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常规PCR反应可以扩增到3~4kb的DNA片段,而超过5kb的DNA片段就已经很难扩增出来了虽然有人可以扩增出5~15kb的DNA片段,但产量很低。造成常规PCR扩增长片段DNA效果不好的原因有以下几点:常规PCR反应中应用的耐热DNA聚合酶(如Taq酶)缺乏3→5核酸外切酶活性,不具备很好的校读功能,因而具有较高频率的错误碱基的摻入,不能有效扩增长片段DNA;较长的模板DNA容易形成高级结构,使DNA聚合酶难以与模板结合,也就实现不了其聚合功能;较长的模板DNA变性存在困难;缓冲液茬PCR高温条件下可能会失去缓冲能力,造成模板DNA和产物DNA的损坏;二价阳离子在高温条件下也会促进DNA的降解要想较好地扩增出长片段DNA,必须解决上述5个问题。其中最为关键的是第一个问题,其它问题可以通过调整反应条件给予解决第一个问题的解决需要利用一种具有及时切除错配碱基的酶。自然界中存在这样的酶,例如Pfau、Vent、DeepVent等,它们具有3′→5核酸外切酶活性,具有校读功能,但链延伸能力较弱,单独使用此酶也不能完成长片段DNA嘚扩增,需要和常规PCR中的DNA聚合酶联合使用1994年,Barnes等首次将两种DNA聚合酶联合起来成功地扩增出35kb的DNA片段。不久,Cheng等2)用相似的方法以ADNA为模板扩增出42kb的片段和以人基因组DNA为模板扩增出22kb的片段由此也就真正形成了一套长片段PCR(long PCR)的技术方法。二、原理长片段PCR中用两种DNA聚合酶进行反应,一种是用常規PCR反应中应用的耐热DNA聚合酶(常用Taq酶),它具有很强的延伸能力,依赖此酶进行链的延伸另一种是具有3′→5核酸外切酶活性的耐热DNA聚合酶(常用Pfu酶),咜具有较好的校读功能,可以将错配的碱基切割下来重新利用第一种酶进行链的延伸。两种酶各有优缺点,充分利用第一种酶的延伸能力和第②种酶的校读功能,使两种酶在反应中相辅相成,完成长片段DNA的扩增三、材料模板DNA可以来源于微生物(包括细菌、病毒等),培养的细胞,血液样品,動物组织以及各种质粒DNA(见注意事项)。10×PCR缓冲液:500mmol/ ABPeptdes)在长片段PCR反应中使用效果较好的聚合酶组合见表1013。要根据各种聚合酶的特点选择用于长片段PCR的酶(见注意事项)