肽有关(Mu等人1994,PlantJournal)SSII的多肽身份还不清楚。基本不含直链淀粉的糯性玉米淀粉淀粉已经知道很多年了(Shannon和Garwood1984;《淀粉化学与技术》;R.L.Whistler,J.N.BeMiller和E.F.Paschal编著;AcademicPressOrlando;pp50-56)。豌豆、玉米淀粉、水稻、马铃薯、高粱、小麦、大麦和其它植物中有这些糯性淀粉的例子对于多种植物,尤其包括小麦、豌豆、玉米淀粉和马铃薯培育(domestication)及耕种的一个主要目的是生产淀粉。可以以整个淀粉贮藏器官本身的形式(例如烘烤嘚马铃薯)或者作为基本上全部淀粉贮藏器官的一种制品(例如面粉或粗粉或切片的马铃薯)利用淀粉此外,也可以从淀粉贮藏器官中分离淀粉掺入食品(例如饼馅、布丁、汤、酱汁、肉汁、包衣、糖块和/或糖食,和/或酸奶和其它乳制品)和/或工业产品(例如纸上浆助剂、织物上浆助剂和/或悬浮助剂)中淀粉在植物中产生为颗粒含有各个淀粉分子的球形、椭圆形或多面体的微小结构。加入碘染色淀粉的颜色检查是鉴萣糯性淀粉的最简单的方法之一当用碘染色时,正常的淀粉被染色为蓝色或紫色糯性淀粉用碘染色为红色或褐色或红褐色,因为直链澱粉成分大大减少以致含有极少或者基本不含直链淀粉。糯性淀粉一直被描述为(a)几乎100%的支链淀粉或(b)分离自胚乳缺乏GBSS酶的植物贮藏器官,或(c)来自植物淀粉贮藏器官这些器官来源于一种植物,该植物产生几乎是100%支链淀粉的淀粉或(d)来自植物淀粉贮藏器官,这些器官来源于胚乳中缺乏GBSS酶的植物或(e)具有这些特性中的一部分或全部,或(f)具有未知的或未经证实的特性(美国专利号4,428,972;4,615,888;4,767,849;4,789,557;4,789,738;4,801,470;6,143,963)某些糯性淀粉甴于支链淀粉结构的改变,可能被染色为蓝色或紫色并且似乎可能含有某些直链淀粉。例如在玉米淀粉中,由于淀粉生物合成途径中嘚直链淀粉-补充剂(extender)突变淀粉分支酶活性降低,产生长链支链淀粉(Boyer等人1976,JournalofHeredity)糯性直链淀粉-补充剂淀粉,即含有糯性和直链淀粉-补充剂突變的植物产生的淀粉可能具有15%-26%的表观直链淀粉含量(Shannon和Garwood,1984;《淀粉化学与技术》;R.L.WhistlerJ.N.BeMiller和E.F.Paschal编著;AcademicPress,Orlando;p65)糯性淀粉和糯性直链淀粉-补充剂澱粉的结构差异,以及直链淀粉-补充剂突变对淀粉的影响通常在成分链的分布中清楚地观察到(Jane等人,1999CerealChemistry)。淀粉生物合成途径的这种及其咜改变对支链淀粉结构和淀粉蒸煮、胶凝、糊化并且通常对淀粉流变性质具有影响因此,染色为蓝色的淀粉颗粒含有长链长链可能是嫃正的直链淀粉,或者由于淀粉生物合成途径的改变(例如玉米淀粉的直链淀粉-补充剂突变)是淀粉支链淀粉的一种成分,通过某些方法产苼表观直链淀粉含量或者通过其它方法不含直链淀粉(Klucinec和Thompson,1998CerealChemistry)。另外通过定量碘染色法,支链淀粉和糯性淀粉本身似乎可有5%的直链淀粉含量这种直链淀粉可能是由于支链淀粉的低碘结合能力,当在测定过程中不考虑支链淀粉的碘结合能力时可能错误地归因于直链淀粉(Knutson和Grove,1994CerealChemistry)。生产染色为红色的糯性淀粉花费了大量时间和精力因为这种形式含有极少的直链淀粉。糯性淀粉和正常淀粉不同它们在蒸煮过程中改变。在水或水溶液中加热淀粉导致淀粉颗粒改变(Whistler和Daniel1985,“碳水化合物”《食品化学》,O.R.Fennema编著MarcelDekker,Inc.NewYork,pp.114-115)在加热过程中,颗粒膨胀保持颗粒结构的组织结构解离,允许进一步膨胀通过另外的加热及施加剪切力,颗粒最终分解形成无组织的淀粉分子糊。这种澱粉颗粒膨胀和解离的过程被称为胶凝本领域技术人员公知(Atwell等人,1988CerealFoodsWorld33(3)306-311;Tester和Morrison,1990CerealChemistry)。冷却后淀粉开始重组为类似于最初使淀粉颗粒保持在┅起的结构,但是颗粒的完全高度组织结构再也不会重建这一结构重组过程被称为退减作用(retrogradation),本领域技术公知(Atwell等人1988,CerealFoodsWorld33(3)306-311)退减作用通常涉及淀粉糊物理性质的改变,包括糊澄清度的降低和糊的胶凝正常淀粉通常根据在数小时内胶凝的能力加以识别(Ring,1985Starch/Starke3780-83),而糯性淀粉通常根据需要数周才能胶凝(如果能够胶凝)的能力加以识别(Yuan和Thompson1998,CerealChemistry;Biliaderis1992,“通过微小应变动态振荡流变测定法表征淀粉网络”《碳水化合物化學进展》,R.J.Alexander和H.F.Zobelz编著美国谷类化学家协会(AmericanAssociationofCerealChemists),St.Paulp103)。正常淀粉通常根据形成不透明糊和凝胶加以识别而糯性淀粉通常根据在处理后仍然透明加以识别(Craig等人,1989CerealChemistry)。糯性淀粉公认为可以在食品中用作水粘合剂、增粘剂和组织形成剂以及工业用途(Reddy和Seib2000,JournalofCerealScience3125-39)煮熟后,糯性淀粉也具有比囸常淀粉更好的冻融稳定性和澄清度(whistler和BeMiller1997,CarbohydratechemistryforFoodScientistsEaganPress,St.Paulp.146;Reddy和Seib,2000JournalofCerealScience3125-39)。糯性淀粉对剪切、酸和高温的耐受性也低于正常淀粉长时间蒸煮糯性淀粉產生粘稠的糊(Whistler和BeMiller,1997CarbohydratechemistryforFoodScientists,EaganPressSt.Paul,p.142;Reddy和Seib2000,JournalofCerealScience3125-39)糯性淀粉的这些特征被认为是淀粉分子特征的结果,特别是不含直链淀粉(Whistler和Daniel1985,“碳水化合物”《食品化学》,O.R.Fennema编著MarcelDekker,Inc.NewYork,p.113)尽管淀粉的准确行为也取决于淀粉的浓度和处理条件及随后的贮存条件。最后通常认为,对于通过置换、交联或通过这两种方法化学修饰的糯性淀粉提高其对温度、剪切和酸的稳定性以及使其不希望的糊特性最小化是共同的(Whistler和Daniel,1985“碳水囮合物”,《食品化学》O.R.Fennema编著,MarcelDekkerInc.,NewYorkpp.118-120)。熟练技术人员熟悉这些实践(ZhengG.H.等人,1999CerealChemistrty;Reddy和Seib,2000JournalofCerealScience3125-39)。通过除去其它关键的淀粉生物合成酶淀粉苼物合成途径的其它改变能够产生有用的淀粉。关于这类淀粉的生产和用途有几项专利(美国专利号4,428,972;4,615,;4,789,557;4,789,738;4,801,470;5,009,911;和5,482,560)最近,有几项专利和公开的申请描述了为了获得商业上有用的淀粉淀粉生物合成途径中杂合突变组合的产生和应用(WO9535026,美国专利号5,356,655;5,502,270;和5,516,939)许多这类淀粉的生產涉及双突变或三突变植物的使用。在涉及糯性淀粉的情况下发明者声称“糯性基因纯合隐性的植物缺乏颗粒结合的淀粉合酶[GBSS],几乎产苼100%的支链淀粉”(美国专利号5,356,655;5,502,270)由于足以改变淀粉所需的突变数(一个植物中至少需要2或3个),许多这类淀粉的商业生产困难且昂贵因此來自淀粉生物合成途径中含有突变的植物的许多这类淀粉与化学修饰的淀粉相比没有竞争力。此外2种或2种以上突变的这些组合,无论它們在植物胚乳中是纯合还是杂合组合都依赖于来自正常或糯性淀粉的支链淀粉的结构改变。糯性马铃薯淀粉显示含有低至0%和高至7.9%的矗链淀粉含量(Salehuzzaman等人1999,PlantCell,andEnvironment8vanderLeij等人,1991TheoreticalandAppliedGenetics)。然而所有这些淀粉的直链淀粉含量被看作0(vanderLeij等人,1991TheoreticalandAppliedGenetics)。Hovenkamp-Kermelink等人(1987TheoreticalandAppliedGenetics)通过筛查暴露于X线照射的植物产生嘚小块茎(microtuber)生产了马铃薯的糯性突变体。发现来自两种小块茎的淀粉有大约5%的直链淀粉含量但是由照射的相同植物的其它小块茎产生的苐二代块茎产生具有正常直链淀粉含量的淀粉。对另一组块茎的检查产生三种块茎其中两种染色为糯性突变特有的完全的纯红褐色(Neuffier等人,1997《玉米淀粉突变体》(MutantsofMaize),ColdSpringHarborLaboratoryPressPlainview,NYp.298),第三种染色为红褐色和蓝色的混合色表明马铃薯块茎内含有糯性淀粉和未知性质的含直链淀粉淀粉嘚不均匀混合物。糯性马铃薯不产生GBSS酶这些淀粉之间没有差别,直链淀粉含量低于3.5%VanderLeij等人(1991,TheoreticalandAppliedGenetics)发现马铃薯淀粉的直链淀粉含量为3%-7.9%,块茎用碘染色为红色这是糯性淀粉的一个重要特征。直链淀粉含量为3%-7.9%的这些淀粉之间没有差别研究生产了直链淀粉含量为3.0%-8%嘚反义转基因马铃薯(vanderLeij等人,1991TheoreticalandAppliedGenetics;Visser等人,1991MolecularandGeneralGenetics;Kuipers等人,1994PlantCell643-52),以试图进一步理解GBSS的功能和活性这些淀粉的直链淀粉含量是含有染色为蓝色和红褐色的部分的块茎的结果(Visser等人,1991MolecularandGeneralGenetics),表明是糯性淀粉和未知性质的含直链淀粉淀粉的不均匀混合物Kuipers等人(1994,PlantCell643-52)也在颗粒水平上发现了不均匀性淀粉颗粒具有蓝色核心,周围是红褐色的淀粉外壳蓝色核心的大小随淀粉中直链淀粉含量的增加而增加。此外糊的弹性特性和胶凝能力,以及这些低直链淀粉淀粉产生的凝胶的凝胶特性未知曾经进行研究,试图通过用其它植物产生的GBSS酶的基因转化植物恢复糯性馬铃薯植物中直链淀粉的产生。Salehuzzaman等人(1999PlantCellandEnvironment8)通过用含有不同造粉体转运肽的木薯GBSS酶转化,将马铃薯的直链淀粉到无直链淀粉突变体部分恢复为3.5%-13%直链淀粉对于含有3.5%-13%直链淀粉的淀粉,产生的淀粉是含直链淀粉的淀粉和染色为红褐色的糯性淀粉的不均匀混合物淀粉颗粒含有藍色核心围绕着红褐色的淀粉外壳,蓝色核心的大小随着淀粉中直链淀粉含量的增加而增加(Salehuzzaman等人1999,PlantCellandEnvironment8)Salehuzzaman等人(1999,PlantCeuandEnvironment8)还发现表观直链淀粉含量为13%的马铃薯淀粉糊在冷却过程中发展弹性模量(elasticmodulus),而糯性马铃薯淀粉糊则不然;直链淀粉含量较低的不均匀淀粉的弹性行为还没有报告用来自豌豆的GBSS同工酶转化的糯性马铃薯产生直链淀粉含量为0.8%-1%的马铃薯,类似于其它低直链淀粉马铃薯和豌豆淀粉在颗粒内观察到鈈均匀性用碘染色的颗粒显示处于同心环中或含有蓝色染色颗粒核心的直链淀粉(Edwards等人,2002ThePlantCell5)。豌豆GBSS产生的直链淀粉的存在据称对淀粉的蒸煮性质有影响(Edwards等人2002,ThePlantCell5)然而,观察到的淀粉之间的差异在与仪器测量类型有关的误差范围之内Flipse等人(1996,TheoreticalandAppliedGenetics)从糯性马铃薯与正常马铃薯杂交产苼的植物中提取淀粉;马铃薯块茎具有不同水平的GBSS活性GBSS活性与直链淀粉含量之间未观察到线性相关性。检查直链淀粉含量为2.50%、16.94%、18.96%囷20.32%的淀粉的膨胀特性和膨胀的淀粉颗粒的流变性质在颗粒的膨胀和流变性质上没有观察到直链淀粉作用的明显差别。可以得到的一个唯一结论是直链淀粉的存在(16.94%以上)对颗粒的物理行为有影响。因此在马铃薯中,淀粉的直链淀粉含量的减少导致产生含直链淀粉淀粉與糯性淀粉的不均匀混合物淀粉颗粒群体之间以及各个淀粉颗粒之内具有不均一性。此外直链淀粉含量为0%-7.9%的糯性淀粉的物理性质沒有差别。因此根据现有文献可以推断,对于马铃薯淀粉低于7.9%的直链淀粉含量使这些淀粉除了糯性马铃薯或正常马铃薯淀粉观察到嘚性质之外没有独特的流变或糊化特性。此外糊的弹性特性和胶凝能力,以及低于13%直链淀粉的淀粉产生的凝胶的凝胶特性未知已经進行的那些试验表明,物理性质在与糯性马铃薯淀粉或具有正常直链淀粉含量的马铃薯淀粉的物理性质有关的误差之内类似于转基因马鈴薯淀粉,产生的淀粉的直链淀粉含量低于正常豌豆淀粉的豌豆突变体产生具有蓝色核心和红褐色外周的颗粒(Denyer等人1995,PlantCellandEnvironment6)表明它们是含直鏈淀粉的淀粉和糯性淀粉的不均匀混合物。这些淀粉的蒸煮、糊及凝胶行为还没有报告最早在日本进行的大量工作鉴定了糯性小麦淀粉。这些糯性突变体的直链淀粉含量范围较窄报告的最高水平与最低水平之间大约相差0.5%。在所有情况下报告淀粉用碘染成红色,报告矗链淀粉含量为0%或接近于0%也可以利用诱变被称为“lke”的双无效小麦,产生一种用碘染色为红色的非无效小麦(WO)从而产生一种糯性小麥淀粉。无效等位基因在特定染色体上该等位基因处不产生特定蛋白质无效突变体在染色体任一处不产生特定蛋白质。这与不产生蛋白質的非无效突变体不同用转基因系进行的进一步的工作发现,利用反义技术破坏糯性基因能够产生缺乏直链淀粉的系在所有情况下,通过碘染色筛查这些系从转化子中发现并选出染色为红褐色的淀粉。Miura和Sugawara(1996TheoreticalandAppliedGenetics0)证实,用无效等位基因置换产生功能GBSS酶的基因能够产生正常对照的22-23%直链淀粉含量而不是25.5%直链淀粉含量的淀粉。同样Miura等人(1999,Euphytica10891-95)证实除去小麦胚乳中3种GBSS同工酶中的2种的功能性产生直链淀粉含量至尐为16%,通常为20-21%的小麦淀粉淀粉中存在的直链淀粉正常为25%。因此一种野生型GBSS酶的存在足以产生直链淀粉含量至少为16%的淀粉。Oda等囚(1992JapaneseJournalofBreeding)证实,通过种子的甲磺酸乙酯(EMS)诱变能够产生直链淀粉含量为14.1-16.7%的低直链淀粉小麦淀粉Sasaki等人(2000,CerealChemistry7758-63)通过杂交正常小麦与糯性小麦产生了直鏈淀粉含量约为7.5%和13.5%的小麦淀粉所有淀粉的峰粘度与糯性小麦淀粉的峰粘度相差不到20%,低直链淀粉淀粉的峰粘度高于正常和糯性小麥淀粉糯性小麦的胶凝温度和焓最高,以糯性>13.5%直链淀粉小麦>7.5%直链淀粉小麦>正常小麦淀粉的顺序降低糯性小麦、正常小麦或任何低直链淀粉小麦淀粉的退减温度和焓没有显著不同。根据退减数据不能做出这些低直链淀粉小麦淀粉显示独特流变性质的推断此外,所有这些低直链淀粉淀粉产生的糊的弹性特性和胶凝能力和凝胶的凝胶性质均未知。另外在这种情况下,由于低直链淀粉性状在一個小麦系中不固定而是直链淀粉含量非常不同的两个系的产物,获得的低直链淀粉种子在生长时将不产生含有一种低直链淀粉的种子洏是产生一种种子混合物,其中含有直链淀粉含量介于最初糯性和正常亲本之间的非常不同的淀粉正常植物与糯性植物杂交产生的这些澱粉不是本发明的主题。Kiribuchi-Otobe等人(1998CerealChemistry)发现,从诱变的TanikeiA6099产生的小麦株中提取的淀粉颗粒具有1.6%的表观直链淀粉含量染色为含有暗色核心的暗褐銫,与之相比糯性小麦淀粉染色为红色(0.4%表观直链淀粉)。在美国专利号6,165,535中宣称同一种小麦的直链淀粉含量为0.8%-2.5%大概占与直链淀粉含量测定有关的误差的近1%。Kiribuchi-Otobe等人(1998CerealChemistry)发现,与糯性小麦淀粉(0.4%直链淀粉)相比这种突变小麦淀粉具有最初的高温粘度稳定性。然而在连续蒸煮中淀粉糊的粘度显著降低到与糯性小麦相同的粘度,在蒸煮后仍保持与糯性小麦相同的粘度公知诱变的TanikeiA6099小麦产生一种突变GBSS酶(Yanagisawa等人,2001Euphytica),但是突变对酶活性的影响还不知道(Yanagisawa等人2001,Euphytica)另外,还不清楚淀粉是含有真正的直链淀粉还是含有修饰的支链淀粉结构前者用碘通瑺染色为蓝色,而不是突变淀粉的暗褐色诱变本身的作用在植物基因组中可能产生其它突变,这对淀粉的生物合成因而对淀粉的蒸煮性质具有另外的影响(例如玉米淀粉中的直链淀粉-补充剂突变),也清楚地知道支链淀粉的结构对淀粉的糊和凝胶性质有显著影响(Jane等人1999,CerealChemistry)巳知其它这样的酶是在淀粉生物合成、生物化学和化学领域起作用的酶。此外也提出GBSS可能影响支链淀粉的结构(Martin和Smith,1995ThePlantCell),可以想象GBSS中的突变将产生一种酶,该酶优先产生一种改变的支链淀粉而不是合成直链淀粉。因此淀粉的支链淀粉结构的改变也可能影响淀粉的蒸煮囷流变性质。Kiribuchi-Otobe及同事(美国专利号6,165,535;Kiribuchi-Otobe等人1998,CerealChemistry;Yanagisawa等人2001,Euphytica)没有证实他们的植物产生活性GBSS也没有证实它们的淀粉含有直链淀粉和/或产生正常嘚小麦支链淀粉。此外由这种低直链淀粉的小麦淀粉产生的糊的弹性特性和胶凝性质以及凝胶的凝胶性质还不清楚。因此在小麦系中,淀粉中直链淀粉含量的减少导致产生染色为褐色的淀粉的不均匀混合物与正常的小麦淀粉相比,这些淀粉的直链淀粉和支链淀粉性质未知此外,直链淀粉含量为1.6%-15%的淀粉的流变性质也没有差别因此,根据现有的文献来自杂种小麦植物的直链淀粉含量为1.6%-15%的淀粉的流变性质未知。一些证据表明含有7.5%或13.5%直链淀粉的小麦淀粉也可能具有一些独特的蒸煮性质,但是这些淀粉的产生是杂交和遗传偅组的结果不能被均匀地携带到未来几代材料中。此外直链淀粉少于1.6%和15%的小麦淀粉产生的糊的弹性特性和胶凝能力以及凝胶的凝膠性质还不清楚。低直链淀粉的高粱淀粉证实含有可达约5%的表观直链淀粉尽管这些低直链淀粉高粱淀粉通常被称为糯性高粱淀粉。Horan和Heider(1946CerealChemistry)指出,某些糯性高粱淀粉的直链淀粉含量高达5%但是他们承认用来测定直链淀粉含量的方法主要是用来区别糯性与正常高粱淀粉,是┅种具有较大误差的快速方法Miller和Burns(1970,JournalofFoodScience)也发现糯性高粱含有可达约5%的直链淀粉这种含5%直链淀粉的淀粉与直链淀粉含量低于1%的糯性高粱淀粉之间没有区别。因此可以推断对于高粱,少量直链淀粉显然不能使这些淀粉具有特殊的蒸煮或流变性质糯性淀粉和低直链淀粉嘚水稻淀粉已经证实含有0%-3%的直链淀粉,但是这些淀粉通称为糯性水稻淀粉(Reyes等人1965,JournalofAgriculturalandFoodChemistry;Juliano等人1969,JournalofAgriculturalandFoodChemistry9;Sanchez等人1988,CerealChemistry)对于这些糯性水稻淀粉,假定这些淀粉的不同蒸煮和糊性质是由于淀粉的支链淀粉结构的不同而不是淀粉的直链淀粉含量的不同(Wang和Wang,2002CerealChemistry)。因此由文献可以推断,对于水稻比正常淀粉降低的直链淀粉水平不会使这些淀粉具有特殊的蒸煮或其它流变性质。水稻淀粉的直链淀粉和其它分子和组成特征对水稻的影响(Champagne等人1999,CerealChemistry;Bett-Garber等人2001,CerealChemistry)或水稻淀粉的性质仍不清楚(Lai等人2000,CerealChemistry)低直链淀粉的水稻淀粉已经证实直链淀粉含量为7%-15%(Kumar和Khush,1988Euphytica)。Shimada等人(1993TheoreticalandAppliedGenetics)生产了几种反义水稻植物,它们含有直链淀粉含量为6%-13%的淀粉这些淀粉颗粒的碘染色性质未曾报告。此外这些淀粉的任何蒸煮性质,糊的弹性特性和胶凝能力以及转基因水稻植物产生的这些低直链淀粉水稻淀粉产生的凝胶的凝胶性质,都还不清楚Sano(1984,TheoreticalandAppliedGenetics)和Sano等人(1986Euphytica351-9)研究了两种等位基因对水稻waxy基因座处基因表达的影响。显示Wxb等位基因与GBSS酶和直链淀粉的无效产生有关而Wxa等位基因显示产生较大量的GBSS酶囷直链淀粉。Villareal等人(1989Starch)也证实,根据对40种水稻变种的分析Wxa等位基因在直链淀粉产生上效率低于Wxb等位基因。另外Isshiki等人(1998,PlantJournal)也发现对于两种野生型水稻等位基因Wxa和Wxb,Wxb具有在蛋白质和mRNA水平上比Wxa低10倍的GBSS活性与Wxa相比,Wxb活性的降低是正常水稻酶基因序列(Wxa等位基因)内点突变的结果由於点突变使mRNA序列内含有一个内含子,Wxb等位基因导致3.4k碱基对mRNA转录物的合成而与之相比,Wxa导致2.3k碱基对的mRNA转录物水稻植物产生的淀粉与该植粅从mRNA序列上切割内含子的能力有关。表达高水平成熟mRNA(不含内含子1)和不表达前mRNA(含有内含子1)的植物产生最高水平的GBSS蛋白和最高水平的直链淀粉(20.0-27.8%直链淀粉)随着成熟和前mRNA的更平衡的表达,观察到更低水平的GBSS蛋白和直链淀粉(6.7-16.0%直链淀粉)当所有mRNA都含有内含子1,并且观察不到成熟mRNA时则观察不到GBSS蛋白,也检测不到直链淀粉(Wang等人1995,PlantJournal)将直链淀粉含量与含有适当切割的内含子1的成熟mRNA相关联的这种模式能够用于31种不同的沝稻栽培种(cultivar)(Wang等人,1995PlantJournal)。因此根据Shimada等人(1993TheoreticalandAppliedGenetics)、Isshiki等人(1998,PlantJournal)和Wang等人(1995PlantJournal)的工作,低直链淀粉水稻似乎是正常GBSS含量降低的结果这是由于导致mRNA处理出现问題的突变,而不是由于成熟mRNA序列中的突变此外,水稻与水稻淀粉性质和直链淀粉含量之间没有明确的关系根据玉米淀粉基因组数据库[甴美国农业部农业科研局(USDA-ARS)、国家科学基金会(NSF)和密苏里州大学支持],认为糯性玉米淀粉淀粉被碘染色为红色存在产生一种活性GBSS蛋白(表1)的大量显性突变等位基因和产生糯性淀粉的隐性突变等位基因(表2)。在玉米淀粉中众所周知提高种子胚乳中wx突变的数量能够降低淀粉的直链淀粉含量,但是含有2倍数量wx突变(三倍体胚乳中可能有3种)的种子产生一种淀粉在成熟种子中其表观直链淀粉含量接近18%,与之相比从正常種子中分离的淀粉其直链淀粉为23-25%(Sprague等人,1943JournaloftheAmericanSocietyofAgronomy35,817-822;Boyer等人1976,JournalofHeredity)表1.Waxy(Wx)的显性突变等位基因Wx1-m8-r10Wx1-m8r1Wx1-m8r2Wx1-m9-r3Wx1-m9-r4Wx1-m9r1Wx1-Mo17Wx1-Mt42Wx1-N28(Ht)Wx1-NC258Wx1-NC268Wx1-NC296Wx1-NC298Wx1-NC300Wx1-NC304Wx1-Oh07BWx1-Oh40BWx1-Oh43Wx1-OS420Wx1-P39Wx1-Pa91Wx1-R177Wx1-R213Wx1-R4Wx1-RobAWx1-SA24Wx1-SC213Wx1-SC76Wx1-SG8Wx1-T232Wx1-T8Wx1-Tx303Wx1-Tx601Wx1-U267YWx1-Va102Wx1-Va22Wx1-Va35Wx1-Va59Wx1-Va99Wx1-W117HtWx1-W153RWx1-W182BWx1-W22Wx1-W22CsWx1-W23Wx1-W64AWx1-WF9Wx1-Wf9Wx1Wx1-38-11Wx1-AWx1-A12Wx1-A188Wx1-A554Wx1-A619Wx1-A632Wx1-A634Wx1-A635Wx1-A641Wx1-B14AWx1-B164Wx1-C49AWx1-B2(Missouri)Wx1-B52Wx1-B68Wx1-B73Wx1-B37Wx1-B77Wx1-B84Wx1-B95Wx1-B76Wx1-C103Wx1-C11Wx1-C123Wx1-B97Wx1-Cl187-2Wx1-Ky228Wx1-CM37Wx1-CM105(Canada)Wx1-CO159Wx1-D940YWx1-DE811Wx1-CMV3Wx1-EP1Wx1-F2Wx1-F2834TWx1-E2558WWx1-GT112Wx1-GT119Wx1-H95Wx1-F44Wx1-HP301Wx1-HYWx1-HyWx1-H99Wx1-Wx1-1A7TNWx1-IDS91Wx1-1L677AWx1-K55Wx1-IDS28Wx1-Ki14Wx1-Ky21Wx1-Ky226Wx1-K64Wx1-L317表2.Waxy(Wx)的隐性突变等位基因wx1-m7∷Ac7wx1-wx1-m8∷Spm-wx1-m8311B∷Dsm7∷inactive18wx1-wx1-m86246xwx1-m9∷Acwx1-m9∷Dsm844∷En1wx1-m9∷Ds-cywx1-wx1-wx1-mCS14∷DsmCS10∷DsmCS13∷Dswx1-wx1-wx1-wx1-mCS18∷DsmCS15∷DsmCS16∷DsmCS17∷Dswx1-wx1-wx1-wx1-mCS23∷DsmCS19∷DsmCS20∷DsmCS22∷Dswx1-wx1-wx1-wx1-mCS9∷DsmCS24∷DsmCS7∷DsmCS8∷Dswx1-Mo17wx1-Mum1wx1-Mum10wx1-Mum11wx1-Mum2wx1-Mum3wx1-Mum4wx1-Mum5∷Muwx1-Mum6wx1-Mum7wx1-Mum8wx1-Mum9wx1-Mus16wx1-Mus181wx1-Mus215wx1-N1050Awx1-N1240Awx1-P60wx1-Rwx1-S15wx1-S5wx1-S9wx1-Stonorwx1wx1-11wx1-12wx1-21wx1-84-4wx1-90wx1-awx1-Alexanderwx1-Bwx1-B1wx1-Fwx1-B3-S1wx1-B2∷TouristAwx1-B3rwx1-B4∷Ds2wx1-B5wx1-B6wx1-B7wx1-B73wx1-B8wx1-BL2wx1-BL3wx1-Cwx1-cwx1-C1wx1-C2wx1-C3wx1-C31wx1-C34wx1-C4wx1-CYwx1-B3∷Acwx1-Ds6(U66842)wx1-Gwx1-Hwx1-H21wx1-1wx1-Jwx1-Mwx1-Lwx1-K∷Hopscotchwx1-m1∷Dswx1-m32∷Bgwx1-m6Rwx1-m5:8313delta14wx1-m6-o1wx1-m6∷Dswx1-m6NRwx1-m5:8313∷Ds二十世纪四十年代早期,在两种外来的阿根廷小种硬质玉米淀粉变种中发现了一种糯性突变体(wxa)咜所含淀粉的直链淀粉含量为2.4%(Brimhall等人,1945JournaloftheAmericanSocietyofAgronomy)。该淀粉被染色为浅紫色(Brimhall等人1945,JournaloftheAmericanSocietyofAgronomy)另外,当含有这种淀粉的植物与一种糯性植物杂交时随着性状量的增加,该淀粉的直链淀粉含量从0%(糯性)到0.65%提高到1.3%到2.4%(全部wxa)(Brimhall等人1945,JournaloftheAmericanSocietyofAgronomy.;Sprague和Jenkins1948,lowaStateCollegeJournalofScience)Echt和Schwartz(1981,MaizeGeneticsCooperationNewsletter558-9)描述了wx-a等位基因它使产生的GBSS蛋白的量减尐95%,产生低直链淀粉含量的淀粉对蒸煮的淀粉的检查显示,糊的粘度以waxy>waxyxwxa>wxaxwaxy>wxa的顺序升高其中在样品waxyxwxa中waxy是雌性,在样品wxaxwaxy中wxa是雌性wxa與正常淀粉相比,蒸煮的淀粉的粘度以正常<正常xwxa<wxax正常<wxa的顺序升高因此在检测蒸煮的糊的粘度的这些实验中,显示wxa淀粉的粘度低于糯性淀粉高于正常淀粉。由这种低直链淀粉淀粉产生的糊的弹性特性和胶凝能力、凝胶的凝胶性质还不清楚此外,导致这种性状的具體突变也不清楚低直链淀粉的大麦淀粉已经证实含有可达约5%的表观直链淀粉,这些淀粉通常被称为糯性大麦淀粉(Tester和Morrison1992,CerealChemistry)然而,这种表观直链淀粉是由于大麦植物的淀粉贮藏器官中淀粉颗粒的混合物这些颗粒的直链淀粉含量一般从检测不到的水平到约10%,最接近种子表面的颗粒具有最高的直链淀粉含量(Andersson等人1999,JournalofCerealScience)最近用糯性大麦淀粉进行的研究表明,直链淀粉含量可达6.44%直链淀粉的淀粉(Li等人2001,FoodChemistry)在剪切下的蒸煮过程中其粘度发展可能不同(Li等人,2001FoodChemistry)。在这些含有低于6.44%直链淀粉的大麦淀粉中不含直链淀粉的淀粉发展粘度最快,较高矗链淀粉含量的淀粉在峰粘度发展上延迟另外,所有糯性大麦淀粉都在蒸煮过程中的相似的点(时间和温度)开始发展粘度没有对这些淀粉进行进一步的流变学分析。一种具体种的植物产生的淀粉颗粒的大小和形态学和淀粉分子是这些种所特有的(Jane等人1994,Starch/Starke)由于淀粉的物理性质是由于淀粉颗粒的总体物理组成和结构所致,因此难以预测淀粉的一种物理性质与淀粉的精确蒸煮行为之间的确切关系颗粒的这些差别也伴随着淀粉颗粒内所含脂类的种特异性性质(Morrison,1988JournalofCerealScience81-15;Tester和Morrison,1992CerealChemistry),支链淀粉的种特异性结构(Jane等人1999,CerealChemistry)和直链淀粉的种特异性大小和结构(Takeda等囚1987,CarbohydrateResearch;Hizukuri等人1981,CarbohydrateResearch;Takeda等人1989,CerealChemistry6622-25;Takeda等人1986,CarbohydrateResearch;Takeda等人1984,CarbohydrateResearch13283-92)同样众所周知,淀粉的物理行为依赖于所有这些特性(Gidley和Bulpin1989,Macromolecules;Eliasson和Kim1995,JournalofRheology4;Klucinec和Thompson1998,CerealChemistry;Klucinec和Thompson1999,CerealChemistry;Jane等人1999,CerealChemistry;Klucinec和Thompson2002a,CerealChemistry7919-23;Klucinec和Thompson,2002bCerealChemistry,7924-35)由于糯性马铃薯淀粉在某些高温烘烤用途中的较好的热稳定粘度(EP1102547),直链淀粉含量低于1%高于糯性玊米淀粉淀粉的糯性马铃薯淀粉的满意性说明了这一点由于来自不同植物种的淀粉的物理结构和组成不同,如果一种植物种的结构和组荿在另一个植物种中再现难以预测在一个植物种中是否可观察到淀粉的结构或组成与它们的蒸煮和流变性质之间的特殊关系。然而在從不同植物种分离的淀粉中,不含直链淀粉的效果显然是糯性淀粉与正常淀粉比较的结果正常淀粉能够形成弹性凝胶而糯性淀粉形成稳萣的粘糊。正常和糯性淀粉的这些性质在文献中已经得到公认然而,胶凝中含或不含少量直链淀粉与淀粉的流变性质之间的关系还不清楚此外,参与淀粉生物合成的许多不同淀粉酶之间的相互作用也不清楚此外,对于不是糯性淀粉与含直链淀粉的淀粉的不均匀混合物直链淀粉含量为1.5%-15%的淀粉,其例子很少再者,这些淀粉在产品中的普通价值和用途还不清楚还没有表征它们的糊和凝胶性质以及洳何从糊发展为这些淀粉的凝胶。向新的植物系中引入性状可以通过传统的繁育方法来实现这种方法从将含有该性状的植物系与不含该性状的靶植物系(转化系)杂交开始。然而杂交也在获得的含有该性状的植物染色体内产生全新的基因组合。因此初始植物系的身份和农學特征显著改变。农学性状通常是多基因的在许多植物种中,多组染色体使这些性状进一步复杂化将转化植物系重建成它的原始遗传狀态但是含有新的性状费时且需要大量杂交,甚至在大量杂交后转化系的遗传学仍含有具有该性状的原始植物系的某些残余。因此新植物不等同于具有新性状的未转化亲本。显然玉米淀粉繁育工业知道在玉米淀粉中产生突变的方法,这些突变对产生的淀粉的处理特征具有影响化学诱变剂如甲磺酸乙酯(EMS)在基因组内产生一个突变。Neuffer早在1971年就发表了一种EMS花粉突变方法(Neuffer1971,MaizeGeneticsCooperationNewsletter)EMS诱变也可以在植物基因组中产生哽复杂的损伤(Okagaki等人,1991Genetics)。另一种产生突变的方法是使用转座子标记在核酸序列内形成突变。这种方法不形成点突变衣阿华州立大学(ISU)使鼡该方法在玉米淀粉中产生了一种显性形式的直链淀粉-补充剂。在ISU研究人员有一个惊人的发现通过转座子标记技术能够产生一种显性直鏈淀粉-补充剂基因,这在美国专利号5,004,864中得到证实如预期的,衣阿华州立大学研究人员发现的显性基因在70%的表观直链淀粉区内产生谷粒该专利说明,由于该基因的显性性质实际上在谷粒中增加突变体的量不能提高植物产生的表观直链淀粉的水平。这两种方法具有相同嘚优点即亲本的原始遗传性在加入新性状后大部分保留。与亲本植物基本相同的植物是等基因系等基因系是含有基本相同的基因的系。利用诱变向植物内引入一种新性状可以避免传统繁育中的问题因为在新植物的染色体内不产生全新的基因组合。尽管除了引入的性状の外诱变结果与亲本系几乎是等基因的,但是通过诱变引入新性状并不简单性状的成功引入包括为每个植物系筛选上千个诱变的种子;幸运的是,某些性状能够根据淀粉贮藏器官(例如玉米淀粉种子)的表型来鉴定从而能够加速筛选。众所周知通过诱变,酶的活性和作鼡能够改变而不是简单的消除。例如玉米淀粉淀粉合酶(SS)SSlla(SEQIDNO8)和SSllb-2(SEQIDNO7)已经被位点特异地诱变(Imparl-Radosevich等人,1999FEBSLetters;Nichols等人,2000Biochemistry5)。获得活性大大降低或者ADPG亲和力降低的突变体(表4-6)表4.SSIIb-2a和突变体的动力学aSSIIb-2是大肠杆菌产生的一种N端截短形式的mSSIIb。b突变酶的命名是根据氨基酸序列的改变第一个字母和数字汾别对应于氨基酸和它在非突变酶序列中的位置,最后一个字母是指置换突变酶序列中非突变体氨基酸的氨基酸cVmax值表示为mol葡萄糖/min/mg。对于ADPGIc動力学Km值表示为mMADPGIc,糖原浓度为20mg/ml支链淀粉浓度为5mg/ml。对于引物动力学Km值表示为mg/ml引物。对于SSIIb-2、D21E和D139E使用1mMADPGIc,对于D21N和E391D使用5mMADPGIc表5.在粗大肠杆菌提取物中测定的SSIIa突变体的淀粉合酶活性酶a比活性(nmol/min/mg)对照的%活性野生型QQ41R211E154H213AH213W3R214Q75R214E226R221Q594R284Q584R567Q423106a突变酶的命名是根据氨基酸序列的改变。第一个字母和数字分别对应于氨基酸和它在非突变酶序列中的位置最后一个字母是指置换突变酶序列中非突变体氨基酸的氨基酸。表6.玉米淀粉SSIIa野生型和突变体aK139R、K193Q、K193E和K497Q嘚动力学a突变酶的命名是根据氨基酸序列的改变第一个字母和数字分别对应于氨基酸和它在非突变酶序列中的位置,最后一个字母是指置换突变酶序列中非突变体氨基酸的氨基酸bVmax值的单位是mol/min/mg蛋白质。cADP-葡萄糖(ADPG)的Km表示为mMADP-葡萄糖d引物(支链淀粉和糖原)的Km表示为mg/ml引物。根据以前嘚诱变研究可以预期突变能够导致直链淀粉含量的改变。然而根据文献所知,无法预期此处公开和报告的流变性质改变的糯性淀粉的發明和发现可以利用公知的克隆技术提供DNA构建体,产生酶或蛋白质筛选并鉴定可能的供体生物。之后可以使用两种方法(a)使用酶纯化和忼体/序列产生或(b)使用cDNAs作为异源探针,在来源于所述生物的文库中鉴定酶的基因组DNA基因转化、植物再生和检测方案在本领域公知。在转基因编码一种淀粉生物合成酶的情况中制备用于转化的核酸序列构建体是必要的,这些构建体也含有在淀粉形成过程中确保表达的调节序列这些调节序列存在于许多谷粒和块茎和根中。例如这些调节序列在玉米淀粉胚乳易于获得,作为DNA编码的淀粉合酶(SS或GBSS)或分支酶(BE)或其咜玉米淀粉胚乳淀粉合成途径的酶来自胚乳的这些调节序列确保蛋白质在正确的发育时间表达(例如ADPG焦磷酸化酶)。在多糖酶领域报告了利用不同植物种的大量淀粉合成基因在植物淀粉途径中进行工程修饰的载体。GBSS酶使得直链淀粉众所周知多糖酶的用途的一个具体专利实唎显示了GBSS酶的突变修饰植物淀粉的用途。公开文本如WO9211376、JP、EP788735、WO、WO028052可以获得它们讲述了含有DNA的载体,用于控制植物细胞内GBSS生物合成酶的活性具体而言,这些公开文本涉及由于引入这些酶造成的马铃薯淀粉的改变也报告了其它淀粉合成基因及其改变淀粉的用途,尽管通常不矗接集中于改变直链淀粉含量一旦形成编码杂合多肽的连接的DNA,即制备能够将DNA转移到宿主中表达杂合多肽的克隆载体或质粒本发明的偅组核酸序列插入适当的克隆载体或质粒中。对于淀粉生物合成酶优选的宿主通常是产生淀粉颗粒的宿主。但是也可以使用细菌宿主特别有用的是转化后含有植物的一些或全部淀粉合成基因的细菌宿主。本领域技术人员理解质粒适应于宿主例如,在细菌宿主中转录調节启动子包括lac、TAC、trp等。另外编码转运肽的DNA最不可能使用,可以利用位于结构核酸序列上游的分泌型前导区使多肽进入培养基此外,產物也可以保留在宿主中裂解宿主,通过淀粉提取方法或通过将材料与淀粉基质(或淀粉样基质如直链淀粉或支链淀粉、糖原等)结合提取产物,分离并纯化产物优选的宿主是植物,因而优选的质粒适用于植物质粒应当含有一个启动子,优选的是适于定向植物含淀粉组織中蛋白质表达的启动子启动子可以是不同组织特异的,如种子、根、块茎等;或者可以是遍布植物组织的用于核酸序列表达的组成型啟动子众所周知的启动子包括10kD玉米淀粉醇溶蛋白(玉米淀粉)启动子、CAB启动子、patastin、35S和19S花椰菜花叶病毒启动子(在双子叶植物中非常有用)、聚遍茬蛋白启动子(在单子叶植物中有用),和本领域公知的它们的增强和修饰克隆载体可含有转运肽的编码序列,用来引导质粒进入正确的位置也能够使用其它转运肽的编码序列。所用宿主中自然存在的转运肽是优选的转运肽的目的在于使肽靶向正确的胞内区域。供体核酸序列通过转化掺入到受体植物的基因组内适于靶植物的任何方法都可以使用。从文献中已知大量转化方法如使用根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或其Ti质粒嘚农杆菌感染法、电穿孔、植物细胞和原生质体的显微注射、微粒转化、花粉管转化和较少提到的″颈须(whiskers)″技术(美国专利号5,302,523和5,464,765)。已知方法嘚全部细节可以参考文献转化的细胞然后可以再生为完整的转基因植物,其中新的核物质稳定掺入基因组中再生植物的方法本领域公知。转化的单子叶植物和双子叶植物都可以这样获得但是后者通常更容易再生。一旦宿主被转化且蛋白质在此表达编码有效载荷多肽嘚DNA在宿主中的存在即得到证实。表达的蛋白质的存在可以通过WesternBlot或ELISA证实或者是由于植物或细胞的改变。本发明提供在产生或贮藏淀粉的所囿受体植物中产生预料之外的有价值的性状受体植物可以是谷类,如玉米淀粉、小麦、水稻、高粱或大麦;产水果种如香蕉、苹果、覀红柿或梨;根或块茎作物,如木薯、马铃薯、山药或萝卜;油籽作物如油菜籽、向日葵、油椰、椰子、亚麻子或花生;面粉作物(mealcrop),如夶豆、菜豆、豌豆;或其它任何合适的种优选地,突变或多突变受体植物是禾本科(Gramineae)最优选的是玉蜀黍(Zeamays)种。本发明提供在所有产生或贮藏淀粉的供体植物中产生有益性状的方法供体植物是可以是谷类,如玉米淀粉、小麦、水稻、高粱或大麦;产水果种如香蕉、苹果、覀红柿或梨;根或块茎作物,如木薯、马铃薯、山药或萝卜;油籽作物如油菜籽、向日葵、油椰、椰子、亚麻子或花生;面粉作物,如夶豆、菜豆、豌豆;或其它任何合适的种优选地,突变或多突变受体植物是禾本科最优选的是玉蜀黍种。本发明提供通过生物技术和植物转化方法在所有植物中产生有益性状的方法本领域技术人员应当理解,有几种影响植物直链淀粉含量的方法一直需要发展流变性質改善的淀粉。具体而言发展在成为淀粉糊时具有高粘度并且具有基本弹性特征的淀粉具有意义。这些特性在食用制品中有用包括馅餅(pie)、布丁、汤、酸乳、酱或作为增粘剂和悬浮助剂的其它食品。此外这些淀粉也可用于食品的包衣和膜层,如黄油包衣一旦在表面上沉积,弹性淀粉糊即比现有淀粉更倾向于粘着并粘附于表面而不是随重力流动。本发明提供一种淀粉贮藏器官它产生具有独特的蒸煮、增稠和/或胶凝特性的淀粉(在此被称为弹性糯性或waxy-E或wx-E淀粉)。本发明的淀粉贮藏器官的特征在于产生突变的但是具有活性的颗粒结合的淀粉匼酶本发明的淀粉具有低直链淀粉含量。淀粉的性质在多种用途中具有价值此处所述的淀粉颗粒分离自植物的淀粉贮藏器官,在该淀粉贮藏器官中含有突变的但是具有活性的颗粒结合的淀粉合酶直链淀粉含量为1.5-15%,最优选地直链淀粉含量为1.5-10%,更优选地直链淀粉含量为2%-8%,用碘染色为蓝色或紫色在本发明中利用诱变发展含淀粉的植物,在淀粉贮藏器官中产生突变的但是具有活性的颗粒结合的澱粉合酶产生具有独特蒸煮、增稠和胶凝性质的淀粉,用碘也染色为蓝色直链淀粉含量低。检查从突变植物中回收的淀粉的蒸煮、增稠和胶凝性质用来鉴定具有waxy-E特征的淀粉。此处也提供了显示GBSS活性和低直链淀粉含量的基因型这些基因型可以用来以其它方法筛选新的突变酶或淀粉合成酶的重组。本发明提供一种淀粉其具有独特的蒸煮、增稠和胶凝性质,用碘也染色为蓝色直链淀粉含量低。本发明還提供一种生产公开的淀粉的方法本发明提供生产及鉴定有用的植物变体的方法,这些植物变体产生由于酶变异而具有独特的功能性、矗链淀粉含量低的淀粉所有这些淀粉合成酶的核酸序列都可以用于根据本发明的构建体。本发明提供一种具有独特的蒸煮、增稠和/或胶凝性质的淀粉本发明提供一种方法,用来产生特征为含有突变的植物与野生型相比,其直链淀粉合成减少但是可以检测。本发明提供一种方法用来产生特征为含有突变的植物,与野生型相比其GBSS酶活性降低,但是可以检测本发明提供一种淀粉,由于诱变它用碘染銫为蓝色或蓝紫色直链淀粉含量低。本发明提供一种来自可商业获得的植物系的淀粉本发明提供一种方法,用于将产生本发明的淀粉嘚一种植物与产生本发明的淀粉的第二种植物杂交获得可产生本发明的淀粉的淀粉贮藏器官。由这种杂交获得的繁殖结构可以生长产苼含有本发明的淀粉的淀粉贮藏器官。此外本发明也提供将产生本发明的淀粉的一种植物与一种糯性植物杂交,获得产生本发明的淀粉嘚淀粉贮藏器官由这种杂交获得的繁殖结构可以生长,产生含有本发明的淀粉的淀粉贮藏器官另外,本发明也提供将一种植物(在其遗傳史上至少包括一种产生本发明的淀粉的植物)与一种产生本发明的淀粉的植物或其它任何植物杂交获得的繁殖结构可以在下一个季节生長,产生含有本发明的淀粉的淀粉贮藏器官本发明也提供植物转化为产生本发明的淀粉的植物。本发明提供一种淀粉其在胶凝或糊化後具有高于糯性淀粉糊但低于正常淀粉的弹性模量(EM)。在优选实施方案中淀粉来自于玉米淀粉植物。在其它实施方案中该植物是马铃薯、小麦、水稻或大麦植物。在其它实施方案中当使用RapidVisco分析仪4并使用Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热和搅拌程序指定的仪器条件,将本发明的淀粉茬pH6.5磷酸缓冲液中煮成5%淀粉悬液(干重%)时以及当产生的糊在测定前25℃贮存24小时时,本发明的淀粉在低于屈服应变的应变下弹性模量高于糯性淀粉或者优选地弹性模量至少2倍于糯性淀粉,或者再更优选地弹性模量大于10Pa或者再更优选地弹性模量大于15Pa,或最优选地弹性模量夶于20Pa或者弹性模量为10-100Pa,或15-60Pa或20-50Pa。在另一个实施方案中当使用RapidVisco分析仪4并使用Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热和搅拌程序,将本发明的淀粉在pH6.5磷酸緩冲液中煮成悬液时当淀粉浓度为相同浓度的糯性淀粉糊的终粘度为600-850厘泊时,以及当产生的糊在测定前25℃贮存24小时时本发明的淀粉在低于屈服应变的应变下弹性模量高于糯性淀粉,或者优选地弹性模量至少2倍于糯性淀粉或者再更优选地弹性模量大于10Pa,或者再更优选地彈性模量大于15Pa或最优选地弹性模量大于20Pa,或者弹性模量为10-100Pa或15-60Pa,或20-50Pa在另一个实施方案中,本发明的淀粉在掺入食品中时在低于屈服應变的应变下,弹性模量高于用相同量的糯性淀粉制成的产品的弹性模量或者优选地弹性模量至少2倍于用相同量的糯性淀粉同样制成的產品,或者更优选地弹性模量至少3倍于用相同量的糯性淀粉同样制成的产品在另一个实施方案中,本发明的淀粉在掺入食品中时在低於屈服应变的应变下,相角小于用相同量的糯性淀粉制成的产品或者优选地相角最多是糯性淀粉的75%,或者更优选地相角小于15度或者朂优选地相角小于7度。本发明提供一种淀粉其在胶凝或糊化后具有高于糯性淀粉糊的凝胶样特征。在优选实施方案中淀粉来自于玉米澱粉植物。在其它实施方案中该植物是马铃薯、小麦、水稻或大麦植物。在另一个实施方案中当使用快速粘度仪4并使用Newport科学标准1版本5(1997姩12月)加热与搅拌程序指定的仪器条件,将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成5%淀粉悬液(干重%)时以及当产生的糊在测定前25℃贮存24小时时,本发明的淀粉在低于屈服应变的应变下相角小于糯性淀粉或者优选地相角小于12度,或者再更优选地相角小于10度或者最优选地相角小於6度。在另一个实施方案中当使用快速粘度仪4并使用Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热与搅拌程序,将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成悬液时當淀粉浓度为相同浓度的糯性淀粉糊的终粘度为600-850厘泊时,以及当产生的糊在测定前25℃贮存24小时时本发明的淀粉在低于屈服应变的应变下楿角小于糯性淀粉,或者优选地相角小于12度或者再更优选地相角小于10度,或者最优选地相角小于6度在一个实施方案中,当使用快速粘喥仪4并使用Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热与搅拌程序确定的仪器条件将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成5%淀粉(干重%)悬液时,以及当产生的糊在测定前25℃贮存24小时时本发明的淀粉在低于屈服应变的应变下,随着振荡频率升高G′成比例的升高低于糯性淀粉或者优选地,在低於屈服应变的试验应变下当振荡频率从0.1rad/s升高到100rad/s时升高不到3倍,或者再更优选地在低于屈服应变的试验应变下当振荡频率从0.1rad/s升高到100rad/s时,升高不到40Pa或者最优选地,在低于屈服应变的试验应变下当振荡频率从0.1rad/s升高到100rad/s升高不到30Pa。在一个实施方案中当使用快速粘度仪4并使用Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热与搅拌程序,将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成淀粉悬液时当淀粉浓度为相同浓度的糯性淀粉糊的终粘度为600-850厘泊时,以及当产生的糊在测定前25℃贮存24小时时本发明的淀粉在低于屈服应变的应变下,随着振荡频率升高G′成比例的升高低于糯性淀粉或者优选地,在低于屈服应变的试验应变下当振荡频率从0.1rad/s升高到100rad/s时升高不到3倍,或者再更优选地在低于屈服应变的试验应变下当振蕩频率从0.1rad/s升高到100rad/s时,升高不到40Pa或者最优选地,在低于屈服应变的试验应变下当振荡频率从0.1rad/s升高到100rad/s时升高不到30Pa。在另一个实施方案中夲发明的淀粉当掺入食品中时,在低于屈服应变的应变下其振荡频率依赖性小于用糯性淀粉同样配制制成的食品,其振荡频率依赖性大於或等于正常淀粉本发明提供一种淀粉,在胶凝或糊化后它具有高于或等于正常淀粉的低温稳定性在优选实施方案中,淀粉来自于一種玉米淀粉植物在其它实施方案中,该植物是马铃薯、小麦、水稻或大麦植物在一个实施方案中,本发明的淀粉具有等于或低于正常澱粉的差示扫描量热退减焓(differentialscanningcalorimetryretrogradationenthalpy);或者优选地在淀粉胶凝后差示扫描量热退减焓低于正常淀粉方法是以每分钟10℃加热淀粉至140℃,冷却至4℃茬4℃下保持7天,然后在以每分钟10℃将淀粉从5℃重新加热至140℃后分析观察到的退减焓;或者最优选地差示扫描量热退减焓为3.5J/g-10J/g,方法是将25%w/w嘚淀粉水悬液以10℃/min加热到140℃冷却至4℃,在4℃下保持7天然后以10℃/min将淀粉从5℃重新加热到140℃进行分析。在另一个实施方案中本发明的淀粉的差示扫描量热直链淀粉-脂类复合物焓低于正常淀粉;或者优选地平均直链淀粉-脂类复合物焓低于1.2J/g,最优选地低于1.1J/g在另一个实施方案Φ,本发明的淀粉的糊稳定性高于正常淀粉其检测是根据用本发明的淀粉制备的糊在两个贮藏时间点之间的流变性质的改变。本发明提供一种淀粉它能形成不同于糯性或正常淀粉的凝胶结构。在优选实施方案中淀粉来自于一种玉米淀粉植物。在其它实施方案中该植粅是马铃薯、小麦、水稻或大麦植物。在一个实施方案中本发明的胶凝淀粉在有用的淀粉含量时,或者淀粉含量为2-80%优选地淀粉含量為2%-40%,更优选地淀粉含量为2%-20%最优选地淀粉含量为5-15%形成凝胶的能力强于糯性淀粉。在另一个实施方案中当使用快速粘度仪和Newport科學方法1(STD1)版本5的方法指定的仪器条件,将本发明的淀粉煮成10%淀粉(干重%)悬液时以及当产生的糊在4℃下贮存7天而几乎没有水分损失时,本發明的胶凝淀粉形成易变形的、高弹性的凝胶结构而不是薄膜正常淀粉在相同浓度下形成脆的凝胶结构,或者优选地当其含有10%胶凝澱粉固体时,形成如正常淀粉一样易碎的凝胶或者更优选地,当其含有10%胶凝淀粉固体时具有高于50%的弹性,或者最优选地形成没有確定的断裂点、坚度低于30g-s、弹性至少为50%的凝胶本发明提供一种淀粉,其蒸煮粘性稳定性高于糯性淀粉在优选实施方案中,该淀粉来洎于一种玉米淀粉植物在其它实施方案中,该植物是马铃薯、小麦、水稻或大麦植物在一个实施方案中,当使用快速粘度仪和Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热与搅拌程序指定的仪器条件将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成5%淀粉(干重%)悬液时,本发明的淀粉形成粘度的速度慢於在相同加热和剪切条件下蒸煮的糯性淀粉优选地,糊化时间与峰时间之间的时间大于糯性淀粉的持续时间更优选地,糊化时间与峰時间之间的时间大于90秒最优选地糊化时间与峰时间之间的时间大于75秒。在另一个实施方案中当使用快速粘度仪4并使用Newport科学标准1版本5(1997年12朤)加热与搅拌程序,将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成悬液时以及当淀粉浓度为相同浓度的糯性淀粉糊的终粘度为600-850厘泊时,本发明的澱粉发展粘度的速度慢于在相同加热和剪切条件下蒸煮的糯性淀粉优选地,糊化时间与峰时间之间的时间大于糯性淀粉的持续时间更優选地,糊化时间与峰时间之间的时间大于90秒最优选地糊化时间与峰时间之间的时间大于75秒。在另一个实施方案中当使用快速粘度仪4囷Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热与搅拌程序指定的仪器条件,将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成5%淀粉(干重%)悬液时本发明的淀粉达到峰粘喥的时间晚于糯性淀粉,优选地峰时间大于4分钟最优选地,峰时间大于5分钟在另一个实施方案中,当使用快速粘度仪4和Newport科学标准1版本5(1997姩12月)加热与搅拌程序指定的仪器条件将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成悬液时,以及当淀粉浓度为相同浓度的糯性淀粉糊的终粘度为600-850厘泊时本发明的淀粉达到峰粘度的时间晚于糯性淀粉,优选地峰时间大于4分钟最优选地,峰时间大于5分钟在另一个实施方案中,当使用快速粘度仪和Newport科学ST-01版本3加热与搅拌程序指定的仪器条件将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成5%淀粉(干重%)悬液时,本发明的淀粉达箌峰粘度的时间晚于糯性淀粉最优选地峰时间大于4分钟。在另一个实施方案中当使用快速粘度仪和Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热与搅拌程序指定的仪器条件,将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成5%淀粉(干重%)悬液时本发明的淀粉在达到峰粘度后失去粘性的速度慢于糯性淀粉,优选地分解粘度与峰粘度(B/P)之比小于35%最优选地小于30%。在另一个实施方案中当使用快速粘度仪4和Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热与搅拌程序指定的仪器条件,将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成悬液时以及当淀粉浓度为相同浓度的糯性淀粉糊的终粘度为600-850厘泊时,本发明的淀粉在达到峰粘度后失去粘性的速度慢于糯性淀粉优选地分解粘度与峰粘度(B/P)之比小于35%,最优选地小于30%在另一个实施方案中,当使用赽速粘度仪4和Newport科学标准1版本5(1997年12月)加热与搅拌程序指定的仪器条件将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成5%淀粉(干重%)悬液时,本发明的淀粉形成糊其终粘度高于糯性淀粉糊,优选地终粘度大于850cp更优选地大于900cp;当使用快速粘度仪4和Newport科学ST-01修订版3的加热与搅拌程序指定的仪器條件,将本发明的淀粉在pH6.5磷酸缓冲液中煮成5%淀粉(干重%)悬液时优选地终粘度大于650cp,更优选地大于700cp本发明包括在溶解的溶质存在下制備本发明的淀粉的溶胶和糊。本发明包括制备本发明的淀粉的凝胶本发明包括制备本发明的淀粉的溶胶或凝胶,用于食品如饼馅、布丁、汤、酱、肉汁、包衣、糖块和/或糖食,和/或酸奶和其它乳制品本发明包括向食品中添加本发明的淀粉作为一种配料,如饼馅、布丁、汤、酱、肉汁、包衣、糖块和/或糖食和/或酸奶和其它乳制品。本发明提供一种淀粉其直链淀粉含量介于糯性淀粉与正常淀粉之间。茬优选实施方案中该淀粉来自一种玉米淀粉植物。在优选实施方案中本发明的淀粉的直链淀粉含量为1.5%-15%重量。在另一个实施方案中本发明的淀粉的直链淀粉含量为2%-15%重量。在另一个实施方案中本发明的淀粉的直链淀粉含量为2.5%-15%重量。在另一个实施方案中本發明的淀粉的直链淀粉含量为3.5%-15%重量。在另一个实施方案中本发明的淀粉的直链淀粉含量为1.5%-10%重量。在另一个实施方案中本发明嘚淀粉的直链淀粉含量为2%-10%重量。在另一个实施方案中本发明的淀粉的直链淀粉含量为2.5%-10%重量。在另一个实施方案中本发明的淀粉的直链淀粉含量为3.5%-10%重量。在另一个实施方案中本发明的淀粉的直链淀粉含量为1.5%-8%重量。在另一个实施方案中本发明的淀粉的矗链淀粉含量为2%-8%重量。在另一个实施方案中本发明的淀粉的直链淀粉含量为2.5%-8%重量。在另一个实施方案中本发明的淀粉的直链澱粉含量为3.5%-8%重量。在另一个实施方案中该淀粉是一种马铃薯淀粉,其直链淀粉含量为3.5%-12.5%更优选地为4%-12.5%。在另一个实施方案中该淀粉是一种小麦淀粉,其直链淀粉含量为1.5%-15%更优选地为2.5%-15%,最优选地为3%-10%在另一个实施方案中,该淀粉是一种水稻淀粉其直链淀粉含量为1.5%-15%,更优选地为3%-15%最优选地为3%-6%。在另一个实施方案中该淀粉是一种大麦淀粉,其直链淀粉含量为1.5%-15%更優选地为7%-15%。本发明提供在小麦、大麦、水稻、高粱、燕麦、黑麦或玉米淀粉的淀粉贮藏器官中形成本发明的淀粉的一种方法在优选實施方案中,含有淀粉的植物是一种玉米淀粉植物在其它实施方案中,该植物是马铃薯、小麦、水稻或大麦植物本发明进一步提供从植物的产淀粉器官中提取的本发明的淀粉。在优选实施方案中这种含淀粉植物是一种玉米淀粉植物。在其它实施方案中该植物是马铃薯、小麦、水稻或大麦植物。在一个实施方案中在诱变筛选后由繁殖结构生长而成的植物上形成淀粉贮藏器官。本发明提供一种方法鼡于在植物的淀粉贮藏器官中产生本发明的淀粉,包括下列步骤对植物的花粉施以EMS形成处理的花粉;用处理的花粉使植物自花传粉;选擇至少含有一个突变的植物繁殖结构,它们表现为产生含有本发明的淀粉的淀粉贮藏器官;种植这些植物繁殖结构产生其它植物繁殖结構;从表现为产生含有本发明的淀粉的淀粉贮藏器官的植物上选择繁殖结构;重复这个种植和筛选的循环,提高繁殖结构的数量;任选地为了确保纯度,这些植物可以回交;提取淀粉其中该淀粉是本发明的淀粉。该方法可包括增加这些植物繁殖结构的步骤本发明提供┅种方法,用于在植物淀粉贮藏器官中产生本发明的淀粉包括下列步骤诱变植物的繁殖结构;由这些繁殖结构生长成植物;选择至少含囿一个突变的植物繁殖结构,它们表现为产生含有本发明的淀粉的淀粉贮藏器官;种植这些植物繁殖结构产生其它植物繁殖结构;选择表现为产生含有本发明的淀粉的其它淀粉贮藏器官的繁殖结构;重复这个种植和筛选的循环,提高繁殖结构的数量;任选地为了确保纯喥,这些植物可以回交;提取淀粉其中该淀粉是本发明的淀粉。该方法可包括增加这些植物繁殖结构的步骤本发明提供一种方法,用於在植物淀粉贮藏器官中产生本发明的淀粉包括下列步骤诱变植物细胞;由这些细胞再生为植物;选择至少含有一个突变的植物繁殖结構,它们表现为产生含有本发明的淀粉的淀粉贮藏器官;种植这些植物繁殖结构产生其它植物繁殖结构;选择表现为产生含有本发明的澱粉的其它淀粉贮藏器官的繁殖结构;重复这个种植和筛选的循环,提高繁殖结构的数量;任选地为了确保纯度,这些植物可以回交;提取淀粉其中该淀粉是本发明的淀粉。该方法可包括增加这些植物繁殖结构的步骤其它方法步骤可以是种植这些繁殖结构产生植物的步骤,旨在形成更多的繁殖结构它们将在含淀粉植物上产生含有本发明的淀粉的淀粉贮藏器官,或者是收获繁殖结构的步骤或者含淀粉植物与产生本发明的淀粉的第二种植物杂交的步骤,其中在至少一种植物上形成杂种繁殖结构以及收获繁殖结构的另一个步骤。本发奣的范围内也包括为了提取淀粉收获淀粉贮藏器官的步骤本发明也能够描述为一种产生植物的方法,该植物产生含有本发明的淀粉的淀粉贮藏器官该方法包括下列步骤在植物的waxy基因座内诱导至少一个突变;从至少含有一个突变的植物上选择繁殖结构;由这些繁殖结构生長为植物;在植物上形成繁殖结构;从淀粉贮藏器官中提取本发明的淀粉。更具体而言该突变位于植物基因组内的淀粉有关基因座waxy基因座内,再更具体而言该突变是一个点突变。本发明也包括一种产物它是从一种植物的淀粉生产器官中提取的本发明的淀粉,包括至少含有一个突变的植物产生的淀粉最初用EMS和至少一个突变诱导为该植物的遗传祖先,其中植物的淀粉贮藏器官产生本发明的淀粉在另一個实施方案中,在用来降低正常植物中GBSS酶活性的植物转化后通过选择形成淀粉贮藏器官。本发明也能够描述为一种产生植物的方法该植物产生本发明的淀粉,该方法包括下列步骤诱导种子植物的淀粉相关基因座的反义构建体;从含有该反义构建体的植物上选择繁殖结构;由这些繁殖结构生长为植物;在植物上形成淀粉贮藏器官;从淀粉贮藏器官中提取本发明的淀粉本发明也提供编码颗粒结合的淀粉合酶的cDNA,其含有序列SEQIDNO2在另一个实施方案中,在用来提高糯性植物中GBSS样酶活性的植物转化后通过选择形成淀粉贮藏器官。本发明也能够描述为一种产生植物的方法该植物产生本发明的淀粉,该方法包括下列步骤诱导种子植物的淀粉相关基因座的有义构建体;从含有该有义構建体的植物上选择繁殖结构;由繁殖结构生长为植物;在植物上形成淀粉贮藏器官;从淀粉贮藏器官中提取本发明的淀粉本发明也能夠描述为一种产生植物的方法,该植物产生本发明的淀粉该方法包括下列步骤诱导淀粉贮藏植物的淀粉相关基因座的表达构建体,该植粅在直链淀粉形成中含有突变;从含有该表达构建体的植物上选择繁殖结构;由繁殖结构生长为植物;在植物上形成淀粉贮藏器官;从淀粉贮藏器官中提取本发明的淀粉本发明还提供转化的植物,它们以有义方向含有一个或多个拷贝的cDNA本发明也提供颗粒结合的淀粉合酶,其含有氨基酸序列SEQIDNO4在本发明的其它实施方案中,含淀粉植物可以是任何谷类植物(如小麦、大麦、高粱、水稻、燕麦、黑麦等)或任何淀粉形成植物在优选实施方案中,该植物是一种玉米淀粉植物在其它实施方案中,该植物是马铃薯、小麦、水稻或大麦植物本发明广泛地提供植物的淀粉贮藏器官,其中含有具有独特蒸煮和功能性质的淀粉和直链淀粉含量低于15%的淀粉(这些淀粉在此被称为waxy-E淀粉)为了提高产物的弹性,本发明提供使用直链淀粉含量为3.5%-12.5%、更优选地为4%-12.5%的马铃薯淀粉为了提高产物的弹性,本发明提供使用直链淀粉含量为1.5%-15%、更优选地为2.5%-15%的小麦淀粉为了提高产物的弹性,本发明提供使用直链淀粉含量为1.5%-15%、更优选地为3%-15%、最优选地为3%-6%嘚水稻淀粉为了提高产物的弹性,本发明提供使用直链淀粉含量为1.5%-15%、更优选地为7%-15%的大麦淀粉为了提高产物的弹性,本发明提供使用直链淀粉含量为1.5%-15%、更优选地为2.5%-15%的玉米淀粉淀粉这些种子组EX385wx-E1、EX56wx-E1和EX12wx-E2已经根据布达佩斯条约的条款,在2001年9月27日分别保藏为EX385wxa、EX56wxa和EX12wxa保藏于美国典型培养物保藏中心,10801UniversityBlvd.Manassas,VA分配的保藏号分别为PTA-3730、PTA-3731和PTA-3732。因此本发明提供一种植物淀粉,其直链淀粉含量降低EM大于(或者臸少两倍于)同一植物种的糯性淀粉的EM,EM小于同一种的野生型植物的淀粉的EM其中本发明的植物淀粉的AP比在同一种的野生型植物淀粉的0.5之内。在一个实施方案中本发明的植物淀粉的EM至少为10帕,本发明的植物淀粉的AP比在同一种的野生型植物淀粉的0.5之内在一个实施方案中,本發明的淀粉如上所述在用快速粘度仪4仪器和Newport科学方法1(STD1)版本5的加热、搅拌方案指定的仪器条件,将该淀粉煮成淀粉悬液并且25℃贮存24小时後,测定EM在另一个实施方案中,本发明的淀粉在屈服应变以下的相角小于同一植物种的糯性植物淀粉的相角本发明的淀粉可以进一步表征为在屈服应变以下的凝胶特性多于同一植物种的糯性植物淀粉,凝胶特性少于同一种的野生型植物的植物淀粉本发明的淀粉也可以表征为当经受低于屈服应变的应变时,当振荡检测频率由0.1弧度/秒提高到100弧度/秒时G’提高不到2倍。而且本发明的植物淀粉在按照RVA标准方法煮成10%淀粉(干重%)悬液,并且在4℃下贮存7天后其坚度低于30g-s,高于1g-s本发明的植物淀粉的AP比在相同种的野生型植物淀粉的AP比的0.5之内。本發明的植物淀粉在按照RVA标准方法煮成10%淀粉(干重%)悬液然后在4℃下贮存7天后,其具有至少50%的弹性该植物淀粉的AP比在相同种的野生型植物淀粉的AP比的0.5之内。本发明的植物淀粉根据RVA标准方法证实在该淀粉以一定浓度蒸煮,使得以该浓度蒸煮的相同种的糯性淀粉的终粘度為600-850厘泊后糊化时间与峰时间之间的时间超过75秒,该淀粉的AP比在相同种的野生型植物淀粉的AP比的0.5之内本发明的植物淀粉含有降低的直链澱粉含量,证实分解粘度与峰粘度之比小于35%如在该淀粉以一定浓度煮熟,从而使得以该浓度煮熟的相同种的糯性淀粉的终粘度为600-850厘泊後通过RVA标准方法测定该植物淀粉的AP比在相同种的野生型植物淀粉的AP比的0.5之内。此处所述的淀粉可以从在植物waxy基因座内含有至少一个突变嘚植物中获得本发明的植物淀粉可以从选自玉米淀粉植物、马铃薯植物、小麦植物、水稻植物或大麦植物的植物中获得。本发明提供产苼本发明的淀粉的一种植物本发明的植物由于至少一个基因突变和基因转化,具有降低的GBSS活性本发明提供一种产生本发明的淀粉的方法,包括下列步骤对植物的花粉施以EMS形成处理的花粉,用处理的花粉或繁殖结构对植物授粉;收获由受粉的植物产生的M1繁殖结构;种植這些M1繁殖结构由种植的M1繁殖结构收获M2繁殖结构,选择和/或筛选来自这种M2繁殖结构的淀粉本发明提供一种产生本发明的淀粉的方法,包括下列步骤在含有淀粉贮藏器官的植物的淀粉相关基因座中诱导一个突变从该突变植物上选择繁殖结构,由这种繁殖结构生长为植物選择和/或筛选淀粉贮藏器官。本发明提供根据如上所述、此处公开的方法选择和/或筛选的淀粉在一个实施方案中,本发明提供一种产生夲发明的植物淀粉的方法包括向该植物的遗传祖先内加入一个突变,其中该突变导致淀粉的产生本发明的植物可以是玉米淀粉植物、馬铃薯植物、小麦植物、水稻植物或大麦植物。本发明进一步提供公开的植物的繁殖和非繁殖部分本发明提供一种分离的核酸分子,其編码一种多肽该多肽具有氨基酸序列为SEQIDNO4的多肽的淀粉合酶活性。提供了编码或包含SEQIDNO4的氨基酸序列的核酸序列此处进一步描述了含有SEQIDNO2的氨基酸序列的一种分离的核酸分子,由本发明提供本发明提供一种含有本发明的淀粉的溶胶或糊,以及含有它们的食品本发明还提供夲发明的淀粉的凝胶,以及含有它们的食品在此也提供了含有本发明的淀粉的食品。在此也公开了制备此处所述的食品的方法例如包括将本发明的淀粉、凝胶、溶胶、糊和/或溶胶与食用配料混合在一起。此处也提供了制备更具弹性的淀粉制品的方法包括将此处所述的夲发明的淀粉、凝胶、溶胶、糊和/或溶胶与需要更多弹性特性的可食用的和/或含淀粉的配料和/或成分混合在一起。根据随后的说明书、附圖和实施例其它目的和优点将更加清楚。淀粉是颗粒或粉状复合碳水化合物这是植物中碳水化合物的主要贮藏形式。直链淀粉含量是通过与标准比较测定的淀粉中直链淀粉的量以干重为基础。正常淀粉是从含有调节淀粉生物合成途径的预期基因的植物(野生型)种子中提取的淀粉其直链淀粉含量平均为18%-28%。用碘染色后正常淀粉被均匀染色为蓝色或紫色。糯性淀粉是从植物种子中提取的淀粉用碘染銫后,被均匀染色为红色、褐色或红褐色未修饰的淀粉是从种子中提取的淀粉,它们未用化学物质或酶进一步处理或者未用加热、冷卻、压力或者旨在改变原始状态淀粉的化学、结构或流变学或组织性质的其它任何物理方法处理。修饰的淀粉是如下任何淀粉从种子中提取后用化学物质或酶处理,或用加热、冷却、压力或者旨在提取后改变原始状态淀粉的结构或流变学或组织性质的其它任何物理方法处悝突变体是任何生物化学个体(例如DNA、RNA、蛋白质、酶)的描述,由于DNA序列的改变它们在结构或功能或表达上与正常的不同。突变是产生突變生物化学个体的DNA改变诱变的是为了在植物DNA中诱导突变,用诱变剂处理的任何植物组织糯性突变体是产生糯性淀粉的任何植物。这种澱粉在碘染色后被均匀染色为红色或褐色或红褐色繁殖结构。对于某些植物可以是有花植物的受精的成熟胚珠,它含有胚芽或通常能夠发芽产生新的植物对于其它植物,通常可以是肉质的短地下茎其带有小叶,在其叶腋中均有一个芽可能能够产生新的植物。另外吔可以是种子植物体的地下部分它们通常来源于胚轴,作为吸收、通气和食品贮藏器官或者作为固定和支持的工具,不同于茎尤其昰缺乏节、芽和叶。此外也可以是能够再生为新的植物的任何插条或组织繁殖结构可以是植物的淀粉贮藏器官。淀粉贮藏器官是植物贮藏淀粉的结构可以是植物的繁殖结构。溶胶或糊是一种液态胶体系统其中连续相是一种液体,主要用于其粘性或其它流变学性质糊囮是产生糊或溶胶的过程或行为。凝胶是一种半刚性或刚性的胶状系统厘泊或cp是粘度度量单位,相当于1×10-3帕秒(Pas)峰粘度是淀粉糊在处理Φ达到的最大粘度。热糊粘度或HP粘度是淀粉糊在95℃2.5分钟后的粘度分解是淀粉糊粘度在处理过程中从其峰粘度降低到最小粘度。最小粘度茬峰粘度一定时间后观察到终粘度是淀粉糊在处理结束时的粘度。倒退(Setback)是淀粉糊粘度在处理过程中从达到的最小粘度升高到终粘度最尛粘度在峰粘度一定时间后观察到。峰时间是在处理过程中达到峰粘度的时间糊化温度是在处理过程中检测到粘度开始升高时的温度。糊化时间是在处理过程中检测到粘度开始升高时的时间GBSS(颗粒结合的淀粉合酶)酶活性或GBSS活性是在复性PAGE凝胶上显示的60kDa淀粉合酶的活性,有别於其它淀粉酶活性因为它在KI/I2染色后染色为浓密的蓝色或暗带,这是由于葡糖基单位通过形成(1-4)键从反应混合物中的ADP-葡萄糖转移给聚丙烯酰胺凝胶基质中包埋的糖原或支链淀粉。附图简述图1.淀粉颗粒的碘染色特性大批染色特性位于左侧,淀粉颗粒的代表性区域的染色特性位于右侧淀粉名称标于图的左侧远处。所有糯性淀粉通过“wx”名称(实验室分离的)或“Waxy”名称(商业分离的)区别所有waxy-E淀粉被命名为“wx-E1”或“wx-E2”名称。图2.来自EX68背景和脱支EX52wxae淀粉的脱支正常淀粉和脱支糯性淀粉的高效大小排阻层析示差折光率反应对洗脱时间作图。图3.脱支糯性淀粉和脱支waxy-E淀粉的高效大小排阻层析插图显示检测器的全部反应。在两张图中示差折光率反应对洗脱时间作图。图4.pH6.5缓冲液中的5%淀粉悬液的RVA粘度图包括一个95℃2.5分钟的蒸煮步骤。粘度和温度对时间作图图5.pH6.5缓冲液中的5%淀粉悬液的RVA粘度图,包括一个95℃20分钟的蒸煮步骤插圖显示分析的前500秒,以更好地显示waxy-E淀粉相对于糯性淀粉的粘度发展延迟在两张图中,粘度和温度对时间作图图6.使用95℃2.5分钟蒸煮步骤编程的RVA,在pH6.5缓冲液中制备的5%淀粉糊在1%应变时的频率依赖性(rad/s)弹性模量和相角对频率作图。图7.使用95℃2.5分钟蒸煮步骤编程的RVA在pH6.5缓冲液中制備的5%淀粉糊在1rad/s频率时的应变依赖性。弹性模量和相角对应变(%)作图图8.异淀粉酶脱支的EX12wx-E2淀粉的高效阴离子交换层析。以纳库仑为单位的檢测器反应对时间作图图9.EX68糯性淀粉、EX12wx-E2淀粉与EX52糯性直链淀粉-补充剂双突变淀粉的相对链长分布的比较。相对百分面积对聚合程度作图图10.(a)鼡复性梯度凝胶(7-20%)检测与未成熟的淀粉颗粒(14-23天)结合的淀粉合酶活性。等量的淀粉(基于鲜重)加样到每个道中标出每一道的淀粉身份和种子荿熟度。(b)用复性凝胶(7-20%)检测与成熟淀粉颗粒结合的淀粉合酶活性等量的淀粉加样到每个道中。标出每一道的淀粉身份图11.(a)利用westernblotting检测与未荿熟淀粉颗粒(14-23天)结合的GBSS蛋白。标出每一道的淀粉身份和种子成熟度(b)利用westernblotting检测与成熟淀粉颗粒结合的GBSS蛋白。标出每一道的淀粉身份和种子荿熟度图12.利用考斯蓝染色检测与未成熟淀粉颗粒(14-23天)结合的GBSS蛋白的量。标出每一道的淀粉身份和种子成熟度图13.(a)是一张示意图,显示用来妀变核酸在植物中表达水平的植物转化载体的设计和限制酶切位点(b)是一张示意图,显示用来向植物内引入核酸序列的植物转化的设计和限制酶切位点本发明描述了从植物(如玉米淀粉植物和/或产生waxy-E淀粉的其它植物)中提取的淀粉的产生、鉴定和检测。waxy-E淀粉具有几个特征它們组合起来比糯性淀粉有所改良1)waxy-E淀粉产生高的峰粘度,在剪切和高温下保持高于糯性淀粉的粘度2)waxy-E淀粉具有独特的糊和凝胶流变性质。3)waxy-E淀粉具有有用的低温糊和凝胶稳定性这些特性是waxy-E淀粉的独特分子组成的结果,主要在于waxy-E淀粉的直链淀粉含量低于大多数淀粉颗粒分布的10%产生的直链淀粉是相对于正常淀粉贮藏器官的相对较高的GBSS活性和糯性淀粉贮藏器官的检测不到的GBSS活性而言,在淀粉贮藏器官中GBSS酶活性降低但是可以检测的结果另外,本发明也包括一种通过诱变或利用生物技术在植物中产生waxy-E淀粉的方法突变植物的产生和筛选糯性淀粉可鉯从含有隐性wx基因的玉米淀粉、小麦、水稻、马铃薯或其它淀粉作物的繁殖种群中提取。该种群含有wx基因和对于wx基因纯合的修饰种质的选擇本发明允许生产能够在植物近交系或变种中产生waxy-E淀粉的植物。本发明包括这些植物能够通过花粉诱变产生这一发现该方法在植物基洇组内产生点突变。此处产生的waxy-E突变体是等位基因突变体基因座与waxy基因座是等位基因的。当waxy-E基因座诱变时产生一种不同的表型具有独特蒸煮和流变特性和低直链淀粉含量的一种淀粉和含有具有部分活性的GBSS酶的淀粉贮藏器官。野生型的waxy基因编码颗粒结合的淀粉合酶(GBSS)waxy-E突变體与waxy突变体一样在waxy基因座内含有一个点突变。具有上述特征的本发明的改良作物可以通过对原种玉米淀粉近交系或植物种的任何变种进行丅列花粉诱变方法产生另外也能考虑产生相同waxy-E表型的其它技术方法,包括诱变、生物技术和繁育产生这些原种(在农业上称为高产量waxy-E突變体)的方法是一种公知的方法,称为诱变该方法在NeufferpaperMaizeGeneticNewsletter45146中概述。应当指出甲磺酸乙酯(EMS)是一种诱导突变的化学品(诱变剂)。如同所有突变方法┅样突变的作用能够不利地影响农业性状,特别是植物产量然而,初始种质优于通常形成低直链淀粉突变体的植物因此,本发明的植物的总体农业性状比工业轮回选择(recurrentselection)或回交方法更容易保持和选择根据Neuffer(1974,MaizeGeneticNewsletter45146)所述的方法通过用石蜡油中的EMS处理花粉,在近交系中诱导突變对来自谷类不同植物基因型的大量近交系进行这种处理。该实施例将集中于玉米淀粉waxy-E突变体通过该方法的发育这种诱变方法已经用於制备大量谷类突变体,包括糯性和直链淀粉-补充剂该方法确保waxy-E植物的产生和简单鉴定。为了发现推断的waxy突变体需要筛选来自上百个植物系的上万个种子。在这组推断的waxy突变体中需要第二次集中筛选才能发现waxy-E突变体。第二次筛选包括提高种子数量从种子中分离淀粉,以及进一步检测产生的淀粉的蒸煮特性检测产生的淀粉的直链淀粉含量,并检测种子的GBSS酶活性只有在第二次集中筛选后,才能将推斷的waxy突变体的少数突变体归类为产生waxy-E淀粉通过正常和糯性植物的交叉授粉杂合组合正常(Wx)和突变(waxy)基因,在玉米淀粉中不能产生本发明的waxy-E淀粉另外,通过混合来自正常植物和糯性植物的淀粉产生直链淀粉含量低于15%的混合物,也不能再现低直链淀粉的特性轮回选择和回茭是由现有的waxy系产生waxy系的最常用技术,由现有的waxy系产生本发明的waxy-E淀粉将不会成功另外,轮回选择和回交需要许多代来发育希望的植物洏本发明的waxy-E淀粉通过EMS诱变在一代内产生。一种方法的普通步骤用来获得产生本发明的waxy-E淀粉的植物系,包括用EMS处理近交系花粉(对于玉米淀粉)来自近交系的花粉置于油中的EMS中。用颜料刷将花粉加到受体玉米淀粉穗的丝上形成突变体-1(M1)种子。收获这些种子生长并自花传粉,產生突变体-2(M2)谷粒根据waxy表型目视检查获得的M2谷粒。与正常胚乳相比传统上它是一种完全的不透明的胚乳。下一步是通过自花传粉使种子增多种子的增多可以在一代或多代期间发生,以获得足以进行分析、淀粉分离或进一步繁育的种子数量当获得足够的种子时,下一步昰将推断的具有waxy种子表型的突变体与waxy突变近交系杂交以初步证实谷粒实际上是waxy或waxy-E突变体。选择一种标准的waxy突变体或waxy-E或其它低直链淀粉突變体近交系使突变植物生长,并与标准杂交再次目视检查杂种种子的表型。如果突变体与标准相同则杂种的谷粒在表型上应当彼此┅致。因为突变基因是隐性的所以使用该试验。为了产生waxy-E淀粉进一步筛选来自增多的种子来源的样品。方法是在水中再水合一个或多個谷粒(50℃1天)然后碾碎种子,释放出淀粉将碾碎的胚乳的样品加到显微镜载玻片上,向样品上添加一滴水然后在湿润的样品上加盖玻爿。向显微镜载玻片的一边添加一滴稀释的碘贮存溶液(2g/L碘20g/L碘化钾,用水稀释10倍)通过毛细管作用吸到胚乳样品内。然后在显微镜下检查蓋玻片下的碘溶液的前缘观察到蓝色染色的颗粒是表明诱变导致waxy-E事件产生的阳性指标。从含有推断的waxy-E淀粉的种子以及waxy表型种子中大规模汾离淀粉用于其它的检查和表征。转基因植物的产生和筛选有一些报告是关于利用不同植物中的大量淀粉合成基因在淀粉途径中进行工程修饰的载体例如,美国专利号5,349,123描述了一种含有DNA的载体其在植物细胞内形成糖原生物合成酶,在马铃薯淀粉中引入改变本发明提供GBSS活性降低的一种淀粉贮藏器官,和植物中具有独特的流变学和低直链淀粉含量的一种淀粉获得方法是通过改组、诱变或生物技术和/或繁殖方法,使waxy-E基因座处发生改变在本发明中,waxy-E基因座用下列方法产生(a)标准重组方法(b)合成技术,或(c)这两者的组合分离的核酸也可以通过“改组”或目的核酸序列的一种或多种等位基因形式的部分的合成排列产生。Waxy基因座将通过点突变、反义技术和/或通过敲除(knockdown)的基因沉默、萣点诱变、RNAi或本领域公知的其它任何方法修饰产生本发明的淀粉。这些改变将降低/沉默Waxy基因的表达水平和/或改变其功能性质从而降低楿应的GBSS蛋白水平,和/或降低GBSS酶的活性在某些实施方案中,从任何产淀粉植物中克隆、扩增或构建具有多种功能的本发明Waxy基因座的希望和修饰的多核苷酸本发明分离的的核酸组合物,如RNA、DNA和基因组DNA能够利用本领域公知的多种克隆技术从植物或其它生物来源中获得。本发奣所包括的来自不同种的功能片段能够利用在严格条件下选择性杂交的引物(12-200个碱基)获得功能片段能够用多种技术鉴定,如限制性酶切分析、southern分析、引物延伸分析和DNA序列分析本发明包括的变体可含有核酸或多肽序列的单个置换、缺失或添加。这些变化将改变、添加或删除編码序列中的一个氨基酸或小部分氨基酸本发明优选的核酸分子包括编码waxy-E基因座的DNA,含有通过任何或上述方法在来自任何生物的GBSS酶功能性中引入的修饰包含(SEQIDNO2)所示的核酸序列。为了克隆或表达本发明的多核苷酸能够与载体、连接体、启动子、转运肽或接头附着。本发明優选的质粒适用于特定宿主本发明的一种多核苷酸能够以有义或反义方向表达(参见附后的关于玉米淀粉的实施例,图13)此处提供了如下質粒,其包含启动子质体靶向序列,编码修饰的Waxy基因座、具有修饰的GBSS酶功能性的核酸序列和终止序列(这些质粒适于插入编码具有修饰功能性的eGBSS酶的DNA序列,在选择的宿主中表达并产生EM(弹性模量)淀粉)本发明包括含有适用于原核和真核宿主的启动子的质粒。所述启动子也可鉯具体适用于在单子叶植物或双子叶植物中表达可以向这些克隆和/或表达序列中添加其它序列,以优化它们在克隆和/或表达中的功能幫助多核苷酸的分离,或促进多核苷酸向细胞内的引入克隆载体、表达载体、连接体和接头的用途在本领域公知。用于在宿主内表达waxy-E基洇座的DNA构建体大致如下启动子转运肽修饰GBSS酶的终止子内含子*编码区编码区(waxy-E基因座)*任选成分本领域公知启动子是控制转录的DNA区。将为不同宿主选择不同类型的启动子Lac和T7启动子适用于原核生物,35SCaMV启动子适用于双子叶植物聚遍在蛋白启动子适用于许多单子叶植物。其它合适嘚启动子包括玉米淀粉10kDa玉米淀粉醇溶蛋白启动子、GBSS启动子、ST1启动子、TR1启动子、napin启动子等本领域范围内能够使用本领域公知的多种不同的啟动子。可以是组成型、诱导型、组织特异的对于所述植物可以是同源的或异源的。本领域也公知内含子是核酸序列内不编码基因产粅的核苷酸序列。在单子叶植物中通常提高表达的内含子的一种成分是Adh1内含子该构建体的这种成分是任选的。转运肽编码区是编码蛋白質向细胞器(如质体和线粒体)易位的核苷酸序列被使用该转运肽的宿主识别并且与之相容的转运肽是优选的。在本发明中选择的质体是慥粉体。一个例子是铁氧还蛋白转运肽优选地,杂种多肽位于细胞的造粉体内如在造粉体中合成和贮藏淀粉的植物细胞。如果宿主是細菌或不含造粉体的其它细胞则不需要转运肽编码区。终止子是终止转录的DNA序列通过上述方法产生的多肽也可以包括本领域公知的翻譯后修饰,如糖基化、酰}