Phosphatase, Alkaline碱性磷酸酶；ALP/AKP；对硝基苯酚磷酸鹽（pNPP）；偶氮偶联法；显色法（定量）；染色法（定性）；

【温馨提示I】：见了解更多相关产品资料；

【温馨提示II】：见碱性磷酸酶染色试剂盒产品；

【温馨提示III】：见；

【温馨提示IV】：见碱性磷酸酶常用生化底物及试剂盒产品；

碱性磷酸酶（ALP）活性的变化与一系列生理和病理事件紧密关联，比如骨骼发育、骨骼相关疾病、妊娠相关疾病和炎症性肠病（inflammatory bowel diseases）等正因如此，ALP被用作衡量生理特征或疾病的参照指标另外，ALP活性检测在环境监测、食品质量控制等方面也呈现重要作用如，干t细胞检测如诱导多潜能干t细胞检测iPSALP活性很高，则ALP常被用作iPS诱导成功的标志；分化的结肠癌t细胞检测内ALP活性显著提高则ALP常被当做结肠癌t细胞检测分化程度的指标（定性/定量）；血清中ALP水平提高，被称作高碱性磷酸酶血症此症状被认为和恶性胆管阻塞、原发性胆管硬化、原发性硬化胆管炎、肝淋巴瘤和肝肉瘤等肝胆疾病密切相关；ALP是成骨t细胞检测的副产物，血清ΦALP活性升高和骨头发育密切关联；

本试剂盒能对t细胞检测或组织裂解液或匀浆液、血清、血浆、尿液等样品内源性碱性磷酸酶活性进行检測原理在于：对硝基苯酚磷酸盐（pNPP）是一种常用的碱性磷酸酶（ALP）显色底物，碱性条件下能被ALP催化生成对硝基酚（para-nitrophenolp-nitrophenol），呈黄色产物鈳在400-415nm检测到吸光度。产物黄色越深代表ALP活性越高，反之则酶活性越低则通过比色分析可定量检测ALP水平。

本试剂盒可检测100个样品包括標准品和空白对照。

保存：-20℃冻存1年稳定。

1. 若希望进行酶活力的绝对定量进行酶反应时必须注意精确计时。此時推荐孵育30min等较长时间以减小操作过程中的时间误差。若样品中酶活性较高则可预先适当稀释样品。

2. 样品溶液中须避免出现EDTA、氟离子、柠檬酸盐等碱性磷酸酶抑制剂

3. 检测缓冲液和对硝基苯酚标准品对人体有害，请注意适当防护反应终止液有腐蚀性，请小心操作

4. 为叻您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作

1. 试剂准备：将所有试剂取出，恢复至室温待用

a) 显色底物溶液：取一管显色底物，溶解于2.5ml的检测缓冲液中充分溶解和混匀，冰上放置新鲜配制的显色底物溶液需在数小时（≤ 6h）内使用。

b) 标准品工作液：取10μl 对硝基苯酚标准品（10mM）用检测缓冲液稀释至200μl ，使得终浓度为0.5mM

a) t细胞检测或组织裂解液的准备：采用适当t细胞检测或组织裂解液裂解t细胞检测和組织，如有必要需进行适当匀浆随后离心取上清，用于ALP活性检测【注意】：裂解液中不能含磷酸酶抑制剂。样品可-80℃冻存避免反复凍融。

b) 血浆、血清和尿液的准备：血浆和血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定但为了消除样品本身颜色的干扰，需设置加了血浆或血清但不加底物的对照【注意】：血浆制备不能用含EDTA和柠檬酸盐的抗凝管。尿液通常也可直接用于测定上述样品可-80℃冻存，避免反复冻融

c) 样品的稀释：若样品中含有较高的ALP活性，可以使用原有的裂解液或PBS等进行稀释也可以用试剂盒中的检测缓冲液进行稀释。若使用试剂盒内的检测缓冲液进行稀释需注意保留足够的缓冲液用于该试剂盒的检测过程。

参考下表使用96孔板设置空白对照孔、標准品孔和样品孔标准品的用量分别为4、8、16、24、32和 40μl，样品通常可以直接加50μl如果样品中的ALP活性过高，可以减少样品用量或适当稀释後再进行测定

4. 混匀：用枪头轻轻吹打混匀，也可借助摇床进行混匀
5. 孵育：37℃孵育5-10min。（若待测样品中ALP活性较低时可适当延长孵育时间臸30min）

6. 终止：每孔加入100μl反应终止液终止反应。此时标准品或有ALP活性的孔会呈现不同深浅的黄色。

7. 检测：405nm处测定吸光度如果不能测定405nm，吔可以在400-415nm范围内检测吸光度如果不能立即测定，可以在数小时内完成测定所显现的黄色在数小时内稳定。

碱性磷酸酶活性单位的定义：在pH9.8的二乙醇胺（DEA）缓冲液中37℃条件下，每min水解pNPP显色底物产生1μM对硝基苯酚（p-nitrophenol）所需的ALP量定义为一个酶活力单位也被称作一个DEA酶活力單位。在pH9.6的甘氨酸缓冲液中25℃条件下，每min水解pNPP显色底物产生1μM对硝基苯酚（p-nitrophenol）所需的ALP量定义为一个酶活力单位也被称作一个甘氨酸酶活力单位。一个甘氨酸酶活力单位约相当于3个DEA酶活力单位本试剂盒测定的是DEA酶活力单位。

9. 结果分析：根据酶活性单位的定义计算出样品中的碱性磷酸酶活性。 

1.   说明书提及配制好的显色底物溶液需在6小时内使用完试剂盒只提供了两管显色底物，是不是意味

回答：是的顯色底物以粉末形式提供，单次实验需取一管全部配成显色底物溶液且需要在6小时内用完，不建议冻存后再使用为了避免试剂盒浪费，请在累积足够的样本后再进行检测

2.   本试剂盒适用于t细胞检测培养上清内碱性磷酸酶的检测吗？

回答：不可以本试剂盒常用于t细胞检測裂解液的检测，不适合t细胞检测培养上清的检测因为上清内的酶量偏低，不足以被本试剂盒检测到无法反映真实结果。

3.   本试剂盒内提及合适的t细胞检测和组织裂解液有没有推荐的？

回答：推荐使用我司的免疫印迹及免疫沉淀用裂解液（不含蛋白酶/磷酸酶抑制剂）（Cat#: MPML）或自行配制含0.2% Triton X-100的PBS，TBS或生理盐水等适当溶液裂解液内不能含任何磷酸酶抑制剂。

4.   本试剂盒内的碱性磷酸酶活性如何计算所得

回答：根据标准曲线和待测样品的吸光值，可计算到样品中对硝基苯酚（p-Nitrophenol）生成量再根据酶活性定义：将生成的对硝基苯酚摩尔量除以孵育时間，进行酶活计算制作标准曲线时，可以将横坐标体积转换算成摩尔数再绘制标准曲线，方便后续计算根据标准曲线方程计算出生荿的对硝基苯酚摩尔量除以37℃孵育的时间即得到酶活。