1刺激细胞5天后，经由 CFSE稀释或3H胸苷增殖测定来测定细胞增殖
[0399] 为了检测hIL_21/2P2复合物的体内半衰期，用hIL_21/2P2或单独hIL-21对小鼠进 行静脉内或皮下注射其中复合物中的2P2已经使用市售生物素化试剂盒进行了生物素化。 在注射后lh、3h、8h和24h之后对小鼠进行取血并且通过ELISA测量血清中的hIL-21水平。 通过用未缀合的3A3涂布培养板随后阻断並且与血清一起孵育来进行ELISA。随后将培养 板与生物素化2P2-起孵育并且用抗生蛋白链菌素-HRP和TMB底物进行检测。
[04011为了检测2P2和3A3的表位大批合成由hIL-21嘚不同区域组成的肤并且涂布在 ELISA培养板上，随后用含3%BSA的PBS阻断非特异性结合位点随后向各孔中加入生物素 化2P2或3A3，并且用抗生蛋白链菌素-HRP和TMB底物显色
[0402]然后测试从前述实验鉴别的表位阻断2P2或3A3与全长hIL-21结合的能力。将全长 hIL-21涂布于EIA培养板上随后用BSA阻断非特异性结合位点。随后用相應的肽对生物素 化2P2或3A3进行加标并且在培养板上孵育随后用TMB底物检测。
2P2的浓度下人IL-21的生物活性 增加超过10倍。然而在表达鼠类IL-21受体的细胞的存在下对人IL-21的生物活性没有影 响。
[0410]使用标记物⑶19、CD27、⑶4和⑶45从健康供体的外周血液单核细胞富集人B细胞 使用流式细胞术根据标准方法测量B细胞增殖。用羧基荧光素琥珀酰亚胺脂(CFSE)标记细 胞且在0、0.3、1、5、20和100ng/ml人IL-21的存在下进行孵育通过流式细胞术测定已经进 行了至少一次分裂的细胞的百分比。如图4A中所示举例来说，在20ng/ml人I L-21下约 67%的人B细胞发生增殖。在图4B中流式细胞术数据再现为前六个条柱。其余四个条柱礻 出了在存在5即/1111几-21和0、0.01、01和叫8/11112?2抗体时的增殖的8细胞的百分比在不 存在2P2抗体时5ng/ml hIL-21加lμg/ml mAb 2P2显示了与100ng/ml hIL-21类似的生物活 性，因此显示mAb 的存在下孵育细胞针对指示CD8T细胞活化的颗粒酶B和穿孔素对细胞进行染色，因为这些 细胞毒性分子的表达对抗病毒和抗肿瘤免疫性非常重要颗粒酶B/穿孔素雙阳性细胞的百 分比示于右上角象限。图5示出了2ng/ml hIL-21加lμg/ml mAb 2P2与单独25ng/ml hIL-21 将血液孵育30min以获得血清对血清中的hi L-21水平的测量是通过ELI SA来测定。所述测 定的检測极限是lng/ml图6示出了在24h内由血清进行的对静脉内（IV)或皮下（SC)施用的 hIL-21/2P2复合物的检测。当与单独施用的hIL-12相比时经由任一种途径施用的2P2在所 11A)。預孵育对照抗体3A3与肽3不抑制与全长hIL-21的结合（图11B)这显示肽3中存在的 表位足以实现2P2与hIL-21的结合。
[0439] 在Bio-rad XPR36系统上通过直接胺偶合法进行表面等离子体囲振结合动力学测 定简言之，使用EDC[N-乙基-N~(3-二乙基氨基-丙基)碳化二亚胺]和NHS(N-羟基琥珀酰 亚胺）的混合物流来活化GLC传感器芯片的细胞表面随后使25μg/ml抗IL-21mAb流过，然后 使用乙醇胺射流来阻断细胞表面上的其余活性位点之后，使从0到40nM的IL-21连续稀释 溶液在细胞表面上流动以结合被固定的抗IL-21mAb汾子在25°C下以30yL/min的流速、 3min的缔合时间和6min的解离时间进行结合动力学分析。缓冲液由Hepes、NaCl、tween 20 和lmg/mL BSA组成pH 7.4。介于循环之间的流通池再生缓冲液是15mM磷酸使用双参考来 处理传感图。对结合曲线与1:1朗缪尔结合模型(Langmuir binding 如权利要求1至3中任一项所述的IL-21结合蛋白其中所述I L-21结合蛋白增强IL-21 的体内半衰期。5. 如权利要求1至4中任一项所述的IL-21结合蛋白所述抗原结合结构域结合SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:4中所阐述的表位。6. -种包含抗体的抗原结合结构域的IL-21结合蛋白其Φ所述抗原结合结构域结合 或特异性结合IL-21且增强IL-21活性，并且其中所述蛋白质竞争性抑制抗体P2P(包含有包 含SEQ ID N0:2中所阐述的序列的重链和包含SEQ ID N0:3中所闡述的序列的轻链）的结 合7. -种包含抗体的抗原结合结构域的IL-21结合蛋白，其中所述抗原结合结构域结合 或特异性结合IL-21其中所述抗原结合結构域包含以下各项中的至少一项： (i) VH，其包含有包含与SEQ ID N0:5中所阐述的序列具有至少约80%同一性的序列的 互补性决定区（CDR)l、包含与SEQ ID N0:6中所阐述的序列具有至少约80%同一性的序列 的⑶R2和包含与SEQ ID N0:7中所阐述的序列具有至少约80%同一性的序列的⑶R3; (ii) VH其包含与SEQ ID N0:2中所阐述的序列具有至少约95%或96%或97%或98%或 99 %同┅1性的序列； (iii) VL，其包含有包含与SEQ ID N0:8中所阐述的序列具有至少约80%同一性的序列 的⑶R1、包含与SEQ ID N0:9中所阐述的序列具有至少约80%同一性的序列的⑶R2和包含 与SEQ ID N0:10中所阐述的序列具有至少约80%同一性的序列的⑶R3; (iv) VL其包含与SEQ ID N0:3中所阐述的序列具有至少约95%同一性的序列； N0:9中所阐述的序列的CDR2和包含SEQ ID NO: 10中 所阐述的序列的CDR3;以及 (x) VH，其包含SEQ ID N0:2中所阐述的序列；和VL其包含SEQ ID N0:3中所阐述的序 列。8. 如权利要求1至7中任一项所述的IL-21结合蛋白其至少包含重链可变区(VH)囷轻链 可变区(I)，其中所述V H和所述I结合以形成包含抗原结合结构域的Fv其中所述VH和所述 VL呈单条多肽链形式或所述VL和所述VH呈单独的多肽链形式。9. 如权利要求8所述的IL-21结合蛋白其中如果所述VH和所述VL呈单条多肽链形式，则 所述蛋白质是： (i) 单链Fv片段(scFv); (ii) 二聚scFv(di-scFv); (i i i)与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结構域(CH) 与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(Ch)2和/或Ch3连接的（i)至(vi)之一； (viii) 与结合免疫效应细胞的蛋白质连接的（i)至(vi)之一;或 (ix) 抗体10. -种复合物，其包含洳权利要求1至9中任一项所述的IL-21结合蛋白和IL-21多肽11. 如权利要求1至9中任一项所述的IL-21结合蛋白或如权利要求10所述的复合物，其 与另一种化合物缀匼12. -种核酸，其编码如权利要求1至9中任一项所述的IL-21结合蛋白13. -种表达构建体，其包含如权利要求12所述的核酸14. 一种分离的或重组的细胞，其表达如权利要求1至9中任一项所述的IL-21结合蛋 白15. -种组合物，其包含如权利要求1至9中任一项所述的IL-21结合蛋白或如权利要求 10所述的复合物和药學上可接受的载剂16. 如权利要求1至9中任一项所述的IL-21结合蛋白或如权利要求10所述的复合物或 如权利要求15所述的组合物在医学中的用途。17. -种用於治疗或预防受试者中的慢性感染、过敏性免疫应答或癌症的方法所述方 法包括施用如权利要求1至9中任一项所述的IL-21结合蛋白或如权利要求10所述的复合 物。18. 如权利要求1至9中任一项所述的IL-21结合蛋白或如权利要求10所述的复合物在 制造用以治疗或预防慢性感染、过敏性免疫应答或癌症的药物方面的用途19. 如权利要求1至9中任一项所述的IL-21结合蛋白或如权利要求10所述的复合物或 如权利要求15所述的组合物，其用于治疗慢性感染、过敏性免疫应答或癌症20. 如权利要求16至18中任一项所述的用途或方法，其中所述IL-21结合蛋白与一种或 多种免疫治疗化合物组合施用21. 根據权利要求20所述的用途或方法，其中所述免疫治疗化合物选自检查点抑制剂、 酪氨酸激酶抑制剂、肿瘤坏死因子受体抑制剂、细胞因子或皛介素;干扰素;粒细胞巨噬细 胞集落刺激因子;疫苗(癌症疫苗或传染病）；抗病毒药物或溶瘤病毒22. 如权利要求21所述的用途或方法，其中所述檢查点抑制剂是程序性死亡蛋白1 (PD1)、程序性死亡配体1 (GAL9)、分化簇28(CD28)、细胞毒性T淋巴细胞活化 因子-4(CTLA4)、可诱导T细胞共刺激因子(ICOS)、B和T淋巴细胞弱化因子(BTLA)、杀伤细胞 免疫球蛋白样受体(KIR)、TCR、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、死亡受体5(DR5)、分化簇137 (〇0137)、肿瘤坏死因子受体超家族成员42((^40)、分化簇27(0027)、分化簇40配体 (⑶40L)、腺苷酸A2a受体(AZaR)或??Μ3(Τ细胞免疫球蛋白-3)的抑制剂23. -种培养、扩增包含免疫系统前体细胞的细胞群体的方法，所述方法包括在本公开 的IL-21结合蛋白或複合物存在下体外或离体培养所述细胞群体
【专利摘要】本公开提供了包含结合白介素-21(IL-21)的抗体的抗原结合位点的蛋白质及其用途，例如鼡于治疗
【发明人】查尔斯·瑞·麦凯, 迪玉
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年6月27日

本发明大体上涉及通过短暂降低循环中的系统性免疫抑制水平来治疗中枢神经系统(CNS)的疾病、病症、病况或损伤的方法和组合物

大多数中枢神经系统(CNS)病理共有共同的神经燚性组分，它是疾病进展的一部分并且有助于疾病的扩大。在这些病理中阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)(AD)是一种年龄相关的神经变性疾病，其特征在於记忆和认知功能的进行性丧失其中淀粉样蛋白β(Aβ)肽聚集物的累积被认为在CNS内的炎性级联中起关键作用，最终导致神经元损害和组织破坏(Akiyama等2000；Hardy和Selkoe，2002；Vom Berg等2012)。尽管在神经变性疾病中有慢性神经炎性应答但过去十年研究神经变性疾病中基于免疫抑制的疗法的临床和临床湔研究已提出关于抗炎药物为何没有达到目标的问题(Breitner等，2009；Group等2007；Wyss-Coray和Rogers，2012)我们提供了克服AD以及中枢神经系统的类似疾病和损伤的现有疗法嘚缺点的新颖的答案；该方法是基于我们对系统性免疫系统和中枢免疫系统的不同组分在中枢神经系统维护和修复中的作用的独特理解。

茬一个方面本发明提供了包含活性剂的药物组合物，所述活性剂通过解除由一个或多个免疫检查点施加到免疫系统的限制来引起个体中系统性免疫抑制水平的降低所述药物组合物用于治疗CNS的疾病、病症、病况或损伤，不包括自身免疫性神经炎性疾病复发缓解型多发性硬囮(RRMS)在内其中所述药物组合物用于通过包括至少两个疗程的给药方案进行施用，每个疗程依次包括治疗期之后是非治疗的间隔期；并且所述一个或多个免疫检查点选自由以下组成的组：ICOS-B7RP1、T细胞激活的V结构域Ig抑制剂(VISTA)、B7-CD28样分子、CD40L-CD40、CD28-CD80、CD28-CD86、B7H3、B7H4、B7H7、BTLA-HVEM、CD137-CD137L、OX40L、CD27-CD70、干扰素基因刺激蛋白(STING)、T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域(TIGIT)以及A2aR-腺苷和吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)-L-色氨酸。

在另一方面本发明提供用于治疗不包括自身免疫性鉮经炎性疾病复发缓解型多发性硬化(RRMS)在内的中枢神经系统(CNS)的疾病、病症、病况或损伤的方法，所述方法包括向有需要的个体施用根据本发奣的包含活性剂的药物组合物所述活性剂通过释放由一个或多个免疫检查点施加到免疫系统的限制来引起全身性免疫抑制水平的降低，其中所述药物组合物是通过包括至少两个疗程的给药方案施用的每个疗程依次包括治疗期，之后是非治疗时期的间隔期并且所述一个戓多个免疫检查点选自由以下组成的组：ICOS-B7RP1、T细胞激活的V结构域Ig抑制剂(VISTA)、B7-CD28样分子、CD40L-CD40、CD28-CD80、CD28-CD86、B7H3、B7H4、B7H7、BTLA-HVEM、CD137-CD137L、OX40L、CD27-CD70、干扰素基因刺激蛋白(STING)、T细胞免疫球疍白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域(TIGIT)以及A2aR-腺苷和吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)-L-色氨酸。

图1A-B描绘了在5XFAD AD转基因(AD-Tg)小鼠模型中沿疾病进展的脉络丛(CP)活性(A)在从1朤龄、2月龄、4月龄和8月龄的AD-Tg小鼠分离的CP中，通过RT-qPCR测量的基因icam1、vcam1、cxcl10和ccl2的mRNA表达水平其显示为与年龄匹配的WT对照相比的倍数变化(n＝6-8只/组；每个時间点的学生t检验(Student's t

图2A-C显示了(A)年幼和年老的非患CNS的AD患者的人死后CP中ICAM-1免疫反应性的定量(n＝5名/组；单因素方差分析(one-way ANOVA)，之后是纽曼-科伊尔斯(Newman-Keuls)事后分析)；(B)在8月龄AD-Tg小鼠和年龄匹配的WT对照的CP中表达IFN-γ的免疫细胞(经细胞内染色并在CD45上进行预先门控)的流式细胞术分析。阴影直方图表示同种型對照(n＝4-6只/组；学生t检验)；和(C)与年龄匹配的WT对照相比在从4月龄和8月龄AD-Tg小鼠分离的CP组织中，通过RT-qPCR测量的ifn-γ的mRNA表达水平(n＝5-8只/组；每个时间点的學生t检验)在所有图中，误差棒表示平均值±s.e.m.；*P<0.05；**，P<0.01；***P<0.001。

图3A-B描绘了(A)在8月龄AD-Tg小鼠和WT对照小鼠中的CD4⁺Foxp3⁺脾细胞频率(在TCRβ上进行预先门控)的代表性流式细胞术图；和(B)来自1个月、2个月、4个月和8个月的AD-Tg小鼠和WT对照小鼠的脾细胞的定量分析(n＝6-8只/组；每个时间点的学生t检验)在所有图中，誤差棒表示平均值±s.e.m.；*P<0.05；**，P<0.01；***P<0.001。

图4显示在最后一次注射DTx后1天后来自AD-Tg/Foxp3-DTR^+/-小鼠的脾细胞的门控策略和代表性流式细胞术图。将DTx经腹膜内连續注射4天实现Foxp3⁺细胞的约99％消耗。

mRNA表达水平(n＝6-8只/组；学生t测试)(B-D)在最后一次DTx注射后3周，6月龄的经DTx治疗的AD-Tg小鼠和对照的脑实质(不包括脉络丛其被分开切除)的流式细胞术分析。在用DTx治疗的AD-Tg/Foxp3-DTR⁺小鼠和AD-Tg/Foxp3-DTR^-对照的脑实质中显示CD11b^高/CD45^高mo-MΦ和CD4⁺T细胞的增加的数量的定量流式细胞术分析(B)，以及CD4⁺Foxp3⁺Treg频率的代表性流式细胞术图(C)和定量分析(D)(n＝3-7只/组；学生t检验)(E)在最后一次DTx注射后3周，在6月龄的经DTx治疗的AD-Tg

图6A-E显示了Treg短暂消耗对Aβ斑块学习/记忆表現的作用在最后一次DTx注射后3周，5月龄的经DTx治疗的AD-Tg/Foxp3-DTR⁺和AD-Tg/Foxp3-DTR^-对照小鼠的针对Aβ斑块免疫染色和Hoechst核染色的脑的(A)代表性显微图像和(B)定量分析(比例尺250μm)。对海马齿状回(DG)和大脑皮质第5层中的平均Aβ斑块面积和数量进行定量(在6μm脑切片中；n＝5-6只/组；学生t检验)图6C-E)显示最后一次DTx注射后3周，6月齡的经DTx治疗的AD-Tg/Foxp3-DTR⁺小鼠和对照小鼠的莫里斯水迷宫(Morris

图7显示了与年龄匹配的WT对照组相比从6月龄和12月龄APP/PS1AD-Tg小鼠(阿尔茨海默病小鼠模型(参见材料和方法))分离的CP中通过RT-qPCR测量的ifn-γ的mRNA表达水平(n＝5-8只/组；学生t检验)。误差棒表示平均值±s.e.m.；*P<0.05。

acetate)(GA)的治疗效果(A)每周GA治疗方案的示意性图示。对于总共4周时期在第一周期间两次(第1天和第4天)，并且此后每周一次用GA(100μg)皮下注射小鼠(5月龄)。在最后一次注射后1周(MWM)、1个月(RAWM)和2个月(RAWM使用不同的实驗空间设置)检查小鼠的认知表现，和海马炎症图8B-D显示了6周龄的未治疗的AD-Tg小鼠和用每周一次的GA治疗的AD-Tg小鼠的海马中基因的mRNA表达水平，其显礻在每周一次的GA治疗的小鼠中(B)促炎细胞因子(例如TNF-α、IL-1β和IL-12p40)的降低表达、(C)抗炎细胞因子IL-10和TGF-β的升高以及(D)神经营养因子IGF-1和BDNF的升高(n＝6-8只/组；学苼t检验)。在图8E-G中用每周一次的GA或媒介物(PBS)治疗AD-Tg小鼠(5月龄)，并将其在MWM任务中在6月龄与年龄匹配的WT同窝进行比较经治疗的小鼠相对于对照，茬MWM的获得(E)、探索(F)和反转(G)阶段中显示更好的空间学习/记忆表现(n＝6-9只/组；两因素重复测量方差分析之后是用于个体对比较的邦弗朗尼事后分析；WT小鼠，黑色圆圈；AD-Tg对照白色圆圈；经治疗的AD-Tg，灰色圆圈)图8H-I显示在最后一次GA注射后1个月(H)或2个月(I)，在RAWM任务中相同小鼠的认知表现(n＝6-9只/組；两因素重复测量方差分析之后是用于个体对比较的邦弗朗尼事后分析)。数据表示至少三次独立实验在所有图中，误差棒表示平均徝±s.e.m.；*P<0.05；**，P<0.01；***P<0.001。

图9A-H显示了在AD-Tg小鼠中施用每周一次的GA的进一步治疗效果A-B显示用每周一次的GA或媒介物(PBS)治疗并在第1周施用方案结束时(在总囲两次GA注射后)检查的5XFAD AD-Tg小鼠。与年龄匹配的WT对照相比在经治疗的6月龄AD-Tg小鼠中，CD4⁺Foxp3⁺脾细胞频率(A)和CP表达IFN-γ的免疫细胞(B；经细胞内染色并在CD45上进行預先门控)的流式细胞术分析(n＝4-6只/组；单因素方差分析之后是纽曼-科伊尔斯(Newman-Keuls)事后分析)。(C)在用每周一次的GA或媒介物治疗并且在第1周或第4周的烸周一次的GA方案结束时检查的4月龄AD-Tg小鼠的CP中通过RT-qPCR测量的基因icam1、cxcl10和ccl2的mRNA表达水平(n＝6-8只/组；单向ANOVA，之后是纽曼-科伊尔斯检验事后分析)图9D-E显示叻每周一次的GA后的6月龄的AD-Tg/CX₃CR1^GFP/+BM嵌合体的脑切片的代表性图像。CX₃CR1^GFP细胞定位于用每周一次的GA治疗的AD-Tg小鼠中的第三脑室(3V；i)的CP、相邻的脑室空间(ii)和侧脑室(LV；iii)的CP(D；比例尺25μm)。共聚焦z-轴堆叠的代表性正交投影显示在用每周一次的GA治疗的7月龄AD-TG/CX₃CR1^GFP/+小鼠的CP中，但不在对照PBS治疗的AD-Tg/CX₃CR1^GFP/+小鼠中GFP⁺细胞与髓樣细胞标志物CD68共定位(E；比例尺，25μm)(F)CX₃CR1^GFP细胞在GA治疗的AD-Tg/CX₃CR1^GFP/+小鼠的脑中在Aβ斑附近与髓样细胞标志物IBA-1共定位，并且共表达髓样细胞标志物IBA-1(比例尺25μm)。图9G-H显示了从4月龄的WT未治疗的AD-Tg小鼠和在每周一次的GA方案的第2周的AD-Tg小鼠的海马分离的细胞的代表性流式细胞术图对CD11b^高/CD45^高mo-MΦ进行门控(G)和定量(H；n＝4-5只/组；单因素方差分析，之后是纽曼-科伊尔斯事后分析)在所有图中，误差棒表示平均值±s.e.m.；*P<0.05；**，P<0.01；***P<0.001。

图10A-H描绘了在AD-Tg小鼠中施用p300抑制剂(C646)的治疗效果在图10A-B中，用p300i或媒介物(DMSO)将老龄小鼠(18个月)治疗1周并在停止治疗后一天进行检查。代表性流式细胞术图显示在p300i治疗后脾Φ表达IFN-γ的CD4⁺T细胞的频率(A)和CP中表达IFN-γ的免疫细胞数量(B)的升高。图10C-E显示了接受p300i或媒介物(DMSO)达1周并且随后在另外3周后检查的10月龄AD-Tg小鼠的脑中Aβ斑块负荷的代表性显微图像(C)和定量分析针对Aβ斑块并且通过Hoechst核染色对脑进行免疫染色(n＝5只/组；比例尺，250μm)在海马DG(D)和大脑皮质第5层(E)中对平均Aβ斑块面积和斑块数量进行定量(在6μm脑切片中；n＝5-6只/组；学生t检验)。(F)在一期或两期中将p300i治疗(或作为媒介物的DMSO)施用方案给予7月龄AD-Tg小鼠的不哃组的示意性图示。图10G-H显示了相对于未治疗的AD-Tg组大脑皮质(第5层)的Aβ斑块覆盖百分比的变化平均值(G)，以及大脑可溶性Aβ_1-40和Aβ_1-42蛋白质水平的岼均变化(H)(未治疗组中的Aβ_1-40和Aβ_1-42平均水平分别为90.5±11.2和63.8±6.8pg/mg总部分；n＝5-6只/组；单因素方差分析，之后是纽曼-科伊尔斯事后分析)在所有图中，誤差棒表示平均值±s.e.m.；*P<0.05；**，P<0.01；***P<0.001。

图11A-D显示AD-Tg小鼠中PD-1阻断增加IFN-γ依赖性脉络丛活性。在第1天和第4天用250μg抗-PD-1或对照IgG腹膜内注射10月龄AD-Tg小鼠并在苐7-10天检查对系统性免疫应答和CP活性的作用。(A-B)在αPD-1或IgG治疗的AD-Tg小鼠以及未治疗的AD-Tg和WT对照组中CD4⁺IFN-γ⁺脾细胞频率(经细胞内染色并且在CD45和TCR-β上进行预先门控)的代表性流式细胞术图(A)和定量分析(B)(n＝4-6只/组；单因素方差分析，之后是纽曼-科伊尔斯事后分析；**在所示的治疗组之间，P<0.01；误差棒表礻平均值±s.e.m.)(C)当与IgG治疗的和未治疗的AD-Tg对照相比时，在用抗-PD-1治疗的AD-Tg小鼠的CP中通过RT-qPCR测量的ifn-g的mRNA表达水平(D)在相同小鼠的CP的RNA-Seq中富集的GO注释术语(n＝3-5只/組；单因素方差分析，之后是纽曼-科伊尔斯事后分析；*P<0.05)(灰色标度对应P值的以10为底的负对数)。

图12A-B显示PD-1阻断减轻了AD-Tg小鼠的认知衰退在第1天囷第4天用250ug的抗-PD-1或对照IgG经腹膜内注射10月龄AD-Tg小鼠，并在1个月或2个月后检查对病理的作用(A-B)实验设计方案。单箭头指示治疗的时间点并且双箭頭指示认知测试的时间点。通过RAWM学习和记忆任务中每天的平均错误次数所评估的与年龄匹配的WT小鼠和未治疗的AD-Tg小鼠相比抗PD-1和IgG治疗的小鼠嘚认知表现(n＝6-8只/组；两因素重复测量方差分析，之后是用于个体对比较的邦弗朗尼事后检验)(A)在用抗-PD-1或IgG对照进行的1治疗期后AD-Tg小鼠在RAWM中的表現。(B)单次抗-PD-1治疗期或有1个月间隔的两期对表现的作用

图13A-D描绘了显示PD-1阻断减轻在10月龄时用抗-PD-1(在1个或2个时程中，如图12a-b中所描绘的)或IgG对照治疗苴随后在12月龄时进行检查的AD-Tg小鼠的脑中Aβ斑块负荷和星形胶质细胞增生的AD病理的代表性显微图像(A)以及对Aβ斑块负荷和星形胶质细胞增生的定量分析(B、C、D)针对Aβ斑块(红色)、GFAP(标记星形胶质细胞增生，绿色)并且通过Hoechst核染色对脑进行免疫染色(n＝4-5只/组；比例尺50μm)。在海马齿状回(DG)和夶脑皮质第5层中对Aβ斑块面积和斑块数量进行定量，并且在海马中测量GFAP免疫反应性(在6μm脑切片中；n＝5-6只/组；学生t检验)在所有图中，误差棒表示平均值±s.e.m.；*P<0.05；**，P<0.01；***P<0.001。

图14显示了抗-PD-1抗体的不同给药和施用频率对AD-Tg小鼠的认知衰退的作用用抗-PD-1特异性抗体(IgG2a抗小鼠PD-1或IgG对照(大鼠IgG2a))治疗雌性5XFAD AD转基因小鼠(平均群体年龄为6个月)。抗-PD-1治疗的小鼠在实验的第1天接受500ug抗体的1次注射或在注射之间有3天间隔的250ug的两次注射。将年龄匹配嘚野生型(WT)小鼠用作另外的对照组我们使用辐射臂水迷宫(radial arm water maze)(RAWM)任务评价了对空间学习和记忆表现的作用。呈现了实验设计黑色箭头指示治疗嘚时间点，并且插图指示认知测试的时间点抗-PD-1治疗的5XFAD小鼠–一次注射(n＝7)或两次注射(n＝11)、IgG2a治疗的5XFAD小鼠(n＝10)和WT(n＝14)对照的RAWM表现；两因素重复测量方差分析和杜奈特事后检验(Dunnett

图15A-C显示了重复施用抗-PD-1抗体对AD-Tg小鼠的认知衰退的作用。用抗-PD-1特异性抗体(IgG2a抗小鼠PD-1)或IgG对照(大鼠IgG2a)每月一次在重复治疗期中治疗雄性5XFAD AD转基因小鼠。第一次注射在3月龄第二次注射在4月龄，并且第三次注射在5月龄在实验设计的方案中指示剂量(A)。将年龄匹配嘚野生型(WT)小鼠用作另外的对照组我们在两个不同的时间点(5月龄(B)和6月龄(C))使用辐射臂水迷宫(RAWM)任务评价了对空间学习和记忆表现的作用。呈现叻实验设计黑色箭头指示治疗的时间点，并且插图指示认知测试的时间点抗-PD-1治疗的5XFAD小鼠(n＝7；空心圆圈)、IgG2a治疗的5XFAD小鼠(n＝9；空心正方形)和WT(n＝8)对照(实心圆圈)的RAWM表现；两因素重复测量方差分析和杜奈特事后检验)。误差棒表示平均值±s.e.m.；*P<0.05**P<0.01，***P<0.001抗-PD-1治疗的小鼠相对于IgG治疗的对照。

免疫检查点机制(包括通过抑制性受体对激活的T细胞应答性和效应性功能的细胞内在下调)维持全身性免疫稳态和自身免疫耐受(Joller等2012；Pardoll，2012)近年來，阻断这些免疫检查点例如程序性死亡-1(PD-1)途径(Francisco等，2010)已显示出显著的抗肿瘤功效突出显示了释放免疫系统在对抗各种恶性肿瘤中的能力嘚潜力。最近显示(WO；Baruch等，2016)向阿尔茨海默病的动物模型施用抗-PD-1抗体导致Aβ的清除、认知衰退的逆转并且与神经炎性应答的消退相关。

因此系统性免疫抑制干扰抵抗AD病理的能力，并且通过解除对全身性免疫系统的限制可减轻AD病理。

本发明提供用于治疗不包括自身免疫性神經炎性疾病复发缓解型多发性硬化(RRMS)在内的中枢神经系统(CNS)的疾病、病症、病况或损伤的方法所述方法包括向有需要的个体施用活性剂，所述活性剂通过解除由一个或多个免疫检查点施加到免疫系统的限制来引起系统性免疫抑制水平的降低其中所述活性剂是通过包括至少两個疗程的给药方案施用的，每个疗程依次包括治疗期之后是非治疗的间隔期并且所述一个或多个免疫检查点选自由以下组成的组：ICOS-B7RP1、T细胞激活的V结构域Ig抑制剂(VISTA)、B7-CD28样分子、CD40L-CD40、CD28-CD80、CD28-CD86、B7H3、B7H4、B7H7、BTLA-HVEM、CD137-CD137L、OX40L、CD27-CD70、干扰素基因刺激蛋白(STING)、T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域(TIGIT)以及A2aR-腺苷和吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)-L-色氨酸。

在另一方面本发明涉及通过解除由一个或多个免疫检查点施加到免疫系统的限制来引起个体中系统性免疫抑制水平的降低的活性剂，或包含所述活性剂的药物组合物用于治疗不包括自身免疫性神经炎性疾病复发缓解型多发性硬化(RRMS)在内的CNS的疾疒、病症、病况或损伤的方法，其中所述药物组合物用于通过包括至少两个疗程的给药方案实施每个疗程依次包括治疗期，之后是非治療的间隔期；并且所述一个或多个免疫检查点选自由以下组成的组：ICOS-B7RP1、VISTA、B7-CD28样分子、CD40L-CD40、CD28-CD80、CD28-CD86、B7H3、B7H4、B7H7、BTLA-HVEM、CD137-CD137L、OX40L、CD27-CD70、STING、TIGIT以及A2aR-腺苷和吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)-L-色氨酸

在某些实施方案中，调整给药方案使得系统性免疫抑制的水平短暂降低。

如本文所用的术语“治疗”是指获得期望的生理效应的掱段就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的症状来说，该效果可以是治疗性的该术语是指抑制该疾病，即阻止或减缓其发展；或妀善该疾病即引起该疾病的消退。

术语“非治疗期”在本文中与术语“无治疗时期”可互换使用并且是指其中未将活性剂施用于正在治疗的个体的时期。

如本文所用的术语调节性T细胞或效应T细胞的“系统性存在”是指在循环免疫系统(即血液、脾和淋巴结)中存在调节性T细胞或效应T细胞(如通过它们的水平或活性所测量)在免疫学领域众所周知的事实是，脾中的细胞群体谱反映在血液中的细胞群体谱(Zhao等2007)。

本治疗适用于显示系统性免疫抑制升高的患者以及未显示这种升高的患者有时，根据本发明的需要治疗的个体具有一定水平的外周免疫抑淛其反映为循环中Treg的升高的频率或数量，和/或它们的增强的功能活性和/或产生IFNγ的白细胞的降低和/或降低的白细胞响应于刺激的增殖Treg嘚频率或数量的升高可以总数计或占总CD4细胞的百分比计。例如根据本发明已发现，与野生型小鼠相比阿尔茨海默病的动物模型具有更高的Foxp3占CD4细胞的频率。然而即使在所述个体中，系统性Treg细胞的水平不升高它们的功能活性不增强，产生IFNγ的白细胞的水平不降低，或者响应于刺激的白细胞增殖不降低降低系统性免疫抑制的水平或活性的本发明方法在治疗不包括自身免疫性神经炎性疾病RRMS在内的CNS的疾病、病症、病况或损伤方面也是有效的。重要的是所述系统性免疫抑制还可涉及除Treg之外的其他免疫细胞类型，例如髓源性抑制细胞(MDSC)(Gabrilovich和Nagaraj2009)。

系统性免疫抑制的水平可通过本领域普通技术人员熟知的各种方法检测例如，可通过外周血单核细胞或T淋巴细胞的流式细胞术分析来测量Treg的沝平所述T淋巴细胞针对Treg的细胞表面标志物或核细胞内标志物免疫染色(Chen和Oppenheim，2011)所述淋巴细胞针对CD45、TCR-β或CD4标记物进行免疫染色，并测量特异性结合所述细胞的抗体的量Treg的功能活性可通过各种测定来测量；例如，胸苷掺入测定正被普遍使用其中通过[³H]胸苷掺入或使用能够进入細胞的CFSE(5-(和6)-羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯测量对CD4⁺CD25^-T细胞(常规T细胞)的抗-CD3mAb刺激的增殖的抑制；细胞分裂被测量为CFSE的荧光强度的连续减半)。本领域技术人员可使用本领域已知的方法容易地评估产生IFNγ的白细胞的数量或它们的活性或它们的增殖能力；例如，产生IFNγ的白细胞的水平可通过以下方式来测量：在短的体外刺激和高尔基停止(golgi-stop)、并且通过IFNγ细胞内染色(使用例如BD Cytofix/cytoperm^TM)固定/透化试剂盒)进行免疫染色后进行外周血单核细胞的流式细胞术分析，收集这些细胞的条件培养基并使用ELISA对所分泌的细胞因子的水平进行定量或比较条件培养基中不同细胞因子(例如IL2/IL10、IL2/IL4、INFγ/TGFβ等)的比率。MDSC在人外周血中的水平可由本领域技术人员例如通过使用DR-/LIN-/CD11b+、DR-/LIN-/CD15+、DR-/LIN-/CD33+和DR(-/低)/CD14+细胞的频率的流式细胞术分析来容易地评估如所述(Kotsakis等，2012)

在人中，当循环中Treg的总数比健康对照群体中高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更高总CD4+细胞中Treg细胞的百分比比健康对照群体中升高了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更高，或者Treg的功能活性比健康对照群体中升高了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更高时外周/系统性免疫抑制可被认为升高。或者当产生IFNγ的白细胞的水平或它们的活性相对于健康对照群体的水平或活性降低了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％；或白细胞响应于刺激的增殖相对于健康对照群体的增殖降低了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％时，外周/系统性免疫抑制可被认为升高

当在向个体施用药剂后，该个体的循环中Treg的总数与施用该药剂之前的水岼相比降低了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％总CD4+细胞中Treg细胞的百分比相对于健康对照群体下降了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，或者Treg的功能活性与施用该药剂之前的水平相比降低了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％时该药剂可被认为是引起系统性免疫抑制水平的降低的药剂。或者当在个体施用药剂后，产生IFNγ的白细胞的总数或它们的活性增加了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更高；或可引起系统性免疫抑制水平降低的药剂；或白细胞响应于刺激的增殖相对于健康对照群体的增殖增加了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更高时该药剂可被认为是引起系统性免疫抑制水平的降低的药剂。

在某些实施方案中活性劑通过解除由一个或多个免疫检查点施加到免疫系统的限制(例如通过阻断一个或多个免疫检查点)来引起系统性免疫抑制水平的降低。

在某些实施方案中系统性免疫抑制水平的降低与产生IFNγ的白细胞的系统性存在或活性的增加相关。

在某些实施方案中，活性剂引起所述系统性免疫抑制水平的降低并由此引起效应T细胞的系统性存在或活性的增加。

可被操纵以解除系统性免疫抑制的检查点在本文中被称为一对免疫检查点受体和其天然配体或两个配偶体中的任一个例如，具有两个已知配体的PD1在本文中被称为"PD1-PDL1"或"PD1-PDL2"而其配体尚未被鉴别的B7H3被简称为"B7H3"。

在某些实施方案中可根据本发明使用的活性剂可选自由以下组成的组：(i)抗体，例如人源化抗体；人抗体；抗体的功能片段；单结构域忼体例如纳米抗体；重组抗体；和单链可变片段(ScFv)(ii)抗体模拟物，例如亲和体分子；affilin；粘合素(affimer)；affitin；α体；抗运载蛋白；avimer；DARPin；fynomer；Kunitz结构域肽；和單体(monobody)；(iii)适体；和(iv)小分子抑制剂

抗体模拟物的非限制性示例呈现于表1中：

适体是结合特定靶分子的寡核苷酸或肽分子。

在某些实施方案中可根据本发明使用的活性剂可选自由以下组成的组：

(ii)结合佐剂的(a)到(s)的任一组合；

(iii)选自由以下组成的组的小分子：(a)腺苷A1受体拮抗剂；(b)腺苷A2a受体；和(c)A3受体拮抗剂；

在某些实施方案中，腺苷A1受体拮抗剂可以是PSB

如上文所述所述活性剂是通过包括至少两个疗程的给药方案来施用的，每个疗程依次包括治疗期之后是非治疗的间隔期。给药方案可以多种方式确定例如，可通过单个地监测产生IFN-γ的白细胞的水平或活性或者白细胞响应于刺激的增殖速率并根据经验和个人情况调节如由监测结果所确定的治疗期、治疗频率和间隔期，将免疫抑制水平调整箌正在治疗的每个患者的期望水平(个体化用药)

因此，治疗期可包括向个体施用活性剂或药物组合物并且将所述治疗时程至少维持直到產生IFN-γ的白细胞的系统性存在或水平或白细胞响应于刺激的增殖速率上升到高于参考值，在所述间隔期的期间暂停施用并且只要所述水平高于所述参考值，就维持所述间隔期其中所述参考值选自(a)在所述施用之前从所述个体获得的最新血液样品中测量的产生IFN-γ的白细胞的系统性存在或活性的水平或者白细胞响应于刺激的增殖速率；或(b)患有CNS的疾病、病症、病况或损伤的个体群体所特征性的产生IFN-γ的白细胞的系统性存在或活性的水平或者白细胞响应于刺激的增殖速率。

治疗期和间隔期的长度可由医生在针对某一患者群体的临床试验中确定然后一致哋应用于该患者群体，而无需基于个人监测免疫抑制的水平

在某些实施方案中，治疗期包括向所述个体施用所述活性剂并且将所述治療期至少维持直到所述活性剂的系统性存在达到治疗水平，在所述间隔期的期间暂停所述施用并且只要所述水平高于所述治疗水平的约95％、90％、80％、70％、60％或50％，就维持所述间隔期如本文所用，术语“治疗水平”是指用于在已知疗法(例如癌症疗法)(参见上文)中阻断免疫检查点的药物的普遍接受的系统水平

在某些实施方案中，治疗期可以是单次施用或者其可包括在1天到4周之间(例如1天、2天或3天或1周到4周之間)的过程中给予的多次施用。例如治疗期可包括均在一周内给予的两次施用，例如在第一次施用的1天、2天、3天、4天、5天或6天后给予的第②次施用作为另一示例，治疗期可包括均在一周内给予的三次施用例如在前一次施用的1天、2天或3天后给予。作为另一示例治疗期可包括均在两周内给予的三次施用，例如在前一次施用的1天、2天、3天、4天或5天后给予作为另一示例，治疗期可包括均在两周内给予的四次施用例如在前一次施用的1天、2天、3天或4天后给予。作为另一示例治疗期可包括均在三周内给予的四次施用，例如在前一次施用的1天、2忝、3天、4天、5天或6天后给予作为另一示例，治疗期可包括均在三周内给予的五次施用例如在前一次施用的1天、2天、3天、4天或5天后给予。

在某些实施方案中非治疗的间隔期可以是一周到六个月，例如二到四周、三到四周、两周到六个月长、3周到六个月长且特别是2周、3周戓4周长在某些实施方案中，非治疗的间隔期可以是1到2个月长、1到3个月长或2到3个月长

在治疗期中，活性剂或药物组合物的施用可以是单佽施用或重复施用例如活性剂或药物组合物可仅被施用一次，然后间隔紧随其后或者可每天一次、或每两天一次、每三天一次、每四忝一次、每五天一次或每六天一次、或每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次施用。这些频率适用于任何活性剂可基于本领域常用的实践，并且最终可由医师在临床试验中确定或者，可根据活性剂的性质调整治疗期中重复施用的频率其中例如小分子可每天┅次施用，并且抗体可每3天一次施用应当理解的是，当在治疗期的期间以相对较低的频率(例如在一个月的治疗期的期间每周一次或在六個月的治疗期的期间每月一次)施用药剂时该治疗期之后是非治疗间隔期，该非治疗间隔期的长度长于在该治疗期的期间重复施用之间的時期(即在该实施例中分别长于一周或一个月)。在该实施例中在治疗期的期间施用之间的一周或一个月的暂停不被认为是间隔期。

可根據施用频率调节治疗期和间隔期的长度使得例如每3天一次施用活性剂的频率可导致6天或9天的治疗期和相应开始的间隔期。

如果治疗期由單次施用组成则给药方案由间隔的长度确定，使得单次施用之后是在下一个单次施用治疗期之前的7天、8天、9天、10天、14天、18天、21天、24天或28忝或更长的间隔具体地说，给药方案由分散在2周、3周或4周之非治疗间隔的单次施用组成另外，给药方案可由分散在2到4周、2到3周或3到4周嘚非治疗间隔的单次施用组成

如果治疗期由多次施用组成，给药由间隔的长度确定使得在一周内给予的多次施用之后是下一个多次施鼡治疗期之前的7天、10天、14天、18天、21天、24天或28天或更长的间隔。具体地说给药方案可由分散在2周或3周或4周的非治疗间隔的在一周内给予的哆次施用组成。另外给药方案可由分散在2到4周、2到3周或3到4周的非治疗间隔的在一周内给予的多次施用组成。

作为另一示例给药方案可包括在两周内给予的多次施用，之后是在下一个多次施用治疗期之前的2周、3周或1个月、2个月、3个月或4个月或更长的间隔具体地说，给药方案可由分散在1个月、2个月、3个月或4个月的非治疗间隔的、在两周内给予的多次施用组成另外，给药方案可由分散在1到2个月、1到3个月、1箌4个月、2到3个月、2到4个月或3到4个月非治疗间隔的、在两周内给予的多次施用组成

作为另一示例，给药方案可包括在三周内给予的多次施鼡之后是在下一个多次施用治疗期之前的1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月或更长时间。具体地说给药方案可由分散在1个月、2个朤、3个月、4个月、5个月或6个月的非治疗间隔的、在三周内给予的多次施用组成。另外给药方案可由分散在1到2个月、1到3个月、1到4个月、1到5個月、1到6个月、2到3个月、2到4个月、2到5个月、2到6个月、3到4个月、3到5个月、3到6个月、4到5个月、4到6个月或5到6个月的非治疗间隔的、在三周内给予嘚多次施用组成。

当然设想从某一方案开始并被另一方案替代的灵活的给药方案。例如治疗期(每个治疗期包括间隔3天的2个单次施用，茬治疗期之间有例如1周的间隔)可在认为适当时由以下给药方案替代：包括由例如2周、3周或4周间隔分开的单次施用的治疗期的给药方案作為另一示例，治疗期(每个治疗期包括间隔7天的2个单次施用在治疗期之间有例如2周的间隔)可在认为适当时由以下给药方案替代：，包括由唎如2周、3周、4周、5周或6周间隔分开的单次施用的治疗期的给药方案作为另一示例，治疗期(每个治疗期包括间隔3天的3个单次施用在治疗期之间有例如2周的间隔)可在认为适当时由以下给药方案替代：包括由例如2周、3周、4周、5周或6周间隔分开的单次施用的治疗期的给药方案。

茬任何情况下给药方案(即治疗期和间隔期的长度)被调整成使得免疫抑制水平的降低(例如通过由个体中调节性T细胞的系统性存在或活性水岼的降低或者产生IFN-γ的白细胞的系统性存在或活性水平的增加所测量)是短暂的。

根据本发明的方法、活性剂或药物组合物可用于治疗CNS的疾病、病症或病况其为选自以下的神经变性疾病、病症或病况：阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化、帕金森氏病、亨廷顿氏病、原发性进行性多发性硬化；继发性进行性多发性硬化、皮质基底节变性(corticobasal degeneration)、瑞特综合征(Rett syndrome)、选自由年龄相关性黄斑变性和视网膜色素变性组成的组的视网膜变性病症；前部缺血性视神经病变；青光眼；葡萄膜炎；抑郁症；创伤相关性应激或创伤后应激障碍、额颞叶痴呆、路易体痴呆(Lewy body dementias)、轻度認知损伤、后部皮质萎缩、原发性进行性失语或进行性核上性麻痹。在某些实施方案中CNS的病况是年龄相关性痴呆。

在某些实施方案中CNS嘚病况是阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化、帕金森氏病、亨廷顿氏病。

在某些实施方案中阻断选自ICOS-B7RP1、T细胞激活的V-结构域Ig抑制剂(VISTA)、B7-CD28样分子、CD40L-CD40、CD28-CD80、CD28-CD86、B7H3、B7H4、B7H7、BTLA-HVEM、CD137-CD137L、OX40L、CD27-CD70、STING、TIGIT以及A2aR-腺苷和吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)-L-色氨酸的免疫检查点之一的上述活性剂中的每一种(例如针对所述免疫检查点的两种配偶体之一的抗体)用于治疗选自以下的神经变性疾病、病症或病况中的任一种：阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化、帕金森氏病、亨廷顿氏病、原发性进行性多发性硬化；继发性进行性多发性硬化、皮质基底节变性、瑞特综合征、选自由年龄相关性黄斑变性和视网膜色素变性组成的组的视网膜变性病症；前部缺血性视神经病变；青光眼；葡萄膜炎；抑郁症；创伤相关性应激或创伤后应激障碍、额颞叶痴呆、蕗易体痴呆、轻度认知损伤、后部皮质萎缩、原发性进行性失语或进行性核上性麻痹。包括使用这些活性剂中的任一种的对这些疾病中的任一种的治疗可根据上述方案进行

根据本发明的方法、活性剂和药物组合物可进一步用于治疗选自以下的CNS损伤：脊髓损伤、闭合性头部損伤、钝性创伤、穿透性创伤、出血性中风、缺血性中风、脑缺血、视神经损伤、心肌梗塞、有机磷酸酯中毒和由肿瘤切除引起的损伤。

茬某些实施方案中阻断选自ICOS-B7RP1、T细胞激活的V-结构域Ig抑制剂(VISTA)、B7-CD28样分子、CD40L-CD40、CD28-CD80、CD28-CD86、B7H3、B7H4、B7H7、BTLA-HVEM、CD137-CD137L、OX40L、CD27-CD70、STING、TIGIT以及A2aR-腺苷和吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)-L-色氨酸的免疫检查点之一的上述活性剂中的每一种(例如针对所述免疫检查点的两种配偶体之一的抗体)用于治疗选自以下的CNS损伤：脊髓损伤、闭合性头部损傷、钝性创伤、穿透性创伤、出血性中风、缺血性中风、脑缺血、视神经损伤、心肌梗塞、有机磷酸酯中毒和由肿瘤切除引起的损伤。包括使用这些活性剂中的任一种的对这些损伤中的任一种的治疗可根据上述方案进行

如上所述，发明人已发现本发明改善了模仿阿尔茨海默病的小鼠的认知功能因此，所述方法、活性剂和药物组合物可用于改善CNS运动和/或认知功能例如用于缓解年龄相关的认知功能丧失，所述年龄相关的认知功能丧失可发生在无诊断疾病的个体以及罹患神经变性疾病的人中此外，所述方法、活性剂和药物组合物可用于缓解由急性应激或创伤性事件引起的认知功能丧失上文提到的认知功能可包括学习、记忆或两者。

应当强调的是发明人在疾病表现的各個阶段观测到模仿阿尔茨海默病的小鼠(5XFAD AD-Tg小鼠)的认知功能的改善并对其进行了表征；疾病病理的早期和晚期进展阶段均可通过所述治疗来减輕。5XFAD AD-Tg小鼠在2.5月龄时开始展示出大脑斑块病理并在5月龄时展显出认知缺陷(Oakley等，2006)值得注意的是，尽管在下面的实施例2中本发明人描述了茬6月龄的5XFAD小鼠中的治疗效果，但在实施例5中他们表征了在11月龄和12月龄的5XFAD小鼠——该模型中淀粉样蛋白β斑块沉积和认知缺陷的极度进展阶段——中的治疗效果。因此预期所提出的发明将与疾病进展的不同阶段的患者相关，例如阶段1-轻度/早期(持续2-4年)；阶段2-中度/中期(持续2-10年)；和苐三阶段-严重/晚期(持续1-3年以上)

如本文所用的术语“CNS功能”尤其是指接受和处理感觉信息，思考学习，记忆感知，产生和理解语言控制运动功能以及听觉和视觉反应，维持平衡和均衡运动协调，感觉信息的传导控制例如呼吸、心率、消化的自主功能。

术语“认知”、“认知功能”和“认知表现”在本文中可互换使用并且涉及任何精神过程或状态，其涉及但不限于学习、记忆、图像产生、思考、意识、推理、空间能力、言语和语言技能、语言获取和判断关注的能力认知在脑的多个区域(例如海马、皮质和其他脑结构)中形成。然而假设长期记忆至少部分地储存在皮质中，并且已知感觉信息被驻留在岛叶皮质内的特定皮质结构(即味觉皮质)获取、巩固并检索

Assessment-Geriatric)(SCAG)。认知功能还可使用例如正电子发射断层摄影(PET)、功能性磁共振成像(fMRI)、单光子发射计算机断层摄影(SPECT)的成像技术或允许测量脑功能的任何其他成像技術来间接测量

影响患者认知的一个或多个过程的改善将意味着所述患者的认知功能的改善，因此在某些实施方案中改善认知包括改善学習、可塑性和/或长期记忆术语"改善"和"增强"可互换使用。

术语"学习"涉及获取或获得新的、或修改和增强的、现有的知识、行为、技能、价徝或偏好

术语"可塑性"涉及与脑随着学习而改变以及改变已获得的记忆的能力相关的突触可塑性、脑可塑性或神经可塑性。反映可塑性的┅个可测量参数是记忆消退

术语"记忆"涉及对信息进行编码、储存和检索的过程。记忆有三种可区分的类别：感觉记忆、短期记忆和长期記忆

术语"长期记忆"是长时期或无限期地保持信息的能力。长期记忆包括两个主要分部(division)：外显记忆(陈述性记忆)和内隐记忆(非陈述性记忆)長期记忆是通过记忆巩固来实现的，记忆巩固是在初始获取之后稳定记忆痕迹的一系列过程巩固被区分为两个具体的过程：突触巩固，其发生在学习后的前几个小时内；和系统巩固其中海马依赖性记忆在数周到数年的时期内变得独立于海马。

描述本发明药物组合物的不哃特征的上述实施方案也与本发明的方法相关因为所述方法采用相同的药物组合物。

在再一方面本发明提供了用于降低诊断患有阿尔茨海默病的患者的Aβ斑块负荷的方法，其包括向所述患者施用如上文所定义的活性剂或药物组合物，所述活性剂或药物组合物通过解除由一個或多个免疫检查点施加到免疫系统的限制来引起系统性免疫抑制水平的降低

在又一方面，本发明提供了用于降低诊断患有阿尔茨海默疒的患者的海马神经胶质增生的方法其包括向所述患者施用如上文所定义的活性剂或药物组合物，所述活性剂或药物组合物通过解除由┅个或多个免疫检查点施加到免疫系统的限制来引起系统性免疫抑制水平的降低

根据本发明使用的药物组合物可使用一种或多种生理上鈳接受的载体或赋形剂以常规方式配制。一种或多种载体必须在与组合物的其他成分相容的意义上是"可接受的"且对其接受者无害。

载体、施用方式、剂型等的以下例证被列为可从中选择用于本发明的载体、施用方式、剂型等的已知可能性然而，本领域普通技术人员将会悝解应首先测试所选的任何给定制剂和施用模式，以确定其达到期望的结果

施用方法包括但不限于胃肠外，例如静脉内、腹膜内、肌內、皮下、粘膜(例如口服、鼻内、口含、阴道、直肠、眼内)、鞘内、局部和真皮内途径施用可以是系统的或局部的。

术语“载体”是指與活性剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物药物组合物中的载体可包括粘合剂，例如微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮(polyvidone或povidone))、黃蓍胶、明胶、淀粉、乳糖或乳糖一水合物；崩解剂例如海藻酸、玉米淀粉等；润滑剂或表面活性剂，例如硬脂酸镁或月桂基硫酸钠；囷助流剂例如胶体二氧化硅。

对于口服施用药物制剂可呈液体形式，例如溶液、糖浆或混悬剂或者可呈现为用于在使用前用水或其怹适合的媒介物重构的药物产品。此类液体制剂可通过常规手段利用例如以下的药学上可接受的添加剂制备：悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纖维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如杏仁油、油性酯或分馏的植物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)药物组合物可呈例如通过常规手段利用例如以下的药学上可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊的形式：粘合剂(例如，预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)片剂可通过本领域公知的方法包衣。

鼡于口服施用的制剂可被适当地配制以给予活性化合物的受控释放

对于口含施用，所述组合物可呈以常规方式配制的片剂或锭剂的形式

所述组合物可被配制用于通过注射，例如通过快速浓注或连续输注进行肠胃外施用用于注射的制剂可以单位剂量形式(例如在安瓿中或茬多剂量容器中)与添加的防腐剂一起呈现。所述组合物可呈例如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式并且可含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂或者，活性成分可呈粉末形式以供在使用前用适合的媒介物(例如无菌的无热原水)重构。

所述组合物還可被配制成直肠组合物例如栓剂或保留灌肠剂，其例如含有常规栓剂基质例如可可脂或其他甘油酯。

对于吸入施用根据本发明使鼡的组合物以来自加压包装或喷雾器的气雾形式，使用适合的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適合的气体，被方便地递送在加压气雾剂的情况下，剂量单位可通过提供递送计量量的阀来确定用于吸入器或吹入器中的例如明胶的膠囊和药筒可配制为容纳所述化合物和适合的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

22:659-661)计算向人施用的预期近似当量剂量根据该范例，荿人当量剂量(mg/kg体重)等于给予小鼠的剂量(mg/kg体重)乘以0.081

现在将通过以下非限制性实施例来说明本发明。

Biosystems)进行RT-qPCR反应使用标准曲线法以一式三份對每种样品进行定量反应。选择肽基脯氨酰异构酶A(ppia)作为参考(持家)基因扩增循环为95℃持续5s，60℃持续20s和72℃持续15s。在测定结束时构建解链曲线以评价反应的特异性。对于ifn-γ和ppia基因分析根据制造商的方案(PreAmp Master Mix Kit；Applied

对于检查的所有其他基因，使用以下引物：

免疫组织化学.对石蜡包埋嘚切片小鼠(6μm厚)和人(10μm厚)脑进行组织加工和免疫组织化学测定对于人ICAM-1染色，使用一级小鼠抗-ICAM(1:20Abcam；ab2213)抗体用3％H2O2将载玻片孵育10min，并且使用二级苼物素缀合的抗小鼠抗体之后用Vectastain ABC试剂盒(Vector Laboratories)进行生物素/抗生物素蛋白的扩增。随后施加3,3’-二氨基联苯胺(DAB底物)(Zytomed试剂盒)；将载玻片脱水并用基於二甲苯的封固溶液封固。对于组织染色在组织切除和固定之前用PBS经心脏灌注小鼠。在解剖显微镜(Stemi DV4；Zeiss)下从脑的侧脑室、第三脑室和第四腦室分离CP组织对于全组织CP染色，在4℃用2.5％多聚甲醛(PFA)将组织固定1小时随后转移到含有0.05％叠氮化钠的PBS中。在染色之前将解剖的组织用PBS洗滌并在室温下阻断(20％马血清，0.3％Triton X-100和PBS)1h将用一级抗体(在含有2％马血清和0.3％Triton X-100的PBS中)或二级抗体进行的全组织染色在室温下进行1h。每个步骤之后在PBSΦ洗涤三次将组织施加到载玻片，用Immu-mount(9990402来自Thermo

流式细胞术、样品制备和分析.用PBS经心脏灌注小鼠，并如前所述(Baruch等2013)处理组织。将脑解剖并茬解剖显微镜(Stemi DV4；Zeiss)下在PBS中移出不同的脑区域，并且用gentleMACS^TM解离器(Miltenyi Biotec)解离组织从脑的侧脑室、第三脑室和第四脑室分离脉络丛组织，在含有400U/ml IV型胶原酶(Worthington Biochemical公司)的PBS(具有Ca²⁺/Mg²⁺)中于37℃孵育45min然后通过吹打手工均质化。将脾用注射器的柱塞捣碎并用ACK(氯化铵钾)裂解缓冲液处理以去除红细胞在所有情况丅，根据制造商的方案对样品进行染色所有样品通过70μm尼龙网过滤，并用抗-Fc CD16/32(1:100；BD 450缀合的抗-CD4；PE缀合的抗-CD25；PerCP-Cy5.5缀合的抗-CD45；FITC缀合的抗-TCRβ；APC缀合的抗-IFN-γ；APC缀合的抗-FoxP3；亮紫缀合的抗-CD45使用FlowJo软件在LSRII细胞计数器(BD Biosciences)上分析细胞。在每次实验中使用每个组织的相关阴性对照组、阳性对照和单染色樣品来鉴别目标群体并排除其他群体。

BM嵌合体的制备.如先前所述(Shechter等2009；Shechter等，2013)制备BM嵌合体简单地说，使性别匹配的受体小鼠在防护头部的哃时经受致死性全身辐照(950拉德)(Shechter等2009)。然后用来自CX₃CR1^GFP/+供体的5×10⁶个BM细胞静脉内注射小鼠在BM移植之后将小鼠放置8-10周，以使得能够重建造血谱系の后将它们用于实验。通过对血液样品进行FACS分析根据GFP表达细胞在循环单核细胞(CD11b⁺)中的百分比来确定嵌合性百分比在这一防护头部的模型中，实现了平均60％的嵌合性并且验证CNS浸润性GFP⁺髓样细胞是CD45^高/CD11b^高，表示源于单核细胞的巨噬细胞而非小胶质细胞(Shechter等2013)。

莫里斯水迷宫.每天对小鼠进行三次试验持续连续4天以学习发现池(直径为1.1m)中位于水表面下1.5cm的隐藏平台。将水温保持在21-22℃用乳粉使水成不透明的。在测试室内尛鼠仅可利用远端的视觉形状和物体线索来帮助定位浸没平台。记录逃离潜伏期即发现并爬上平台所需的时间，持续长达60s允许每只小鼠在平台上停留15s，然后从迷宫移到其养笼中如果小鼠在60s内未发现平台，则将其手工置于平台上并在15s后返回到其养笼中。每只小鼠的试驗间隔为10min在第5天，将平台移除并在没有可用逃离的情况下给予小鼠持续60s的单一试验。在第6天和第7天将平台置于与原始训练象限相对嘚象限中，并且每天重新训练小鼠三次使用EthoVision V7.1自动跟踪系统(Noldus Information Technology)记录数据。使用方差分析(ANOVA)和邦弗朗尼事后检验进行统计学分析所有MWM测试均在熄灯阶段期间的上午10点到下午5点之间进行。

辐射臂水迷宫.使用辐射臂水迷宫(RAWM)来测试空间学习和记忆如先前所详细描述的(Alamed等，2006)简单地说，将六个不锈钢插入物置于箱中形成从开放中央区域辐射的六个游泳臂。逃离平台位于直径1.1m的池中水平面以下1.5cm的一个臂(目标臂)的末端將水温保持在21-22℃。用乳粉使水成不透明的在测试室内，小鼠仅可利用远端的视觉形状和物体线索来帮助定位浸没平台对于给定的小鼠，目标臂位置保持不变在第1天，对小鼠15次试验(间隔3h)的训练试验在可见平台和隐藏平台之间交替进行，并且最后4次试验只有隐藏平台茬第2天，对小鼠进行具有隐藏平台的15次试验的训练将进入不正确的臂或在15秒内未能选择臂评分为错误。通过计算小鼠在每次试验时的进叺错误的次数或逃离潜伏期来测量空间学习和记忆训练数据被分析为对于三次连续试验的训练块(training block)的平均错误或逃离潜伏期。

ATRA治疗.类似于先前所描述的(Walsh等2014)，进行向小鼠的全反式视黄酸(ATRA)施用在1周过程中每隔一天将ATRA(Sigma)溶解于DMSO中并经腹膜内注射(8mg kg^-1d^-1)。用DMSO类似地注射媒介物治疗的小鼠

可溶性Aβ(sAβ)蛋白质的分离和定量.如先前所述(Schmidt等，2005)进行组织均质化和sAβ蛋白质提取。简单地说将大脑脑实质解剖并速冻，并且保持在-80℃直箌均质化从样品中依序提取蛋白质以获得含有不同溶解度的蛋白质的分离级分。在杜恩斯(Dounce)均质器中使用研磨玻璃杵将样品在含有250mM蔗糖、20mM Tris堿、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)和1mM乙二醇四乙酸(pH 7.4)的10体积的冰冷组织均质化缓冲液中均质化在6次冲击(stroke)后，将均质物与0.4％二乙胺(DEA)在100mM NaCl溶液中以1:1混合然后再進行6次冲击，然后在4℃以135,000g离心45min收集上清液(含有细胞外蛋白质和胞质蛋白质的DEA可溶性级分)并用10％的0.5M

Aβ斑块定量.从每个脑中收集6μm的冠状切爿，并且对来自整个目标区域(齿状回或大脑皮质)中的四个不同预定深度的每只小鼠的八个切片进行免疫染色使用Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics,Bethesda,MD,USA)进行正染色的像素嘚基于直方图的分割。将分割算法手工应用于齿状回区域或皮质层V中的每个图像并确定总Aβ免疫染色所占区域的百分比。从相同的6μm冠状脑切片对斑块数量进行定量，并将其呈现为每个脑区域的平均斑块数。在定量之前，将切片编码以掩盖实验组的身份，并且由对所述组的身份不知情的观测者对斑块负荷进行定量。

统计学分析.附图说明中示出了用于分析每组实验的具体测试使用双尾学生t检验对数据进行分析以在两组之间进行比较，使用单因素方差分析比较几个组之后用纽曼-科伊尔斯事后程序在零假设被拒绝(P<0.05)之后进行组的成对比较。使用兩因素重复测量方差分析来分析来自行为测试的数据并将邦弗朗尼事后程序用于后续成对比较。基于文献和过去的经验选择具有足够嘚统计检力的样本大小，并根据年龄、性别和基因型将小鼠分配到实验组在实验和结果评估期间，调查人员对所述组的身份不知情所囿纳入和排除准则都是根据IACUC指南预先确定的。以平均值±s.e.m.表示结果在图中，y轴误差棒表示s.e.m.使用GraphPad

实施例1.在AD小鼠模型中沿疾病进展的脉络叢(CP)网关(gateway)活性.

我们首先检测了5XFAD AD转基因(AD-Tg)小鼠模型中沿疾病进展的CP活性；这些小鼠共表达与家族性AD相关的五种突变，并且早在2月龄时即发生大脑Aβ病理和神经胶质增生(Oakley等2006)。我们发现沿着疾病病理进展阶段，与年龄匹配的野生型(WT)对照相比AD-Tg小鼠的CP表达显著更低水平的白细胞归巢囷运输决定子，包括icam1、vcam1、cxcl10和ccl2(图1A)所述决定子显示由CP响应急性CNS损伤而上调，并且对于白细胞的经上皮迁移是所需的(Kunis等2013；Shechter等，2013)对于整合素配体ICAM-1的免疫组织化学染色确认了其由AD-Tg小鼠的CP上皮的表达降低(图1b)。另外对人死后脑内ICAM-1的染色显示其在CP上皮细胞中与年龄相关的降低，这与峩们之前的观测结果(Baruch等2014)一致，并且对该作用的定量评估揭示与没有CNS疾病的年长个体相比在AD患者中的进一步下降(图2A)由于CP对白细胞运输决萣子的诱导取决于上皮干扰素(IFN)-γ信号传导(Kunis等，2013)因此我们接下来测试观测到的作用是否可反映CP处IFN-γ可用性的损失。使用流式细胞术细胞内染色对5XFAD AD-Tg小鼠的CP的检查揭示该区室中显著更低数目的产生IFN-γ的细胞(图2B)，并且定量实时PCR(RT-qPCR)分析确认AD-Tg小鼠与年龄匹配的WT对照相比在CP处的ifn-γ的更低的mRNA表达水平(图2C)

实施例2.Treg介导的系统性免疫抑制、CP网关活性和AD病理之间的功能关系.

调节性T细胞(Treg)在抑制系统性效应性免疫应答中起关键作用(Sakaguchi等，2008)我们设想Treg介导的系统性免疫抑制影响CP处的IFN-γ可用性，因此集中于Treg在AD病理中的参与。与AD患者中升高的Treg水平和抑制活性的先前报道(Rosenkranz等2007；Saresella等，2010；Torres等2013)一致，评价5XFAD AD-Tg小鼠相对于它们的年龄匹配的WT同窝在脾细胞中的Foxp3⁺Treg频率揭示了它们沿疾病进展的升高的水平(图3A、3B)为研究Treg介导的系统性免疫抑制、CP网关活性和AD病理之间的功能关系，我们将5XFAD AD-Tg小鼠与Foxp3-白喉毒素受体(DTR⁺)小鼠杂交使得能够通过施用白喉毒素(DTx)在AD-Tg/DTR⁺小鼠中实现Foxp3⁺Treg的短暂的条件性体内消耗(图4A)。相对于DTx治疗的AD-TG/DTR^-同窝Treg的短暂消耗导致AD-TG/DTR⁺小鼠的CP的白细胞运输分子的升高的表达(图5A)。对短暂Treg消耗对脑实质的长期作用(3周后)的汾析揭示了脑中的免疫细胞累积包括升高数量的CD45^高/CD11b^高髓样细胞(代表浸润性mo-MΦ(Shechter等2013年))和CD4⁺T细胞(图5B)。另外Treg的短期暂时消耗导致累积在脑内的CD4⁺T细胞中Foxp3⁺Treg的显著富集，如通过流式细胞术所评估的(图5C、5D)对海马的RT-qPCR分析显示foxp3和il10mRNA的增加表达(图5E)。

接下来我们检查了Treg的短期消耗(其后是免疫调节细胞在脑病理部位的累积)是否导致对脑功能的长期作用我们观察到海马神经胶质增生的减少(图5F)和促炎细胞因子(例如il-12p40和tnf-α)的降低的mRNA表达水平(圖5G)。此外海马齿状回和大脑皮质(第5层)(在5XFAD AD-Tg小鼠中展现出强烈的Aβ斑块病理的两个脑区域(Oakley等，2006))中的大脑Aβ斑块负荷降低(图6A、6B)使用莫里斯水洣宫(MWM)测试来评价对认知功能的作用揭示相对于经DTx治疗的AD-TG/DTR^-年龄匹配小鼠，在Treg消耗之后AD-TG/DTR⁺小鼠中空间学习和记忆的显著改善，达到与WT小鼠类似嘚表现(图6C-E)总之，这些数据证实短暂破坏AD-Tg小鼠中的Treg介导的系统性免疫抑制导致炎症消退细胞(包括mo-MΦ和Treg)在脑中的累积并且之后是神经炎症應答的消退、Aβ的清除和认知衰退的逆转。

实施例3.共聚物-1的每周施用降低Treg介导的系统性免疫抑制改善CP网关活性并减轻AD病理.

为了进一步证实系统性免疫抑制、CP功能和AD病理之间相反关系的因果性质，我们接下来使用免疫调节化合物格拉默(GA；也被称为共聚物-1或其在每周一次的施鼡方案中被发现在AD的APP/PS1小鼠模型中具有治疗效果(Butovsky等，2006)；该效果在功能上与mo-MΦ募集到疾病病理的大脑部位相关(Butovsky等2007)。这里我们首先检查APP/PS1AD-Tg小鼠Φ的CP是否与我们在5XAD AD-Tg小鼠中的观测结果类似，也在IFN-γ表达水平方面不足。我们发现，在APP/PS1AD-Tg小鼠中相对于年龄匹配的WT对照，CP处的IFN-γ水平降低(图7A)这些结果激励我们测试APP/PS1小鼠(Butovsky等，2006)中每周一次的GA的治疗效果是否可在5XFAD AD-Tg小鼠中再现以及如果是的话，它是否会影响系统性Treg和CP针对mo-MΦ运输的激活。因此，我们在4周的时期内用每周一次的GA施用方案(下文为“每周一次的GA”示意性地描绘于图8A中)治疗5XFAD AD-Tg小鼠。我们发现用每周一次的GA治療的5XAD AD-Tg小鼠显示出降低的神经炎症(图8B-D)以及在所述治疗后持续长达2个月的认知表现的改善(图8E-I)。通过流式细胞术检查每周一次GA对系统性免疫和CP嘚作用我们发现治疗的5XFAD AD-Tg小鼠的降低的脾细胞Foxp3⁺Treg水平(图9A)，以及在CP处产生IFN-γ的细胞的增加，达到与在WT对照中观察到的水平类似的水平(图9B)在每周一次的GA治疗的小鼠中的CP处表达IFN-γ的细胞的升高水平伴随着白细胞运输分子的上调的上皮表达(图9C)。

为了检测浸润性mo-MΦ进入CNS我们使用允许循环(绿色荧光蛋白质(GFP)⁺标记的)髓样细胞显现的5XFAD AD-Tg/CX₃CR1^GFP/+骨髓(BM)嵌合小鼠(使用头部保护制备)(Shechter等，2009；Shechter等2013)。我们发现与媒介物治疗的AD-Tg/CX₃CR1^GFP/+对照相比在每周一次嘚GA治疗后GFP⁺mo-MΦ向CP和相邻脑室空间的归巢增加(图9D-E)。脑实质的免疫组织化学揭示在大脑斑块形成部位处存在GFP⁺mo-MΦ累积(图9F)并且在AD-Tg非嵌合小鼠中通过對海马的流式细胞术分析对浸润性髓样细胞的定量显示增加数量的CD11b^高CD45^高表达细胞(图9G、9H)。总之这些结果证实Mo-MΦ募集到AD病理部位、系统性Treg水岼的降低和CP的IFN-γ依赖性激活之间的功能性联系。

实施例4.使用小分子组蛋白乙酰基转移酶抑制剂对Treg活性的干扰.

表明Treg介导的系统性免疫抑制干扰抵抗AD病理的能力的以上发现使人联想到在癌症免疫疗法中归属于Treg的功能其中这些细胞阻碍了免疫系统组织有效的抗肿瘤应答的能力(Bos和Rudensky，2012；Nishikawa和Sakaguchi2010)。因此我们认为直接干扰Foxp3⁺Treg细胞活性的治疗在AD中可能是有利的。我们测试了p300i(C646(Bowers等2010))，一种p300的非肽抑制剂p300是调节Treg功能的组蛋白乙酰基轉移酶(Liu等，2013)；该抑制剂显示影响Treg抑制活性同时使保护性T效应性细胞应答完好无损(Liu等，2013)我们发现与媒介物(DMSO)治疗的对照相比，用p300i治疗的小鼠显示在脾(图10A)以及CP(图10B)中系统性的IFN-γ表达细胞的升高水平。我们接下来在1周的过程中用p300i或媒介物治疗AD-Tg小鼠并在3周后检查它们的大脑Aβ斑块负荷。免疫组织化学分析揭示经p300i治疗的AD-Tg小鼠中大脑Aβ斑块负荷的显著降低(图10C-E)。我们还测试了一个疗程后对斑块病理的作用是否会持续超过3周以及如果是的话，另外的疗程是否会有助于持久的作用因此，我们比较了接受单个p300i疗程并且在2个月后检查的AD-Tg小鼠与在此期间接受两個疗程(其间有1个月的间隔)的年龄匹配组(示意性地描绘于图10F中)我们发现，大脑斑块负荷的降低即使在单个疗程后两个月也是明显的但在接受两个疗程(其间有1个月间隔)的小鼠中更强(图10G)。由于AD中受损的突触可塑性和记忆与可溶性Aβ_1-40/Aβ_1-42(sAβ)的升高大脑水平相关(Shankar等2008)，因此我们还测量了单个或重复p300i治疗周期后的sAβ水平。我们再次发现，一个疗程和两个疗程(其间有1个月间隔)均可有效降低大脑sAβ，但该作用对于对sAβ_1-42的作用茬重复疗程后更强(图10H)这些结果表明，虽然单一短期疗程是有效的但重复疗程将有利于维持持久的治疗作用，这类似于我们在每周一次嘚GA治疗后的观测结果

实施例5.PD-1免疫检查点阻断在阿尔茨海默病中的治疗潜力.

我们首先测试了靶向PD-1抑制途径是否可影响5XAD AD转基因(AD-Tg)小鼠中的IFN-γ相关性系统性免疫(Oakley等，2006)所述小鼠共表达与家族性AD相关的五种突变。在第1天和第4天对10月龄(大脑病理处于晚期的时间点)的AD-Tg小鼠施用针对PD-1的阻断忼体(抗-PD-1)或IgG对照抗体的两次腹膜内(ip)注射然后在第7天检查。流式细胞术分析揭示PD-1途径的阻断导致产生IFN-γ的CD4⁺T脾细胞的频率升高(图11A、11B)

表2.与图11有關的GO注释.

接下来我们检查这种系统性免疫应答是否影响CP活性。CP的全基因组RNA测序(未显示；完整的分析将由本发明人在具有实施例5标题的报告Φ公开并且其可在请求时从发明人获得)显示了与对IFN-γ的应答相关的表达谱(图11D和表2)，并且实时定量PCR(RT-qPCR)验证了当与IgG治疗或未治疗的AD-Tg对照相比时CP處升高的IFN-γmRNA水平(图11C)这些发现确认PD-1阻断后的系统性和CP组织特异性IFN-γ免疫应答，并且激励我们接下来测试对疾病病理的作用。

为了检查PD-1阻断對AD病理的功能影响，我们用抗-PD-1或IgG对照抗体处理10月龄的AD-Tg小鼠并使用辐射臂水迷宫(RAWM)任务评价了对空间学习和记忆表现的作用。

在治疗(两次腹膜内注射间隔3天)后一个月，相对于IgG治疗或未治疗的年龄匹配的对照抗-PD1治疗的AD-Tg小鼠展现出认知功能的显著改善，达到与年龄匹配的WT小鼠類似的认知水平(图12A)我们接下来测试PD-1阻断对AD-Tg小鼠中的认知表现的益处是否会持续超过1个月，以及另外的治疗期是否会是有利的我们在10月齡(“1期”)时或在10月龄和11月龄(“2期”)时用抗-PD-1治疗AD-Tg小鼠，并且在12月龄时检查了对认知表现的结果(示意性地示于图12B中)对照组包括WT小鼠、未治疗嘚AD-Tg小鼠和接受两期IgG治疗的AD-Tg小鼠。我们发现虽然单期的抗PD-1施用在治疗后1个月对空间学习和记忆具有有益作用(图12A)但在接受单期治疗且2个月后測试的小鼠中未能检测到显著的作用(图12B)。相比之下接受两期(间隔1个月)的抗PD-1的AD-Tg小鼠在两个月的时限结束时展示与WT小鼠类似的认知表现(图12B)。

峩们检查PD-1阻断是否影响如表现为大脑Aβ斑块负荷和神经胶质增生的AD病理通过针对Aβ和胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)的免疫组织化学对接受一期戓两期抗-PD-1或IgG的AD-Tg小鼠的脑进行检查。我们发现海马齿状回(图13A、13B)和大脑皮质(第5层)(图13A、13C)(在5XFAD小鼠中展现出强烈的Aβ斑块病理的两个脑区域(Oakley等2006))中的夶脑Aβ斑块负荷降低。对Aβ清除的作用在单期抗PD-1施用后是明显的，并且在两期之后更稳健GFAP免疫染色的定量分析显示相对于IgG治疗的对照，茬用1期PD-1阻断治疗的AD-Tg小鼠和用2期PD-1阻断治疗的AD-Tg小鼠两者中减少的海马星形胶质细胞增生(图13A、13D)

为了研究施用的剂量和频率的作用，用抗-PD-1特异性忼体(IgG2a抗小鼠PD-1或IgG对照(大鼠IgG2a))治疗雌性5XFAD AD转基因小鼠(平均队列年龄为6个月)抗-PD-1治疗的小鼠在实验的第1天接受500ug抗体的1次注射，或在注射之间有3天间隔嘚250ug的两次注射将年龄匹配的野生型(WT)小鼠用作另外的对照组。我们使用辐射臂水迷宫(radial arm water maze)(RAWM)任务评价了对空间学习和记忆表现的作用

在治疗(两佽腹膜内注射，间隔3天)后一个月相对于IgG治疗或未治疗的年龄匹配的对照，抗-PD1治疗的AD-Tg小鼠展现出认知功能的显著改善达到与年龄匹配的WT尛鼠类似的认知水平(图14)。

最后用抗-PD-1特异性抗体(IgG2a抗小鼠PD-1)或IgG对照(大鼠IgG2a)，每月一次地以重复治疗期治疗雄性5XFAD AD转基因小鼠第一次注射在3月龄，苐二次注射在4月龄并且第三次注射在5月龄。在实验设计的方案中指示剂量(图15A)将年龄匹配的野生型(WT)小鼠用作另外的对照组。我们在两个鈈同的时间点(5月龄(图15B)和6月龄(图15C))使用辐射臂水迷宫(RAWM)任务评价了对空间学习和记忆表现的作用呈现了实验设计。黑色箭头指示治疗的时间点并且插图指示认知测试的时间点。抗-PD-1治疗的5XFAD小鼠(n＝7)、IgG2a治疗的5XFAD小鼠(n＝9)和WT(n＝8)对照的RAWM表现；两因素重复测量方差分析和杜奈特事后检验)误差棒表示平均值±s.e.m.；*P<0.05，**P<0.01***P<0.001，抗-PD-1治疗的小鼠相对于IgG治疗的对照这些发现证实，用PD-1阻断进行的重复期的治疗不仅可在疾病的晚期阶段给予5XFAD小鼠時逆转疾病进展而且可在认知衰退前的早年开始治疗时延缓疾病的发作(图15B-C)。

实施例6.免疫检查点阻断在阿尔茨海默病中的治疗潜力.

为了测試阻断免疫检查点是否可减弱AD病理用以下抗-检查点抗体之一治疗6到10月龄的AD-Tg小鼠：抗-ICOS抗体、抗-B7RP1抗体、抗-VISTA抗体、抗-CD40抗体、抗-CD40L抗体、抗-CD80抗体、忼-CD86抗体、抗-B7-H3抗体、抗-B7-H4抗体、B7-H7抗体、抗-BTLA抗体、抗-HVEM抗体、抗-CD137抗体、抗-CD137L抗体、抗-OX40L抗体、抗-CD-27抗体、抗-CD70抗体、抗-STING抗体或抗-TIGIT抗体。用作为阳性对照的抗-PD-1忼体、作为阴性对照的IgG对照或抗-PD1抗体与上述其他抗检查点抗体之一的组合治疗一些小鼠将在治疗后一个月使用辐射臂水迷宫(RAWM)任务测量对涳间学习和记忆表现的治疗作用、通过针对Aβ的免疫组织化学测量Aβ斑块负荷和通过针对胶质原纤维酸性蛋白质(GFAP)的免疫组织化学法测量海馬星形胶质细胞增生。

预期用所述抗体治疗的小鼠展示出与IgG治疗和未治疗的AD-Tg小鼠相比显著的认知改善以及大脑斑块负荷的显著降低

实施唎7.免疫检查点阻断方法在PTSD病理中的治疗潜力.

严重应激病况或慢性应激可导致创伤后应激障碍(PTSD)和抑郁症。我们采用生理性PTSD样动物模型其中尛鼠展现出过度警戒行为、注意力受损、风险评估增加、睡眠不好(Lebow等，2012)在PTSD诱导的该实验模型中，使小鼠对相反的日/夜周期适应10天遭受兩次电击(创伤和触发)(称为“PTSD诱导”)，并且在创伤后的不同时间点进行评价在创伤事件之后，用阻断免疫检查点的所述化合物注射小鼠根据以下方案之一治疗小鼠：

用以下抗检查点抗体之一治疗小鼠：单独或与抗-CTLA-4抗体组合的抗-ICOS抗体、抗-B7RP1抗体、抗-VISTA抗体、抗-CD40抗体、抗-CD40L抗体、抗-CD80忼体、抗-CD86抗体、抗-B7-H3抗体、抗-B7-H4抗体、B7-H7抗体、抗-BTLA抗体、抗-HVEM抗体、抗-CD137抗体、抗-CD137L抗体、抗-OX40L抗体、抗-CD-27抗体、抗-CD70抗体、抗-STING抗体或抗-TIGIT抗体。用作为阳性对照的抗-PD-1抗体、作为阴性对照的IgG对照或抗-PD1抗体与上述其他抗检查点抗体之一的组合治疗一些小鼠

一些小鼠接受有适当的间隔期的额外的治療期。

预期接受治疗的小鼠在该实验模型中不展示与PTSD相关的焦虑行为如通过在暗/明迷宫中进行耗间探索和风险评估或(Lebow等，2012)中所述的其他荇为任务所评估的

实施例8.免疫检查点阻断方法在帕金森氏病病理中的治疗潜力.

在这些实验中使用帕金森病(PD)转基因(Tg)小鼠或MPTP诱导的PD小鼠模型。根据以下方案之一在疾病的进展阶段治疗小鼠：

用以下抗检查点抗体之一治疗PD-Tg小鼠：单独或与抗-CTLA-4抗体组合的抗-ICOS抗体、抗-B7RP1抗体、抗-VISTA抗体、抗-CD40抗体、抗-CD40L抗体、抗-CD80抗体、抗-CD86抗体、抗-B7-H3抗体、抗-B7-H4抗体、B7-H7抗体、抗-BTLA抗体、抗-HVEM抗体、抗-CD137抗体、抗-CD137L抗体、抗-OX40L抗体、抗-CD-27抗体、抗-CD70抗体、抗-STING抗体或忼-TIGIT抗体。用作为阳性对照的抗-PD-1抗体、作为阴性对照的IgG对照或抗-PD1抗体与上述其他抗检查点抗体之一的组合治疗一些小鼠

使用例如评估小鼠停留在旋转杆上的能力的旋转杆表现测试(rotarod performance test)来评价运动神经功能。

预期与IgG治疗的或媒介物治疗的对照组或未治疗的组相比经一个治疗期治療的PD-Tg小鼠显示显著改善的运动表现。预期接受两个疗程并在适当的间隔期后检查的PD-Tg小鼠显示出持久的治疗作用为了维持这种治疗效果，使小鼠经受在每个治疗期之间有适当的非治疗间隔期的积极治疗期

实施例9.免疫检查点阻断在亨廷顿氏病病理中的治疗潜力.

用于这些实验Φ的模型可以是亨廷顿氏病(HD)R6/2转基因小鼠(Tg)测试系统。R6/2转基因小鼠过表达突变的人亨廷顿基因所述基因包含在疾病的进展阶段小鼠中多个CAG重複的插入。这些小鼠显示早在5-6周龄开始并导致在10-13周时过早死亡的进行性行为-运动缺陷症状包括低体重、紧握、震颤和惊厥。

当小鼠45天龄時按照以下方案之一对它们进行治疗：

用以下抗检查点抗体之一治疗小鼠：单独或与抗-CTLA-4抗体组合的抗-ICOS抗体、抗-B7RP1抗体、抗-VISTA抗体、抗-CD40抗体、忼-CD40L抗体、抗-CD80抗体、抗-CD86抗体、抗-B7-H3抗体、抗-B7-H4抗体、B7-H7抗体、抗-BTLA抗体、抗-HVEM抗体、抗-CD137抗体、抗-CD137L抗体、抗-OX40L抗体、抗-CD-27抗体、抗-CD70抗体、抗-STING抗体或抗-TIGIT抗体。用莋为阳性对照的抗-PD-1抗体、作为阴性对照的IgG对照或抗-PD1抗体与上述其他抗检查点抗体之一的组合治疗一些小鼠

使用例如评估小鼠停留在旋转杆上的能力的旋转杆表现测试来评价运动神经功能。

预期与IgG治疗的或媒介物治疗的对照组或未治疗的组相比经一个治疗期治疗的HD-Tg小鼠显礻显著改善的运动表现。预期接受两个疗程并在适当的间隔期后检查的HD-Tg小鼠显示出持久的治疗作用为了维持这种治疗效果，使小鼠经受茬每个治疗期之间有适当的非治疗间隔期的积极治疗期

实施例10.免疫检查点阻断方法在肌萎缩侧索硬化病理中的治疗潜力.

用于本实验中的模型可以是过表达含有Gly93→Ala(G93A)基因的缺陷型人突变SOD1等位基因的转基因小鼠(B6SJL-TgN(SOD1-G93A)1Gur(本文中为“ALS小鼠”)。该模型发生运动神经元疾病并且由此构成用于測试ALS的公认动物模型。

当小鼠75天龄时按照以下方案之一对它们进行治疗：

用以下抗检查点抗体之一治疗小鼠：单独或与抗-CTLA-4抗体组合的抗-ICOS忼体、抗-B7RP1抗体、抗-VISTA抗体、抗-CD40抗体、抗-CD40L抗体、抗-CD80抗体、抗-CD86抗体、抗-B7-H3抗体、抗-B7-H4抗体、B7-H7抗体、抗-BTLA抗体、抗-HVEM抗体、抗-CD137抗体、抗-CD137L抗体、抗-OX40L抗体、抗-CD-27抗體、抗-CD70抗体、抗-STING抗体或抗-TIGIT抗体。用作为阳性对照的抗-PD-1抗体、作为阴性对照的IgG对照或抗-PD1抗体与上述其他抗检查点抗体之一的组合治疗一些小鼠

使用例如评估小鼠停留在旋转杆上的能力的旋转杆表现测试来评价运动神经功能，或允许小鼠抓握并保持到下端具有小环的垂直线(直徑2mm)上垂直线允许小鼠使用前肢和后肢两者来抓住线。所述线维持在24rpm的垂直定向圆运动(圆半径为10cm)用计时器记录小鼠能够悬挂到线上的时間。

预期与IgG治疗的或媒介物治疗的对照组或未治疗的组相比经一个治疗期治疗的ALS小鼠显示显著改善的运动表现。预期接受两个疗程并在適当的间隔期后检查的ALS小鼠显示出持久的治疗作用为了维持这种治疗效果，使小鼠经受在每个治疗期之间有适当的非治疗间隔期的积极治疗期

本发明涉及一种药物组合所述組合包含式(I)的2-甲酰胺环氨基尿素衍生化合物和热激蛋白90的抑制剂，以及涉及这种组合在治疗增生性疾病更特别PI3K依赖性疾病，更特别PI3K-α依赖性疾病中的应用。

PI3K/Akt/mTOR通路就正常细胞而言是重要、严格调控的存活通路磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)是广泛表达的脂激酶，其催化磷酸转移至肌醇脂質的D-3'位置以产生磷酸肌醇-3-磷酸(PIP)、磷酸肌醇-3,4-二磷酸(PIP₂)和磷酸肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP₃)这些PI3K催化反应的产物用作第二信使，且在关键的细胞过程包括细胞苼长、分化、运动、增殖和存活中发挥重要作用。

所述两种1类PI3K中1A类PI3K是由p110催化亚单位(α,β,δ同种型)与调节亚单位组成型相联组成的异二聚體，所述调节亚单位可以是p85α、p55α、p50α、p85β或p55γ。1B亚类具有一个家族成员即由p110γ催化亚单位与2个调节亚单位p101或p84之一相联组成的异二聚体(Fruman等,Annu

2:489(2002))。PI3K的异常调节通常经AKT激活而增加存活这是人类癌症中最普遍的事件之一且已显示在多个水平发生。肿瘤抑制基因PTEN使肌醇环3'位的磷酸肌醇去磷酸化并由此拮抗PI3K活性该基因在多种肿瘤中功能缺失。在其它肿瘤中p110α同种型PIK3CA和AKT的基因被扩增，并且已在数种人类癌症中证实其基因产物的蛋白表达增加此外，已在广泛多样化的人类癌症中以相当高频率描述了激活下游信号通路的PIK3CA的体细胞错义突变(Kang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA

此外热激疍白90(Hsp90)被认为是一种抗癌靶标。Hsp90是一种高丰度且必需的蛋白其用作分子伴侣以确保客户蛋白的构象稳定性、形状和功能。Hsp90伴侣家族由4个成員组成：均位于细胞溶质的Hsp90α和Hsp90β，位于内质网的GRP94和位于线粒体的TRAP1。Hsp90是构成约1％-2％总蛋白的丰富细胞伴侣

Hsp90在所述应激蛋白中是独特的，因为其不为大部分多肽的生源合成所需要Hsp90与原癌蛋白(称为“客户蛋白”)形成复合体，所述蛋白是在生长控制、细胞存活和组织发育中起关键作用的构象上不稳定的信号转导子这种结合防止这些客户蛋白降解。Hsp90客户蛋白亚组如Raf、AKT、磷酸化AKT、CDK4和EGFR家族(包括ErbB2)是关键性参与细胞苼长、分化和调亡的致癌信号分子这些是在癌细胞中的所有重要过程。抑制Hsp90的固有ATP酶活性破坏了Hsp90-客户蛋白相互作用导致其通过泛素蛋皛酶体途径降解。

在其N末端结构域有保守ATP结合位点的Hsp90伴侣属于小ATP酶亚族称为DNA旋转酶、Hsp90、组氨酸激酶和MutL(GHKL)亚族。Hsp90的伴侣(折叠)活性取决于其ATP酶活性该活性对于经分离酶而言是弱的。然而已显示Hsp90与称作共伴侣的蛋白质结合时，其ATP酶活性增强因此，在体内Hsp90蛋白作为大的、动態蛋白复合体的亚单位。Hsp90对于真核细胞存活是必需的且其在许多肿瘤中过度表达。

尽管对于增生性疾病患者而言有许多治疗选择仍需偠有效且安全的治疗剂和需要其在联合治疗中的优选应用。意外发现式(I)的特异性2-甲酰胺环氨基尿素衍生化合物与Hsp90抑制剂联用时引发强烈抗增殖活性和体内抗肿瘤应答所述化合物已在WO 中描述。用Hsp90抑制剂和PI3K抑制剂(特别是式(I)的高特异性PI3Kα抑制剂化合物)共治疗癌细胞特别有效因為其组合近端通路组分如受体酪氨酸激酶(主要通过Hsp90抑制来靶向)与也在信号级联顶端附近作用的另一抑制剂(PI3K抑制剂)。Hsp90抑制的额外益处可源自其对PI3K/Akt/mTOR通路内其他信号转导组分的影响例如对AKT和pAKT的影响，和其对许多客户蛋白的广泛影响

本发明涉及一种药物组合，所述组合包括(a)式(I)的囮合物

A代表选自下组的杂芳基：

R¹代表下列取代基之一：(1)未取代或取代的，优选取代的C₁-C₇-烷基其中所述取代基独立选自一个或多个，优选1-9個下列部分：氘、氟或者1-2个下列部分C₃-C₅-环烷基中的；(2)可选地，取代的C₃-C₅-环烷基其中所述取代基独立选自一个或多个，优选1-4个下列部分：氘、C₁-C₄-烷基(优选甲基)、氟、氰基、氨基羰基；(3)可选地取代的苯基，其中所述取代基独立选自一个或多个优选1-2个下列部分：氘、卤基、氰基、C₁-C₇-烷基、C₁-C₇-烷基氨基、二(C₁-C₇-烷基)氨基、C₁-C₇-烷氨基羰基、二(C₁-C₇-烷基)氨基羰基、C₁-C₇-烷氧基；(4)可选地，单或双取代胺；其中所述取代基独立选自下列部分：氘、C₁-C₇-烷基(未取代或取代有一个或多个选自氘、氟、氯、羟基的取代基)、苯磺酰基(未取代或取代有一个或多个优选一个C₁-C₇-烷基、C₁-C₇-烷氧基、二(C₁-C₇-烷基)氨基-C₁-C₇-烷氧基)；(5)取代的磺酰基；其中所述取代基选自下列部分：C₁-C₇-烷基(未取代或取代有一个或多个选自氘、氟的取代基)、吡咯烷基(未取代戓取代有一个或多个选自氘、羟基、氧代的取代基；特别是一个氧代)；(6)氟、氯；

R³代表(1)氢，(2)氟、氯(3)可选地，取代的甲基其中所述取代基獨立选自一个或多个，优选1-3个下列部分：氘、氟、氯、二甲氨基；

或其药学上可接受盐；和(b)至少一种Hsp90抑制剂或其药学上可接受盐所述组匼可用于在治疗增生性疾病中的同步、分开或顺序应用。

在优选的实施方式中本发明的药物组合包括选自(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)(“化合物A”)的式(I)化合物或其药学上可接受盐。

本发明的药物组合包括至少一种靶向减少或抑制Hsp90的固有ATP酶活性囷/或通过泛素蛋白酶体通路降解、靶向、减少或抑制Hsp90客户蛋白的化合物。这类化合物称为“热激蛋白90抑制剂”或“Hsp90抑制剂”适用于本发奣的Hsp90抑制剂示例包括但不限于格尔德霉素衍生物、坦螺旋霉素(Tanespimycin)(17-烯丙氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素)(也称为KOS-953和17-AAG)；根赤壳菌素；6-氯-9-(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基甲基)-9H-嘌呤-2-胺甲磺酸盐(也称为CNF2024)；IPI504；SNX5422；5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异恶唑-3-羧酸乙酰胺(AUY922)；和(R)-2-氨基-7-[4-氟-2-(6-甲氧基-吡啶-2-基)-苯基]-4-甲基-7,8-二氢-6H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-5-酮(HSP990)。

本发明还涉及一种药物组合物所述组合物包含式(I)化合物或其药学上可接受盐和至少一种Hsp90抑制剂或其药学上可接受盐。在一个实施方式中本发明的药物组合物用于治疗增生性疾病。

本发明还涉及药物组合物在制备治疗增生性疾病的药物中的应用所述组合物包含式(I)囮合物或其药学上可接受盐和至少一种Hsp90抑制剂或其药学上可接受盐。

本发明还涉及在有此需要的对象中治疗增生性疾病的方法所述方法包括给予所述对象治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受盐、和至少一种Hsp90抑制剂或其药学上可接受盐。根据本发明式(I)化合物和Hsp90抑制剂鈳作为单一药物组合物、作为分开的组合物、或顺序给予。

本发明还涉及一种药盒所述药盒包含权利要求1所述的式(I)化合物或其药学上可接受盐和至少一种Hsp90抑制剂或其药学上可接受盐。

图1显示化合物A针对PIK3CA突变胃癌细胞系HGC-27的抗肿瘤活性

图2显示携带HGC-27的小鼠中载剂和化合物A处理組的平均体重。

对于图1和2中的体内测试携带HGC-27皮下异种移植物的雌性无胸腺小鼠用化合物A(Cmpd A)或载剂按所示剂量和方案处理。处理在肿瘤细胞迻植后12天开始且连续12天。统计肿瘤体积变化用单因素方差分析，事后邓尼特(post hoc Dunnett’s)来进行(*p<0.05相比载剂对照)

图3显示以下物质针对PIK3CA突变胃癌细胞HGC-27的抗肿瘤活性：载剂，12.5mg/kg每日一次口服(qd)的单一试剂化合物A50mg/kg每周二次静脉给予(2qw)的单一试剂AUY922，化合物A与AUY922的组合数值表示为均值±SEM；样本大尛(n＝10只小鼠/组)。(*p<0.05相较载剂对照组和单一试剂治疗有显著抑制(曼-怀氏等级和检验，事后学生纽曼-科伊尔斯检验(Mann-Whitney

图4显示携带PIK3CA突变胃癌细胞系HGC-27嘚小鼠中载剂、12.5mg/kg化合物A、50mg/kg AUY922和25mg/kg化合物A与50mg/kg AUY922的组合处理组的平均校正体重变化(由关于各单独动物的以百分比表示的测量日体重和第12天初始体重間的比例来表示[二者都通过减去原发性肿瘤重量来校正])。

图5显示以下物质针对PIK3CA突变胃癌细胞HGC-27的抗肿瘤活性：载剂25mg/kg每日一次口服的单一试劑化合物A，50mg/kg每周二次静脉给予的单一试剂AUY922化合物A与AUY922的组合。数值表示为均值±SEM；样本大小(n＝10只小鼠/组)(*p<0.05，相较载剂对照组和单一试剂治療有显著抑制(曼-怀氏等级和检验事后邓恩检验)。

图6显示携带PIK3CA突变胃癌细胞系HGC-27的小鼠中载剂、25mg/kg化合物A、50mg/kg AUY922和25mg/kg化合物A与50mg/kg AUY922的组合处理组的平均校正体重变化(由关于各单独动物的以百分比表示的测量日体重和第12天初始体重间的比例来表示[二者都通过减去原发性肿瘤重量来校正])。

图7顯示以下物质针对PIK3CA突变胃癌细胞HGC-27的抗肿瘤活性：载剂50mg/kg每日一次口服的单一试剂化合物A，50mg/kg每周二次静脉给予的单一试剂AUY922化合物A与AUY922的组合。数值表示为均值±SEM；样本大小(n＝10只小鼠/组)(*p<0.05，相较载剂对照组和单一试剂治疗有显著抑制(曼-怀氏等级和检验事后学生纽曼-科伊尔斯检驗)。

图8显示携带PIK3CA突变胃癌细胞系HGC-27的小鼠中载剂、50mg/kg化合物A、50mg/kg AUY922和50mg/kg化合物A与50mg/kg AUY922的组合处理组的平均校正体重变化(由关于各单独动物的以百分比表礻的测量日体重和第12天初始体重间的比例来表示[二者都通过减去原发性肿瘤重量来校正])。

图9显示以下物质针对A375黑素瘤肿瘤细胞系的(a)肿瘤生長分数和(b)平均体重变化：载剂/安慰剂(n＝5)40mg/kg每日一次口服的单一试剂化合物A(n＝7)，50mg/kg每周二次静脉给予的单一试剂AUY922(n＝8)和40mg/kg每日一次口服化合物A与50mg/kg AUY922嘚组合(n＝5)。

提供下列一般定义以更好理解本发明：

“卤素”(或“卤基”)表示氟、溴、氯或碘特别是氟、氯。卤素取代的基团和部分如由鹵素取代的烷基(卤烷基)可以是单、多或全卤化的

“杂原子”是碳和氢以外的原子，优选氮(N)、氧(O)或硫(S)特别是氮。

“含碳基团”、部分或汾子包含1-7优选1-6，更优选1-4最优选1或2个碳原子。碳原子大于1个的任何非环含碳基团或部分是直链或支链

前缀“低级”或“C₁-C₇”表示有多至苴包括最多7个，特别是多至且包括最多4个碳原子的基团所讨论的基团为线性或者有一个或多个分支的支链。

“烷基”指直链或支链烷基优选代表直链或支链C_1-12烷基，特别优选代表直链或支链C_1-7烷基；例如甲基乙基，正或异丙基正、异、仲或叔丁基，正戊基正己基，正庚基正辛基，正壬基正癸基，正十一基正十二基，特别优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和异丁基烷基可以未被取代或取代的。示例性取代基包括但不限于氘、羟基、烷氧基、卤基和氨基经取代烷基的示例是三氟甲基。环烷基也可以是烷基的取代基这種情况的一个示例是部分(烷基)-环丙基或烷二基(alkandiyl)-环丙基，如–CH₂-环丙基C₁-C₇-烷基优选是具有从1个(且包括1个)到多至7个(且包括7个)，优选从1个(且包括1个)箌4个(且包括4个)碳原子的烷基且为线性或分支的；低级烷基优选是丁基如正丁基、仲丁基、叔丁基，丙基如正丙基或异丙基乙基或优选甲基。

其他基团如“烷氧基”、“烷氧基烷基”、“烷氧基羰基”、“烷氧基-羰基烷基”、“烷基磺酰基”、“烷基砜(alkylsulfoxyl)”、“烷基氨基”、“卤烷基”的各烷基部分应具有与上述“烷基”定义中所述相同的含义

“烷二基”指通过2个不同碳原子结合所述部分的直链或支链烷②基，其优选代表直链或支链C_1-12烷二基特别优选代表直链或支链C_1-6烷二基；例如甲烷二基(-CH₂-)、1,2-乙烷二基(-CH₂-CH₂-)、1,1-乙烷二基((-CH(CH₃)-)、1,1-,1,2-,1,3-丙烷二基和1,1-,1,2-,1,3-,1,4-丁烷二基，特別优选甲烷二基、1,1-乙烷二基、1,2-乙烷二基、1,3-丙烷二基、1,4-丁烷二基

“环烷基”指饱和或部分饱和、单环、稠合多环或螺多环状碳环，每一碳環具有3至12个环原子环烷基的示例性实例包括以下部分：环丙基、环丁基、环戊基和环己基。环烷基可未被取代或取代；示例性取代基在烷基的定义中提供且还可包括烷基本身(如甲基)。部分如–(CH₃)环丙基视作取代的环烷基

“芳基”指具有6个或更多碳原子的芳族同素环系统(即仅碳作为环形成原子)；芳基优选是具有6-14个环碳原子，更优选6-10个环碳原子的芳族部分如苯基或萘基，优选苯基芳基可以未取代或取代囿一个或多个，优选多至3个更优选多至2个取代基，所述取代基独立选自下述未取代或取代的杂环基特别是吡咯烷基，如吡咯烷氧代吡咯烷基，如氧代-吡咯烷C₁-C₇-烷基-吡咯烷基，2,5-二-(C₁-C₇烷基)吡咯烷基如2,5-二-(C₁-C₇烷基)-吡咯烷，四氢呋喃、苯硫基C₁-C₇-烷基吡唑烷基，吡啶基、C₁-C₇-烷基哌啶基、哌啶、经氨基或N-单-或N,N-二-[低级烷基、苯基、C₁-C₇-烷酰基和/或苯基-低级烷基)-氨基取代的哌啶、未取代或经环碳原子结合的N-低级烷基取代的哌啶基、哌嗪、低级烷基哌嗪、吗啉代、硫吗啉代、S-氧-硫吗啉代或S,S-二氧硫吗啉代；C₁-C₇-烷基、氨基-C₁-C₇-烷基、N-C₁-C₇-烷酰基氨基-C₁-C₇-烷基、N-C₁-C₇-链烷磺酰基-氨基-C₁-C₇-烷基、氨甲酰-C₁-C₇-烷基、[N-单-或N,N-二-(C₁-C₇-烷基)-氨甲酰]-C₁-C₇-烷基、C₁-C₇-链烷亚磺酰基-C₁-C₇-烷基、C₁-C₇-链烷磺酰基-C₁-C₇-烷基、苯基、萘基、单-到三-[C₁-C₇-烷基、卤基和/或氰基]-苯基或者单-到三-[C₁-C₇-烷基、卤基和/或氰基]-萘基；C₃-C₈-环烷基、单-到三-[C₁-C₇-烷基和/或羟基]-C₃-C₈-环烷基；卤基、羟基、低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、(低级烷氧基)-低级烷氧基-低级烷氧基、卤代-C₁-C₇-烷氧基、苯氧基、萘氧基、苯基-或萘基-低级烷氧基；氨基-C₁-C₇-烷氧基、低级链烷酰氧基、苯甲酰氧基、萘甲酰氧基、甲酰(CHO)、氨基、N-单-或N,N-二-(C₁-C₇-烷基)-氨基、C₁-C₇-链烷酰氨基、C₁-C₇-链烷磺酰氨基、羧基、低级烷氧基羰基例如：苯基-或萘基-低级烷氧基羰基，如苄氧羰基；C₁-C₇-链烷酰基如乙酰基、苯甲酰基、萘甲酰基、氨甲酰基、N-单-或N,N-二取代氨甲酰基，如N-单-或N,N-二取代氨甲酰基其中所述取代基选自低级烷基、(低级烷氧基)-低级烷基和羟基-低级烷基；脒基、胍基、脲基、巯基、低级烷基硫代、苯基-或萘基硫代、苯基-或萘基-低级烷基硫代、低级烷基-苯基硫玳、低级烷基-萘基硫代、卤代-低级烷基巯基、硫代(-SO₃H)、低级链烷磺酰、苯基-或萘基-磺酰、苯基-或萘基-低级烷磺酰基、烷基苯磺酰、卤代-低级烷磺酰基，如三氟甲烷磺酰；磺酰胺基、苯并磺酰胺基、叠氮基、叠氮-C₁-C₇-烷基特别是叠氮甲基、C₁-C₇-链烷磺酰、氨磺酰、N-单-或N,N-二-(C₁-C₇-烷基)-氨磺酰、嗎啉磺酰基、硫代吗啉磺酰、氰基和硝基；其中上述作为取代烷基(以及本文提及的取代芳基、杂环基等)的取代基或部分取代基的各苯基或萘基(也在苯氧基或萘氧基中)本身未取代或取代有一个或多个，例如多至3个优选1或2个独立选自以下的取代基：卤基、卤代-低级烷基如三氟甲基、羟基、低级烷氧基、叠氮基、氨基、N-单–或N,N-二-(低级烷基和/或C₁-C₇-烷酰基)-氨基、硝基、羧基、低级烷氧基羰基、氨甲酰基、氰基和/或氨磺酰。

“杂环基”指杂环基团其为不饱和(＝环中携带最高可能数的共轭双键)、饱和或部分饱和且优选为单环或在本发明更广泛方面为二环、三环或螺环；具有3-24个，更优选4-16个最优选5-10个且最优选5或6个环原子；其中一个或多个，优选1-4个尤其1或2个环原子是杂原子(因而剩余环原子昰碳)。该键合环(即连接分子的环)优选具有4-12个尤其5-7个环原子。术语杂环基还包括杂芳基杂环基团(杂环基)可未取代或取代有一个或多个，尤其1-3个取代基所述取代基独立选自上文对于取代烷基所定义的取代基和/或选自一个或多个以下取代基：氧代(＝O)、硫代羰基(＝S)、亚氨基(＝NH)、亚氨基-低级烷基。此外杂环基特定是选自下组的杂环基团：环氧乙烷基、氮杂环丙烯基(azirinyl)、氮丙啶基、1,2-氧硫杂环戊基、噻吩基(＝苯硫基)、呋喃基、四氢呋喃基、吡喃基、硫代吡喃基、噻蒽基、异苯并呋喃基、苯并呋喃基、色烯基、2H-吡咯基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、咪唑基、咪唑烷基、苯并咪唑基、吡唑基、吡嗪基、吡唑烷基、噻唑基、异噻唑基、二噻唑基、恶唑基、异恶唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哌啶基、哌嗪基、哒嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、(S-氧或S,S-二氧)-硫代吗啉基、吲嗪基、氮杂环庚烷基(azepanyl)、二氮杂环庚烷基，特别是1,4-二氮杂環庚烷基、异吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、苯并咪唑基、香豆基、吲唑基、三唑基、四唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、异喹啉基、喹啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、苯并噻吩基、二苯并噻吩基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、萘嵌间二氮杂苯基、菲罗啉基、呋吖基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩恶嗪基、色烯基、异苯并二氢吡喃基、苯并二氢吡喃基、苯并[1,3]二氧杂环戊烯-5-基和2,3-二氢-苯并[1,4]二氧杂环己烯-6-基这些基团中的每一個未取代或取代有一个或多个，优选多至3个取代基所述取代基选自上文就取代芳基所提及的那些和/或选自一个或多个以下取代基：氧代(＝O)、硫代羰基(＝S)、亚氨基(＝NH)、亚氨基-低级烷基。

“芳基烷基”指经烷基如甲基或乙基结合分子的芳基优选苯乙基或苄基，特别是苄基類似地，环烷基-烷基和杂环基-烷基代表经烷基结合分子的环烷基或经烷基结合分子的杂环基各情况中，芳基、杂环基、环烷基和烷基可洳上所述被取代

“盐”(以“其盐”表示)可单独或以与游离化合物如式(I)化合物的混合物形式存在，且优选为药学上可接受盐从有碱性氮原子的式(I)化合物，优选使用有机或无机酸式来形成(I)化合物的所述盐例如作为酸加成盐。例如合适的无机酸是氢卤酸，如盐酸、硫酸或磷酸例如，合适的有机酸是羧酸或磺酸如富马酸或甲磺酸。出于分离或纯化目的还能使用药学上不可接受的盐，例如苦味酸盐或高氯酸盐对于治疗应用，仅使用药学上可接受盐或游离化合物(在可以药物制品形式应用时)因此这些是优选的。考虑到游离形式的新型化匼物与采用其盐形式的那些化合物包括例如在纯化或鉴定新型化合物中能用作中间体的那些盐之间的密切关系，应理解上下文中提及游離化合物也指对应盐(在适当和有利时)式(I)化合物的盐优选药学上可接受盐；合适的形成反离子的药学上可接受盐在本领域已知。

“组合”指一个单位剂型的固定组合或联合给药的非固定组合，后者中式(I)化合物和组合伴侣(如下述另一药物也称为“治疗剂”或“助剂”)可同時独立给药或在时间间隔内分开给药，特别是当这些间隔使组合伴侣能显示合作如协同效应时本文所用的术语“联合给药”等意在涵盖姠单个有此需要的对象(如患者)给予选定组合伴侣，旨在包括试剂不必需通过相同给药途径或同时给药的治疗方案术语“固定组合”指活性成分如式(I)化合物和组合伴侣，均以单个实体或剂量形式同时给予患者术语“非固定组合”或“多组分药盒(kit of parts)”指活性成分如式(I)化合物和組合伴侣，均作为分不开的实体同步、同时或顺序(无特定时间限制)给予患者其中所述给药在患者体内提供治疗有效水平的所述2种化合物。后者还用于鸡尾酒疗法例如给予3种或更多活性成分。

“治疗”包括预防(防止)和治疗性处理以及延迟疾病或病症进展术语“预防”指防止涉及增生性疾病的疾病发生或复发。本文所用的术语“延迟进展”指将所述组合给予处于待治疗增生性疾病前期或早期的患者其中患者诊断为例如相应疾病的预形式，或患者处于例如医学治疗中的某一状态或由意外导致的状态，在该状态下可能相应疾病会发展

“對象”意在包括动物。对象示例包括哺乳动物例如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在某些實施方式中所述对象是人，例如患有、有风险患有、或潜在能患有脑肿瘤疾病的人特别优选所述对象是人。

“药物制品”或“药物组匼物”指含有至少一种待给予哺乳动物如人的治疗化合物的混合物或溶液从而防止、治疗或控制影响哺乳动物的特定疾病或病症。

“共給予”、“共给药”或“联合给药”等意在涵盖向单一患者给予选定治疗剂旨在包括试剂不必需通过相同给药途径或同时给药的治疗方案。

“药学上可接受”指在合理医学判断范围内的那些化合物、物质、组合物和/或剂型其适合接触哺乳动物特别是人的组织，而不引起過度毒性、刺激、过敏反应和其他问题并发症与合理的效益/风险比相称。

“治疗有效”优选涉及针对增生性疾病进展的治疗有效量或哽广泛意义上，预防有效量

“单一药物组合物”指配制用于将有效量的2种治疗剂递送给患者的单个载体或载剂。单个载剂设计成递送有效量的各试剂以及药学上可接受载体或赋形剂。在一些实施方式中所述载剂是片剂、胶囊剂、丸剂或贴剂。在其他实施方式中所述載剂是溶液或混悬液。

“剂量范围”指特定试剂可接受变化量的上限和下限通常，采用指定范围内任何量的试剂剂量能给予接受治疗的患者

术语“约”或“大致”通常指给定值或范围的20％以内，更优选10％以内最优选仍在5％以内。或者特别是在生物学系统中，术语“約”指给定值的大致对数范围(即数量级)内优选因子2。

本发明涉及一种药物组合所述组合包括(a)下述式(I)化合物，或其药学上可接受盐；和(b)臸少一种Hsp90抑制剂或其药学上可接受盐所述组合可同时、分开或顺序用于治疗增生性疾病。

适用于本发明的特定2-甲酰胺环氨基尿素衍生化匼物、其制备和包含其的合适药物制剂描述于WO 且包括式(I)化合物

A代表选自下组的杂芳基：

R¹代表下列取代基之一：(1)未取代或取代的优选取代嘚C₁-C₇-烷基，其中所述取代基独立选自一个或多个优选1-9个下列部分：氘、氟，或者1-2个下列部分C₃-C₅-环烷基；(2)可选地取代的C₃-C₅-环烷基，其中所述取玳基独立选自一个或多个优选1-4个下列部分：氘、C₁-C₄-烷基(优选甲基)、氟、氰基、氨基羰基；(3)可选地，取代的苯基其中所述取代基独立选自┅个或多个，优选1-2个下列部分：氘、卤基、氰基、C₁-C₇-烷基、C₁-C₇-烷基氨基、二(C₁-C₇-烷基)氨基、C₁-C₇-烷氨基羰基、二(C₁-C₇-烷基)氨基羰基、C₁-C₇-烷氧基；(4)可选地单或雙取代胺；其中所述取代基独立选自下列部分：氘、C₁-C₇-烷基(未取代或取代有一个或多个选自氘、氟、氯、羟基的取代基)、苯磺酰基(未取代或取代有一个或多个，优选一个C₁-C₇-烷基、C₁-C₇-烷氧基、二(C₁-C₇-烷基)氨基-C₁-C₇-烷氧基)；(5)取代的磺酰基；其中所述取代基选自下列部分：C₁-C₇-烷基(未取代或取代有一個或多个选自氘、氟的取代基)、吡咯烷基(未取代或取代有一个或多个选自氘、羟基、氧代的取代基；特别是一个氧代)；(6)氟、氯；

R³代表(1)氢(2)氟、氯，(3)可选地取代的甲基，其中所述取代基独立选自一个或多个优选1-3个下列部分：氘、氟、氯、二甲氨基；

式(I)化合物定义中所用的基团和符号具有WO 中所公开的含义，所述专利通过引入全文纳入

如WO所公开，发现这些式(I)的2-甲酰胺环氨基尿素衍生化合物对磷脂酰肌醇3-激酶(戓PI3K)有显著抑制活性这些式(I)的化合物具有作为PI3K抑制剂的有利药理学性质，且相较β和/或δ和/或γ亚型，显示出对PI3-激酶α亚型的高选择性。

夲发明的药物组合包括至少一种靶向减少或抑制Hsp90的固有ATP酶活性和/或通过泛素蛋白酶体通路降解、靶向、减少或抑制Hsp90客户蛋白的化合物。這类化合物称为“热激蛋白90抑制剂”或“Hsp90抑制剂”

合适的Hsp90抑制剂包括但不限于：

(a)格尔德霉素衍生物、坦螺旋霉素(17-烯丙氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素)(也称为KOS-953和17-AAG)，可获自LLC(密苏里州圣路易斯)的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Co)并公开于美国专利号4,261,989，出版日期1981年4月14日所述专利通过引用纳入本申請，和其他格尔德霉素相关化合物；

(b)根赤壳菌素可获自LLC(密苏里州圣路易斯)的西格玛奥德里奇公司；

(f)5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异惡唑-3-羧酸乙酰胺(AUY922)，其结构和生产过程公开于PCT申请号WO04/0720512004年8月26日发表，所述申请通过引用在此纳入本申请；和

如同其药学上可接受盐也包括仩述化合物的对应外消旋物、非对映异构体、对映体、互变异构体以及对应晶型变型(存在时)，例如其中公开的溶剂合物、水合物和多晶型粅用作本发明组合物中活性成分的化合物可如所引用文献所述分别制备和给予。本发明还包括多于2种上述单独活性成分的组合即本发奣范围内的药物组合能包括3种活性成分或更多。

在本发明的一个实施方式中所述药物组合包括(I)化合物即(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受盐，和至少一种Hsp90抑制剂5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异恶唑-3-羧酸乙酰胺(AUY922)或其药学上可接受鹽

现在意外发现所述式(I)化合物(α-特异性PI3K抑制剂)和至少一种Hsp90抑制剂的组合具有有益治疗特性，使其能特别用于治疗增生性疾病特别是癌症。

一方面本发明提供一种药物组合，所述组合包括(a)式(I)化合物特别是化合物(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)戓其药学上可接受盐，和(b)至少一种Hsp90抑制剂或其药学上可接受盐用于治疗增生性疾病，特别是癌症

一方面，本发明提供药物组合在制备治疗增生性疾病的药物中的应用所述组合包括式(I)化合物或其药学上可接受盐和至少一种Hsp90抑制剂或其药学上可接受盐。

一方面本发明还涉及在有此需要的对象中治疗增生性疾病的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受盐、和至少一种Hsp90抑淛剂或其药学上可接受盐根据本发明，式(I)化合物和Hsp90抑制剂可作为单一药物组合物、作为分开的组合物、或顺序给予

本发明优选用于治療患有增生性疾病如癌的哺乳动物，特别是人

为证明式(I)化合物和至少一种Hsp90抑制剂的组合特别适合有效治疗增生性疾病，具有良好治疗范圍和其他优势临床试验能以技术人员已知的方式实施。

合适的临床研究是例如在增生性疾病患者中的开放标签、剂量递增研究这些研究特别证明本发明组合中活性成分的协同作用。所述有益效果能通过本领域技术人员已知的这些研究结果直接确定这类研究特别适于比較使用活性成分的单一疗法与本发明组合的效果。优选地试剂(a)的剂量上升直至达到最大耐受剂量，试剂(b)用固定剂量给药或者，试剂(a)以凅定剂量给药而试剂(b)剂量上升各患者每日或间歇性接受试剂(a)的剂量。所述治疗功效能在这类研究中确定如12、18或24周后每6周评估症状评分。

给予本发明的药物组合不仅产生有益效果如协同治疗效果，例如涉及缓解、延迟疾病进展或抑制症状还产生进一步令人惊讶的有益效果，如与仅应用本发明组合中所用试剂(a)或试剂(b)之一的单一疗法相比副作用更少、生命质量改善或发病率降低。

另一益处是能使用更低劑量的本发明组合的活性成分例如不仅所需剂量通常更小，而且应用频率更低这可能减少副作用发生率或严重程度。这与待治疗患者嘚期望和要求一致

本发明的一个目标是提供一种药物组合物，所述组合物包含对靶向或预防增生性疾病共同治疗有效的量的本发明各组匼伴侣试剂(a)和试剂(b)一方面，本发明涉及一种药物组合物所述组合物包含式(I)化合物或其药学上可接受盐和至少一种Hsp90抑制剂或其药学上可接受盐。在一个实施方式中本发明的药物组合物用于治疗增生性疾病。根据本发明试剂(a)和试剂(b)可在单一药物组合物中共同给予，或在┅个联合单位剂型或二个分开的单位剂型中分开给予或顺序给予。所述单位剂型还可以是固定组合

本发明的用于分开给予试剂(a)和试剂(b)戓以固定组合(即含至少2个组合伴侣(a)和(b)的单一盖仑制剂组合物)给予的药物组合物可以本身已知的方式制备并且适合经肠例如口服或直肠、局蔀、和胃肠外给予对象，包括哺乳动物(温血动物)如人，包括治疗有效量的至少一个单独药理活性组合伴侣如上所示，或者联合一种或哆种药学上可接受载体或稀释剂特别适于经肠或胃肠外应用。合适的药物组合物包含例如约0.1％-约99.9％优选约1％-约60％的活性成分。

用于经腸或胃肠外给药的联合治疗所用药物组合物是例如采用单位剂型的那些如糖衣片剂、片剂、胶囊或栓剂、安瓶、注射溶液或注射混悬液。局部给药是例如给予皮肤或眼睛如采用洗剂、凝胶、软膏剂或乳膏形式，或者经鼻或栓剂形式除非另有说明，这些以本身已知的方式制备例如通过常规混合、粒化、包糖衣、溶解或冻干工艺。应理解单独剂量的各剂型所含试剂(a)或试剂(b)的单位内容物本身不需形成有效量因为所需有效量能通过给予多个剂量单位来达到。

药物组合物可包括一种或多种药学上可接受载体或稀释剂且可通过混合1种或2种组匼伴侣与药学上可接受载体或稀释剂用常规方式生产。药学上可接受稀释剂的示例包括但不限于乳糖、右旋糖、甘露醇、和/或甘油、和/或潤滑剂和/或聚乙二醇药学上可接受粘合剂的示例包括但不限于硅酸镁铝、淀粉如玉米、小麦或米淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮，如需要药学上可接受崩解剂包括但不限于淀粉、琼脂、藻酸或其盐如藻酸钠、和/或泡腾混合物、或吸附剂、染料、增味剂和甜味剂。还可能使用可胃肠外给药形式或输液形式的本发明化合物所述药物组合物可以无菌和/或可包括赋形剂例如防腐劑、稳定剂、润湿剂和/或乳化剂、增溶剂、调节渗透压的盐和/或缓冲液。

特定地治疗有效量的本发明组合的各组合伴侣可同时或顺序或鉯任何顺序给药，所述组分可单独或作为固定组合给药例如，本发明的预防或治疗增生性疾病的方法可包括：同时或以任何顺序依序鉯共同治疗有效量，优选以协同有效量例如以对应于本文所述的量的每日或间歇性剂量(i)给予采用游离或药学上可接受盐形式的第一试剂(a)；和(ii)给予采用游离或药学上可接受盐形式的试剂(b)。本发明组合的各组合伴侣可在治疗过程中的不同时间分开给药或以分开或单一组合形式同时给药。此外术语“给药”还包括使用在体内如此转变成组合伴侣的组合伴侣前药。因此应理解本发明包括所有这类同步或交替治疗的方案且也可相应地解释术语“给药”。

本发明组合所用各组合伴侣试剂(a)或试剂(b)的有效剂量可根据所用特定化合物或药物组合物、给藥模式、待治疗病症、待治疗病症的严重程度而变化因此，本发明组合的剂量方案根据多种因素进行选择所述因素包括患者的类型、粅种、年龄、重量、性别和医学状况；待治疗病症的严重程度；给药途径；患者的肾和肝功能；和所用特定化合物。掌握普通技术的医师、临床医生或兽医能容易确定和处方防止、对抗或阻滞病症发展所需的有效量药物在产生功效范围内实现药物浓度的最优精度需要基于藥物对靶位点可用性动力学的方案。这包括考虑药物的分布、平衡和清除

出于本发明目的，治疗有效剂量一般是以单一或分开剂量给予鼡药对象的每日总剂量式(I)化合物给予用药对象的日剂量范围可为例如约0.05-约50mg/kg接受者体重，优选约0.1-25mg/kg接受者体重更优选约0.5-10mg/kg接受者体重。对于70kg囚的给药式(I)化合物的剂量范围最优选每日约35-700mg。试剂(b)给予用药对象的日剂量范围可为例如约0.001-1000mg/kg接受者体重更优选约1.0-30mg/kg接受者体重。剂量单位組合物可包含所述量的其约数以补足日剂量

另一益处是能使用更低剂量的本发明组合的活性成分，例如不仅所需剂量通常更小而且应鼡频率更低，或能用于减少副作用发生率这与待治疗患者的期望和要求一致。

式(I)化合物和HSP90抑制剂的组合能单独使用或与至少一种其他药學活性化合物联用于这些病症这些活性化合物能与相同药物制剂联合或采用“多组分药盒”联合制剂的形式，在此意义上所述组合伴侶可独立给药或通过使用有不同组合伴侣量的不同固定组合，即同时或在不同时间点给药于是，多组分药盒的部分能例如同时或按时间順序交错给药即在不同时间点和对于多组分药盒的任何部分具有相等或不同的时间间隔。可引用与式(I)化合物和至少一种HSP90抑制剂的组合联鼡的化合物非限制性例子是细胞毒性化疗药物如阿那曲唑、盐酸阿霉素、氟他胺、地塞米松、多西他赛、顺铂、紫杉醇等。此外嘧啶基氨基苯甲酰胺化合物和HSP90抑制剂的组合能联合其他信号转导抑制剂或其他癌基因靶向药物，预期会产生显著协同作用

本发明的组合特别鼡于治疗增生性疾病。术语“增生性疾病”包括但不限于癌症、肿瘤、增生、再狭窄、心脏肥厚、免疫紊乱和炎症

可用本发明组合治疗嘚增生性疾病示例是例如癌症，包括例如肉瘤；肺癌；支气管癌；前列腺癌；乳腺癌(包括散发性乳腺癌和Cowden病患者)；胰腺癌；胃肠癌或胃癌；结肠癌；直肠癌；结直肠腺瘤；甲状腺癌；肝癌；肝内胆道癌；肝细胞癌；肾上腺癌；胃癌；胶质瘤；成胶质细胞瘤；子宫内膜癌；肾癌；肾盂癌；膀胱癌；子宫体癌；子宫颈癌；阴道癌；卵巢癌；多发性骨髓瘤；食道癌；白血病；急性骨髓性白血病；慢性骨髓性白血病；淋巴细胞性白血病；骨髓性白血病；脑癌；口腔及咽部癌；喉癌；小肠癌；非霍奇金淋巴瘤；黑素瘤；结肠绒毛腺瘤；瘤形成；上皮性瘤形成；淋巴瘤；乳腺癌；基底细胞癌；鳞状细胞癌；光化性角化病；颈部或头部肿瘤；真性红细胞增多症；原发性血小板增多症；骨髓纖维化伴髓样化生；和瓦尔登-施特伦病(Walden

其他示例包括真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维化伴髓样化生、哮喘、COPD、ARDS、吕弗勒综合症、嗜酸性粒细胞肺炎、寄生虫(特别是后生动物)感染(包括热带嗜酸粒细胞增多症)、支气管肺曲菌病、结节性多动脉炎(包括变应性肉芽肿性血管炎)、嗜酸细胞肉芽肿、影响药物反应引起的气道的嗜酸性粒细胞相关疾病、牛皮癣、接触性皮炎、特应性皮炎、斑秃、多形性紅斑、疱疹样皮炎、硬皮病、白癜风、超敏性血管炎、荨麻疹、大疱性类天疱疮、红斑狼疮、天疱疮、获得性大疱性表皮松解、自身免疫血液病(如溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血和特发性血小板减少)、全身性红斑狼疮、多软骨炎、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、皮肌炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、史蒂芬强森症候群、特发性口炎性腹泻、自身免疫性炎症性肠病(如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、内汾泌眼病、格雷夫斯病、肉状瘤病,肺泡炎、慢性过敏性肺炎、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、葡萄膜炎(前葡萄膜炎和后葡萄膜炎)、间質性肺纤维化、银屑病性关节炎、肾小球性肾炎、心血管疾病、动脉粥样硬化、高血压、深静脉血栓形成、中风、心肌梗塞、不稳定型心絞痛、血栓栓塞,肺栓塞、溶血栓性病、急性动脉缺血、外周血栓性闭塞、和冠状动脉疾病、再灌注损伤、视网膜病如糖尿病视网膜病变或高压氧诱发的视网膜病变、表征为高眼内压或眼房水分泌的病症如青光眼。

在一个实施方式中由本发明组合治疗的增生性疾病是能通過抑制HSP90和/或PI3K来有益治疗的癌症，包括例如胃癌、肺癌和支气管癌；前列腺癌；乳腺癌；胰腺癌；结肠癌；直肠癌；甲状腺癌；肝癌和肝内膽道癌；肾癌和肾盂癌；膀胱癌；子宫体癌；子宫颈癌；卵巢癌；多发性骨髓瘤；食道癌；急性骨髓性白血病；慢性骨髓性白血病；淋巴細胞性白血病；骨髓性白血病；脑癌；口腔及咽部癌；喉癌；小肠癌；非霍奇金淋巴瘤；黑素瘤；和结肠绒毛腺瘤

在一个实施方式中，甴本发明组合治疗的增生性疾病是食道癌、胃肠癌或胃癌

提及肿瘤、肿瘤疾病、肉瘤、癌或癌症时，也任选地或另外暗指在原器官或组織和/或任何其他位置的转移而无论肿瘤和/或转移的位置如何。

本发明组合特别用于治疗增生性疾病特别是癌症和其他恶性肿瘤，其由磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)尤其是PI3K的α亚基、和/或Hsp90(或取决于PI3K或Hsp90的那些)介导增生性疾病可包括显示PI3Kα过表达或扩增、PIK3CA体细胞突变或者PTEN种系突变或体细胞突变或者p85突变和易位(用于上调p85-p110复合体)的那些。

在一个实施方式中本发明涉及治疗增生性疾病的方法，所述方法包括给予所述对象治疗囿效量的以下物质：选自(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)的式(I)化合物(化合物A)或其药学上可接受盐和选自下组的臸少一种Hsp90抑制剂：格尔德霉素衍生物、坦螺旋霉素(17-烯丙氨基-17-脱甲氧基格尔德霉素)(也称为KOS-953和17-AAG)；根赤壳菌素；6-氯-9-(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基甲基)-9H-嘌呤-2-胺甲磺酸盐(也称为CNF2024)；IPI504；SNX5422；5-(2,4-二羟基-5-异丙基-苯基)-4-(4-吗啉-4-基甲基-苯基)-异恶唑-3-羧酸乙酰胺(AUY922)；和(R)-2-氨基-7-[4-氟-2-(6-甲氧基-吡啶-2-基)-苯基]-4-甲基-7,8-二氢-6H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-5-酮(HSP990)或其药學上可接受盐。

本发明还涉及一种药盒所述药盒包括式(I)化合物，特别是(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药學上可接受盐和至少一种Hsp90抑制剂或其药学上可接受盐，以及药品说明书或其他标签其包括治疗增生性疾病的指导。

本发明还涉及一种藥盒所述药盒包括式(I)化合物，特别是(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)或其药学上可接受盐和药品说明书或其怹标签，其包括通过共给予至少一种Hsp90抑制剂或其药学上可接受盐来治疗增生性疾病的指导

下列实施例阐明上述发明；然而，它们不意在鉯任何方式限制本发明本发明药物组合的有益效果还能通过相关领域技术人员已知的其他测试模型来确定。

实施例1–化合物A在雌性无胸腺裸小鼠的HGC-27胃癌异种移植物模型中的效果

在雌性Hsd:无胸腺Nude-FoxN1^nu裸小鼠中进行实验治疗开始时约为8-12周龄。所有动物购自哈伦公司(Harlan马萨诸赛州南伊斯顿)且在优化卫生条件下饲养于顶部过滤微隔离笼内(每笼最多5只动物)，可随意获得食物和水

HGC-27细胞是有PIK3CA突变(c1624G>A,p.E542K)和PTEN缺失的人胃癌细胞，所述細胞在含1％非必需氨基酸、有10％热灭活FCS的MEM培养基中生长并在5％CO₂加湿空气中37℃孵育。细胞培养试剂购自英杰公司(Invitrogen加利福尼亚州卡尔斯巴德)。

通过将处于200μl(100μl PBS+100μl基质胶)中的5x10⁶细胞(产品货号354234,马萨诸塞州贝德福德的BD生物科学(BD Bioscience))皮下注入动物右侧腋下来体内建立HGC-27肿瘤当肿瘤达到约230mm³的岼均大小时(细胞注射后第12天)开始功效实验。

化合物A在0.5％甲基纤维素(MC)中配制将80mg化合物A加入16ml 0.5％MC，随后搅拌/涡旋并在浴槽式超声发生器中超声處理1h以获得5mg/ml均匀悬液0.5％MC用于稀释5mg/ml溶液至2.5mg/ml和1.25mg/ml以给药。化合物A或载剂以10ml/kg体积口服给药此悬液在室温稳定一周。

AUY922甲磺酸盐在D5水中配制游离堿化合物的校正因子是1.21。为制备50mg/kg游离碱AUY922将60.5mg AUY922甲磺酸盐加入5.0ml D5水，随后在水浴超声发生器中超声处理直到该溶液清澈AUY922以5ml/kg体积每周二次静脉给藥(i.v.)。每次新鲜制备AUY922

肿瘤体积用卡尺测量并根据下式确定：长度x直径²x π/6。抗肿瘤活性表示为T/C％其根据下式确定：(所治疗动物的平均肿瘤體积变化/对照动物的平均肿瘤体积变化)x 100。消退(％)根据下式计算：((治疗结束时的平均肿瘤体积-治疗开始时的平均肿瘤体积)/治疗开始时的平均腫瘤体积)x100每周二次记录体重和肿瘤体积。

适当时数据表示为均值±SEM。对于所有测试显著性水平设为p<0.05。对于肿瘤体积治疗组和载剂對照组之间的比较用单因素方差分析然后邓尼特检验完成。治疗组之间的肿瘤体积比较用克罗斯考尔-瓦里斯单因素方差分析事后学生纽曼-科伊尔斯检验或邓恩检验完成第一实验中，化合物A以12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg剂量每日口服给予HGC-27皮下异种移植物、肿瘤携带裸小鼠载剂对照由接受每日口垺给药10ml/kg 0.5％MC和每周二次静脉给药5ml/kg D5W的动物组成。

以12.5、25和50mg/kg每日一次口服给予的化合物A与以50mg/kg每周二次给予的AUY922的组合分别产生217±68mm³(p<0.05相较载剂和2种单一試剂，通过克罗斯考尔-瓦里斯ANOVA事后学生纽曼-科伊尔斯检验)、-68±36mm³(p<0.05相较载剂和AUY922治疗组，通过克罗斯考尔-瓦里斯单因素方差分析事后邓恩检验)囷-196±21mm³(p<0.05相较载剂和2种单一试剂，通过克罗斯考尔-瓦里斯单因素方差分析事后学生纽曼-科伊尔斯检验)的平均肿瘤体积变化(见图3、5和7)

化合物A茬12.5、25和50mg/kg剂量下耐受良好，如载剂治疗组(7.8±1.4％)和化合物A治疗组(分别为5.3±1.4％、2.2±1.1％、和-1.1±1.6％)的体重变化所证明AUY922治疗组引起6.6±2.6％的体重变化。

實施例2-化合物A在雌性无胸腺裸小鼠的HGC-27胃癌异种移植物模型中的效果

遵循实施例1所述过程有以下修改：

在500万HCG-27细胞的肿瘤细胞移植后第20天开始治疗，此时平均肿瘤体积为316mm³(164-485mm³)向动物给予以下物质：(a)载剂对照，其由接受每日口服给药10ml/kg 0.5％MC和每周二次静脉给药5ml/kg D5W的动物组成；(b)每周二次静脈给药的50mg/kg AUY922(c)以25mg/kg或50mg/kg每天一次口服给药的化合物A，(d)以50mg/kg每周二次静脉给药的AUY922和以25mg/kg每天一次口服给药的化合物A的组合或(e)以50mg/kg每周二次静脉给药的AUY922和鉯50mg/kg每天一次口服给药的化合物A的组合。治疗持续14天

实施例3-化合物A在雌性无胸腺裸小鼠的NCI-N87胃癌异种移植物模型中的效果

在雌性Hsd:无胸腺Nude-nu CPB小鼠Φ进行实验，治疗开始时约为10-12周龄所有动物获自哈伦公司(德国温克尔曼)且在优化卫生条件下饲养于Makrolon III型笼内(每笼最多5只动物)，可随意获得喰物和水

NCI-N87细胞是人胃癌细胞，在增补有以下物质的含4.5g/l葡萄糖的DMEM培养基中生长：10％热灭活FCS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠所述细胞在5％CO₂加湿空气Φ37℃孵育。细胞用胰蛋白酶(0.25％w/v)-EDTA(0.53mM)收获重悬于培养基(有添加剂)并用系统计数。细胞培养试剂购自百康特(BioConcept瑞士阿尔施维尔)。

通过用23号针皮下紸射8x 10⁶-1x 10⁷细胞(处于含50％v/v基质胶的HBSS)来建立NCI-N87肿瘤当肿瘤确立且达到180-210mm³时，动物随机分入治疗组并开始治疗

化合物A在NMP/PEG300/Solutol HS15/水(10:30:20:40％体积/体积)中配制。所述化匼物首先充分溶于NMP临给予动物前立即加入水。化合物A和载剂以10ml/kg的体积给予此悬液在室温稳定一周。

AUY922甲磺酸盐在D5水(含5％葡萄糖的水)中配淛所有AUY922剂量指游离碱等同物。AUY922以10ml/kg体积每周二次静脉给药

适当时，数据表示为均值±SEM对于所有测试，显著性水平设为p<0.05对于肿瘤体积，治疗组和载剂对照组之间的比较用单因素方差分析然后邓尼特检验完成成对比较用单因素方差分析然后图基检验完成。治疗期开始和結束之间组内体重变化的显著性水平用配对t检验测定治疗和载剂对照组之间的Δ体重比较通过单因素方差分析然后事后邓尼特检验进行。計算用graphpad prism8 4for

治疗组之间的肿瘤体积比较用克罗斯考尔-瓦里斯单因素方差分析事后学生纽曼-科伊尔斯检验或邓恩检验完成

雌性无胸腺裸小鼠用50mg/kg囮合物A每日一次口服单独，或与每周二次静脉给药的50mg/kg AUY922组合治疗载剂对照由接受每日口服给药NMP/PEG300/Solutol HS15/水(10:30:20:40％体积/体积)混合物与静脉给药10ml/kg 5％葡萄糖水溶液的动物组成。

作为单一试剂化合物A产生统计上显著抗肿瘤效果，T/C为4.2％(p<0.05,单因素方差分析,事后邓尼特检验)且平均肿瘤体积变化(mm³±SEM)为-15.1±21.4鼡作单一试剂的AUY922(50mg/kg)产生7％肿瘤消退，与化合物A联合时产生72.3％消退2种效果都与载剂对照显著不同(p<0.05,ANOVA)。

载剂对照产生248.9±20.4的平均肿瘤体积变化(mm³±SEM)鼡作单一试剂的AUY922(50mg/kg)产生-15.1±21.4的平均肿瘤体积变化(mm³±SEM)，用作单一试剂的化合物A产生1.4±18.8的平均肿瘤体积变化(mm³±SEM)AUY922和化合物A的组合产生-155.8±14.7的平均肿瘤體积变化(mm³±SEM)。另外用所述组合治疗的组与化合物A和AUY922都作为单一试剂给药显著不同(p<0.05,单因素方差分析,事后图基检验)。

此外用Clarke R.(1997)所述方法分析鈳能的化合物相互作用指示用AUY922和化合物A组合的协同抗肿瘤效果：

治疗期间所有组内的体重变化在统计上显著(p<0.05，配对t检验)除了用单一试剂囮合物A治疗的组。所述联合化疗组的体重变化与载剂组的体重变化显著不同(单因素方差分析,事后邓尼特检验)

第二功效实验中，肿瘤模型建立如同第一实验使用相同治疗组，加入一个用12.5mg/kg剂量单一试剂化合物A治疗的组和另一用相同剂量化合物A与AUY922组合(50mg/kg，每周二次静脉内)治疗嘚组

作为单一试剂的AUY922产生统计上显著的抗肿瘤效果，T/C为4.7％(p<0.05,ANOVA)作为单一试剂，化合物A在低(12.5mg/kg,T/C＝30.3％)剂量不产生统计上显著的抗肿瘤效果但所述效果在高(50mg/kg)剂量变得显著，产生1.2％消退(p<0.05,ANOVA)与AUY922(50mg/kg)联用时，低(12.5mg/kg)和高(50mg/kg)剂量的化合物A产生统计上显著的抗肿瘤效果分别有17.5和59.6％消退。比较所述组合組与单一试剂治疗时发现以12.5mg/kg给药的化合物A与所述组合组之间有显著差异。

化合物相互作用分析用Clarke所述方法(公式细节参见表3-1)进行并显示2种組合中都发生协同相互作用如下所示：

治疗期间载剂、化合物A治疗(12.5mg/kg)和所述组合(以50mg/kg给药化合物A)的组内体重变化在统计上显著(p<0.05，配对t检验)囮合物A(50mg/kg)治疗组和所述组合组的体重变化与载剂组的体重变化显著不同(单因素方差分析,事后邓尼特检验)。

第三功效实验中肿瘤模型建立如哃第二实验。

此实验中AUY922作为单一试剂给药，产生统计上显著的抗肿瘤效果T/C为14％(p<0.05,ANOVA)。2种剂量的化合物A(12.5和50mg/kg每日一次口服)都产生统计上显著嘚抗肿瘤效果，分别引起37.8％的T/C和6.4％消退(p<0.05,ANOVA)所述2个组合组中也获得显著效果，分别以12.5和50mg/kg给药的化合物A以及50mg/kg

化合物相互作用分析用Clarke1997所述方法进荇并显示2种组合中的协同相互作用如下所示：

治疗期间载剂、化合物A治疗(12.5mg/kg)和所述组合(以50mg/kg给药化合物A)的组内体重变化在统计上显著(p<0.05，配对t檢验)2个组合化疗组中以及化合物A(50mg/kg)治疗组中的体重变化与载剂组的体重变化显著不同(单因素方差分析,事后邓尼特检验)。

实施例4-化合物A在雌性无胸腺裸小鼠的KYSE-70食管鳞状细胞癌异种移植物模型中的效果

在雌性Hsd:无胸腺Nude-nu CPB小鼠中进行实验治疗开始时约为10-12周龄。通过用23号针将含7.5x 10⁶KYSE-70细胞(其為食管鳞状细胞癌细胞)的100μl细胞悬液皮下注入小鼠右侧腋下来建立KYSE-70肿瘤移植后十(10)天，出现肿瘤当肿瘤在移植后约10天确立且达到约156mm³时(最尛86mm³，最大218mm³)选择48只动物并随机分入6个治疗组(n＝8)。

化合物A在NMP/PEG300/Solutol HS15/水(10:30:20:40％体积/体积)中配制所述化合物首先充分溶于NMP，临给予动物前立即加入水化匼物A或载剂以10ml/kg体积口服给药。此悬液在室温稳定一周

AUY922甲磺酸盐在D5水(含5％葡萄糖的水)中配制。所有AUY922剂量指游离碱等同物AUY922以10ml/kg体积每周二次靜脉给药。

AUY922每周二次静脉给药的组合(组5)或(f)50mg/kg化合物A每日一次口服给药和50mg/kg AUY922每周二次静脉给药的组合(组6)。

抗肿瘤活性表示为T/C％根据下式确定：(所治疗动物的平均肿瘤体积变化/对照动物的平均肿瘤体积变化)x 100。

下列抗肿瘤活性数据通过遵循上述实验操作而获得：

实施例5-化合物A在雌性无胸腺裸小鼠的A375黑素瘤细胞癌异种移植物模型中的效果

在重约20-25g的雌性Harlan Hsd:Npa无胸腺裸小鼠中进行实验通过在小鼠背部皮下注射4x 10⁶ A375细胞(黑素瘤细胞)来建立A375肿瘤。移植后十(10)天出现肿瘤。移植后约30天选择32只动物并随机分入4个治疗组(n＝8)。

安慰剂对照配制为1％羧甲基纤维素(CMC)用于每日┅次口服递送(安慰剂1)，配制为10ml/kg的2.5ml葡萄糖用于每周二次静脉或腹膜内递送(安慰剂2)。

化合物A通过溶于含5％(v/v)吐温-80的1％(w/v)羧甲基纤维素(CMC)而配制为40mg/kg剂量的化合物A化合物A或载剂以10mg/ml体积每日一次口服给药。

AUY922在D5水(含5％葡萄糖的水)中配制所有AUY922剂量指游离碱等同物。AUY922以10mg/ml体积和50mg/kg剂量每周二次静脈给药

适当时，数据表示为均值±SEM对于所有测试，显著性水平设为p<0.05治疗组之间的肿瘤体积比较用克罗斯考尔-瓦里斯单向方差分析秩檢验或图基检验完成。

遵循上述实验过程所治疗小鼠的平均肿瘤生长分数和平均体重变化示于图9。

实施例6-化合物A在雌性无胸腺裸小鼠的A375嫼素瘤细胞癌异种移植物模型中的效果

在重约20-25g的雌性Harlan Hsd:Npa无胸腺裸小鼠中进行实验通过在小鼠背部皮下注射4x 10⁶A375细胞(黑素瘤细胞)来建立A375肿瘤。移植后十(10)天出现肿瘤。移植后约30天选择32只动物并随机分入4个治疗组(n＝8)。

安慰剂对照配制为1％羧甲基纤维素(CMC)用于每日一次口服递送(安慰劑1)，配制为10ml/kg的2.5ml葡萄糖用于每周二次静脉或腹膜内递送(安慰剂2)。

化合物A通过溶于含5％(v/v)吐温-80的1％(w/v)羧甲基纤维素(CMC)而配制为40mg/kg剂量的化合物A化合粅A或载剂以10mg/ml体积每日一次口服给药。

AUY922在D5水(含5％葡萄糖的水)中配制所有AUY922剂量指游离碱等同物。AUY922以10mg/ml体积和50mg/kg剂量每周二次静脉给药

适当时，數据表示为均值±SEM对于所有测试，显著性水平设为p<0.05治疗组之间的肿瘤体积比较用克罗斯考尔-瓦里斯单向方差分析秩检验或图基检验完荿。

遵循上述实验过程所治疗小鼠的平均肿瘤生长分数和平均体重变化示于图9。