一、组织培养的概念 1、植物组织培养：是指在无菌和人工控制的条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器 官（如根、茎、叶、花、果实、种子、胚、花药、子房等） 、组织（如形成层、皮层、胚乳 等） 、细胞（如体细胞、生殖细胞花粉等） 、原生质、幼小的植株进行培养，使其再生细胞或 完整的植株的技术。 由于培养的植物材料已经脱离的母体，也称植物离体培养。 2、无菌（asepsis ) ：使培养器皿、器械、培养基和培养材料等处于无真菌、细菌、病毒等 微生物的状态，以保证植物材料在培养皿中正常生长和发育。 3、人工控制的环境：光照(lx)、温度、湿度(70-80﹪)、气体(O2)等。 4、外植体(explant) ：由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官。离体培养的 材料，包括：器官、组织、细胞、原生质体。 5、愈伤组织：原义---植物在受伤之后在伤口表面形成的一团薄壁组织；在组织培养中指在 人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。 6、 组织培养分为五种类型：1）愈伤组织培养 2）细胞培养 3）器官培养（胚、花药、子房、 根、茎、叶）4）茎尖分生组织培养（脱毒）5）原生质体培养 7、培养基（culture medium ) ：是植物组织培养的重要基质，为培养物提供生长发育及 分化的营养物质及支持。 8、培养基的营养组成： 1）无机营养大量元素：氮、磷、钾、硫、钙、镁； 2）无机营养微量元素：铁、硼、锰、铜、锌、钼、氯 3）有机营养：维生素、肌醇、氨基酸等 4）植物生长调节剂：生长素类（2，4-D、NAA、 IAA、 IBA) 细胞分裂素类(KT BA ZT ) 其他类（GA ABA) 5）附加物: 琼脂、活性碳、一些天然复合物 9、氮是细胞中核酸的组成部分，也是生物体许多酶的成分，氮被植物吸收后转化为氨基酸 再生成蛋白质被植物利用。氮还是叶绿素、维生素和植物激素的组成分。主要以铵态氮和销 态氮形式被利用。 10、磷参与植物生命中核酸及蛋白质全成、光合作用、呼吸作用及能量的贮存、转化、释放 等重要的生理生化过程，提高抗逆性，促进早熟。 11、钾是许多酶的活化剂。 组织培养中钾能促进器官和不定胚分化促进叶绿体 ATP 的合成， 增强植物光合作用和产物的运输，调解植物细胞的水势，调解气孔运动，提高抗逆性。 12、钙、镁、硫参与细胞壁的构成影响光合作用，促进代谢等生理活动 二、组织培养的生理依据 1、细胞全能性学说：植物体的每一个细胞都含有一个完整个体的全套基因，这些基因在适 宜的外界条件下按照某种特定的程序先后表达， 最终分化形成一个完整的植株， 称为细胞全 能性（totipotency) 2、全能性只是一种可能性。要把这种可能性变为现实性必须满足两个条件： 1）要把这些细胞从植物体其余部分的抑制性影响下解脱出来，也就是说必须使部分细胞处 于离体的条件下。 2)要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。一个单细胞再生完整植株的 过程 A：离体单细胞 B-E：单细胞增殖成 愈伤组织 F：将愈伤组织在培 养基上继代 G．促进愈伤组织分 化和增殖 H．诱导茎芽生根 I．再生植株移栽 3、全能性体现的两个过程：一个已分化的细胞要表现它的全能性，必须经历两个过程，即 首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。 4、再分化的过程有两种方式： 1）器官发生方式 2）胚胎发生方式 5、植物组织培养过程： 胚 植物体 根、芽 状 体 6、脱分化：一个成熟细胞转变为分生状态并形成未分化的愈伤组织的现象。 7、再分化：一个成熟的植物细胞经历了脱分化之后，经过培养还能形成完整的植株的过程。 8、再生：指组织、器官、悬浮细胞和原生质体经培养后获得植株的过程。 9、继代：植物组织培养过程中，外植体在培养基上培养一段时间以后需要转移到新的培养 基上进行培养。 10、离体培养条件下，细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的。 三、组织培养的类型 1、植物组织培养：→培养材料：茎尖分生组织培养、器官培养、愈伤组织培养、 细胞培养、原生质体培养 →培养方式：固体培养 液体培养：震荡培养、旋转培养、静置培养、纸桥培养 (1)愈伤组织培养：将外植体接种在培养基上，由于植物生长调节剂的存在，其细胞脱分化 形成愈伤组织，然后通过再分化形成再生植株。 愈伤组织是一种最常见的培养形式， 因为除茎尖分生组织和一部分器官以外， 其他的几种培 养形式最终也都要经过愈伤组织才能再生植株。 愈伤组织的形态发生途径 : ①胚胎发生途径； ②器官发生途径 (2)器官培养：器官培养是通过培养器官的类别来分类的。培养的是什么器官，就称为什么 培养。如根、茎、叶、花、果实、种子的培养。 (3)胚培养：胚培养是器官培养的一种。选用的外植体是成熟或未成熟的胚进行离体无菌培 养。其具体方法是将其取出放在液体或固体培养基上培养，由于胚包含在胚珠和子房里，因 而进行胚胎培养时，常常是将胚珠和子房放在培养基上培养。 胚培养用途：1.拯救胚。 2.研究胚的发育营养。 3.一些特殊的领域的研究。 (4)细胞和原生质体培养 细胞培养：将植物的单个细胞或细胞团分离出来，放在培养基上进行培养。 离体、 消毒的植物 脱分化 愈伤 器官、 组织或细胞 组织 再分化原生质体培养：指将植物细胞的细胞壁通过物理或化学的方法去除，然后再进行培养。原生 质体培养的最大用处是体细胞杂交。 (5)茎尖分生组织培养 四、植物组织培养实验构建及操作技术 1、实验室组成：缓冲室、准备室、温室、驯化室、培养室、无菌操作室 2、实验室设置基 本 实 验 室准备室 准备室 准备室实验准备,培养基的 配制,洗涤与灭菌等 离体材料的无菌操 作,又称接种室 控制条件下的离体 培养细胞学 实验室 生化分 析室辅 助 实 验 室4、仪器设备和器皿用具 常见仪器设备：1、超净工作台或接种箱 2、空调 3、除湿机或加湿器 4、恒温培养箱 5、高压灭菌锅 6、冰箱 7、天平 8、显微镜 9、水浴锅 10、摇床与转床 11、蒸馏水发生器 12、酸度计 13、离心机 接种器具：镊子、剪刀、解剖刀等 培养设备：培养箱、培养架等 5、细胞学鉴定设备：光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜 五、培养基及其配制 （一）、培养基的成分 培养基组成：无机营养物、有机营养物、植物生长调节剂、碳水化合物、其它添加物 1、无机营养元素(inorganic element) ： 1)大量元素：指浓度大于 0.5mmol／L 的元素。 [N、P、K、Mg、S 和 Ca 等]。 2)微量元素：指小于 0.5mmol／L 的元素。[Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co 等] 2、有机化合物(organic compound) （1）碳水化合物：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织 很好的生长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在 2% —3%， 常用 3%， 但在胚培养时采用 4%-15%的高浓度， 因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。 不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖 和蔗糖相当，麦芽糖差一些。大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。 最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源。使用浓度在 1%—5%，常用 3% 作用：碳源；维持培养基渗透压。 （2）维生素(vitamin) ：作用：在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，这类 化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动， 对生长、 分化等有很好的 促进作用。主要有 VBl(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、Vc（抗坏血酸） 、有 时还使用生物素、叶酸、VB12 等。一般用量为 0．1—1．0mg／L。有时用量较高。VB1 对 愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6 能促进根的生长，Vpp 与植物代谢和胚的发育 有一定关系。Vc 有防止组织变褐的作用。 使用浓度：一般用量为 0.1—1.0mg／L。 （3）肌醇：又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。使用浓度：一般为 lOOmg／ L，作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。 （4）氨基酸 (amino acide） ：作用：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。 种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨 酸等。使用浓度：为 10—200mg／L。 3、有机附加物 （天然复合物） 1)椰乳：浓度 10%—20% 2)香蕉：150-200ml／L 3)马铃薯(potato) ：150—200g／L 4)水解酪蛋白：浓度 100—200mg／L 5)其他：酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)，主要成 分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液(0.01%～0.5%) 4、植物生长调节物质(hormone) （1）生长素类：作用：主要被用于诱导愈伤组织形成；促进细胞脱分化；促进细胞伸长； 促进生根。在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下，(10-5—10-8mg／L)就 可促进生长，其次是茎和芽。 生长素种类：吲哚乙酸：IAA；萘乙酸：NAA；吲哚丁酸：IBA；2,4-二氯苯氧乙酸 2,4—D 生长素作用强弱顺序：2,4—D&NAA&IBA&IAA （2）细胞分裂素类：作用：①促进细胞分裂与扩大。②诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎 增粗，抑制茎伸长。 ③抑制根的分化。 种类：6—BA(6—苄基腺嘌呤)； Kt (kinetin 激动素)； Zt (zeatin 玉米素) 细胞分裂素作用强弱顺序：Zt&6—BA&Kt 激素配比模式： 生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向 （形成愈伤组织； 长根； 长芽） 。 高 有利于根的形成和愈伤组织的形成 生长素/细胞分裂素 适中 有利于根芽的分化 低 有利于芽的形成 （3）赤霉素（GA3 赤霉酸） ：作用：促进幼芽伸长生长，促进不定胚发育成小植株。 赤霉素和生长素协同作用， 对形成层的分化有影响： 当生长素／赤霉素比值高时有利于木质 部分化，比值低时有利于韧皮部分化。 5、培养材料的支持物 ---琼脂(agar)： 固体培养时最好的固化剂。用量：6—10g／L。琼脂 是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中， 成为溶胶，冷却至 40 ℃即凝固为固体状凝胶。 琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH 值 等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失 凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。 固体培养基的特点（与液体培养基相比）:优点:操作简便，通气问题易解决，便于观察研究。 缺点:培养物与培养基的接触(即吸收)面积小， 各种养分在琼脂中扩散较慢， 影响养分充分利 用，同时培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。 6、抗生物质(antibiotic) ：种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等。 浓度：5—20mg/L。 作用：可防止菌类污染。 7、活性炭(active carbon) ：目的：是利用其吸附能力，减少一些有毒物质的影响；利于生 根。 使用浓度：1—5g／L。 它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸附 力减弱，甚至不吸附。 8、水（water)：作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。 注意： 用蒸馏水， 最好是重蒸馏水； 以保持培养基成分的精确性。 大规模生产时可用自来水。 三、培养基的 PH 值 (pH value) 1、多数植物要求 pH5.6-5.82、用 0.1-1N 的 NaOH 和 0.1-1N 的 HCI 调节. 3、注意：经高压灭菌后，培养基 pH 会下降 0.2-0.8,固调整 pH 值时,应高于 0.5； pH 的大小会影响琼脂的凝固能力，当 pH&6.0 时，培养基将会变硬，pH &5.0 时，琼脂凝固 不好。 四、培养基的种类、配方及特点 培养基(culture medium) ：是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的 组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。因此， 没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官， 在建立一项新的培养系统时， 首先必 须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。 （一）培养基的种类 1、根据态相不同：固体培养基、液体培养基 2、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基 3、根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基 4、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、改良培养基。 （二）常用的培养基及特点 1、MS 培养基：它是 1962 年由 Murashige 和 Skoog 为培养烟草细胞而设计的。是目前应用 最广泛的培养基。 特点：是无机盐离子浓度较高，有高含量的 N、K，硝酸盐量大，营养丰富。 2、White 培养基：1943 年由 White 为培养番茄根尖而设计的。 特点：无机盐浓度较低，适于生根培养。 3、N6 培养基：1974 年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。 特点：是成分较简单，KNO3 和（NH4）2SO4 含量高，不含钼。在国内已广泛应用于小麦、 水稻及其他植物的花粉和花药培养。 (4)B5 培养基:是 1968 年由 Galmborg 等为培养大豆根细胞而设计的。 特点：是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。 (5)KM—8P 培养基:它是 1974 年为原生质体培养而设计的。 特点：是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素。 五、培养基的配制及其灭菌 1.配制方法：1、将母液按顺序摆放；2、取适量的蒸馏水(所需培养基量的 2/3)入容器 3、按需要量依次取母液及生长调节物质；4、加入蔗糖(30g/L)溶解 5、加琼脂(6-10g/L)，煮沸，2-3min；5、定容 6、调 PH 值(pH=5.8)；7、分装培养瓶，封口；8、高压灭菌 组织培养常见的灭菌方法： 消毒:是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。 灭菌:是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有 生命的物质全部杀死。 常用的灭菌方法: 物理方法:干热灭菌(烘烧和灼烧);湿热灭菌(常压或高压蒸煮);射线处理(紫外线、超声波、微 波);过滤除菌;大量无菌水冲洗 化学方法:甲醛(福尔马林)、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、升汞(氯化 汞)、酒精 培养基的灭菌－湿热灭菌法：培养基在制备后的 24h 内完成灭菌工序。 高压灭菌的原理：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断 提高，从而锅内温度也随之增加。在 108kPa 的压力下，锅内温度达 121℃。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 灭菌方法：将锅内空气完全排除后，关闭放气阀。当压力表上升达 108kPa 时，锅内温度达 121℃（在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢） ，维持 20-30min。 过滤灭(除)菌（不耐热的物质 ） ：一些生长调节剂(赤霉素、玉米素)、某些维生素是不耐热 的，常用过滤灭菌-细菌过滤器方法。防细菌滤膜网孔的直径为 0.45μ m 以下，可阻止细菌 细胞和真菌的孢子通过。GA3 空间及物体表面灭菌：(1)紫外线灭菌(2)熏蒸灭菌：熏蒸剂:甲醛和高锰酸钾。 六、组织培养的历史 虽然组织培养技术的蓬勃发展近 50 年。但它的整个历史可以追溯到上世纪初。组织培养的 发展过程大致可以分为三个阶段：萌芽阶段（从 20 世纪初至 20 世纪 30 年代中）奠基阶段 （从 20 世纪 30 年代末到 20 世纪 50 年代中） 快速发展阶段和应用阶段 （从 20 世纪 50 年代 到现代） 萌芽阶段：1.Schleiden 和 Schwann 所提出的细胞学说；2.德国植物生理学家 Haberlandt 于 1902 年提出了高等植物的器官和组织可以分割,直至分到单个细胞观点和细胞全能性观点。 3.Hannig 1904 年在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚，并使这些胚在离体条件 下长到成熟；4.Laibach
年把由亚麻种间杂交形成的不能成活的种子胚剥出，培 养至成熟，证明了胚培养在植物远缘杂交中利用的可能性。 奠基阶段(Gautheret， White 和 Nobecourt 被誉为植物组织培养的奠基人)： 1.30 年代两个重 要的发现，一是认识了 B 族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素--一种天然的 生长调节物质；2.1934 年，White 由番茄根建立了第一个活跃生长的无性系，使根的离体培 养实验首次获得了真正的成功。用 3 种 B 族维生素，即吡哆醇、硫胺素和烟酸，取代酵母 浸出液获得成功，后被称为 White 培养基。3.Gautheret（1934）在山毛柳和黑杨等形成层组 织的培养中发现只有在培养基中加入了 B 族维生素和 IAA 以后，山毛柳形成层组织的生长 才能显著增加。揭示了 B 族维生素和生长素的重要意义，1939 年连续培养胡萝卜根形成获 得首次成功。同年，white 由烟草种间杂种的瘤组织，Nobecourt 由胡萝卜也建立了类似的连 续生长的组织培养物。4. 40 年代和 50 年代初期，Skoog 等确定了腺嘌呤与生长素的比例控 制芽和根形成的主要条件之一， 利用激动素和生长素在组织培养中控制器官分化。 5.50 年代 开始以后的 10 年中，研究进展有以下 6 项：①1952 年，Morel 和 Martin 首次证实，通过茎 尖分生组织离体培养，可以由已受病毒侵染的大丽花中获得无毒植株。 ② 年， Muir 进行单细胞培养获得初步成功，对分离的单细胞进行了 “看护培养” 。实现 Haberlandt 培养单细胞可能性的这一设想。 ③1955 年， Miller 等由鲱鱼精子 DNA 中分离出细胞分裂素， 并把它定名为激动素（kinetin） 。④1957 年，Skoog 和 Miller 提出了有关植物激素控制器官 形成的概念。 ⑤1958 年，Wickson 和 Thimann 应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情 况下处于休眠状态的腋芽的生长。⑥
年，Reinert 和 Steward 分别报道，在胡萝 卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚。 这是一种不同于通过芽和根的分化而形成植株的再生方 式。现在知道有很多物种都能形成体细胞胚。在有些植物任何部分都可以得到体细胞胚，如 胡萝卜和毛茛上。 迅快发展阶段:（l）原生质体培养取得重大突破;(2)细胞融合技术应运而生;(3)花药培养取得 显著成绩;(4)微繁技术得到广泛应用;(5)转基因技术的应用 1、组织培养在农业中的应用可以有以下 10 个方面 （1）组织培养是转基因技术不可或缺的组成部分，无论是转基因受体的提供，还是转化细 胞的筛选和再生，都需要有组织培养技术作为支撑。 （2）在自花授粉作物杂交育种中，或在异花授粉作物自交系选育过程中，采用花药培养技 术不但可缩短杂合体纯合化所需的时间，而且还可以节省土地面积。（3）在某些雌雄异株植物(如石刁柏)中，若把花药培养技术包括到制种程序中去，在后代 就有可能得到均匀一致的单性群体，提高经济效益。 （4）在远缘杂交中，通过离体授粉或原生质体融合有可能克服受精前障碍，在通过幼龄合 子胚培养可以克服受精后障碍，通过体细胞融合还有可能制造出细胞质杂种。 （5）对于无药可治的病毒病，可通过茎尖培养消除病毒，这对解决马铃薯种薯退化问题能 发挥重要的作用，在其他很多植物中也可用以建立无毒原种。 （6）通过离体诱导不定芽或促进腋芽生枝，可对很多重要的园艺植物和名贵花卉、树种进 行快速繁殖。 （7）应用在细胞水平上进行突变体选择的技术，可以在一定程度上使高等植物的育种程序 微生物化，从而大大提高选择效率，节省时间和土地面积，并且不受季节的限制。 （8）体细胞无性系变异是除有性杂交和理化诱变之外的第三个变异来源。 （9）通过用人工种皮包被体细胞胚制造人工种子，为某些稀有和珍贵物种的繁殖提供了一 种高效的手段。 （10）在无性繁殖植物中，通过对茎尖分生组织等离体材料进行超低温保存，不但可以大大 节省空间，而且还可以避免病虫害的侵袭。 一、细胞全能性概述 1.植物体的每一个细胞都含有一个完整个体的全套基因，这些基因在适宜的外界条件下按照 某种特定的程序先后表达最终分化形成一个完整的植株称为细胞全能（totipotency) 细胞全能性的相对性；不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的反应； 2.植物细胞全能性：一个植物细胞所具有的产生完整植物个体的潜在能力。 3.植物细胞按照分裂能力分三类：1）在细胞周期中运转的细胞，属周期细胞 2）暂时脱离细胞周期的细胞，它们可在适当的刺激下重新进入细胞周期，进行增殖。属 G0 期细胞。 3）不可逆地脱离了细胞周期，失去分裂能力，保持生理机能的细胞，为终端化细胞. 4.一个植物细胞向分生状态恢复的程度，取决于它在自然部位上所处的位置和生理状态 脱分化能力：厚壁细胞&退化细胞&薄壁细胞&形成层&营养生长中心 5.细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现 二、细胞脱分化 1.细胞脱分化并非离体培养所特有，而是植物界普遍存在的现象。 离体外植体细胞实现全能性，首先经历脱分化使其恢复分生状态，然后进行再分化。 脱分化是分化的逆过程。 2.实现细胞全能性的方法有：1）以植物体细胞为材料，可以获得二倍体植株 可以开花国、结果。2）以植物性细胞如大小孢子体为材料，可以获得单倍体或其它倍性的 植株。3）以植物单细胞的原生质体或融合的原生质体为材料，可以获得不同倍性的植株， 甚至自然中不存在的远缘杂种。 3.细胞脱分化与愈伤组织形成：细胞脱分化是细胞生理状态的改变，脱分化细胞经过连续的 有丝分裂，形成愈伤组织。 脱分化 再分化 切取形成层→无菌接种 → 诱导愈伤组织的形成 → 试管苗的形成→培养室→移栽 4.愈伤组织形成的过程：从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期：启动期 （诱 导期） 、分裂期和形成期。三个时期愈伤组织的代谢状况、结构以及细胞的平均大小都有明 显的差别。 5.为什么要进行愈伤组织培养：1）无性繁殖并大大量扩繁被培养的植物 2）为细胞悬浮培养盒次生代谢产物生产与利用、原生质体培养和细胞融合提供易于操作的起始材料 3）为植物 体细胞无性系变异、细胞突变体筛选创造适宜的体系和基础 4）为外源基因的遗传转化提供 便于保存和利用的操作对象 5）为种质资源的保存提供新的形式 6）为离体研究植物组织和 细胞分裂、分化、代谢和状态的转变创造适宜的材料和体系 6.愈伤组织的诱导：外植体的类型与生理状态：选择细胞分化水平较低或含低分化细胞的器 官或组织；选择幼嫩、分生能力强、不含发育抑制物或其含量较低的器官或组织作为诱导愈 伤组织的外植体。外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。 培养基的选择：培养基的类型；激素含量等 其他培养条件：温度（25-28 或 28-30 、光照（光照周期 12-16h；光照强度
lx） 愈伤组织的类型：颜色：奶黄色；白色有光泽；淡绿色；黄色或褐色 是否具有胚性：胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织 7.诱导期（Induction）: 诱导期是细胞准备分裂的时期，是愈伤组织形成起点。 特点：在诱导期，代谢活化了，细胞内蛋白质和 RNA 含量迅速增加，细胞核体积明显增大。 细胞内的合成代谢迅速进行，但是细胞的大小仍然和外植体时一样，没有多大改变。 受激素作用后，分裂前细胞的主要变化有:一、呼吸作用加强，消耗氧气的量明显增加。 二、多聚核糖体的不断增加，到有丝分裂前 RNA 的含量增加 300﹪；三、蛋白质合成加快， 分裂前细胞内蛋白质的总量增加 200﹪；四、各种与分裂有关的酶活性大加强。 8.分裂期（Cell division） ：外植体中已分化的活细胞在外源激素的作用下，外植体外层细胞 出现了分裂， 由于外层细胞的迅速分裂使得这些细胞的体积缩小， 逐渐回复到分生组织状态， 因此也称为回复变化。在回复变化时，细胞通过脱分化的启动期而进入分裂，并开始形成愈 伤组织。 特征：是外层细胞进行分裂，而中间的细胞不分裂。另外细胞数目增加，体积变小；细胞核 和核仁增到最大，RNA 含量升高等。 9.形成期（Differentiation）特点：外植体细胞经过诱导期和分裂期形成了无序结构的愈伤 组织。进入形成期后，表层细胞分裂逐渐停止，内部深处细胞开始分裂，组织内部形成瘤状 的拟分生组织。形成愈伤组织形成中心或者进一步分化成为维管组织。 愈伤组织的特征：细胞分裂快，结构疏散；缺少有组织的结构；颜色浅而透明。 愈伤组织状态（优良的愈伤组织） ：1.具有旺盛的自我增殖能力；2.容易散碎，以便建立优 良的悬浮系或原生质体；3. 高度的胚性或再分化能力；4. 可以长期继代保存。 10.影响细胞脱分化因素:1.外植体本身损伤;2.生长调节剂;3.光照;4.细胞位置 5.外植体的生理状态;6.植物种类差异;7.基因型 11.外植体褐变:多酚氧化酶是植物体内普遍存在的一类末端氧化酶，它催化酚类化合物形成 醌和水，醌再经非酶促聚合形成深色物质，对植物体材料产生毒害作用。 褐变的影响因素：1、植物种类及基因型。2、外植体的部位及生理状态。3、外植体的受伤 程度。4 培养基的成分和培养条件。5、培养时间过长 防止褐变的方法：1、选择适宜的外植体 2、对外植体进行处理，如先进行低温处理，再放 入只含糖的琼脂培养基中，使酚类物质渗入到培养基中。3、选择适宜的培养基和培养条件 4、添加褐变抑制剂和吸附剂。如维生素 C 等 5、连续转移。减轻酚类化合物的毒害。 12.玻璃化现象：在进行植物组织培养时，经常会出现试管苗生长异常，叶等出现透明或半 透明的水浸状植物矮小肿胀，失绿等现象称为玻璃化现象。原因复杂没有定论。 防止玻璃化措施：1、 增加琼脂浓度。2、 提高糖的含量或加入渗透剂， 降低培养基中渗透势， 减少植物材料可获得的水分。3、降低培养基中细胞分裂素的含量 4、增加光照、控制温度、改善通风换气条件。 三、细胞再分化1.细胞水平的再分化;组织水平的再分化;官水平的再分化（又称器官发生） 2.影响细胞再分化因素:关键：维管组织的分化（生长素、蔗糖浓度、细胞分裂素和赤霉素、 物理因子）;同种类植物的再生能力差异；再生条件没有完全掌握； 影响因子与脱分化因子基本一致。 3.器官发生: 在离体的培养条件下，植物的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不 定芽等器官的过程。 器官发生方式:1.先分化芽，再分化根；2.先分化根，再分化芽；3.在愈伤组织块的不同部位 上分化出根和芽 器官型--外植体本身存在器官原基（茎尖、根尖） 器官发生的解剖学:两种途径 器官发生型--外植体→形成愈伤组织→器官原基及器官 形成 4.影响器官分化的因素: 培养基成分：矿质元素 有机成分 激素组合 环境条件：光照 温度 湿度 植株材料： 品种基因型的差异 材料的生理状况 培养基成分:矿质元素及其他有机成分 矿质元素促进器官发生； 糖维持培养基的渗透压 提供碳源和能源 5.植物激素的应用规律: 1）先生长素，后细胞分裂素，有利于细胞分裂，但细胞不分化。容易产生多倍体细胞。 2）先细胞分裂素，后生长素，细胞分裂也分化。 3）生长素和细胞分裂素同时处理，分化频率提高。但两者同时存在的用量比值可以改变形 态建成方向。 4)生长素/细胞分裂素：比值高时，有利于根分化； 比值低时，有利于芽分化，抑制根形成； 比值适中时，促进愈伤组织生长。 激素控制器官分化的模式图: 高生长激素（2,4-D） 高细胞分裂素/生长素 低细胞分裂素/生长素 外植体→脱分化 → 形成愈伤组织 → 再分化→分化成芽 → 分化成根→完 整植株 植物激素的应用浓度：①离体培养条件下，生长素应用的浓度范围为 0.1-15mg/L。 在细胞脱分化过程中，启动细胞分裂形成愈伤组织，以 2,4-D 最为有效，使用范围在 0.5-15mg/L。一般规律是：细胞脱分化需要高浓度的 2,4-D，当胚性细胞形成转入再分化时， 则需较低的 2,4-D 浓度。 ②细胞分裂素在离体培养条件下，既可诱导细胞分裂，又可调节细胞分化。使用浓度范围为 0.1-10mg/L。 6.培养基的渗透压：离体培养中培养基渗透压是影响植物细胞脱分化、再分化的重要因素； 培养基渗透压是由培养基中各种物质的总浓度决定的； 培养细胞是通过细胞渗透来吸取营养 的，当培养材料和培养基之间处于等渗时，或培养材料的渗透压略低于培养基渗透压时，培 养材料才可能汲取养分和水分。 渗透压调节物质及其应用：糖对渗透压起决定作用，其次甘露醇、盐类也可影响渗透压。 ①不同植物类细胞脱分化和再分化所需糖浓度不同，多数植物种适宜糖浓度为 2-6%； ②培养目的不同要求糖浓度不同：诱导器官脱分化形成愈伤组织为 3%-6%，愈伤组织芽分 化为 3%-6%，根分化为 2%-3%； ③培养方式不同对糖浓度的要求不同。 7.培养基的酸碱度： 调节培养基酸碱度的意义：离体条件下，培养基酸碱度与植物细胞脱分化、再分化和器官发生有着密切的关系。植物组织和细胞在离体培养条件下，失去自行调节的能力。 调节方法如下：pH 测定计测定、pH 值试纸比色测定，用 1mol/LHCl 或 KOH 进行调节。 8.器官发生环境条件：光照 包括光强、光质和光周期。 光强 lx，光周期 12-16h，近紫外和蓝紫光促进芽的发生，红光促进生根。 温度 25℃适于器官发生，应考虑原产地、昼夜温差、低温预处理 湿度 70-80% 9.器官发生植物材料：品种基因型的差异 材料生理状况 生理状态年轻，来源于生长活跃或生长潜力大的组织和器官的细胞更有利 于培养 四、体细胞胚胎发生 1.双子叶植物的胚胎发育过程：(A) 伸长期合子；(B) 合子经过第一次分裂, 产生 1 个顶细 胞(绿色)和一个基细胞(粉红色)；(C) 四分体胚: 顶细胞经历 2 次纵向分裂，产生含有 4 个 细胞的胚体和 2 个细胞的胚柄；(D) 16 细胞球形胚: 8 细胞胚的所有细胞经过 1 次平周分 裂, 产生包含 8 个细胞的表皮原和 8 个细胞的内部组织；(E) 早期心形胚；(F) 心形胚: 子 叶和胚根原基已经出现；(G) 成熟胚胎。 2.体细胞胚胎发生概念与特点 概念：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培 养的细胞是体细胞还是生殖细胞） ，统称为体细胞胚或胚状体。 特点:离体产物 起源于非合子胚 经过胚胎发育过程 3.体细胞胚的产生 单细胞悬浮培养 原生质体培养 组织器官培养 体 细 胞 胚 花 粉 胚非 合 子 胚花粉培养非 合 子 细 胞合子胚 无融合生殖胚 大多数植物组织培养， 单细胞悬浮培养、 原生质体培养和花粉培养中都观察到体细胞胚胎发 生或花粉胚胎发生（pollen embryogenesis） **前者为二倍体的体细胞产生的胚状结构 **后者是由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生的体细胞胚，通常称花粉胚（pollen embryos） ，可发育成单倍体植株。 体细胞胚或花粉胚都是指在植物组织培养中起源于一个非合子细胞， 经过胚胎发生和胚胎发 育过程形成的胚状结构，包括以下几点含义： 1、体细胞胚是组织培养的产物，区别于无融合生殖的胚，只限于在组织培养范围使用； 2、体细胞胚起源于非合子细胞，区别于合子胚； 3、体细胞胚的形成经历胚胎发育过程，区别于组织培养的器官发生中芽与根的分化。 4.植物体细胞胚胎发生和诱导器官发生相比具有明显的特点： 1、具有两极性; 2、存在生理隔离; 3、遗传性相对稳定; 4、卵形态发生的特性5.体细胞胚胎发生的方式: **植物组织培养过程中植物体细胞胚胎途径可归纳为两类：直接途径和间接途径。 **直接途径是直接从原外植体不经愈伤组织阶段发育而成 **间接方式是体胚从愈伤组织或悬浮细胞、有时也从已形成的体胚的一组细胞中发育而成， 如香雪兰（Freesia refracta）花序外植体经直接体细胞胚胎发生途径形成再生植株。 6.体细胞胚发生的途径及类:1)途径 直接途径： 从外植体某个部位直接诱导分化出体细胞胚 间接途径：首先形成愈伤组织，其后在愈伤组织表面分化形成体细胞胚。胚性细胞团特征：成簇、成团，体积小，细胞质致密 7.体细胞胚与器官发生形成个体的途径相比：体细胞胚发育再生植株有两个明显的特点。 一是体细胞胚具有双极性（doublepolarity） ，二是遗传的稳定性：胚状体起源于单细胞或细 胞团，在产生和发育过程中一旦形成即通过了分化过程，结构即稳定，细胞变异的频率低， 成苗率高，遗传稳定性好。 8.体细胞胚的单细胞起源:在同一块愈伤组织或一个胚性细胞复合体上可以观察到多个不同 发育时期的体细胞胚，从单个原始细胞到多细胞的原胚、球形胚、鱼雷胚直至具子叶的胚状 体，这是由体细胞胚发生和分裂的不同步所致。 9.体细胞胚与合子胚的比较:合子胚在发育初期具有明显的胚柄，而体细胞胚一般没有真正 的胚柄只有类似胚柄的结构。 特别是那些发育初期类似于动物胚胎发育途径的体细胞胚， 这 一点更为明显;合子胚的子叶是相当规范的，可以作为分类的依据，而体细胞胚的子叶常不 规范，有时具有两片以上的子叶。与相同植物比较，体细胞胚的体积明显小于合子胚。 体细胞胚没有休眠而直接形成植株。 合子胚在胚胎发育完全进入子叶期以后， 经过一系列的 物质积累和脱水就进入休眠。 10.、影响体细胞胚胎发生的因素:植物种类和基因型; 培养材料的生理状态; 培养基; 培养条件:低温 1)基因型与体细胞胚发生 2)植物激素与体细胞胚发生①内源激素与体细胞胚发生 ②外源激素与体细胞胚发生 a.2，4-D 与体细胞胚发生;b.其它生长激素与体细胞胚发生 除 2,4-D 外，ABA 对植物体细胞胚的发生也起到重要的调控作用。 3)多胺（腐胺、尸胺、亚精胺、高亚精胺、精胺等）和乙烯与体细胞胚发生 4)糖类和金属离子与体细胞胚发生 5)外植体与体细胞胚发生 6)体细胞胚的产生要求培养基中含有一定浓度的还原态氮 第三章 植物胚胎培养：胚、胚乳、子房、胚珠进行离体培养，使其发育成完整植株 1.胚培养的概念：胚培养(Embryo Culture)：是将胚从胚珠或种子中取出，置于适宜的培养基生长；包括未成 熟胚和成熟胚两种类型的离体培养． 胚挽救(Embryo Rescue)：是由于营养或生理原因造成难以播种成苗或在发育早期阶段就败 育或退化的胚进行早期离体培养． 1）杂种幼胚在人工培养基上培养 2）杂种幼胚的胚乳看护培养 3）杂种幼胚的愈伤组织培养 2.胚的发育：植物在受精后就开始胚发育。由于胚处在胚囊中，胚囊可以供给胚发育的特殊 营养物质。胚的发育包括：原胚时期-球型胚-心型胚-鱼雷胚-成熟胚。 胚发育越小，培养时就需要更多更复杂的营养物质。 3.体细胞胚胎/体细胞胚（胚状体）概念：指在组织培养中起源于一个非合子细胞、经过胚 胎发生和发育途径（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚 5 个时期） ，形成具有双 极性的胚状结构。 4.胚发育可分为异养和自养两个阶段: 异养阶段:在此阶段,胚主要依靠胚乳及周围的母体组织吸取养分. 自养阶段:开始于心形胚后期，此时，胚在代谢上已能由基本的无机盐和糖合成生长所需要 的物质. 原胚-球型胚-心形胚-鱼雷胚-成熟胚-小苗 5.胚培养的意义:1)用于胚的挽救获得远缘杂种; 2)打破种子休眠，缩短育种年限; 3)诱导胚状体及胚性愈伤组织; 4)种子生活力的快速测定; 5)稀有植物的繁殖 6.胚培养的类型: 成熟胚培养:成熟胚一般指从种子中剥离的发育完全的胚。它培养容易成功,成熟胚材料不受 季节性限制。实质是胚的离体萌发过程 离休胚培养的发育方式 ： 1)合子胚发育途径；由合子形成球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶形胚，形成完整的种子， 成苗 2)“胚”的早熟萌发；幼胚离体培养不是促进胚正常发育成熟形成幼苗，而是以幼小的胚的 形态早熟萌发形成畸形苗。苗的根、茎、叶俱全，但子叶中几乎无营养积累而极端瘦弱，在 培养中适当调整培养基配方可以防止早熟萌发 3)脱分化形成愈伤组织。幼小的胚在离体培养时多数情况下脱分化形成愈伤组织。主要原因 为培养基中成分不适宜 7.按正常胚胎发育途径形成植株: 成熟胚→正常发育形成小苗 未成熟胚→维持胚的生长，进行正常的胚胎发育成熟，完成胚胎发育的全过程 8.愈伤组织途径: 激素浓度高 分化培养基 离体胚 → 愈伤组织 → 胚状体或不定芽→小植株 9.胚“ 早熟萌发” ：离体的幼胚在培养基上不能长出成熟胚的各种结构，越过正常胚胎发生 过程中的若干阶段，直接长成弱小的幼苗，只具有离体时已有的结构。 10.成熟胚的培养 1）材料的消毒与接种 2）培养基 大量元素和微量的无机盐为基本成分 谷氨酰胺作为氮源，可以促进胚生长 植物天然浸提物（YE）促进胚生长 附加成分硫氨素促进胚根的伸长 生长素低浓度促进胚的发育（胚根） 赤霉素促进有后熟作用的种子萌发3）培养条件：pH 一般为 5.2-6.3、加热灭菌后 PH 通常会下降；12 小时光照和 25C，热带兰 花杂交种胚 30C 11.幼胚培养方法： （一）材料的选择与灭菌：取材时期：大多数幼胚成功的实例证明，适宜于幼胚发育时期 多为心形胚至鱼雷形胚。 （在解剖镜下观察，摸索植物的授粉天数与胚胎发育的对应关系） 。 操作：取回大田或温室里授粉受精后的植物子房，用 70%的酒精进行表面消毒，再用 0.1% 氯化汞灭菌 10-30min，用无菌水冲洗 3-4 次，即可用于胚的分离和培养。 次氯酸钠：5%的次氯酸钠处理 10min 用无菌水冲洗 3-4 次，即可用于胚的分离和培养。 胚龄和胚的发育形态：一般认为胚龄是影响胚培养成功的关键因素之一。 1、球型胚:成苗少,苗发育不良,缺叶绿素,子叶不发生。 2、心型胚:叶小白色,真叶发生需 3-4 周,后面的生长也不良。 3、鱼雷胚:叶绿色,展开的子叶大,苗发育较前两时期好。 （二）幼胚的分离及培养：幼胚剥离：幼胚剥离是关键的关键，幼胚是一种半透明、高粘稠 状组织，剥离过程极易失水干缩，因此操作速度要迅速。胚柄参与幼胚的发育，取材时应带 胚柄。 接种培养：了解培养对象的特性，比如休眠、春化作用、胚萌发温度等 葡萄胚挽救的几个步骤图例： a.取材料：材料处理，灭菌剥胚；2）取胚；3）胚发育阶段；4）正常成苗； 5）培养室炼苗；6）温室炼苗；7）移栽大田，生长为壮苗 12.幼胚培养的关键技术： 取材时期、幼胚剥离、培养基设计、培养条件的控制（是否需要特殊处理） 13.幼胚培养条件： 1）培养基：基本培养基：MS N6 White 等 糖的作用：蔗糖是最好的碳源之一，主要调解渗透压的作用 无机氮以硝酸盐、铵盐的形式存在可以提高钾和钙的浓度 氨基酸：谷氨酰胺刺激胚的生长；水解蛋白 维生素：促进幼胚的早期发育 植物生长调节剂 天然有机物：胚乳看护培养：大麦离体胚，在含有同种胚乳的培养基中，对胚的生长促进。 大麦离体胚，在含有异种胚乳的培养基中，对胚的生长促进作用更强。 大麦×黑麦杂交胚，在含有大麦胚乳的培养基中，成苗率提高 30-40% 2）环境条件：温度：胚培养 25-30℃；光照：黑暗或弱光，光对胚胎发育有轻微抑制作用 3）植物材料：胚柄→胚柄是一个短命结构，球形胚时期，胚柄发育成最大。 胚柄参与幼胚的发育 5mg/L 赤霉素能有效的取代胚柄的作用 14.植物胚乳培养 含义：将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术。 被子植物的胚乳是三倍体由两个中央极核与一个精核结合而成；裸子植物的胚乳是单倍体 （由大孢子发育而来） 。 胚乳的产生：被子植物双受精后，受精卵发育成胚，受精极核发育成胚乳15.胚乳培养的探讨：1）胚乳培养的最早研究始于 1933 年，Lampe 和 Mills 首例进行了玉 米胚乳培养。 ；2）胚乳细胞的全能性。3）大多数被子植物的胚乳是三倍体，能否通过胚乳 培养获得三倍体植株而得到无籽果实；通过胚乳培养技术，探索改良农、林及园艺植物三倍 体育种技术的可能性。4）研究离体培养条件下胚和胚乳的关系。5）胚乳细胞是研究淀粉、 蛋白质和脂类天然产物代谢途径的理想系统。 目前研究概况：12 科，40 多种。1）蔷薇科：苹果，梨，桃。2）禾本科：大麦、玉米和水 稻。3）茄科：枸杞、马铃薯。 16.胚乳培养方法：1）胚乳外植体的选择制备。游离核型期材料难以培养，而细胞型期的材 料易于成功。从盛花期后胚乳组织进入细胞型期的是时间玉米为 8-12 天，小麦为 8 天，黄 瓜为 7-16 天 2）胚乳愈伤组织的诱导及器官分化： （1）器官发生途径，先生成芽后生成根。 （2）胚胎发生途径，在愈伤组织上直接生成胚状体，后生成小苗。 17.影响胚乳细胞染色体稳定性的因素：胚乳类型、胚乳愈伤组织发生位置、培养基中外源 激素的种类和水平、 外源激素的配比不仅决定胚乳细胞的增值和分化还影响胚乳细胞染色体 的倍性变化 造成染色体倍性变化的主要原因有： 培养基中的外源激素；继代的次数越多，倍性越不稳定。 18.胚乳外植体的制备：有较大的胚乳的种子，消毒剥去种皮，培养；胚乳外有粘性物质包 裹的，消毒、去皮、去粘液，取出胚乳组织培养；有果实的种子，将果实消毒，切开幼果， 取出种子，分离出胚乳组织进行培养 19.胚乳愈伤组织的建立：1）愈伤组织诱导 胚乳接种到培养基上 6-7d，细胞分裂，形成原 始细胞团，即为愈伤组织。2）形态建成 器官发生：巴豆(先根)、麻风树（先芽）最后在分 化培养基上没能发育成小植株。要分化必须选择特定的激素和附加物。例如（枸杞：BA、 BA+NAA 分化 77-85%：猕猴桃：ZT） ；体胚发生：柑橘、桃、枣 20.三倍体后代特征：1）形态特征 被子植物通过胚乳培养得到三倍体植株，产生无籽果实。 2）胚乳再生植株的倍性 染色体常常发生变化；同一植株往往是不同倍性的嵌合体；倍性 混乱在胚乳培养中相当普遍； 3）影响倍性因素：胚乳类型、胚乳愈伤组织发生部位、培养基外源激素 21.影响胚乳培养的因素：1）植物外植体：胚乳发生类型和发育程度，胚在胚乳培养中的作 用；2）培养基与激素；3）培养条件 22.胚乳的发育类型： （时间: 早于胚的发育，一般不经过休眠） 类型:核型胚乳、细胞型胚乳、沼生目型胚乳 1）核型胚乳:普遍的形式，先期核多次分裂（胚乳核） ，但不形成细胞壁，称为游离核形成 期。 发育后期产生细胞壁， 形成胚乳细胞。 单子叶植物、 双子叶植物的离瓣花(schizopetalous flower)为核型胚乳。 2）细胞型胚乳：无游离状态，核的分裂伴随壁的形成。双子叶的合瓣花（烟草、番茄） 3）沼生目型胚乳：第一次分裂形成 2 个细胞（即珠孔室、合点室） ，但接着进行多次游离 核分裂，在发育后期只有珠孔室能形成细胞壁。 23.胚乳发育时期的影响： 1）发育早期的胚乳，接种不方便，愈伤组织的诱导频率很低。 2） 处于旺盛生长期的胚乳， 离体条件下最易诱导产生愈伤组织， 诱导率最高， 可达 90-95% 。 3）接近成熟或完全成熟的胚乳，愈伤组织诱导频率很低。 24.胚在胚乳培养中的作用： （胚乳培养中两种方式：带胚培养和不带胚培养） 带胚培养（早期胚乳）更容易形成愈伤组织。处于生长旺盛期的不需要，生理活性微弱的胚 乳(完全成熟的胚乳）必须借助于胚的增殖作用，赤霉素可替代胚的作用25.培养基与培养条件：培养基：MS、水解酪蛋白、酵母提取物、蔗糖、外源激素、pH； 温度：25℃；光照：因物种而异 26.胚乳离体培养的意义：1）胚乳培养再生植株指明了全能性理论；2）研究胚和胚乳的关 系及胚乳的组织功能；3）再生植株多为三倍体，产生无籽果实；4）可以从胚乳愈伤中分 离和筛选各种类型的非整倍体的植株；5）胚乳细胞是研究淀粉、脂类和蛋白质天然产物代 谢途径的理想系统 27.胚珠培养：含义：将胚珠从母体上分离出来，在人工控制下，进行离体培养，使其生长 发育形成幼苗的技术。 类型：受精胚珠培养、未受精胚珠培养 一）胚珠培养方法： 1.材料的选择和灭菌：培养受精胚珠：从大田或温室取回授粉时间合适的子房； 培养未受精胚珠：取授粉前时间合适的子房；消毒后，用解剖刀沿子房纵轴切开， 取出一个个胚珠（可带胎座） ，接种。 2.培养基对胚珠培养的影响 3.胎座和子房对胚珠培养的影响 4.胚发育时期的影响 二)培养基对胚珠培养的影响：椰子汁、酵母提取物、水解酪蛋白、氨基酸、蔗糖等 矮牵牛胚珠培养：授粉后 7d，胚珠处于球形胚期，剥离后放在蔗糖浓度 4% -10%的培养基 上，可发育成成熟的种子。 三）胎座和子房对胚珠培养的影响：胎座和子房的某些组织在胚珠发育初期起着重要作用 四） 胚发育时期的影响：球形胚时期 〉合子和原胚时期 28.子房培养：含义：将子房从母体上分离下来，置于培养基上，使其发育成幼苗的技术。 子房：由子房壁、胎座、胚珠组成 培养方法：外植体的制备与胚珠培养方法相似； 培养基； 椰子汁、酵母提取物（YE） 族维生素 IAA 、B 第四节 植物离体授粉 1.含义：在人工控制下将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定 的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术，也称试管受精，离体受精。 方法：离体柱头授粉、离体子房授粉、离体胚珠授粉 2. 离体授粉的方法：. 实验材料的选择：选用子房大有多个胚珠的植物，如茄科、玉米 多保留母体花器官组织有利于离体授粉成功。 离体授粉程序 确定时间—去雄套袋---制备无菌子房或胚珠—制备无菌花粉---试管授粉 一）胚珠试管受精 1）取胚珠，将子房表面消毒，在无菌的条件下将子房剥下，除去花托， 取出带胚座的裸露胚珠，接种于配好的培养基上。 2）人工授粉，一种是在接种好的胚珠表面授以无菌的花粉，二是先培养花粉，然后将胚珠 接种在有花粉的培养基上。钙、硼离子对花粉萌发和花分管生长的促进有重要作用 二）子房离体授粉 通过人工的方法把花粉直接引入子房使花粉粒在子房腔内萌发并完成受 精过程。这样可以使花粉管不经过柱头和花柱组织，直接进入子房中的胚珠，有可能 克服孢子体不亲和现象，从而获得远缘杂交种。 1）直接引入法，用刀片在子房壁上开个切口，把花粉悬浮液滴于切口处 2）注射法，在子房上切 2 个注射孔，一个在子房顶端，一个在其对面靠近 子房基部，用注射器吸取花粉悬液从基部注射孔注入。当从另一端溢出时，用 凡士林封闭两个孔，将子房接种于培养基上。 三）雌蕊离体授粉，在花药尚未开列开裂时切取母本花蕾，消毒后在无菌的条件下除去花瓣、雄蕊、保留萼片，将整个雌蕊接种于培养基上，在培养的当天或 次日在其柱头上授以无菌的父本花粉。 3.影响离体授粉受精的因素：1）外植体的发育阶段→柱头和花柱的影响；胎座的影响； 外植体的生理状态；2）培养基及授粉方式 White MS；3.）培养条件及培养前预处理 20-25℃，弱光，低温处理可能有利于某些未受精的胚珠与了房离体培养形成单倍体植株。 4）基因型；5）花粉粒的数量及萌发力 第四章 植物细胞培养 1.植物细胞培养（plant cell culture） ：指对植物器官或愈伤组织上分离出来的单细胞(或小 细胞团)进行培养，形成单细无性系或再生植物的技术。 优点：操作简便、重复性好、群体大等。 分类：1）根据规模：小规模培养、大批量培养；2）根据培养方式：悬浮培养、平板培养、 看护培养、纸桥培养法 3）根据要求的产物：诱变的细胞培养、生产次生产物的细胞培养 2.植物细胞培养的特性:1）植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁; 2）培养过程 生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素； 3）细胞生长的中期及对数期．易凝聚为 团块，不能象微生物一样均匀分散，悬浮培养较难； 4）培养时需供氧; 5）因为有细胞 壁, 培养细胞产物滞留于细胞内，产量较低； 6）细胞培养过程有结构与功能全能性,因而 易分化; 7）悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否则不生长（ 个/ML） 。 3.植物细胞培养需要解决的问题:1）氧和二氧化碳的控制，过多氧过少氧均不利于生长； （2）营养物的供应； 3）细胞密度过高引起细胞团聚甚至分化，培养过程中细胞的分化 的防止; 4）细胞取得中微生物的去除； 4.植物细胞培养的意义：1）研究细胞生理代谢过程及各种影响因子； 2）用于植物品种的改良； 3）用于植物次生代谢物质的生产。 5.细胞培养过程：1)择适宜的外植体； 2)诱导疏松愈伤组织； 3)选择适宜的培养基； 4)悬浮培养； 5)悬浮细胞的继代与选择； 6)悬浮细胞的同步化； 7)悬浮愈伤组织形成及植株再生。 第一节 悬浮培养 1.含义： 将单个游离单细胞或小细胞团按一定密度悬浮在液体培养基中进行悬浮培养增殖的 技术。由愈伤组织液体培养技术发展而来。 2.特点：1)培养细胞可不断增殖，且生长速度快，适于大规模培养及工业化生产有用的细胞 次生代谢产物。 2)在液体培养基中，细胞和营养物质充分接触，细胞状态相对保持一致。 3)大规模悬浮培养成本较高， 因为它需要配置大型摇床、 转床、 连续培养装置、 生物反应器、 倒置显微镜等特殊设备。 3.分批培养（Batch culture）: 1)含义：是在一个封闭的系统中进行细胞培养，当培养物增加到一定量时，需继代培养，即 取出少量培养物转接于新鲜培养液中。 2)特点：培养基体积固定；培养过程中，细胞生长，其数目 不断发生变化，呈 S 增长。 （生长过程与微生物类似，有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶段。接种时细胞要 达到一定细胞浓度，通常为 0. 25 x l06 细胞／ml -0. 5 x 106 细胞／m1。 ） 4.继代的方法和最佳时期： 继代方法： 用注射器或移管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物， 并移到含有新 鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。 最佳继代时期：了解细胞数目增长变化 S 形曲线后，选择对数生长期和直线生长期！ 5.细胞生长曲线：在整个培养过程中，细胞数目不断发生变化，呈现出明显的由慢到快，再 到慢，最后增长停止的细胞周期。细胞的生长呈 S 型曲线6.细胞生长各个时期的特点： 1）滞后期（延迟期） ：细胞很少分裂，其长短与接种量大小和继代时原种细胞所处的生长 期有关 2）对数生长期：细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变 3）直线生长期：细胞生长和发育最明显的时期 4）缓慢期：生长逐渐缓慢：培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少 5）静止期：生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。 讨论： 1）滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量 的多少。 2）加入条件培养基可以缩短滞后期（条件培养基：曾培养过一段时间组织或细 胞的培养基） ；3）缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长期。 4）如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。 操作注意事项：1）对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞 团（2- 4 细胞） ，使用吸管或注射器。2）继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再 吸上层悬浮液。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。 7.连续培养(Continuous culture):是用一定容积的非密闭系统进行细胞培养的方法， 在培养 过程中不断注入新鲜培养基，而使营养物连续得到补充，细胞生长和增殖连续进行，同时有 等体积的培养物排除系统。 （分为封闭型和开放型连续培养两种） 加入培养基=排出培养基及其培养物 8.开放式和封闭式区别：封闭式：排出液中的细胞用机械方法收集后，又放入原培养基，所 以其培养细胞数目不断增加； 开放式：在注入新鲜培养基的同时，培养细胞随同培养液一 起流出，培养细胞数目保持恒定；通过调节流入和流出的速度，使培养物的生长速度永远保 持接近最高值的恒定水平上。 9.连续培养意义：1）植物细胞代谢调节的研究（某种生长限速浓度－细胞生长的影响） ； 2)次生物质的大量生产。 10.细胞培养的特性：1)植物细胞较微生物细胞大，具有纤维素细胞壁。 2)细胞生长速度 慢，易受微生物污染，有时需用抗生素；3)细胞生长的中期及对数期，易凝聚为直径达 350 um 一 400 um 的团块，悬浮培养较困难； 4)培养时需供氧，培养液粘度大，不能耐受强 力通风搅拌；并具有群体效应; 5)培养细胞产物滞留于细胞内，且产量较低，培养过程具 有结构与功能全能性。 11.悬浮培养步骤:一)愈伤组织诱导; 二)悬浮系的建立与继代培养; 三)悬浮细胞的生长动态; 四)悬浮培养细胞的同步化 12.细胞的悬浮培养(cell suspension culture) :是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度， 悬浮在液体培养基中进行培养的方法。 适宜于大规模培养，细胞工程产业的技术基础。 13.起始悬浮液的制备: 愈伤组织(质地疏松，细胞分散程度大；质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养)→ 液体培养基→摇床振荡(转速 30-150rpm)→悬浮培养 14.悬浮培养中起始物的建立:①选择适宜的外植体：幼胚、下胚轴、子叶。②选择适宜的培 养基：较高浓度；必要的附加物质。③愈伤组织的要求：松散性好，增殖快，再生性强。 15.悬浮系的建立与继代（成功的悬浮体系）:悬浮培养物分散性良好，细胞团较小；均一性 好，细胞形状和细胞团大小大致相同；细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般 2-3 天增加 1 倍。 16.悬浮培养细胞的同步化:细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞 胞 培 周期的某一特定时期。 数 养 5 目 细 4 3 1 2方法：分选法 — 梯度离心、过滤; 饥饿法 — N、P 同时饥饿处理一种海藻 50 h，有 二分之一的细胞处于 G1 期。 加入 DNA 合成抑制剂， 5-氨基尿嘧啶。 如 细胞不能合成 DNA， 处于 G1 和 S 期。 低温处理 -- 4℃DNA 合成受阻，细胞趋向 G1 期 17.影响细胞悬浮培养的因素: 1)基本培养基的组成:a 氮 硝酸盐是最常用的氮源。 氮的吸收取决于培养基的 PH 培养物的 年龄低浓度的氮刺激细胞分裂导致大量小细胞的形成，而高浓度的氮有利于细胞生长。 b 磷 植物细胞能以各种方式吸收磷，其浓度是细胞分裂和生长的限制因子，它与由核苷 酸库（ATP,ADP,AMP）所引起的能量水平以及 RNA,DNA 合成直接相关磷能抑制游离氨基 酸的积累。 c 硫 硫的缺失使所有蛋白质合成自动停止。 2)有机成分 氨基酸类、维生素类; 3)碳源 碳水化合物，二氧化碳; 4)植物激素 生长素，细胞分裂素，乙烯; 5)PH 及渗透压 6、培养基成分、振荡频率 第二节 单细胞培养 1.单倍体细胞培养主要包括三个方面： 1)花药培养； 2)小孢子培养； 3)为末受精的子房和卵细胞培养。 2.诱发植物产生单倍体主要方法：1)种间和属间杂交; 2)物理照射和化学诱变; 3)双生苗 的筛选； 4）花药和花粉培养。可产生单倍体胚，或者先诱导单体愈伤组织再经适当途 径产生单倍体植株。 3.单细胞培养方法：对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通 过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直到长成完整植株的技术。 ●细胞平板培养●看护培养●微室培养●纸桥培养法 4.单细胞的分离:由完整的植物器官分离单细胞; 由培养组织（如愈伤组织）中分离单细胞 由完整的植物器官分离单细胞:叶片是分离单细胞的最好材料(机械法、酶解法) 机械法和酶解法比较： 机械法：细胞不受到酶的伤害； 不用质壁分离； 细胞产量低； 细胞易破 酶解法：细胞受到酶的伤害； 要质壁分离； 细胞产量高； 细胞不易破。 由培养组织（愈伤组织）分离单细胞： 步骤：1）诱导产生愈伤组织；2 ）愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的 松散性； 由愈伤组织分离单细胞的方法：1）将未分化、易散碎的愈伤组织转到有液体培养基的三角 瓶中，80-100RPM/进行振荡培养，获得悬浮细胞液。 2）用孔径为 200um 的无菌网过 滤， 4000RPM/M 离心， 除去比单细胞小的碎片， 获得纯净的细胞悬浮液。 3） 60-100UM 用 的网过滤，再用 20-30UM 的网过滤，离心除去细胞碎片。 4）回收获得的单细胞，并用 液体培养基洗衣净，可用于培养。 5.植物单细胞培养方法： （影响单细胞培养的因素：一是培养基的成分；二是细胞直板密度） 一） 平板培养法： 分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的培养皿内的培养过程称为平板 培养法。 优点：①单细胞在培养基中分布均匀，便于在显微镜下对细胞进行定点观察，是单细胞筛选 和突变体筛选的常用方法。 ②由于它具有筛选效率高、筛选量大、操作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、分化、生 理生化、遗传变异、次生代谢产物合成等。 缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。 二）看护培养： 指利用生长的愈伤组织所产生的物质来培养单细胞或者异种愈伤组织等的方 法 三）微室培养:在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法。 优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程。 缺点：培养基少，营养和水分难以保持，PH 变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。 四）纸桥培养法：是指植物茎尖分生组织培养常用的方法，有时也可用于单细胞培养。 具体做法是：将滤纸的两端浸入液体培养基中，使滤纸中间部分露出培养基表面，将所要培 养的细胞放在滤纸的表面上培养。 6.单倍体的应用价值：1）在植物育种中使后代迅速纯合; 2）提高选择效率 3)排除杂种优势对后代的影响; 4)遗传研究的良好实验材料体系 5)突变体的筛选; 6)消除致死原因; 7)选育新型自交系 8)遗传转化的受体材料; 9)基因表达研究的良好材料 第三节 培养细胞的次生代谢及产物积累 1.概述:植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合 物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。 次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢 2.植物产生代谢产物的类型 植物次生产物种类繁多（据保守估计已超过 2 万种） ，根据分子结构不同大致分为： 酚类化合物--黄酮类、单酚类、醌 类（苯醌、萘醌、蒽醌） 萜类化合物--三萜皂甙、甾体皂甙、单萜、倍半萜、二萜 含氮化合物--生物碱（真生物碱、伪生物碱、原生物碱） 3.植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。 4.规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径 保护生态环境、提高生产效率、发展新型生物技术产业 5.次生代谢产物的工业化生产：20 世纪 40 年代后期，J.Bonner 首次报道银胶菊植物组织 可获得橡胶。20 世纪 80 年代以来，细胞大规模培养生产有用的物质，如药物、食品、调料、 香精、颜料等再生资源。 6.药源问题解决办法 一）人工栽培：采用种子繁殖、扦插等无性繁殖方法快速、大面积人工繁育红豆杉幼苗 寻找红豆衫的替代物：从红豆杉非树皮部位提取；产紫杉醇的非红豆杉植物 优点：生长周期缩短、简便、直接 缺点：1、紫杉醇含量低、生长缓慢； 2、提取工艺复杂 二）化学合成 全合成 1994 年获得成功 现有六种途径 缺点：1、合成过程烦琐复杂，几十步 2、费用高，化学试剂昂贵 3、总收率太低（2%） 半合成以 10-DABⅢ和 Baccatin Ⅲ作为半合成原料获得紫杉醇，新方法用 10-DAT 优点：1、原料枝叶含量丰富、 提取相对容易，充分利用再生资源； 2、产率高； 3、最具实用价值可以工业化生产； 4、获取紫杉醇构效关系信息，进行结构改造 缺点：合成过程相对复杂（11 步化学转化和 7 步分离） 三）生物方法 组织和细胞培养 微生物发酵 优点：1、摆脱自然因素，可长期稳定生长； 2、适应市场、方便调节；3、成分简单， 有利于分离纯化；4、成本低、生长周期短；5、为半合成提供原料；6、有望工业化生产 缺点：1、产量低、不稳定； 2、工业化放大研究 生物合成研究阶段：红豆杉生物合成途径基本明确；10 种相关酶基因被克隆表达；利用基因工程手段改造红豆杉提高紫杉醇产量 7.次生代谢、分子生物学与组织培养的联系:植物为人类社会生存和发展提供了丰富的食物 和药品来源。人们已知的 3 万多种天然产物中有 80%来源于植物。就药物而言，全美药方 中四分之一的药品来源于植物次生代谢产物。 Kossel 明确提出了植物次生代谢(secondary metabolism）的概念，认为次生代谢是植物体 利用某些初生代谢产物为“原料” ，在一系列酶的催化下，形成一些特殊的化学物质有别于 初生代谢的一类特殊而复杂的代谢过程。 简单酚类 酪醇 植 酚类化合物 黄酮类 花青素 物 醌类 紫草宁 次 低等萜类 青蒿素 生 萜类化合物 代 高等萜类 人参皂甙 谢 8. 生物碱 莨菪碱 产 含氮有机化合物 胺类 AA 类似物 物 生氰苷 苦杏仁苷 多炔类 种 其 它 类 有机酸 9.以高山红景天为例 技术路线： 基因分离→尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因→生物信息学分析 ↓ →基因及表达特性分析 构建植物高效表达载体→转化回高山红景天→功能分析 技术方案：高山红景天 UDP-葡萄糖基转移酶基因（UGT1）的分离及特性分析 UGT1 转化高山红景天及基因功能分析 高山红景天抗性选择标记潮霉素（Hyg）适宜浓度的确定; 潮霉素浓度为 5mg/L 时，外植 体生长减慢，致死率达到 50.17%；潮霉素浓度为 10mg/L 时，致死率高达 93.0%；潮霉素 浓度为 15mg/L 时，叶片全部死亡。 UGT1 转基因抗性愈伤组织的遗传转化及筛选→UGT1 转基因高山红景天植株的获得→ 高山红景天转基因材料分子鉴定→高山红景天转基因材料分子鉴定及转基因高山红景天愈 伤组织红景天甙含量的 HPLC 测定 10.高等植物提供的天然物质、性质及用途:11.植物次生代谢产物的提取与分离纯化 1)细胞破碎； 2)提取；3)沉淀分离；4)层析分离 5)萃取分离；6)结晶；7）浓缩与干燥 第四节 植物细胞的规模培养 一、植物细胞规模化培养体系建立 种细胞的选择→种细胞系的增殖与放大→大规模培养体系的建立 1. 种细胞的选择 外植体选择：植物类型、组织、器官 在起始细胞培养时选择自然状态下产生天然产物的器官、组织作为外植体。 高产细胞的建立： 2. 种细胞系的增殖与放大培养 目的：获得大量的活跃生长的细胞群体，为细胞大批量生产准备基础材料。 方法：液体振荡培养，从几百毫升到几升逐级放大。 3、植物细胞大规模培养 细胞大规模培养：成批培养 bacth culture、连续培养 continuous culture（开放式连续培养、 封闭式连续培养） 、半连续培养 semi-continuous 4.成批培养（各种类型的培养个人认为要知道的） 含义： 在一个培养体积中接种细胞和添加培养基后， 中途不再添加培养基也不更换培养基的 方式。 特点：培养装置和操作简单，但在培细胞生长、产物积累，以及培养基的物理状态常常随时 间的变化而变化，培养检测十分困难。同时，成批培养的周期短，一个培养周期后，细胞和 培养液同时取出进行目的产物的提取，下一个培养周期必须重新接种，因此增加了成本。 5.连续培养： 含义：在培养过程中，不断向反应器中以一定的流量添加新鲜培养基，同时以相同的流量从 系统中取出培养液， 从而维持培养系统内在细胞密度、 产物浓度以及物理状态上的相对平衡。 优点：可以延长细胞培养周期，从而延长目的产物的积累时间，增加目的产物产量。 6.半连续培养 含义：在完成成批培养的一个周期后，只从反应器中取出大部分细胞悬液，保留小部分细胞 悬液作为下一培养周期的种细胞，然后加入新鲜培养基进行培养。 特点：可以节省种细胞培养成本，同时保留的培养液有利于细胞分裂启动。但细胞同步性不 是很好。 7.固定化培养 细胞固定化培养是指将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中， 培养液 呈流动状态进行无菌培养的一门技术。 固定化细胞生物反应器：包埋式固定化培养系统； 附着式固定化培养系统 固定化细胞生物反应器优点：1）细胞固定在支持物上，培养基不断更换，可以在培养基中 提取产物，免除了培养基中因含有过多的次生产物而对细胞代谢产生的反馈机制。 2)可以 较容易地控制培养系统的理化环境，从而研究特定的代谢途径，便于调节。 3)细胞位置的 固定类似于在植物体的状态，相互间接触密切，形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合 成。 4)由于细胞固定在一定的介质中，可以不断提取产物，即可以进行连续生产。 三、植物细胞大规模培养的技术要求： 1.从培养技术方面讲必须满足以下三个条件：1.培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产 量恒定的产物； 2.细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产 物； 3.代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。2.目前面临的技术问题：1) 适用于不同培养对象的新型生物反应器的研制。2) 提高生物反 应器内部培养物生长的均匀性和空间利用率。3) 培养物接种、取样、无菌化等操作技术的 优化。4) 不同培养体系生物反应器培养的动力学研究与工艺优化控制。5) 生物反应器培养 的放大技术。 3.两相培养技术： 是在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化 合物，使培养体系形成上、下两相，细胞在水相中生长，合成的次生代谢产物分泌出来后转 移至有机相中。 两相培养技术的优点：减少产物的反馈抑制作用，提高产物含量（促进储存在细胞内部的产 物分泌） ；通过有机相的不断回收及循环使用，实现培养的连续化。 建立植物细胞的两相培养系统必需满足以下条件：⑴添加的有机物或多聚化合物对植物细 胞无毒， 不会影响细胞的生长和产物的合成。 ⑵产物能较容易地被有机物吸附或溶解于有机 相中。⑶两相之间的分离容易。⑷有机物或多聚化合物不能吸收培养基中的有效成分。 两相培养的应用举例——紫杉醇细胞两相培养 ①实验材料： 采用东北红豆杉细胞系， 培养基采用某些成分加倍后的 B5 培养基， 附加蔗糖、 水解酪蛋白等成分。有机溶剂采用十六烷、油酸等对产物有大的分配系数的物质。 ②生产过程与紫杉醇的含量分析：无光条件下摇床培养。离心分离获得细胞、胞外培养液、 有机相溶液，用高效液相色谱进行测定。对于收获的细胞经冻溶、加入环已烷研磨破壁，再 加入甲醇超声处理，合并甲醇，用于测定。 ③结果：胞内含量：0.893mg/L;胞外培养液:0.75mg/L;有机相中:10.65mg/L。 四、人工种子的概念及意义（这个老师有磨叽） 人工种子（artificial seed）是指通过植物组织培养的方法获得的具有正常发育能力的材料， 如胚状体，外面再包有特定物质，通常是一层有机的薄膜包装，这种与天然种子相类似的人 工合成种子称作人工种子或无性种子和人造种子。 一、人工种子意义：具有繁殖速度快、结构完整等特点；体细胞胚可以固定 F1 代杂种优势； 为一些不能采用种子繁殖的园艺作物开辟了良种繁育的新途径。 二、 人工种子的制作程序： 体细胞胚的诱导及同步化控制； 人造胚乳及人造种皮研制及包埋； 人工种子的贮存及萌发 1.高质量体细胞胚发生系统的建立;体细胞胚胎发生的同步化控制 化学抑制法、低温抑制法、机械过筛选择法、渗透压选择法、应用植物胚性细胞分级仪 三、人造种皮及人造胚乳研制及包埋 1.人造种皮的研制:对人造种皮总的要求是：能保持胚状体的活力，利于萌发和贮藏。 因此，所选的材料要有韧性，耐压，对胚状体无毒害作用，含有胚状体发芽生长所需的营养 成分或植物激素，还应含有杀菌剂以防止播种后土壤微生物的侵染。 2.人造胚乳的研制:人造胚乳的主要成分为无机盐、碳水化合物及蛋白质等营养物质。 3.人造种子的包埋技术的研制:最佳的包埋材料是藻酸盐、包埋方法有滴注法和装模法 四、 人工种子研究历史： 1.1978 年 Murashige 提出人工种子概念； 2.1986 年 Redenbaugh 等成功地利用藻酸钠包埋单个体细胞胚，生产人工种子。 3.胡萝卜、棉花、玉米、甘蓝、 莴苣、苜蓿等人工种子制作获得成功。 4.在我国人工种子的研究已列入国家高新技术研究 与发展计划（863 计划） ，并已取得一些重要的研究成果。 五、人工种子各部分功能 1、体细胞胚：为了使人工种子在一定条件下萌发生长，并形成完整植株，人工种子首先应 该具备一个能够很好地发育成完整植株能力的胚，它具有胚根和胚芽的双极性，经原胚、球 形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶形胚等不同阶段发育而成。 2、人工胚乳：人工胚乳为体细胞胚萌发提供营养物质。根据使用者的目的，可向人工胚乳内自由添加有利于胚状体正常萌发所需的各种营养成分、防病虫物质、植物激素等，也是人 工种子优越于天然种子之处。 3、人工种皮：包裹在人工种子的最外层，对人工种子起到保护作用，保护人工种子内部 的水分和营养不致丧失和防止外部物理冲击，还要保证通气。 六、人工种子种类 根据包裹体细胞胚材料的不同， 可以将人工种子分为以下 4 种类型 （Redenbaush 等， 1991） 。 1）裸露的或休眠的繁殖体，可以直接播种，如休眠的微鳞茎和微型薯等。 2）人工种皮包裹的繁殖体。 3）水凝胶包埋的胚状体、不定芽以及休眠的小鳞茎等繁殖体，水凝胶中可含多种养分和激 素，促进繁殖体的生长。 4）液胶包埋的繁殖体。 七、人工种子与天然种子比较有其自身的特点： 1）可对一些自然条件下不结实的或种子很昂贵的植物进行繁殖。 2）固定杂种优势，使 Fl 杂交种可多代利用，使优良的单株能快速繁殖成无性系品种，从而 大大缩短育种年限。 3）在人工种子的包裹材料里加入各种生长调节物质、菌肥、农药等，可人为地影响控制作 物生长发育和抗性。 4)可以保存及快速繁殖脱病毒苗，克服某些植物由于长期营养繁殖所积累的病毒病等。 5)与试管苗相比成本低，运输方便(体积小)，可直接播种和机械化操作。 八、人工种子的研制 体细胞胚的诱导与同步化控制方法： 1.人工种子制备包括胚状体的诱导与同步化、 手工选择：无菌条件下逐个筛选。 人工种子的包埋、人工胚乳的制作、 过筛选择： 胚性细胞悬浮培养液分别通过不同 人工种皮的制作、人工种子贮藏 孔径滤网过筛、培养、再过滤。 等步骤内容。 不连续密度梯度离心：通过 Ficoll 不同浓度 2.高质量和高产量的 产生不同密度梯度溶液， 对不同比重细胞 体细胞胚诱导与同步化控制 ；物理方法体细胞胚的诱导 与同步化控制方法：体细胞胚 诱导与同 步化控制进行筛选。 渗透压分选： 基于体细胞胚不同发育阶段渗透 压明显变化， 选择比较一致的同一发育时 期的体细胞胚。 植物胚性细胞分级仪筛选： 根据不同发育阶段 体细胞胚比重不同， 通过筛选液 （一般为 2％蔗糖，进样速度 15mL/min，分选液流 速 20mL/min）经数分钟分级筛选，以获 得一定纯化的成熟胚。 低温处理同步化：冷处理或与营养饥饿相结 合，以增加细胞同步化。 饥饿法：除去悬浮细胞生长所需基本成分，导 致进入静止生长期， 然后恢复营养， 以促 进细胞同步化。 阻断和解除法：适当阻断细胞循环过程，使培 养细胞同步化， 然后解除阻断， 以控制体 细胞胚发育同步化。 有丝分裂阻止： 利用秋水仙碱抑制细胞有丝分 裂，以达同步化，但处理时间不宜过长， 避免引起不正常有丝分裂。化学方法3.人工种子包埋 获得发育正常、形态上较为一致的体细胞胚后，就要用适合的材料进行包埋。进行包埋时应 做到以下几点： （1）包埋材料必须对体细胞胚无损害和无毒性，并能保护胚和胚发芽的能力，成本低廉； （2）同时在制造、贮藏、运输和种植过程中必须具有耐久性，一定的硬度； （3）胶囊必须含有养分和植物激素以及植物生长和发育所需的成分和水分，以保证体细胞 胚的正常萌发； （4）人工种子适合于农业机械化播种。 4.包埋方法： （这个貌似我没有听过他磨叽，了解吧） 经研究认为藻酸盐所形成的胶囊是目前最好的凝胶包埋材料， 所采用的主要方法是滴注和装 膜两种。 1）滴注法：制备人工种子是将选择好的体细胞胚悬浮于含 2%～3%的藻酸钠溶液中，然后 用一个塑料吸管吸注含体细胞胚的藻酸钠悬滴加入到 0.1mol/LCaCl2 溶液中，这时离子间 发生交换而形成胶囊，胶囊的直径依赖于吸管的内径和吸注的速度，胶囊的大小，视体细胞 胚的大小和发芽能力而定，一般采用吸管口径为 3－4 mm，可得直径为 4－5 mm 的胶囊。 体细胞胚包在胶囊中的位置不宜处在中央， 宜偏在一边以利萌发。 至于聚合时间长短则依赖 于所用试剂浓度。 一般藻酸钠的浓度控制在 2％－3%， CaCl2 中停留实践不要超过 10min， 在 以免胶囊太硬而影响发芽。形成胶囊后转入无菌水中冲洗，最后在 1/2MS 培养基上作发芽 和转换试验或进一步包裹人工种皮。 2）装膜法：制备人工种子是把体细胞胚混合到一个温度较高的胶液中，然后滴注到一个有 小坑的微滴板上，随着温度降低变为凝胶而形成胶丸。 5.人工种皮的研制：美国杜邦公司生产的 Elvax4260 是一种较好的“人工种皮”材料，是由 乙烯、乙酸和丙烯酸三种物质共聚的产物，用它作为人工种子最外层的包裹剂，即人工种皮 取得较好效果 。 6.用 Elvax 作为人工种皮的具体操作程序为： 1）将 4 g 藻酸钙胶囊置于 20 mL 含 0.1 g 葡萄糖和含 0.2 mL 甘油的氢氧化钠溶液中搅拌 1min； 2）在 50 mL 环乙烷中加入 10%的 Elvax4260; 3）在 40℃条件下溶解 5g 硬脂酸，10 g 鲸醋醇和 25 g 鲸醋取代物，另加 295 mL 石油醚和 155 mL 二氯甲烷； 4)将藻酸钙胶囊放在上述的混合液中浸泡 10s，取出后用热风吹干。如此重复 4－5 次，最 后用石油醚冲洗干净，经尼龙布过虑后在空气中风干即可。 十、人工种子的储藏与萌发 人工种子储藏时间的长短和萌发率的高低对人工种子的应用至关重要。 人工种子的寿命， 其 最理想的状态是能够与真正的合子胚种子的寿命一样长， 只有这样， 才有利于人工种子的储 藏和萌发。 此外，海藻酸盐胶囊本身又抑制呼吸，更加缩短了体细胞胚的寿命。因此，储藏和萌发是人 工种子研制的主要难点之一。 延长人工种子储藏时间和提高其萌发率的主要方法包括低温法、干燥法、抑制法、液体石蜡 法等以及这些方法的组合。 （干燥法和低温法是目前应用最多的方法） 1）低温储藏技术:低温储藏是指在不伤害植物繁殖体的前提下,通过降低温度来降低繁殖体 的呼吸作用,使之进入休眠状态。常用的温度一般是 4℃。在此温度下体细胞胚人工种子可 以储存 1-2 个月。 2）液体石蜡储藏技术:液体石蜡作为经济、无毒稳定的液体物质,常被用来储藏细菌、真菌 和植物愈伤组织。美国已有报道,把人工种子放在液体石蜡中,保存时间可达 6 个月以上3）超低温储藏技术:超低温一般是指- 80℃以下的低温, 如超低温冰箱( - 80～ - 150℃) 、 液氮( - 196℃)等。在此温度下,植物活细胞内的物质代谢和生命活动几乎完全停止。所以, 植物繁殖体在超低温过程中不会引起遗传性状的改变,也不会丢失形态发生的潜能。 4）干燥法:干化的人工种子更像天然种子，具有更长的储藏寿命。Gray 等（1987）在 23℃ 条件下干化鸭茅体细胞胚 21 天，萌发率达到 12％。Hammatt 等（1987）把大豆体细胞胚 干化到原体积的 40%-50%后再吸水，萌发率仍达到 31%。干化增强人工种子幼苗的活力， 可能与其超氧化物酶和过氧化物酶的活性显著提高， 从而减轻低温贮藏对体细胞胚的伤害有 关。 十一、人工种子应用前景 1、人工种子的应用目前存在的问题 1）许多有价值的作物，特别是那些不易获得种子和自然增殖率极低的植物，目前尚未显示 出较好的体细胞胚发生能力，或胚的生活力差； 2）有些作物虽然可以诱导出体细胞胚， 但胚胎发生机制研究不够， 而且同步化等技术尚未解决， 因而难以达到大量控制同步化的目 的； 3）人工种子的成本远高于自然种子； 4）人工种子贮藏、运输和加工以及机械化播 种，尚未完全解决，许多问题尚待进一步研究和探索。 2、人工种子应用应该考虑哪些方面 要想人工种子技术得到应用： 1）首先应考虑该作物的价值； 2）要考虑那些很难获得种 子，而且自然增殖率极低的植物。 例如：多年生名贵药材，高质量的木材和橡胶树或优质果树以及珍惜濒危植物等。 3、人工种子发展前景: 1）人工种子的发展前景是客观的 2）它将是农业中一种革命性 的繁殖系统 3）相信该技术会得到逐步完善，建立多种模式来研制人工种子，并逐步扩 大应用范围。 第五章 植物花药和花粉培养（这章说了好几次，好好看） 第一节 花药和花粉培养的概念 1.单倍体（haploid)：植物的花粉是由花粉母细胞经减数分裂形成的，染色体数目只有体细 胞一半，叫单倍体。 2.单倍体植物与它们的二倍体相比较，有三个明显的特点：1)体细胞染色体数减半；2)生长 发育弱，体形小、各器官明显减小；3)雌、雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。 3.花药是花的雄性器官，花药培养属于器官培养；花粉是单倍体细胞，花粉培养与单细胞培 养相似；花粉和花药都可以在培养过程中诱导单倍体细胞系和单倍体植株 单倍体植株经过染色体加倍就成为纯和二倍体植株，这样可以缩短育种周期，获得纯系。花 陪已成为植物育种的一种重要手段 4.花药包括：二倍体的花药壁、药隔和单倍体的雄性性细胞（花粉粒）培养前要用醋酸洋红 压片镜检确定发育时期 5.花药培养:将花粉发育至一定阶段的花药培养在人工培养基上，(先暗培养，愈伤形成后移 到光下促进分化)诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的过 程。 （器官培养） 花粉培养含义：将花粉培养在人工培养基上，诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈 伤组织，进而分化成苗的过程。 （单细胞培养） 影响花药培养的因素：1）供体植株的生长条件：不同的生长季节、环境、不同部位的花蕾， 其花粉的生理状态也不同，培养效果也会有明显的差异； 2）供体植株的年龄：多数情况 下幼年的植株好于老年的植株，但是甘蓝型油菜相反。 3）花粉的发育时期：烟草中处于 ； 第一次有丝分裂期的花粉最好；而在禾本科和芸苔属中，单核早期最好； 4）花蕾、花药的处理：低温； 5）供体植株的基因型； 6）培养基、培养条件及活性碳6.花药和花粉培养实质：把发育到一定阶段的花药（或花粉）接种在人工培养基上，改变花 粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化，最终发育成完整植株的 过程。 广义的花粉培养，孤雄生殖。 培养类型：花药---器官培养 培养类型：花粉---单细胞培养 两者目的一致：诱导花粉细胞发育成单倍体植株。 7.再生植株途径有 2 种：1）经由成愈伤组织再生植株； 2）经由胚状体再生植株 第五章 植物花药和花粉培养 第二节 花粉小孢子发育途径 一、花粉孢子体发育途径：离体培养条件下，把花粉培育第二节 花粉小孢子发育途径成 植株的途径，称为花粉孢子体发育途径。 雄核发育（androgenesis)：把小孢子沿孢子体途径发育成植株的过程，称为～ 二、离体培养条件下的小孢子发育 离体条件下，改变了花粉原来的生活环境，花粉第二次分裂不再像花粉发育 那样由生殖核再分裂一次形成两个精子核，而是像胚细胞一样持续分裂。 离体条件下花粉分裂方式有四种类型： 1、营养细胞发展育途径。花粉第一次有丝分裂形成不等的营养核和生殖核， 生殖核较小，退化，而较大的营养核多次分裂形成细胞团，形成胚状体或者 愈伤组织，最后形成单倍体。 2、生殖细胞发育途径。营养核分裂几次退化，生殖核形成细胞团。 3、营养细胞和生殖细胞并进发育途径。一种情况各自形成愈伤组织或者是 胚状体，另一种情况为融合后再分裂 4、花粉均等分裂途径。花粉均等分裂形成 2 个均等子核，以后形成 2 个子 细胞，最后形成胚状体或者愈伤组织。 途径一 （几个途径要知道，上课老师说可能出） A 途径：自然下小孢子第二次分裂及萌发形成花粉管。 B 途径：营养核重复分裂生殖核败育 C 途径：生殖细胞重复分裂，营养细胞败育。 途径二： D 途径：两个核共同分裂形成单倍体胚。 E 途径：两个核融合后分裂形成纯合的二倍体。 P-花粉：离体培养的花粉粒形态不同于正常花粉粒，两个核位于花粉粒的中心，具有潜在的 胚胎发生功能，也称为小花粉花粉（potential embryogenic pollen) 。 三、单倍体植株形成途径（两种方式要清楚） 通过胚状体形成单倍体植株 通过器官发生（愈伤）形成单倍体植株 第三节 花药和花粉培养 单倍体植株育种 1. 诱导形成单倍体；2.有利于筛选隐性突变体，提高选择效率 3；获得无病毒个体；4.有利于 隐性基因控制形状的选择;5.快速获得自交系的超雄株 花药培养与单倍体育种 花药培养的主要目的， 是培育花粉粒的单倍体植株， 并使单倍体加倍， 作为育种材料的来源。 利用杂种花药离体培养获得的再生植株， 由不同基因型的配子发育而来， 具有丰富的变异类型，选择出有利的变异类型，经过经济状况鉴定后，选出优良者直接用于生产或配制杂交组 合，获得优良杂交品种。 构建永久性分离群体—双单倍体系，用于基因定位。 双单倍体：是指单倍体细胞（花粉或卵细胞）经过人工或自发加倍后得到双单倍体细胞，细 胞经诱导分化可发育为单双倍体植株。 花药培养 （一）花药培养研究概况:首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者 Guha 和 Maheshwari ()。目前已有 250 多种植物花药培养成功。我国 1971 年水稻花药培 养并得到苗; 目前，花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花 科作物的育种中广泛应用。 （二）花药培养的基本程序 外植体选择－外植体(花蕾)预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养 花药材料的选取 关键选取处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉发育。实践证明，从减数分裂期 至双核期的花药，均有可能诱导离体孤雄发育。 大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核期或单核中晚期。 单倍体植株染色体加倍的方法 1. 自然加倍 2. 人工加倍：用秋水仙素溶液浸苗、处理愈伤组织和用含 0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹单倍 体植株的顶芽、腋芽、可得到能结实的二倍体植株。 3. 愈伤组织反复继代培养，可得到二倍体植株。 花药预处理（物理、化学）; 花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的： 1. 引起花药内源激素发生变化，改变了小孢子（花粉粒）第一次有丝分裂的轴向发育（正 常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒） ，进而形成愈伤组织或胚状体。 2. 引起小孢子的孤立化，花药壁细胞和绒毡层在低温预处理过程中逐渐解体退化；从而切 断与小孢子之间的联系。 3. 使小孢子同步分裂，激发花粉产生原胚。 4.提高小孢子的生活力，延缓退化速度，而提高了诱导率。 2、培养基→基本培养基：MS（Murashigc & Skoog，1962） Nitsch(Nitsch，1969)；N6(朱 ； 至清，1974)；B5(Gamborg et al.，1976)。 激素：细胞分裂素类（BA、KT Zeatin） 类（NAA、I 生长素 AA、2,4-D） 碳源：单子叶植物（需要的浓度） 〉双子叶植物； 二细胞花粉〉三细胞花粉； 麦芽糖〉蔗糖 蔗糖浓度:培养基中蔗糖浓度比其它组织培养高，尤其早期培养，一般 5%—10%。原因是花 粉母细胞的渗透压比花丝等体细胞高，即高浓度的蔗糖不利于药壁、花丝等体细胞的生长， 而利于花粉的生长。 激素 2，4-D 的浓度从 0.2mg/L 起，随着浓度的提高，花 粉愈伤组织出现频率的增高趋势。但是有几种籼稻相反。 花药培养不经愈伤组织直接产生胚状体是最理想的方式，这样可免去愈伤组织和生根阶段。 但多数情况是产生愈伤组织， 这时要用提高细胞分裂素， 降低生长素甚至不用生长素的分化 培养基诱导分化产生芽。 3、培养条件:光照：先弱后强 温度：原则—花粉发育的最适温度（25℃）比不分化的愈伤组织生长的最适温度（22℃）要 高。 花药壁因素（花药壁的绒毡层释放的某些物质启动了花粉粒的胚性分裂）确定取材时间 选择大致处于所需要时期的花蕾。 由于花粉发育时期和植株的某些外部形态特征之间的大致 相关性，因此利用这些外部标志，选择符合条件的花蕾，经镜检确定花粉发育的准确时期。 在水稻中， 以单核靠边期的花粉对诱导单倍体植株较为适宜， 在外部形态上可根据与叶枕距 为 5-15cm，颖片（禾本科植物小穗基部，由苞片转变而成）淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片 长度的二分之一这些条件来判断。 1、水稻花药培养过程： 1）预处理:低温冷藏是最常用的方法 2）表面消毒 3）接种 4）培养形成花粉植株。 花粉---愈伤组织---苗 花粉---胚状体---苗 水稻花药培养过程： 旗叶鞘用 70%酒精擦洗一遍----剥去旗叶鞘，取出稻穗----10%漂白粉 10min----无菌水洗 3 次 -----左手持穗。 右手用镊子取花药， 放无菌培养皿中---用接种环接种到培养基上---培养 5 天， 花药变褐，20 天后花药裂开，长出淡黄色的花粉愈伤组织，先长芽，后长}