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&&&&&&&&&&&&分子生物学绪论作业
分子生物学绪论作业
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内容要点：
分子生物学绪论作业第一章 绪论复习题 1. 从广义和狭义上给出分子生物学的定义。 广义：研究核酸、蛋白质等生物大分子的结构与功能，并从分子水平上阐述这些大分子之间相互作用的关系及其基因表达调控机制的科学。 狭义：偏重于核酸的分子生物学范畴，主要研究基因或 DNA 结构与功能、复制、转录、表达和调节控制等的分子过程，其中也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构和功能的研究。 2. 分子生物学研究的主要内容有哪几个方面 ? 1、基因与基因组的结构与功能 2、 DNA 的复制、转录和翻译 3、基因表达调控的研究 4、 DNA 重组技术 5、结构分子生物学 3. 简述什么是反向生物学？什么是后基因组时代？ 反向生物学：直接从克隆目的基因出发，研究基因的功能及其与表型的关系 的科学 。 后基因组时代：主要任务是研究细胞内全部基因的表达图式和全部蛋白质图式，或者说是“从基因组到蛋白质组”。 4. 分子生物学、基因工程、 DNA 重组技术有什么区别？ 分子生物学是 研究核酸、蛋白质等生物大分子的结构与功能，并从分子水平上阐述这些大分子之间相互作用的关系及其基因表达调控机制的科学。 基因工程并不等同于 DNA 重组技术 ，基因工程还包括其他能使生物细胞基因组结构发 生改变的体系。而 DNA 重组技术是分子生物学的研究 内容 之一。 5. 写出 3 个分子生物学发展史中的大事件 (发明年代、发明者、简要内容 )。 21 世纪分子生物学的发展趋势将是怎样的？ ① 1928 年， Griffith 做的肺炎双球菌的转化实验 ： 以 R 型和 S 型菌株作为实验材料进行遗传物质的实验，他将活的、无毒的 RⅡ型（无荚膜，菌落粗糙型）肺炎双球菌或加热杀死的有毒的 SⅢ型肺炎双球菌注入小白鼠体内，结果小白鼠安然无恙；将活的、有毒的 SⅢ型（有荚膜，菌落光滑型）肺炎双球菌或将大量经加热杀死的有毒的 SⅢ型肺炎双球菌和少量无毒、活的 RⅡ型肺炎双球菌混合后分别注射到小白鼠体 内，结果小白鼠患病死亡，并从小白鼠体内分离出活的 SⅢ型菌。 ② 1952 年， Hershey 和 Chase 先用 32P 标记噬菌体的 DNA，用 35S 标记噬菌体的蛋白质，使噬菌体吸附在大肠杆菌上，然后用组织捣碎器将二者分开，这时发现几乎全部 35S 的放射性都可以从细胞上拉下来，而大部分 32P 则被注入到细胞内，噬菌体在细胞内照样正常地进行增殖。至于进入细胞内的少量 35S，在后代噬菌体中几乎没有出现，相反一半以上的 32P 出现在后代噬菌体的 DNA 中。明确了噬菌体的 DNA 将新的信息带进细胞，这些信息规定了噬菌体在细胞内进行增殖所必需的一切条件，从而产生与亲代噬菌体遗传性完全一样的子代噬菌体。 ③ 1953 年，沃森和克里克发现了 DNA 双螺旋的结构，开启了分子生物学时代，使遗传的研究深入到分子层次，“生命之谜”被打开，人们清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径。 21 世纪分子生物学的发展趋势： 研究细胞内全部基因的表达图式和全部蛋白质图式，即后基因组。 6. 解释下列名词：结构分子生物学、生物信息学、 DNA 重组技术、功能基因组学、蛋白质组学、功能蛋白质组学、反向生物学、后基因组时代、基因表达调控 结构分子生物学： 研究生物学大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。 生物信息学 :对浩如烟海的 DNA 和蛋白质分子中各种类型的 信息进行识别、存储、分析、比对、注释、模拟和传播是生物学的主要内容，它由各类数据库、计算机网络和应用软件三大部分组成 。 DNA 重组技术 ： 将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种 DNA 分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。 功能基因组学 ：对成千上万的基因表达进行分析比较，从基因组整体水平上阐述其活动规律的科学。 蛋白质组学 ：是以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学。 功能蛋白质组学 ：研究定位在细胞内与某种功能有关或在某种环境条件下的一群或一套 蛋白质的科学。 反向生物学 ：直接从克隆目的基因出发，研究基因的功能及其与表型的关系的科学。 后基因组时代 ： 主要任务是研究细胞内全部基因的表达图式和全部蛋白质图式，或者说是“从基因组到蛋白质组”。 基因表达调控 ：基因表达的实质是遗传信息的转录和翻译，基因表达的调控主要在转录水平和翻译水平上发生。原核生物主要发生在转录水平，真核生物主要发生在各种不同的水平，主要表现在对上游调控序列、信号转导、转录因子及 RNA 剪接等多个方面。 第二章 核酸的结构与功能复习题 1. 研究 DNA 的一级结构有什么重要生物学意义 ? DNA 的一级结构即使指 DNA 分子中的核苷酸排列顺序。 DNA 的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于 DNA 分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。 2. 检测核酸变性的定性和定量方法是什么？具体参数如何？ 紫外吸收光谱的变化是检测变性最简单的定性和定量方法。核酸在 260 nm 具有特征的吸收峰，表示为 A260nm,吸收紫外光的量取决于核酸分子的结构。结构越有序，吸收的光越少。因此，可用紫外吸收值的大小来测定 DNA 的含量； 3. 影响 DNA 复性速度的因素包括哪些？ ① DNA 分子组成。简单分子，如多聚 dC-多聚 dG 变性后，彼此容易发现互补链，因此很快就会复性。 同一种 DNA 分子，浓度越高，互补链碰撞机会越多，复性速度越快。 ② DNA 片段大小。较大的线状单链分子，由于分子扩散受到妨碍，减少了发现互补链的机会。因此，在复性研究时，一般要将其剪切成 400bp 大小的片段，以增加复性速度。 ④ 温度的影响，复性速度与温度直接有关。 ⑤ 阳离子浓度，小于 0.5mol/L 浓度时增加盐浓度有利于复性。 4. DNA 复性实验的标准条件是什么？复性程度怎样检测？ 标准条件： ① 一定的离子强度。 DNA 复性以后，双螺旋结构的各种性质可以得到恢复。DNA 的复性需一定的离子强度，用以削弱两条链中磷酸基团之间的排斥力，通常使用0.15~0.50mol/L NaCl。 ② 较高的温度。用以避免随机形成的无效氢键。一般认为比 Tm 低 25℃左右的温度是复性的最佳条件（ 55-60 度）。 复性程度的检测 : ①减色效应，在复性过程中可跟踪测定 A260nm 的光吸收值； ② S1 核酸酶只催化单链 DNA 的水解，不能作用于双链 DNA，因此将样品限定水解后测定抗 S1 核酸酶水解的双链 DNA 量。③羟基磷灰石层析，羟基磷灰石是一种磷酸钙盐， 经过一定的处理后，具有吸附双链 DNA 的能力，洗脱时，只允许单链通过，从而可以计算出剩余双链 DNA 的量。 5. 核酸的分子杂交一般有几种类型？它们分别用于检测那些物质？ 溶液杂交：将不同来源的 DNA 变性后，在溶液里进行杂交。 滤膜杂交：用硝酸纤维素制成的滤膜 , 可以吸附单链 DNA 或 RNA,将变性 DNA 或 RNA 吸附到滤膜上，再进行杂交。 可分 Northern 印迹法 、 Southern 印迹法 和 Western 印迹法。 6. 解释下列名词：核小体、 Southern、 Northern 、 Western、 Cot 曲线、分子杂交、 microRNA、snoRNA、非编码 mRNA、 ORF、 nRNA、 hnRNA、 snRNA、 scRNA、 tmRNA、 nRNA、B-DNA、 Z-DNA。 核小体： 构成真核生物染色质的基本结构单位。 Southern： Southern 印迹法， DNA 片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交，被检对象为 DNA，探针为 DNA 或 RNA。 Northern： Northern 印迹法， RNA 片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交，被检对象为 RNA ，探针为 DNA 或 RNA，是用于鉴定 RNA 的杂交技术。 Western： Western 印迹法，是一种专门针对蛋白质的一种特异性鉴定技术，以一级抗体和与酶偶联的二级抗体为探针。 Cot 曲线 ： DNA 的复性曲线，以 Cot 值为横坐标，双链 DNA 的百分数为纵坐标 所绘制的曲线， Cot1/2=1/K2∝ X,K2 可以反应 DNA 序列的复杂性， DNA 序列越复杂， K2 越小，复性速度越慢。 分子杂交 ： 双螺旋结构的各种性质在 DNA 复性后可得到恢复，利用这一特性科将两个来源不同的互补序列退火形成双链，这个过程成为分子杂交。 microRNA： 是植物和动物细胞中自然产生的一类长度为 18-25bp 的小分子 RNA。 snoRNA：是一种能与蛋白质结合成核仁小核糖核蛋白，作为 rRNA 前体加工复合体的重要成分，参与 rRNA 前提的加工的 RNA。 非编码 mRNA： 是能够进行剪接和 3’端加尾修饰，但是不具有开放阅读框 的 RNA。 ORF： 指一条核苷酸能以 3 种可能的形式之一读出，每个可读框序列分成一系列的三联体，依照序列的不同，任何序列都有 3 种可能的可读框。可读框一般是不含转录终止子的读码框。 nRNA： 细胞核内 RNA 的统称，包括 ① 核内 mRNA、 tRNA 和 rRNA 初始转录混合物 ② 核内小分子 RNA hnRNA： mRNA 分子生物学绪论作业
暂无评论，赶快抢占沙发吧。基因结构异常和调控异常与疾病发生的关系
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&&&&&&&&医学分子生物学&&&&*生物学：研究生命、生命本质、生命活动规律的科学，从整体水平、细胞水平、分子水&&&&平三个层次上研究生命活动及其规律的一门学科。&&&&&&&&*分子生物学：从分子水平研究生命现象、生命本质、生命活动规律的一门新兴边缘学科。*医学分子生物学：是分子生物学的一个重要分支，是从分子水平上研究人体在正常和&&&&疾病状态下的生命活动及其规律，从分子水平开展人类疾病的预防、诊断和治疗研究的一门科学。&&&&&&&&*分子生物学重要技术原理：基因工程技术（分子克隆）原理、DNA序列测定、核酸分&&&&子杂交、PCR、转基因和基因打靶、DNA芯片技术的基本概念、原理及其在医学领域的应用&&&&&&&&*分子生物学在临床医学中应用：基因结构异常和调控异常与疾病发生的关系、基因诊&&&&断和基因治疗的基本概念及其应用&&&&&&&&第一章第一节研究对象学科地位&&&&&&&&绪论&&&&&&&&分子生物学和医学分子生物学研究的主要内容&&&&&&&&*分子生物学的基本含义&&&&1.生物大分子的结构2.生物大分子在遗传信息和细胞信息传递中的作用是当前生命科学中发展最快的前沿领域，正在与其它学科广泛交叉与渗透&&&&&&&&的重要前沿领域，生命科学的带头学科。&&&&&&&&分子生物学的主要内容：一、生物大分子的结构与功能及分子间的相互作用：主要研究&&&&核酸、蛋白质、酶的结构与功能及蛋白质与蛋白质、核酸与核酸、核酸与蛋白质、核酸与其它生物大分子之间的相互作用。二、基因信息的传递及调控：三、细胞之间的信息传递机制：四、细胞的识别：涉及细胞粘附分子与细胞外基质。五、细胞的增殖与分化：包括癌基因与抑癌基因、肽类生长因子、细胞周期及其调控的分子机理等。六、分子生物学技术：主要包括分子杂交技术、链反应技术、基因工程与蛋白质工程等。&&&&&&&&医学分子生物学主要内容：一。生物大分子的结构与功能。二。基因组的结构与功能。&&&&三。基因的复制、表达、调控。四。细胞通讯与细胞内信号传导。五．基因工程的各种技术体系（克隆、测序、杂交、PCR、转基因、DNA芯片）。六．基因与疾病。七．基因诊断与基因治疗&&&&&&&&医学分子生物学的概念和性质：&&&&一．二．三．定义：是从分子水平上研究人体正常和疾病状态下生命活动及其规律的一门科学。是分子生物学的重要分支是医学领域的带头学科&&&&&&&&第二节&&&&孕育阶段&&&&&&&&分子生物学的历史回顾&&&&&&&&1.1871年Miescher核素;2.1900年，Gene3.1910年，Morgan：Gene存在于染色体上4.1944年，Avery证实DNA携带遗传信息。&&&&&&&&创立阶段&&&&&&&&&&&&1.二十年代，Levene研究了核酸的结构，并提出了四核苷酸假说。2.1953年Watson和CrickDNA双螺旋3.1958年Crick中心法则4.1958年，Meselson和StahlDNA半保留复制。5.1960年发现mRNA，DNApol6.1961年，Jacob和Monod操纵子学说7.1961年，Nirenberg破译第一个遗传密码&&&&&&&&发展阶段&&&&1.1970年，Temin和Baltimore发现逆转录酶。2.阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，发现限制性内切酶,获1978年诺贝尔生理学和医学奖。3.Sanger设计测定DNA分子内核苷酸序列，1980年与伯格(Berg)（重组DNA技术）分享Nobel生理医学奖。4.1989年Altman、Cech发现核酶共享Nobel化学奖.5.PCR技术的建立。6.显微注射术开始转基因动物的研究。7.转基因植物的诞生。8.基因治疗技术。9.人类基因组计划。10.克隆羊的诞&&&&&&&&分子生物学的研究发展&&&&一．不断把本学科的理论和技术引向深入目前分子生物学研究的前沿：基因组研究、基因表达调控研究、结构分子生物学研究、信号传导研究二。不断地与其他学科进行深入的横向联系和交叉融合分子、细胞、整体水平的研究得到和谐统一&&&&&&&&分子生物学与其他学科的结合分子生物学广泛渗透到医学各学科领域，成为现代医学重要的基础&&&&分子生物学与生理学,微生物学,免疫学,病理学,药理学,临床医学的结合&&&&&&&&分子生物学广泛的渗透到医学各学科领域&&&&分子细胞学分子药理学分子免疫学分子病理学分子病毒学分子神经学学分子遗传学分子诊断学（基因诊断学）分子治疗学（基因治疗学）分子细菌&&&&&&&&分子生物学大大促进了医学的发展&&&&医学分子生物学是分子生物学的一个重要分支，它主要研究人体生物大分子和大分子体系的结构、功能，相互作用及其同疾病发生、发展的关系。人体的生长、发育、衰老、死亡等生命现象，人体各种疾病的发生，都是一种或多基因有关，常常涉及到细胞间通讯和细胞内信号转导。因此，医学分子生物学主要研究人体发育、分化和衰老的分子生物学基础，细胞增殖调控的分子基础，人体三大功能调控系统（神经、内分泌、免疫）的分子生物学基础，基因的结构异常或调控异常与疾病发生、发展的关系；同时，应用分子生物学理论和技术体系开展疾病的基因诊断和基因治疗、生物制药以及卫生防疫。&&&&&&&&第三节&&&&&&&&分子生物学在医学上的应用&&&&&&&&一、人体发育调控和人体功能调控的分子生物学基础&&&&?1、发育、分化与衰老的分子生物学基础?2、细胞增殖调控的分子生物学基础?3、神经、内分泌和免疫调控的分子生物学基础&&&&&&&&二、基因与疾病&&&&基因结构与功能的改变、基因表达调控异常、病原体的基因结构与功能都与疾病的发生有关对疾病相关基因的研究，不仅从分子水平阐明疾病发生、发展的机制，而且为基因诊断和基因治疗奠定了基础。&&&&&&&&基因诊断：是应用分子生物学技术，检查人体某些基因结构或表达调控的变化，或者检测&&&&病原体基因组在人体内的存在，从而达到诊断疾病和基因治疗奠定了基础&&&&&&&&&&&&基因治疗：是通过特定的分子生物学技术关闭或降低异常表达的基因，或者将正常的外&&&&源基因导入体内特定的靶细胞以拟补缺陷基因，或将某种特定基因导入体细胞表达以产生特定的蛋白质因子实现对疾病的治疗作用。总体上分为两个大的方面：一、纠正异常基因（异常表达或缺陷）二、利用特定基因在体内表达特定的蛋白质因子以实现对疾病的治疗作用。&&&&&&&&三、生物工程与生物制药1、基因工程生产多肽类药物：人胰岛素、人生长激素、干扰素、红细胞生成素、孕激&&&&素、白介素1-16、集落刺激因子、免疫球蛋白、B细胞生长因子。&&&&&&&&酶工程：利用基因工程技术制取酶制剂：如尿激酶、链激酶蛋白质工程：利用基因工程技术改造目的基因的结构，在受体细胞中表达不同结构的蛋&&&&白质。&&&&&&&&微生物工程：利用微生物特定性状产生有用物质，抗生素2、利用转基因动、植物获取多肽类药物四、预防医学1、疫苗研究：利用重组DNA技术和转基因动、植物技术可以改造病原体或有关蛋白成&&&&分，研制各种基因工程疫苗，取代传统疫苗。&&&&&&&&DNA疫苗：也称核酸免疫，直接用编码抗原的基因重组到真核表达载体，直接导入机&&&&体内，表达出相应抗原，通过细胞或体液免疫产生抗体，而达到防治疾病的目的。&&&&&&&&2、环境检测与净化：采用分子杂交或PCR方法检测环境中病原体；通过基因重组的方&&&&法制造超级细菌。&&&&&&&&五、中医药研究&&&&中医基础理论中医临床针灸中药&&&&&&&&第二章&&&&&&&&核酸的结构与功能&&&&&&&&核酸是一类重要的生物大分子，是生物遗传的物质基础。脱氧核糖核酸主要存在于细胞核内，是遗传信息的储存和携带者，是遗传的物质基础。核糖核酸主要分布在细胞质中，参与遗传信息表达的各过程。第一节核酸的化学组成&&&&&&&&核酸----单核苷酸----【核酸（碱基和戊糖）+磷酸】戊糖（ribose）&&&&&&&&&&&&β-D-核糖碱基（base）嘧啶pyrimidine&&&&&&&&β-D-2’-脱氧核糖&&&&&&&&嘌呤purine&&&&&&&&胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）尿嘧啶（U）（2-氧-4-氨基嘧）（5-甲基尿嘧啶）(2,4-二氧嘧啶)&&&&&&&&鸟嘌呤（G）腺嘌呤（A）（2-氨基-6-氧嘌呤）（6-氨基嘌呤）&&&&&&&&稀有碱基&&&&&&&&假尿嘧啶核苷&&&&&&&&次黄嘌呤核苷&&&&&&&&二氢尿嘧啶核苷&&&&&&&&甲基鸟嘌呤核苷&&&&&&&&核苷&&&&碱基|____________核苷键|purine：N9-1&&&&&&&&{&&&&&&&&&&&&戊糖&&&&&&&&pyrimidine：N1-C1&&&&&&&&8种核苷&&&&&&&&核苷酸&&&&?核苷与磷酸缩合生成的磷酸酯。?自然界所发现的核苷酸主要为核苷C5‘上羟基与磷酸形成的酯键，称为5‘核苷酸或一磷酸核苷。?核苷酸是核酸的基本组成单位。&&&&&&&&RNA&&&&AMP、ADP、ATPGMP、GDP、GTPCMP、CDP、CTPUMP、UDP、UTP&&&&&&&&DNA&&&&dAMP、dADP、dATPdGMP、dGDP、dGTPdCMP、dCDP、dCTPdTMP、dTDP、dTTP&&&&&&&&二磷酸核苷和三磷酸核苷多为核苷酸有关代谢中间产物或酶活性及代谢的调节物质。三磷酸核苷是参与核酸合成的直接形式，并同时为生理储能和供能的重要形式。&&&&&&&&第二节DNA的碱基组成A、G、C、T&&&&&&&&DNA的分子结构&&&&A=TA+G=C+T&&&&&&&&DNA的一级结构（primarystructure)特征：&&&&*DNA分子中脱氧核苷酸的排列顺序，即碱基的排列顺序。单核苷酸通过3‘,5‘-磷酸二酯键连接成大分子——多核苷酸。5‘-末端：P3‘-末端：OH&&&&&&&&书写方式1.线条简化式&&&&&&&&&&&&2.文字简化式&&&&……pApGpCpT…………pA-G–C-T…………pAGCT……方向：5’3’&&&&&&&&DNA的二级结构（secondarystructure)&&&&&&&&特征：&&&&&&&&?两条反向平行的脱氧核苷酸链绕同一中心轴，右手螺旋。?磷酸-戊糖骨架位于外侧，两条链上的碱基以A=T、G=C相连，构成碱基平面，位于螺旋内侧。?10个碱基对旋转一周，螺距为3.4nm，螺旋直径为2.0nm。?大沟（majorgroove），小沟（minorgroove）?氢键：维持双螺旋横向稳定碱基堆砌力：维持纵向稳定&&&&&&&&DNA的三级结构（tertiarytructure）特征：&&&&原核生物DNA超螺旋共价封闭环状双螺旋再进一步螺旋。&&&&&&&&真核生物&&&&?真核生物的三级结构是该DNA双链盘绕在组蛋白上的负超旋。这种以组蛋白为核心绕以DNA片段的颗粒称为核小体（nucleosome）。?完整的核小体由两部分组成，即核小体核心（nucleosomecore），以及连接各核心颗粒之间的区域称连接区（linker）。?DNA双螺旋——核小体——串珠状多核小体细丝——螺线管——超螺线管——染色单&&&&&&&&体&&&&&&&&DNA的功能&&&&?&&&&&&&&生物遗传信息的携带者、生物遗传信息复制的模板和基因转录的模板。RNA所必需的&&&&&&&&基因（gene)是一个功能性遗传单位，是合成一个有功能蛋白或&&&&全部DNA序列。&&&&&&&&?&&&&&&&&基因组（genome）指细胞或生物体的一套完整单个的遗传物质。一个基因组&&&&包括一整套基因。&&&&&&&&?结构基因（structuralgene）编码蛋白质或RNA。&&&&&&&&&&&&第三节RNA的一般特征&&&&&&&&&&&&RNA的结构和功能&&&&&&&&主要存在于细胞质中一般是单链分子与DNA在碱基组成上的区别是RNA分子中含有的是U，U与T具有相同的结构信息量RNA核糖分子上C2‘-OH是游离的，是一个易发生不良反应的位置，因此RNA不如DNA稳定&&&&&&&&tRNA&&&&&&&&&&&&(transferRNA)&&&&细胞内分子量最小的一类核酸，约占总RNA的15%含有10-20%的稀有碱基细胞内tRNA的种类很多，每一种氨基酸都有其相应的一种或几种tRNA二级结构为―三叶草‖的结构三级结构呈倒L形重要的功能是参与转运氨基酸，解译mRNA的密码&&&&&&&&tRNA―三叶草‖形的二级结构功能部位：反密码环:倒L形的三级结构mRNA(messengerRNA)&&&&?细胞内含量较少的一类RNA，占总RNA的5%左右，但种类很多。功能：将核内DNA的碱基顺序（遗传信息）按碱基互补原则抄录并转送到胞质的核糖体上，用以决定蛋白质合成的氨基酸顺序。三联密码：mRNA分子上每三个核苷酸为一组，决定肽链上的一个氨基酸。反密码子氨基酸臂：3‘-CCA-OH&&&&&&&&真核生物mRNA的特殊结构&&&&?5‘-末端的帽结构：m7G-ppp5‘-Np促进核糖体与mRNA的结合加速翻译的起始速度、增强mRNA的稳定性?3‘-末端的polyA结构:参与mRNA从核内向胞质的转移、增强mRNA的稳定性?真核生物mRNA含有内含子，在核内需经过一系列的加工、修饰及剪接等去除内含子，转变为成熟的mRNA，进入胞浆。&&&&&&&&rRNA(ribosomalRNA)&&&&细胞内含量最多的RNA，约占RNA总量的80%左右。rRNA不能单独行使功能，必须与蛋白质结合后形成核糖体(ribosome)，作为蛋白质合成的场所。某些低等真核生物的细胞核rRNA的前体在成熟过程中可以自我剪接，称为核酶(ribozyme)。&&&&&&&&&&&&?&&&&&&&&?&&&&&&&&原核细胞rRNA包括：5SrRNA23SrRNA16SrRNA+蛋白质+蛋白质大亚基小亚基真核细胞rRNA包括：5SrRNA5.8SrRNA28SrRNA18SrRNA+蛋白质+蛋白质大亚基小亚基&&&&&&&&rRNA二级结构：有较多茎环结构，是与蛋白质结合的结构基础，也是酶性RNA的&&&&结构基础。&&&&&&&&第四节&&&&&&&&核酸的理化性质&&&&&&&&?分子大小：1μmDNA=3000bp=2x106Dalton?紫外吸收：260nm&&&&&&&&核酸的变性、复性与分子杂交1.DNA变性：在某些因素的作用下，DNA双链间氢键断裂，双螺旋结构解开，形成单&&&&链无规则线团状分子的过程。&&&&&&&&高色效应：解链过程中，DNA&&&&&&&&A260增加，并与解链程度相关。&&&&&&&&Tm值：50%DNA解链的温度，又称融解温度。&&&&&&&&2.复性：变性DNA在适当条件下，可使两条彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构的&&&&过程。&&&&&&&&3.分子杂交：两条来源不同具有完全或不完全互补碱基顺序的多核苷酸片段在溶液中&&&&经退火处理可以形成双螺旋结构。如DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA杂交分子。&&&&&&&&第三讲一、生物大分子&&&&&&&&相关基础知识&&&&&&&&通常将所有的生物分子简单地分为两类：&&&&一类是小分子，即为简单的单体物质；另一类是大分子，一般为多聚化合物。&&&&&&&&1、生命物质的十三个层次&&&&量子→小分子→生物大分子→生物大分子聚合体→细胞器→细胞―系‖→细胞→组织→器官→系统→个体→种群→生态系&&&&&&&&2、生物大分子&&&&&&&&&&&&是指生物体内由分子量较低的基本结构单位首尾相连形成的多聚化合物。如核酸是由核苷酸与核苷酸相连而构成的，蛋白质的多肽链是由氨基酸与氨基酸相连而成。基本结构单位的排列顺序构成了生物大分子的一级结构，在此基础上可形成复杂的空间结构。核酸、蛋白质和多糖都属于生物大分子范畴。核酸与蛋白质的结构与功能是分子水平生命活动的基础，分子生物学的研究内容基本上围绕核酸与蛋白质展开的。&&&&&&&&3、生物大分子聚合体&&&&如核蛋白、糖蛋白、脂蛋白&&&&&&&&4、细胞―系‖&&&&遗传信息流、膜流、能流、以受体为主的通讯流等。&&&&&&&&二、DNA复制的特点复制&&&&以DNA为模板,按碱基互补配对原则,聚合成新的DNA链的过程。&&&&&&&&1、DNA的半保留复制&&&&半保留复制即新的双链DNA中，一股链来自模板，一股链为新合成的。实验依据2002年10月，在由权威的美国《生物科学》杂志组织的一次评选中，梅塞尔森和斯塔尔的半保留复制实验当选为有史以来生物学领域―最美丽‖的一项实验。&&&&&&&&半保留复制的意义&&&&复制的这种方式可保证亲代的遗传特征完整无误的传递给子代，体现了遗传的保守性。&&&&&&&&DNA复制的一般过程&&&&即DNA复制时一条链是连续合成的，另一条是不连续分段合成最后才连接成长链。由于DNA双链方向相反，当双链以复制的起点解开形成复制叉时，3端位于复制起点的模板链合成新链是从5向3发展，是DNA聚合酶前进的方向，故可以连续合成，而5端位于复制起点的模板链，由于缺乏3向5走向的DNA聚合酶不可能合成连续新链，只能以不连续的方式分段进行。此连续合成的新链其合成方向与复制叉前进方向一致，称领头链，分段合成的短链称冈崎片段，其合成方向与复制叉前进方向相反，称为随从链。&&&&&&&&复制起始点&&&&&&&&常用ori或O表示。细胞中的DNA复制一经开始就会连续复制下去，直至&&&&&&&&完成细胞中全部基因组DNA的复制&&&&&&&&复制子或复制单元：NDA复制从起始点直到终点为止，每个这样的DNA单位称复&&&&制子。原核细胞中，每个DNA分子只有一个复制起始点，因而只有一个复制子；真核生物中，复制是从许多起始点同时开始的，所以每个DNA分子上有许多个复制子&&&&&&&&大肠杆菌的DNA复制定点开始双向复制这是原核与真核生物DNA复制最主要的形式三、DNA损伤与修复&&&&&&&&&&&&（一）DNA的损伤（DNAdamage）&&&&指一个或多个脱氧核苷酸的构成、复制或表型功能的异常变化，也称DNA损伤，又称突变（mutation）突变的结果引起遗传信息的改变。&&&&&&&&1、DNA分子的自发性损伤&&&&（1）DNA复制中的错误（2）DNA的自发性化学变化：碱基的异构互变、碱基的脱氨基作用、脱嘌呤与脱嘧啶、碱基修饰与链断裂&&&&&&&&2、物理因素引起的DNA损伤&&&&（1）紫外线引起的DNA损伤（2）电离辐射引起的DNA损伤&&&&&&&&3、化学因素引起的DNA损伤&&&&（1）烷化剂对DNA的损伤（2）碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤&&&&&&&&（二）DNA损伤的后果1、点突变：指DNA上的单一碱基的变异（转换：嘌呤与嘌呤、嘧啶与嘧啶；颠换：&&&&嘌呤与嘧啶或嘧啶与嘌呤）2、缺失：指DNA链上一个或一段核苷酸的消失3、插&&&&&&&&入：指一个或一段核苷酸插入到DNA链中4、倒位或转位：指DNA链重组使其&&&&中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处5、双链断裂&&&&&&&&（三）DNA修复1、回复修复这是较简单的修复方式，一般都能将DNA修复到原样（1）光修复最早发现的DNA修复方式，由细菌中的光解酶完成。后发现类似的修复酶&&&&广泛存在于动植物中，人体细胞中也有发现。&&&&&&&&（2）单链断裂的重接（3）碱基的直接插入（4）烷基的转移2、切除修复：是修复DNA损伤最为普遍的方式，对多种DNA损伤都能起修复作用。&&&&普遍存在于各种生物细胞中，也是人体细胞主要的DNA修复机制&&&&&&&&切除修复：先切除DNA损伤序列，再合成补充切除的片段3、重组修复切除错误片段，自另一条复制好的链中找相应片段补充。反应需要&&&&RecA&&&&&&&&&&&&等蛋白参与。&&&&&&&&4、SOS修复：是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修&&&&复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复，使细胞有较高的突变率。此系统由十几个修复蛋白组成。&&&&&&&&（四）基因突变是指由于DNA碱基对的置换、增添或缺失而引起的基因结构的变化。1、自发突变：在自然条件下发生2、诱发突变：人工利用物理或化学药剂诱发&&&&根据基因结构的改变方式分为：碱基置换突变和移码突变根据遗传信息的改变方式分为：同义突变、错义突变、无义突变&&&&&&&&四、转录、复制、翻译1、转录转录是以DNA的一股为模板合成一条互补RNA的过程。转录的整个过程至少需包含以下步骤：&&&&(1)聚合酶来到转录起点附近。DNA里隐含转录起点的序列称为启动子。原核生物的RNA聚合酶可以直接辨认启动子，真核生物的RNA聚合酶则需藉助於转录因子。(2)解开DNA的双螺旋。负责解开双螺旋的酶是解螺旋酶。原核生物的RNA聚合酶具有解螺旋酶的功能，但是真核生物的RNA聚合酶没有，其DNA的双螺旋系由特定的转录因子解开。(3)以DNA的一股为模板合成RNA，所用的原料是核苷三磷酸。(4)终止转录。真核生物和原核生物利用不同的信号终止转录。（注：遗传密码的终止密码子代表肽链合成的终止，并非转录的终止）。在真核生物里，与DNA结合的组蛋白会阻碍RNA聚合酶和DNA的作用，因此需要其他转录因子来应付此种情况。&&&&&&&&RNA转录是以一条全序列负链RNA为模板，指导合成几条较短的正链RNA（即mRNA）&&&&的过程称RNA，如疱疹性口炎病毒（－）RNA可转录出5种单顺反子mRNA，进而翻译出5种蛋白质。&&&&&&&&2、复制&&&&分DNA复制与RNA复制，前者如上述。后者是指以RNA为模板，在RNA指导的RNA聚合酶（也称RNA复制酶）催化下合成互补的RNA链的过程。（－）RNA病毒（如流感病毒、狂犬病毒）或双链RNA病毒都能进行复制。&&&&&&&&3、翻译：以mRNA为模板合成肽链的过程称翻译。&&&&&&&&&&&&4、逆转录：以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下利用宿主细胞中4种dNTP为原料&&&&在引物的3‘端以5‘－3‘方向合成与RNA互补的DNA链（cDNA）的过程称逆转录。&&&&&&&&复制、转录与逆转录的区别&&&&首先是原料不同；酶不同；摸版不同；生成物不同。别的还有调控方式，参与的因子等不同&&&&&&&&五、转录的基础1、转录单位：指RNA聚合酶作用的起始点与终止位点之间的DNA顺序2、转录子：指2个或2个以上紧密连锁并共同转录一种mRNA分子的结构基因组成的&&&&复合单位。只存在于原核生物中。&&&&&&&&3、启动子(promoter)：&&&&又称启动基因，DNA模板上专一地与RNA聚合酶结合并决定转录从何处起始的部位，是也决定基因的转录效率。生物中有许多启动子，如大肠杆菌约有2000个启动子。各启动子的效率可不相同，大肠杆菌的强启动子每2秒钟启动一次转录，而弱启动子每10分钟才启动一次，从百多个大肠杆菌启动子结构的分析，得知两个强启动子的同源序列的中心在转录起始部位(基因编码链上第一个核苷酸)5侧约10和35个核苷酸处，弱启动子序列中往往有多处核苷酸被置换。许多原核生物都含有这两个重要的启动子区：&&&&&&&&真核生物的启动子部位与原核生物不同，而且启动转录的活性，除需启动子外，还需某些外加序列&&&&&&&&4、DNA指导的RNA聚合酶催化NTP合成与模板互补的RNA大肠杆菌的RNA聚合酶含有五个亚单元：a两个，b、b?及σ各一个。真核生物的RNA聚合酶有三种：PolI、PolII及PolIII。其中最主要的是Pol&&&&II，参与所有蛋白质基因以及大部分snRNA基因的转录。PolI位於细胞核的核仁，负责合成5S以外的rRNA。PolIII位於核仁外，负责合成tRNA、5SrRNA、U6snRNA及一些小RNA(如7SL、7SK、7SM等)。这三种聚合酶各由十几个亚单元组成，其中四个与大肠杆菌RNA聚合酶的a、b和b类似。不过，真核生物的RNA聚合酶并不包含类似σ因子的亚单元。它需藉助於一般性转录因子才能来到启动子区域，发挥聚合酶的功能。&&&&&&&&5、终止子&&&&终止子是DNA分子中终止转录的核苷酸序列。而终止密码子是作为翻译终止的信号，在下图中，DNA分子下面一条被从左到右转录，从画线DNA转录来的RNA片段形成发夹环，因为两框中核苷酸含有互补碱基顺序，这就迫使DNA/RNA杂交区域裂开，因&&&&&&&&&&&&而随后包括氢链结合较弱的多聚腺苷酸和尿嘧啶mRNA分子就从这个位置脱离下来。&&&&&&&&6、增强子是能够增强与之相连锁的基因转录活性的调控序列(顺式作用元件)，其本身不&&&&具备启动子的活性。&&&&&&&&增强子的作用特征：&&&&①与启动子的相对位置和取向无关，具有远程效应（只要共处一条DNA分子上）；②需要特定的蛋白因子参与；③有些能在几乎所有类型细胞中发挥作用，而大多数具有相对组织特异性。&&&&&&&&六、转录调控元件与因子1、顺式作用元件：为与结构基因串联的DNA顺序，它们对基因转录的精确起始和活&&&&性调节起着十分重要的作用。如启动子、增强子等。&&&&&&&&2、反式作用因子：是分布于不同或相同染色体上基因所编码的蛋白质因子，通过顺&&&&式作用元件和RNA聚合酶的相互作用而调节基因转录的活性。&&&&&&&&七、基因扩增的概念&&&&在某些情况下，真核细胞DNA分子的一定顺序反复进行复制，而其它部分不复制，这种现象称为基因扩增。（两栖类的卵母细胞中多见）它是通过改变基因数量而调节基因表达产物的一种调节方式。&&&&&&&&八、DNA探针是指一段有标记的与已知的DNA互补的DNA片段。基因探针probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个&&&&基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。具有可检测的标记&&&&&&&&探针的来源&&&&DNA探针根据其来源有3种：一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针（genomicprobe）；另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNA探针（cDNAprobe）。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列。此外，还可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。&&&&&&&&基因和基因组的结构与功能一、基因的生物学概念&&&&?1866Mendel发表《植物杂交实验》，―遗传因子‖通过豌豆实验，提出经典遗传定律：分离定律和独立分配定律1909W.Johannse提出gene这一名词，但还只是遗传性状的符号，未涉及基因的物质概念1910Morgan发现果蝇的白眼性状的伴性遗传，首次特定的基因和一个特定的染&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&色体联系起来1919教材中开始出现gene一词ThePhysicalBasisofHeredite1926Morgan发表TheTheoryofGene，认为：&&&&&&&&基因依孟德尔第一定律（分离定律）而彼此分离，于是每个生殖细胞只含一组基因；不同连锁群里的基因依孟德尔第二定律（自由组合定律）而自由组合；两个相对连锁群的基因之间有时候也发生有秩序的交换，交换率证明了每个连锁群里诸要素的直线排列，也证明了诸要素的相对位置。20世纪40年代Bendle和Tatum提出―一个基因，一个酶‖学说首次在分子水平上给基因如下定义：基因位于染色体上的一定区域，在有丝分裂中作为1个遗传单位存在，并决定一定的表型。20世纪50年代Benzer提出―顺反子‖、―一个顺反子，一条多肽链‖?20世纪60年代遗传密码的破译使人们对基因表达的机理有了更多的了解修改定义为：基因是基因组中的1个区域或1段DNA序列；其转录产物编码1条多肽链或者1个结构RNA分子（tRNA或rRNA）。80年代以后认识到基因表达的复杂性1994Alberts基因是一段DNA序列，包括完整的功能单位（如编码序列、调节序列和内含子等）；基因可以作为1个转录单位，其表达产物通常是1条多肽链或1个DNA分子，但有时编码1组相关的蛋白异形体，有些蛋白异形体的产生和特殊的转录后加工（如RNA编辑）或者翻译水平的再编码（如核糖体跳跃）有关。&&&&&&&&二、基因的现代概念生物学概念：基因是世代相传的，基因决定了遗传性状的表达，基因的颗粒性主要&&&&表现在世代相传的行为和功能表达上具有相对的独立性，基因呈直线排列在染色体上。&&&&&&&&分子生物学概念：合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部&&&&&&&&DNA（除部分病毒&&&&&&&&RNA），即一个基因不仅包括编码蛋白质或RNA的核酸序列，还应包括为保证转录所必需的调控序列。&&&&&&&&三、基因组的概念&&&&细胞或生物体中，一套完整单体的遗传物质的总和，即某物种单倍体的总DNA。对于二倍体高等生物来说，其配子的DNA总和即一组基因组，二倍体有两份同源基因组。&&&&&&&&四、原核生物基因组的特点病毒基因组&&&&1．结构简单，基因组小，所含基因少。2．基因组可由DNA组成，也可由RNA组成，但不能共存于同一病毒。3．相关基因丛集。DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因，丛集在基因组的一个或几个特定部位，形成一个功能单位或转录单位，可被一起转录成为多顺反子mRNA。4．常见重叠基因现象。5．非编码区少，重复顺序少。&&&&&&&&&&&&细菌基因组E.coli&&&&1.一条双链DNA，具有类核结构。2.具有操纵子结构。几个功能相关的结构基因串联在一起受同一个调控区调节。E.coli基因组含3500个基因，有260个已查明具有操纵子结构，定位于75个操纵子中。3.蛋白质基因单拷贝，rRNA基因多拷贝，这可能有利于核糖体的组装。E.coli中rRNA基因（rDNA）具有多拷贝，而且都以转录单位的形式组织在一起。1个转录单位通常含3个rDNA，以16S-23S-5S的顺序串联排列，有的转录单位中间还插有tRNA基因，每个转录单位的长度大于5Kb。转录后先得到rRNA前体，再剪切成16S、23S和5SrRNA4.结构基因中无内含子，边转录边翻译。5.无基因重叠结构。6.DNA分子中有多种功能区。这些区域往往具有特殊的结构，并且含有反向重复序列。&&&&&&&&质粒DNA&&&&存在于细菌与真核细胞中的一种亚细胞结构。绝大多数质粒都是双链DNA分子。没有蛋白外壳，只能在寄主细胞中独立地增殖，并随着宿主细胞的分裂而被遗传下去。对于宿主细胞的生存不是必需的，但质粒所携带的某些基因，可以对宿主细胞的生物学特征产生影响。&&&&&&&&质粒是一个完整、独立的复制子，并且能够转化细胞（把它的一个复本从供体细胞转移给&&&&受体细胞），因此可以作为一种载体，把目的DNA带入宿主细胞中进行增殖。而且通常能给细胞带来特殊的标记，顾而可以利用这些标记来筛选阳性克隆。&&&&&&&&质粒DNA的复制类型严紧型：&&&&每个宿主细胞中仅含有1-3个拷贝，其复制要受到宿主细胞的严格控制。&&&&&&&&松弛型：每个宿主细胞可含有10-60个拷贝，其复制不受宿主细胞的严格控制，即当宿&&&&主细胞蛋白合成受到抑制时，质粒可以继续复制，拷贝数可以增至之多。&&&&&&&&质粒DNA的功能类型1.F质粒（F因子或性质粒）能够使宿主细胞染色体上的基因和F质粒一起转&&&&移到原先不存在该质粒的受体细胞中。&&&&&&&&2.R质粒（抗药性因子）3.Col质粒&&&&&&&&编码一种或几种抗菌素的抗性基因，并能将此抗性基&&&&&&&&因转移到宿主细胞中，使其获得同样的抗性能力。编码控制大肠杆菌素合成的基因。&&&&&&&&细菌基因组学研究的意义&&&&&&&&&&&&1、能够更好地了解病原微生物的致病机制。2、对致病菌基因组的研究，可以加快重要致病基因的发现速度。3、寻找病原菌所特有的DNA序列，提高临床诊断的效率和准确性。4、为筛选有效药物及发展疫苗提供参考。总之，细菌基因组研究将使人类从更高层次上掌握病原微生物的致病机制及规律，从而得以发展新的诊断、治疗、预防微生物感染的制剂、药物及疫苗。此外，新发现的微生物酶及蛋白还可能在工农业生产上有应用价值。&&&&&&&&五、真核生物基因组的特点真核生物基因组结构与功能特点&&&&1、真核生物基因组的化学本质为DNA，大多与蛋白质结合形成染色质，基本结构单位为核小体。每一种真核生物都有一定的染色体数目，除配子为单倍体外，体细胞一般为双倍体，即含两份同源基因组，而原核生物的基因组则是单拷贝的。2、基因组远大于原核生物，结构复杂，基因数庞大，具有许多复制起始点，每个复制子大小不一。3、基因不存在操纵子结构，功能相关基因分散在不同的染色体上。基因都由一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反子，即一分子mRNA只能翻译成一种蛋白质。4、基因组中有大量低度（重复频率103）、中度（重复频率105）和高度重复序列。5、基因是不连续的（断裂基因），由外显子和内含子镶嵌排列而成。基因转录的初级产物需经一定的加工，切除内含子使外显子拼接，才能形成成熟的mRNA。6、非编码区（占90%以上）远大于编码区。7、功能相关的基因构成各种基因家族，它们可串联在一起，亦可相距很远，但即使串联在一起的成簇的基因也是分别转录的。8、基因组中也存在一些可移动的遗传因素，这些DNA顺序并无明显生物学功能，似乎为自己的目的而组织，故有自私DNA之称，其移动多被RNA介导（如在哺乳动物及人类基因组中发现的逆转座子），也有被DNA介导的（如在果蝇及谷类中发现的DNA转座子）&&&&&&&&重复序列将真核生物基因组的DNA进行复性动力学测定，显示3个不同的时相。重复序列的作用&&&&1、编码某些重要的功能性蛋白质及产物等，如组蛋白、rRNA、tRNA等。2、与染色体的构象、着丝点的形成有关。3、参与基因表达调控。&&&&&&&&高度重复序列1.卫星DNA5-10个bp，大多位于着丝粒和端粒、表达基因的间隔区、内含子。&&&&人的卫星DNA可分为I、II、III、IV四种，各类型由不同的重复顺序家族构成。分子杂交研究表明，同一类型中不同家族成员之间不能进行杂交，说明卫星DNA具有多态性。&&&&&&&&2.微卫星DNA又称简单重复序列（simplerepeatsequence,SRS）。&&&&1－6bp为重复单位，10-60次拷贝串联。最常见是2bp串联（即(AC)n和(TG)n，约占10%），散在分布在基因组中，多位于编码区附近，也存在于卫星序列中及中度重复序列中。&&&&&&&&&&&&功能：参与遗传物质结构的改变、基因调控及细胞分化等过程。卫星DNA与微卫星DNA的比较&&&&卫星DNA存在部位重复单位长度重复次数总序列长度重复单位的差异染色体近端粒和着丝粒区6-70bp，常富含GC几次到几百次0.5-30kb重复单位组成稍有差异，微卫星DNA染色体任何部位1-6bp10-60次约200bp重复单位的变异性低，如单个碱基置换很多&&&&&&&&存在数量&&&&&&&&有限，有些染色体尚未见到&&&&&&&&高度重复序列的功能&&&&1、参与复制水平的调2、参与基因表达的调节3、参与转位作4、与进化有关5、作为每一个体的特征6、可能与染色体减数分裂时染色体配对有关&&&&&&&&中度重复序列特征：&&&&1.一般是不编码的序列，在基因调控中起重要作用，包括开启或关闭基因的活性、DNA复制的起始、其转录产物参与hnRNA（不均一核RNA）的处理等；2.重复单位的序列相似，不完全一样，分散在基因组中，序列的长度和拷贝数不均一；具有种属特异性。&&&&&&&&（1）Alufamily&&&&哺乳动物中含量最丰富的中度重复序列家族。重复单位中带有限制性内切酶Alu的酶切位点：AG↓CTTC↑GA主要集中在细胞分裂晚期的R带，大部分属于非编码DNA，但也有一部分位于mRNA的非翻译区，甚至位于编码区内。功能可能与hnRNAr的加工成熟、DNA复制及转录调节有关&&&&&&&&（2）KpnIfamily&&&&仅次于Alu家族的第二大家族。人KpnI顺序长6.4kb，散在分布，拷贝数约为个，占人体基因组的1%。&&&&&&&&（3）Hinffamily&&&&限制性内切酶HinfI约有50-100个拷贝分散在基因组的不同区域。&&&&&&&&多基因家族（multigenefamily）&&&&&&&&&&&&亦称基因家族，是真核生物基因组中一组来源相同、结构相似、功能相关的基因，有的编码蛋白质，有的编码RNA。根据分布不同，可分为两大类：（1）基因成簇地分布在一条染色体上，呈串联排列，产生多个拷贝，具有几乎相同的序列，同时发挥作用，如rRNA、tRNA、组蛋白等。（2）各家族成员分布在不同的染色体上，序列虽然不相同，但编码的是一组紧密相关的蛋白，如干扰素、生长激素、珠蛋白等。&&&&&&&&假基因（pseudogene）&&&&在基因家族中，有些成员的序列与相关功能基因的序列相似，但不能被转录或转录后生成无功能的基因产物。一个假基因常常有多个有害的突变，可能因为作为一种活性基因一旦停止，就再没有适当机制阻止进一步突变的聚积。假基因数目一般较少，往往只占基因总数的一小部分。&&&&&&&&假基因主要有两种类型&&&&（1）由于一种基因的加倍而失活。这种类型假基因保留原来亲本基因的外显子及内含子组织并常与亲本基因密切联系，如α、β球蛋白基因簇的假基因。它们可能是由于失去起始转录信号，或外显子—内含子连接处不能剪接或翻译不能终止。（2）第二种假基因仅含有亲本基因的外显子，常常拥有3‘端polyA尾，并随机分布于基因组中。这些假基因是源于mRNA，并通过逆转录而重新整合进基因组。&&&&&&&&超基因家族&&&&指一组由多基因家族及单基因组成的更大的基因家族。结构上有不同程度的同源性，可能起源于相同的祖先基因，但功能不相同。例如，免疫球蛋白超基因家族。&&&&&&&&单一序列&&&&?也称为单拷贝序列。真核生物一般为二倍体细胞，因此不重复的单一序列存在2个拷贝。大多数结构基因都是单一序列。80%左右的mRNA来自单一序列DNA。结构基因的突变容易引起遗传性状的改变或产生遗传性疾病。&&&&&&&&断裂基因&&&&即不连续基因。绝大多数真核生物的基因都是断裂基因。编码蛋白质的基因称为外显子（exon），其间由不编码的序列即内含子（intron）隔开。转录时一起被转录出来，然后再经过加工剪切内含子后，外显子拼接起来后成为成熟的mRNA。不连续基因的发现时是通过mRNA和DNA杂交实验而发现的。&&&&&&&&?&&&&&&&&移动基因（转座子或转位子，transposon）&&&&?可从染色体基因组的一个位置转移到另一个位置的基因，也可在不同的染色体之间跳跃。&&&&&&&&&&&&?&&&&&&&&?&&&&&&&&20世纪40、50年代，美国遗传学家McClintock（1983年获得诺贝尔生物医学奖）在研究玉米籽粒颜色的高频变异时提出这一概念，当时称为―控制因子‖。这些基因能在玉米不同的染色体上从一个位点转移到另一个位点，有时象一个新奇的生物学开关一样，开动或关闭基因。跳跃基因的概念，使人们认识到功能上相关的各个基因，并不一定以紧密连锁的形式存在，它们可以分散在不同染色体或者同一染色体的不同部位上，因此极大地丰富和发展了现代基因概念。&&&&&&&&人类基因组计划人类基因组结构特点&&&&1、前述的真核基因组的结构特点基本上都适用于人类基因组。2、基因组DNA有30亿个碱基对(3×109bp)，5－10万个基因，目前已定位的有2000个3、编码序列只占基因组总DNA量的5%以下，非编码区占95%以上，大量为重复序列&&&&&&&&人类基因组中的DNA多态性&&&&每个人之间基因组并不完全相同，也叫基因组的多态性，这个多态性表现在DNA的序列上。统计表明，任意两个人之间的DNA核苷酸差异约占基因组的0．01％，就是这基因组中0．01％的差异，决定了人类的遗传多样性，如有的人容易生病，而有的人却对疾病的免疫能力特别高，有些药物，有的人用了就灵验，有的人就不灵验。只有从不同个体DNA序列的差异上阐明人类基因组的多态性，才能真正了解与疾病特别是多基因疾病有关的遗传机制，同时深入准确地了解人类起源、进化和迁徙过程中的DNA序列变化。&&&&&&&&1、位点多态性&&&&是由于等位基因间在特定位点上DNA序列存在差异造成的。例如人血液中的许多蛋白质和红细胞、白细胞的表面抗原在不同个体之间的生化特征、抗原特性都存在着由遗传造成的变异。在各种DNA位点多态性系统中，人类白细胞抗原（HLA）是最复杂的一种，仅其中的HLA-DR抗原的编码位点就有DRA、DRB1DRB2、DRB3、DRB4、DRB5六个座位，共有60多个等位基因。&&&&&&&&2、限制性片段长度多态性&&&&?DNA位点多态性可影响限制酶的切割位点，造成限制性片段长度多态性，即用同一种限制酶消化不同个体的DNA时，会得到长度各不相同的限制性片段类型。不同个体基因组在同一段DNA是否有同样的酶切位点，决定了酶切后是否会产生同样大小的片段。当碱基组成的变化改变了限制酶识别位点（位点消失、产生新的位点、位点移位等）时，就会得到不同的限制性片段类型，这样的位点称为多态性位点。通过限制酶酶切片段的长度多态性来揭示DNA碱基组成不同的技术称为限制性片段长度多态性技术，简称RFLP技术。高度重复序列中的无间隔反向重复序列很容易形成限制酶识别位点，也很容易由于突变产生或失去一个酶切位点。所以，RFLP的基础是高度重复序列（数量大）和点突变。&&&&&&&&?&&&&&&&&3、串联重复顺序多态性&&&&?有一些重复序列，其重复单位很小，比如（CC）n、（ATT）n，但串联重复次数有&&&&&&&&&&&&较大的变化，形成串联重复顺序多态性，也称为可变数目的串联重复序列（variablcnumberoftandcmrepeats，VNTRs），这是另一种DNA序列长度多态性，这种多态性在人群中有极高的频率。串联重复顺序长度多态性主要发生在小卫星DNA和微卫星DNA中。&&&&&&&&研究背景&&&&?1985年，美国能源部（DOE）率先提出，旨在阐明人类基因组DNA长达3×109碱基对（basepair，bp）的序列。发现所有人类基因并阐明其在染色体上的位置，从而在整体上破译人类遗传信息。1986年美国宣布启动―人类基因组启动计划‖。1989年，美国国家卫生研究院（NIH）建立国家人类基因组研究中心（NCHGR）。1990年，NIH和DOE联合提出美国人类基因组计划，正式启动HGP，计划于15年内提供30亿美元的资助，在2005年完成人类基因组全部序列的测定。&&&&&&&&?&&&&&&&&研究进程&&&&HGP启动以后进展顺利，计划进度一再修改。1998年，最后一个五年计划指定出来，HGP提前2年于2003年完成。&&&&&&&&最后一个五年计划的主要目标是：&&&&①得到标记间距为1厘摩厘摩=重组频率为1%的两个基因间的遗传距离）（1的遗传图谱；②得到至少有30万个序列标记位点（STS）的物理图谱，1998年10月实际已经有5.2万个STS被作图；③2001年得到人类基因组序列的―草稿‖，2003年得到最后―定稿‖；④测序能力要达到每年500Mb(1Mb=1000kb),每个碱基对的分析费用要少于25美分，支持毛细管阵列电泳、DNA芯片等的测序技术的发展；⑤增加测定人类基因组变异的内容，得到10万个作图定位了的单核苷酸多态性（SNP）；⑥得到所有基因的全长cDNA；⑦发展在基因组尺度上分析生物功能的技术；⑧在模式生物基因组研究方面，大肠杆菌、酵母菌、短小丽杆线虫的全基因组序列已经全部完成并发表公布，到2002年完成果蝇的全基因组序列，2005年完成小鼠的全基因组序列。&&&&&&&&基因组研究大事记&&&&?１９９０年１０月被誉为生命科学―阿波罗登月计划‖的国际人类基因组计划启动。１９９８年一批科学家在美国罗克威尔组建塞莱拉遗传公司，与国际人类基因组计划展开竞争。１２月一种小线虫完整基因组序列的测定工作宣告完成，这是科学家第一次绘出多细胞动物的基因组图谱。１９９９年９月中国获准加入人类基因组计划，负责测定人类基因组全部序列的１％。中国是继美、英、日、德、法之后第６个国际人类基因组计划参与国，也是参与这一计划的唯一发展中国家。１２月１日国际人类基因组计划联合研究小组宣布，完整破译出人体第２２对染色&&&&&&&&?&&&&&&&&&&&&?&&&&&&&&体的遗传密码，这是人类首次成功地完成人体染色体完整基因序列的测定。２０００年４月６日美国塞莱拉公司宣布破译出一名实验者的完整遗传密码，但遭到不少科学家的质疑。４月底中国科学家按照国际人类基因组计划的部署，完成了１％人类基因组的工作框架图。５月８日德、日等国科学家宣布，已基本完成了人体第２１对染色体的测序工作。６月２６日科学家公布人类基因组工作草图，标志着人类在解读自身―生命之书‖的路上迈出了重要一步。１２月１４日美英等国科学家宣布绘出拟南芥基因组的完整图谱，这是人类首次全部破译出一种植物的基因序列。２００１年２月１２日中、美、日、德、法、英等６国科学家和美国塞莱拉公司联合公布人类基因组图谱及初步分析结果。2002年六国科学家公布人类基因组细节研究成果&&&&&&&&?&&&&&&&&四张图谱1.遗传图谱&&&&遗传图的绘制是人类基因组研究的第一步，是以染色体上某一点为遗传标记，以与之相伴遗传的特征为对象，经连锁分析，将编码该特征的基因定位于染色体特定位置。即通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率，确定它们的相对距离；一般用厘摩（cM，即每次减数分裂的重组频率为1％）来表示。遗传图所表现的，是通过连锁分析确定的各基因间的相对位置。&&&&&&&&2.物理图谱&&&&?是以一段已知核苷酸序列的DNA片段为―位标‖，以DNA实际长度（Mb或kb）作为图距的基因组图。这段已知核苷酸序列的DNA片段称为序列标记位点，在基因组中应有明确的位置。物理图的另一重要内容是构建以DNA克隆片段相互重叠的邻接克隆群&&&&&&&&?&&&&&&&&3.转录图谱&&&&?人类基因组中转录、表达的序列仅占总序列的1％－5％，而人体特别是成年个体的特定组织中又只有10％的基因是表达的。因此如果能把mRNA（或cDNA）先分离、定位，就抓住了基因的主要部分（可转录的部分）。转录图（transcriptionmap）以表达序列标记（expressedsequencetags，EST）作为位标，实际上就是人类―基因图‖的雏形，又称cDNA图或―表达序列图‖。转录图具有特定的生物学意义。&&&&&&&&4.序列图谱&&&&?人类基因组核苷酸序列图（sequencemap）也就是分子水平上最高层次、最详尽的物理图。测定人类基因组的核苦酸顺序是人类基因组计划中最为明确、最为艰苦的定时、定量、定质的任务。由于毛细管电泳自动测序法的建立、计算机和序列软件&&&&&&&&&&&&系统的日臻完善，测序速度不断提高。2000年6月，美国、英国、法国、德国、日本与中国几乎同时宣布人类基因组工作草图完成，尽管该工作草图还需进一步补充完善，但它的完成却是科学界一个具有里程碑意义的重大成就。人类基因组计划研究提供的这―四张图‖被誉为人类―分子水平上的解剖图‖，或被更形象地称为人类―生命元素周期表‖。人类将依赖这张―生命元素周期表‖彻底解开人类进化和生命之谜，同时有望彻底阐明人类6000多种单基因、多基因遗传病的发病机制，并为这些疾病的诊断、治疗及预防奠定基础，人类健康的历史将翻开全新的一页。&&&&&&&&基因表达调控第一节基因表达调控基本概念和原理&&&&&&&&一、基因表达调控的基本概念基因表达:&&&&基因转录与翻译的过程。即是指DNA携带的遗传信息通过转录传递给RNA，&&&&&&&&mRNA通过翻译将基因的遗传信息在细胞内合成具有生物功能的各种蛋白质的过程。&&&&&&&&广义的基因表达是指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个&&&&过程。&&&&&&&&基因表达调控：是指对基因组中某一个基因或一些功能相近的基因表达（生物体内基&&&&因表达）的开启、关闭和表达强度的直接调节。它是生物在长期进化过程中逐渐形成的精确而灵敏的生存能力和应变能力，是生物赖以生存的根本之一。&&&&&&&&二、基因表达的方式（一）组成性表达&&&&指不大受环境变动而变化的一类基因表达。其中某些基因表达产物是细胞或生物体&&&&&&&&整个生命过程中都持续需要而必不可少的，这类基因可称为管家基因(housekeeping&&&&gene)，这些基因中不少是在生物个体其它组织细胞、甚至在同一物种的细胞中都是持续&&&&&&&&表达的，可以看成是细胞基本的基因表达。&&&&组成性基因表达也不是一成不变的，其表达强弱也是受一定机制调控的。?&&&&&&&&（二）诱导和阻遏表达适应性表达：指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。&&&&&&&&应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导，这类基因被称为可诱导的基因&&&&&&&&&&&&随环境条件变化而基因表达水平降低的现象称为阻遏，相应的基因被称为可阻遏&&&&&&&&的基因。?(三)&&&&调表达(&&&&&&&&协调表达:&&&&&&&&一定机制控制下，功能相关的一组基因,协调一致,共同表达,即协&&&&&&&&三、基因表达调控的基本原理（一）基因表达的多级调控&&&&基因在五个不同层次上的调控：DNA水平调控---转录调控---转录后调控---翻译调控---翻译后调控&&&&&&&&（二）基因转录激活调节基本要素&&&&1.特异DNA序列2.调节蛋白3.DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用4.RNA聚合酶&&&&&&&&1.特异DNA序列特异DNA序列主要指具有调节功能的DNA序列。原核生物大多数基因表达调控是通过操纵子机制实现的。真核基因调控机制普遍涉及编码基因两侧的DNA序列——顺式作用元件&&&&&&&&操纵子：通常由2个以上的编码序列与启动序列、操纵序列以及其它调节序列在基因组&&&&中成簇串联组成。每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子。操纵子包括若干个结构基因及其上&&&&&&&&游的调控序列（原核生物）调控序列中的启动子是RNA聚合酶结合模板DNA。&&&&的部位，也是控制转录的关键部位。&&&&&&&&启动序列：RNA聚合酶结合并启动转录的特异DNA序列。又称启动子。各种原核启动&&&&序列特定区域内（通常在转录起始点上游-10及-35区域）存在共有序列&&&&&&&&启动子：指RNA聚合酶识别、结合并开始转录的一段&&&&&&&&DNA序列。原核生物启动子序&&&&&&&&列按功能的不同可分为三个部位，即起始部位、结合部位、识别部位。&&&&&&&&操纵序列：与启动序列毗邻或接近的DNA序列，是原核阻遏蛋白的结合位点。其DNA&&&&序列常与启动序列交错、重叠。&&&&&&&&顺式作用元件特点&&&&&&&&&&&&真核生物编码基因两侧的DNA序列可影响自身基因的表达活性通常是非编码序列包括启动子、增强子、沉默子&&&&&&&&沉默子又称沉默基因、沉默元件(。是一种转录调控元件，特点很象增强子，但不增强转&&&&录，而是减弱转录，故称负增强子。&&&&&&&&2.调节蛋白原核生物基因调节蛋白（DNA结合蛋白）分为三类特异因子：决定RNA聚合酶对一个或一套启动序列的特异性识别和结合能力。阻遏蛋白：可结合特异DNA序列——操纵序列，阻遏基因转录。激活蛋白：可结合启动序列邻近的DNA序列，促进RNA聚合酶与启动序列的&&&&结合，增强RNA聚合酶活性。分解（代谢）物基因激活蛋白就是一种激活&&&&&&&&蛋白。真核生物基因调节蛋白又称转录因子&&&&绝大多数真核转录调节因子由某一基因表达后，通过与特异的顺式作用元件结合（DNA-蛋白质相互作用）反式激活另一基因的转录，称为反式作用因子有些真核调节蛋白可特异识别、结合自身基因的调节序列，调节自身基因的开启或关闭，称为顺式作用蛋白基因产物特异识别、结合其它基因的调节序列，调节其它基因的开启或关闭称为反式调节基因产物特异识别、结合自身基因的调节序列，调节自身基因的开启或关闭称为顺式调节&&&&&&&&转录因子&&&&能直接或间接与RNA聚合酶结合的反式作用因子.按功能特性可分为:&&&&&&&&基本转录因子--是RNA聚合酶结合启动子所必需的一组蛋白因子，决定三种RNA转录&&&&的类别。&&&&&&&&特异转录因子--为个别基因转录所必需,决定该基因的时间、空间特异性表达。3.DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用DNA-蛋白质相互作用主要&&&&指反式作用因子和顺式作用元件之间的特异识别。&&&&&&&&&&&&蛋白质-蛋白质相互作用（是指蛋白质通过分子之间的相互作用实现其特异的生物学&&&&功能。&&&&&&&&蛋白质－蛋白质相互作用&&&&DNA最常见的结合形式&&&&&&&&形成二聚体或多聚体，间接结合DNA是调节蛋白结合&&&&&&&&4.RNA聚合酶&&&&（1）启动序列/启动子与RNA聚合酶活性（2）调节蛋白与RNA聚合酶活性&&&&&&&&第二节原核基因表达的调控一、原核基因转录水平调控(一)原核基因转录调控的特点&&&&1.只有一种RNA聚合酶,?因子决定RNA聚合酶识别特异性2.操纵子模型的普遍性,数个可转录编码基因,转录出多顺反子mRNA通过调控单个启动子来完成多个基因的协调表达.一开俱开,一关俱关。&&&&&&&&操纵子：由一组功能相关的结构基因串联在一起，连同其上游的启动子和操纵基因&&&&(operator,P)组成，P和O合称操纵区，这些共同构成一个转录单位称为操纵子操纵区上游较远处还有阻遏基因，转录翻译为阻遏蛋白，故也称作调节基因(R基因)&&&&&&&&调节基因编码的调节蛋白能识别、结合操纵基因负调控：调节蛋白结合操纵基因后可抑制结构基因的转录。这类调节蛋白称为阻遏蛋白或&&&&阻遏物。&&&&&&&&正调控：调节蛋白结合操纵基因后可促进结构基因的转录。&&&&正、负调控系统是按照没有调节蛋白存在的情况下操纵子对于新加入的调节蛋白的响应情况来定义的。&&&&&&&&操纵子的分类&&&&细胞内某些小分子的代谢物可通过改变调节蛋白活性来调节操纵子的开启或关闭，根据它们对操纵子调节的性质，可将操纵子分为可诱导的操纵子和可阻遏的操纵子两种类型。&&&&&&&&可诱导操纵子：加入小分子后则开启基因的转录活性，这种作用及过程叫诱导。产生诱导作用的小分子物质叫诱导物。乳糖操纵子即属此类型。可阻遏操纵子：加入小分子后则关闭基因的转录活性，这种作用及过程叫阻遏。产生阻遏作用的小分子物质叫辅阻遏物。色氨酸操纵子属此类型&&&&3.原核基因一般不含内含子，其基因是连续的。4.转录和翻译是偶联进行的5.阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性6.影响转录的因素1)启动子2)?因子&&&&&&&&3)阻遏蛋白&&&&&&&&4)正调控蛋白&&&&&&&&&&&&5)倒位蛋白6)RNA聚合酶抑制物7)衰减子原核生物基因表达的调控主要在转录水平，即对RNA合成的调控，因此通常有两种调控方式：一种是起始调控，即启动了调控；另一种终止调控，即衰减子调控。&&&&&&&&(二)、乳糖操纵子调节机制&&&&1.乳糖操纵子的结构2.阻遏蛋白的负性调节3.CAP（分解代谢基因调节活化蛋白）的正性调节4.协调调节&&&&&&&&1、乳糖操纵子的结构&&&&&&&&调控区&&&&IPOZ&&&&&&&&结构基因&&&&YA&&&&&&&&启动序列透酶乙酰转移酶操纵序列CAP结合位点β－半乳糖苷酶调节基因&&&&2、阻遏蛋白的负性调节&&&&没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。I序列表达的lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录启动。有乳糖存在时，lac操纵子可被诱导。别乳糖作为诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离，发生转录&&&&&&&&没有乳糖存在时(基因关闭)&&&&&&&&I&&&&&&&&P&&&&mRNA&&&&&&&&O&&&&&&&&Z&&&&&&&&Y&&&&&&&&A&&&&&&&&&&&&阻遏蛋白&&&&有乳糖存在时(基因开放)&&&&&&&&I&&&&&&&&P&&&&&&&&O&&&&&&&&Z&&&&&&&&Y&&&&&&&&A&&&&&&&&mRNA&&&&&&&&阻遏蛋白&&&&、乳糖&&&&&&&&8-半乳糖醛酶&&&&&&&&半乳糖&&&&&&&&乳糖在透酶催化、转运进入细胞，再经?-半乳糖苷酶催化，转变成别乳糖。&&&&&&&&（3）CAP的正性调节当没有葡萄糖及cAMP浓度较高时，cAMP与CAP（分解代谢基因活化蛋白）结合，这时CAP结合在lac启动序列附近的CAP位点，可刺激RNA聚合酶转录活性。当有葡萄糖存在时，cAMP浓度较低，cAMP与CAP结合受阻，lac操纵子表达下降（4）协调调节Lac阻遏蛋白负性调节与cAMP正性调节两种机制协调合作无乳糖，无诱导物时，转录作用被I表达的阻遏蛋白所阻断有诱导物时，诱导物与阻遏蛋白结合，使其变构，从操纵基因上解离出来。当葡萄糖和乳糖共同存在时，葡萄糖通过降低cAMP浓度，阻碍cAMP-CAP复合物的形成，抑制lac操纵子转录，使细菌只能利用葡萄糖。单独存在乳糖时，cAMP-CAP复合物与CAP位点结合，促进转录，翻译出三种酶，细菌可分解利用乳糖作为能源。&&&&&&&&乳糖操纵子调控的机制&&&&4种不同的组合葡萄糖＋无乳糖基因状态关闭&&&&&&&&&&&&无葡萄糖＋无乳糖葡萄糖＋乳糖无葡萄糖&&&&＋乳糖&&&&&&&&关闭关闭打开&&&&&&&&(三)色氨酸操纵子调控机制作用:产生合成Trp的三种酶&&&&调控机制:阻遏蛋白+转录衰减阻遏蛋白执行的―开、关‖不是Trp操纵子的全部调节过程，转录开始后,转录衰减进行细调.&&&&&&&&色氨酸操纵子&&&&当有色氨酸结合阻遏蛋白时，阻遏蛋白构象改变可结合O序列，阻断基因转录。阻遏蛋白当没有色氨酸结合阻遏蛋白时，阻遏蛋白不能结合O序列，基因开始转录。&&&&&&&&转录衰减&&&&当色氨酸丰富时，色氨酸操纵子使用衰减作用来终止和减弱转录。转录衰减的DNA作用部位称为衰减子。它是位于结构基因上游前导序列中具有终止子结构的短序列。前导序列转录的RNA5‘端162个核苷酸顺序，这段mRNA包含4个彼此互补的区域，可形成独特的二级结构。区域1还是一个开放阅读框，可编码一个含14个氨基酸的短肽，称为前导肽。前导肽的第10、11位是两个连续的Trp。有足够的Trp供给时，前导肽继续合成，核蛋白体占据1区和2区，3、4区配对形成发夹结构。其后又紧跟一串U残基，转录终止Trp缺乏时，没有色氨酸-tRNA供给，前导肽的翻译至Trp密码子（UGG）时停止，核蛋白体不再移动，占据1区位置，区域2，3配对，区域4空出，不形成转录终止信号。&&&&&&&&（四）RNA聚活酶活性调节——严谨反应&&&&?蛋白质合成时，空转反应，消耗GTP，生成GDP，产生严谨因子催化下列反应：严谨因子ATP+GDPPPPGPP或PPGPP与RNApolE形成复合物使酶活性下降&&&&&&&&&&&&二.原核基因翻译水平调控&&&&（一）反义RNA的调控作用反义RNA是指能与特定mRNA互补结合的RNA片段，又叫干扰mRNA的互补RNA，&&&&即micRNA。由反义RNA基因转录而来。其调控为翻译水平的调控，有三种方式：1、mRNA5′端非转译区包括SD序列相结合与（SD序列是mRNA与核糖体小亚基结合的部位）2、与mRNA5′端编码区起始密码子AUG结合3、与靶mRNA的非编码区互补结合，使mRNA构象改变影响其与核糖体的结合&&&&&&&&渗透压对大肠杆菌外膜蛋白OmpC和OmpF合成的调节就是通过反义RNA(micRNA)调控实现的。（二）mRNA的稳定性&&&&增加mRNA的稳定性，延长mRNA寿命，可提高翻译水平。核糖体蛋白与mRNA结合阻止翻译&&&&&&&&（三）核糖体蛋白自体调控&&&&与rRNA结合成核糖体&&&&&&&&第三节&&&&&&&&真核基因表达的调控&&&&&&&&一、真核基因组结构特点&&&&（一）真核基因组结构庞大（二）单顺反子（三）重复序列（四）基因不连续性&&&&&&&&多顺反子：细菌大多数基因按功能相关性成簇地形成操纵子，由操纵子机制控制转录&&&&生成的mRNA是多顺反子，即一个mRNA分子编码几个功能相关的蛋白质。&&&&&&&&单顺反子：真核生物转录生成一个mRNA分子，经翻译生成一条多肽链，真核基因&&&&转录产物为单顺反子。&&&&&&&&二、真核基因表达调控特点&&&&（一）RNA聚合酶（二）活性染色体结构变化（三）正性调节占主导（四）转录与翻译分隔进行（五）转录后加工、修饰&&&&&&&&三.基因组水平调控&&&&（一）基因易位（二）基因扩增（三）基因重排（四）DNA甲基化&&&&&&&&四.转录水平调控&&&&多级调控中，主要在转录水平通过顺式作用元件和反式作用因子相互作用来实现。（一）顺式作用元件启动子增强子沉默子&&&&&&&&增强子：由约200bp的DNA序列组成其作用在于增加转录的频率。&&&&增强子的特点有：1.可以在很远的距离（1-30kb）作用于顺式连接的启动子。2.增强&&&&子的作用是没有方向性的3.增强子既可位于启动子的上游，也可位于启动子的下游，还可位于启动子内部4.增强子无基因的特异性，对各种基因的启动子均有作用，但有组织特异性。&&&&&&&&&&&&（二）反式作用因子&&&&&&&&1.转录调节因子分类（按功能特性）&&&&基本转录因子：指普遍存在于各种细胞中、结合在TATA盒附近的转录因子，主要&&&&参与RNA聚合酶与转录起始点附近的DNA特异序列形成稳定的转录起始复合物。&&&&&&&&特异转录因子：为个别基因转录所需，决定该基因的时间、空间特异性表达。有转&&&&录激活因子和转录抑制因子两种2.转录调节因子结构&&&&&&&&三个结构区域：DNA结构区域，转录结合激活域，二聚话结构域&&&&五.转录后水平调控（一）mRNA前体加工，5‘-端加m7G帽，3‘-端加polA尾，这两个因素保证mRNA在转录过程中不被降解。（二）mRNA选择性剪接对基因表达的调控作用1.mRNA选择剪接1）外显子选择，也称外显子跳跃：一是外显子全部保留，二是删除一个或几个外显子。2）互斥外显子一对外显子中，二者不能同时出现在同一个成熟的mRNA中。2.选择剪接对基因表达的调控作用Bax基因编码产生几种蛋白，缘于mRNA的选择剪接形成不同的表达产物。六.翻译水平调控（一）翻译起始的调控起始因子可逆磷酸化是常见的调节方式，如血红素对翻译起始因子的调控制。（二）mRNA稳定性的调节真核基因，mRNA的稳定性差别很大，为珠蛋白的，半衰期10小时以上，而有些只有30分钟。3‘端非编码区结构（AU丰富区）影响mRNA的稳定性。（三）小分子RNA(lin-4RNA的影响1993年发现一种小分子lin-4RNA像霉和调节蛋白那样对真核生物的翻译起阻抑作用。七.翻译后水平的调控（一）高级结构的修饰1.亚基聚合2.辅基连接（二）一级结构的修饰1.新生肽链的水解2.个别氨基酸的修饰3.通过信号肽分拣、运输和定位。&&&&&&&&分子克隆（基因工程）&&&&前言二十世纪40年代，基因分子生物学家确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质二十世纪40年代，基因分子生物学家确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质1944年O.T.Avery等证明了肺炎球菌转化因子是DNA&&&&&&&&&&&&50年代，Waston和Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制深刻意义在于：解决了基因自我复制和遗传信息的传递问题50年代末和60年代，相继提出了―中心法则‖和操纵子学说，并成功破译了遗传密码。从而阐明了遗传信息的流向和表达问题DNA(自主复制)-----转录mRNA，tRNA,rRNA---翻译蛋白质:RNA逆转录形成DNA这些都为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础&&&&&&&&基因工程的诞生&&&&70年代初，DNA限制性内切酶的发现和一整套DNA体外重组技术又为基因工程的发展奠定了坚实的技术基础。1972年，美国学者Berg.P等人首次在体外把SV40（一种猴病毒）的DNA和噬菌体DNA分别切割，又将两者接在一起，成功地构建了第一个体外重组的人工DNA分子。1973年，Cohen等人首次将体外重组的DNA分子导入大肠杆菌中，成功地进行了无性繁殖，从而完成了DNA体外重组和扩增的全过程。基因工程这门新兴学科也就由此诞生了。&&&&&&&&基本概念&&&&基因工程的核心是重组DNA技术，又叫DNA克隆。所谓克隆是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。在基因工程中所指的克隆，是指在体外对DNA分子按照既定目的和方案进行人工重组，并将重组分子导入适合的宿主细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。这类克隆是在分子水平上操作，故又称分子克隆。由于研究对象常常是特异的基因片段，所以又称作基因克隆。实现基因克隆所采用的方法及相关工作统称为基因工程。基因工程与当前发展的蛋白质工程、酶工程以及细胞工程共同构成了当代新兴的学科领域——生物技术工程。生物技术工程的兴起为现代科学技术发展和工农业、医药卫生事业的进步提供了巨大动力。细胞克隆技术：在制备单克隆抗体的B淋巴细胞杂交瘤技术中运用的最为充分。哺乳动物的克隆：克隆概念在个体水平上的应用采用了核质分离、细胞融合、体外培养及胚胎移植等技术&&&&&&&&主要内容&&&&①从复杂的生物有机体基因组中，分离出目的基因片段。②在体外，将目的基因片段连接到能自我复制的并且具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。③将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称宿主细胞），并与之一起增殖。④筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。⑤从筛选出的阳性克隆中提取出扩增的目的基因片段，供进一步研究使用。⑥将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之实现功能表达。应用实例重组DNA技术跨越天然物种屏障，将原核和真核生物，植物和动物，细菌和人，动物和人的基因连接起来，进行基因交流。利用大肠杆菌（E.coli)、酵母、哺乳动物细胞表达系统来生产人类所需要的，从其他方法又难以大量获得的重组蛋白质。1、第一个用细菌表达的用于人类的基因重组药物——人胰岛素上市（1979年美国基因技术公司）牛、猪胰岛素，免疫反应。。化学合成人胰岛素基因。。插入E.coli表达载体中?-半乳糖苷酶&&&&&&&&&&&&基因后。。融合蛋白。。溴化氰水解。。混合重建2、用酵母细胞生产乙型肝炎病毒亚单位疫苗乙肝病毒包括包膜蛋白，，核心蛋白，，病毒DNA用基因工程方法制备乙肝表面包膜蛋白为抗原亚单位疫苗无致病力，很安全、高效。3、生物钢目前世界范围内开发的基因工程多肽药物、疫苗、抗体有五百多种&&&&&&&&理论意义&&&&1、彻底填平了生物种属间不可逾越的鸿沟2、重组技术缩短了进化单位3、能按人们的意愿定向改造、培育新品种4、解决医学与生物学上长期无法解决的许多重大（如是什么基因、在什么地方、什么时间、起什么作用？如何起作用？）人们预言，21世纪是生命科学的世纪，以基因工程为主导的生物技术可能对世界的重大问题－－饥饿、疾病、能源、污染等提出切实的解决办法，推动社会生产力的飞速发展。&&&&&&&&一、分子克隆中常用的工具酶&&&&在重组DNA与基因工程中，对目的基因的分离、剪切和重组涉及到一系列酶催化反应，这些酶就像外科医生的手术刀一样，是进行基因工程操作必不可少的工具。常分为限制性核酸内切酶、连接酶和核酸修饰酶。&&&&&&&&限制性核酸内切酶&&&&限制性核酸内切酶是指能识别DNA的特殊序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类酶。它主要来源于原核生物，可将侵入宿主细胞的外源性DNA迅速降解，而对细菌自身的DNA，则通过甲基化酶在该种限制酶切位点甲基化修饰而保护自身的DNA不被降解。限制性内切酶由于能限制外源DNA的―入侵‖而得名。限制性核酸内切酶的命名命名是根据含有该酶的微生物种属而定。通常有三个斜体字母的缩写表示。第一个大写字母取自细菌属名的第一个字母；第二、三个小写字母取自微生物种名的头两个字母；第四个字母代表该微生物同种内不同的株系；如果同一株名发现几种限制酶，则根据其被发现和分离的先后顺序，用罗马数字表示。例如，从大肠杆菌（EscherichiaColi）RY13株中发现分离的第一种限制酶，称为EcoRI。限制酶的分类及特点根据限制酶的组成、辅因子及切割DNA方式不同，可分为I、II、III型。重组DNA技术中常用的是II型限制性内切酶。型酶作用特点是有严格的识别、II切割顺序，以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5?端为磷酸基，3‘端为羟基。识别顺序一般为4－6个碱基，通常是回文结构（palindrome）。识别序列的大小决定其切割DNA后产生的片段的长短。44＝256、46＝536II型酶切割双链DNA产生3种不同的切口：⑴在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或称钝性末端，如HpaI：5…GTT▼AAC…3HpaI5…GTTAAC…3?3…CAA▲TTG…53…CAATTG…5⑵在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从5端切割产生5端突出的粘性末端，如EcoRI：5…G▼AATTC…3EcoRI5…GAATTC…33…CTTAA▲G…53…CTTAAG…5&&&&&&&&&&&&⑶从3端切割产生3端突出的粘性末端。如PstI：5…CTGCA▼G…3PstI5…CTGCA3…G▲ACGTC…53…G&&&&&&&&G…3?ACGTC…5&&&&&&&&同工异源酶&&&&1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶2.特点：1）识别相同顺序2）切割位点的异同KpnIGGTACCSstICCGCGGAsp718GGTACCSacICCGCGG&&&&&&&&同尾酶&&&&有些限制酶识别序列不同，但产生相同的粘性末端，称这些酶为同尾酶。如：BamHI(GGATCC)和Sau3AI(NGATCN)由此产生的DNA片段可借粘性末端相互连接，在DNA重组时具有更大的灵活性星号活力：限制性内切酶在非标准反应条件下，能够切割一些与其特异性识别顺序类似的序列，这种现象称星号活力。5?…G▼AATTC…3‘5?…N▼AATTN…3‘星号活力EcoRI*诱发星号活力常见原因：高甘油含量1、（5%，V/V）内切酶用量过大，（100U/?2、gDNA）3、低离子强度：25mmol/L4、高pH值：pH85、含有机溶剂：二甲基亚砜、乙醇、乙烯二乙醇等6、有Mn2+、Cu2+、Zn2+、Co2+等非Mg2+的二价阳离子。。应用在分子生物学和基因工程中具有举足轻重的地位。其主要胜用途：1、改造及组建质粒2、组建基因组DNA物理图谱3、基因组DNA同源性研究4、DNA重组克隆及亚克隆5、DNA杂交与序列分析注意事项1酶切底物DNA要纯，抽提时酚／氯仿要去除干净。2所加酶量不应超过10％（RE保存在50％的甘油中－20度较稳定）取酶时量要准，最后加酶，最好在冰箱里加。4酶切反应2。3小时左右，可延长，节约酶量。5两种酶有相同的缓冲液，可双酶切；不同，先用需低盐缓冲液的限制酶消化，再用需高盐缓冲液的酶消化。DNA连接酶连接酶可催化DNA分子中相邻5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。常用的有T4（噬菌体）DNA连接酶和E.ColiDNA连接酶。DNA聚合酶重组DNA技术中，聚合酶（polymerase）的最重要作用是以DNA或RNA为模板在体外合成DNA或RNA。可分为DNA聚合酶和RNA聚合酶两大类。RNA聚合酶以DNA为模板合成RNA。常用于离体条件下，合成单链RNA作为杂交探针。常用的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(klenow)以DNA为模板，催化5?→3‘核酸链的延长，另有3?→5‘的外切酶活性。常用于DNA3?末端的标记和填充；cDNA第二链的合成，DNA测序。磷酸酶牛小肠碱性磷酸酶，催化DNA或RNA的5磷酸基水解。常用于去除线状载体DNA两端的5磷酸基团，防止载体自身连接环化；也用于用32P标记DNA的5末端之前除去原来的5磷酸基。逆转录酶&&&&&&&&&&&&以RNA为模板，合成cDNA链（5→3），另有RNA酶H活性。常用于cDNA第一，二链的合成及反转录PCR（RT-PCR）。名称功能及应用大肠杆菌DNA聚合酶I大片段以DNA为模板，催化5‘→3‘核酸链的延长，另有3‘→5‘的外切酶活性。常用于DNA3‘末端的标记和填充、cDNA第二链的合成、DNA测序。以DNA为模板，催化5‘→3‘核酸链的延长，另有弱的5‘→3‘的外切酶活性，耐高温。常用于PCR及DNA测序催化NTP中的NMP通过其磷酸基与DNA3‘-OH连接而使DNA链延长，无需模板。常用于3端标记或形成DNA共聚尾巴。以RNA为模板，合成cDNA链（5‘→3‘），另有RNA酶H活性。常用于cDNA第一、二链的合成及反转录PCR（RT-PCR）。以DNA为模板合成RNA。常用于离体条件下，合成单链RNA作为杂交探针。&&&&&&&&TaqDNA聚合酶&&&&&&&&末端转移酶&&&&&&&&逆转录酶&&&&&&&&RNA聚合酶&&&&&&&&二、分子克隆中常用的载体基因工程载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。什么样的载体才是较为理想的呢？其基本条件是：①能自主复制并能带动插入的目的基因一起复制。②具有适当的限制性酶切位点，以便目的基因的插入。③载体分子大小合适，太大不易复制；太小不易容纳较大目的基因。④具有合适的筛选标记（如抗药性基因，酶基因等），以便筛选阳性克隆。⑤如作为表达载体，要配备适当的调控元件，如启动子、增强子等。载体的分类一般常用的载体按来源分有质粒、噬菌体和病毒。天然的质粒、噬菌体、病毒都需经过人工改造才能成为合乎要求的基因工程载体。质粒和噬菌体常用于以原核细胞为宿主的分子克隆；动物病毒常用于以真核细胞为宿主的分子克隆。载体按得到的产物分类：克隆载体主要用于DNA大量扩增，并不需要得到目的基因所编码的蛋白质。表达载体，使插入的目的基因可转录、进而翻译成多肽链而设计的载体，具有表达外源基因的能力。&&&&&&&&质粒载体&&&&质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，能在宿主细胞独立自主地进行复制，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞新的遗传性状，如质粒携带的氨苄青霉素抗性基因使宿主细胞对氨苄青霉素产生抗性，从而轻易地筛选出成功转化了质粒的细菌。载体质粒上往往还引入了―多克隆位点‖，即一段人工合成的DNA序列，上面含有密集的多种限制性酶切位点，以供插入外源基因片段。另外，较好的载体往往还引入多种用途的辅助序列，如供蓝白斑筛选的LacZ基因。如果插入的外源基因是在lacZ基因内，就会影响lacZ的表达，利用lac-E.coli为转染或感&&&&&&&&&&&&染细胞，在含X-gal的培养基上生长时会出现白色菌落；若无外源基因插入，则出现蓝色菌落α-互补：pUC质粒带有大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的一个片段LacZ基因，它编码β-半乳糖苷酶的一个片段，而宿主细胞能编码与这个片段互补的β-半乳糖苷酶的另一部分，实现互补，形成完整的β-半乳糖苷酶，此酶能分解发色底物X-gal，形成蓝色菌落。当外源基因插入后，LacZ基因被破坏，不能合成完整的β-半乳糖苷酶，因此不能分解底物X-gal，菌落成白色。因此通过蓝白斑筛选可以筛选、鉴定重组体与非重组体载体。&&&&&&&&噬菌体载体&&&&是一种细菌病毒，可作为克隆载体。其优点是可以在体外包装产生感染性很高的噬菌体颗粒。目前使用的噬菌体载体主要有λ噬菌体衍生物载体、粘粒载体和单链M13噬菌体载体等。除M13噬菌体载体外，这类载体的特点是其容量比质粒载体大，即可插入较大的外源DNA片段（如20kb以上）。M13噬菌体目前常用的单链载体是经改建的M13mP系列。其中引入了lacZ基因一部分和多克隆位点，因此也可用蓝白斑筛选重组DNA。M13噬菌体基因组是单链环状DNA，当它侵犯宿主菌后，在细菌胞内酶的作用下，单链DNA转变成复制型双链DNA，可提取出来做基因重组。双链DNA在大肠杆菌中复制100-200拷贝后，M13的合成转变成不对称地合成双链中的一条，产生大量单链DNA，并包装成成熟的噬菌体颗粒，透出菌壁，释放到培养基中。因此可以从大肠杆菌培养基中分离单链DNA。M13噬菌体的最大特点就是能产生单链DNA，这是独一无二的。因此从培养基上收获到的含目的基因的M13单链DNA可直接作为模板进行双脱氧链终止法测序和寡核苷酸定点突变。&&&&&&&&λ噬菌体&&&&λ噬菌体是一种大肠杆菌病毒，为线性双链DNA，它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称COS位点。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。λ噬菌体侵入细菌后，即可裂解生长（环状DNA在细菌中多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌），又可以溶源生长（λ噬菌体DNA整合到细胞染色体基因组DNA中，与染色体DNA一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解）。λ噬菌体基因组中功能相关基因集中分布。包装限制性。重组子大小在75％－105％，可被包装成为成熟颗粒。λDNA在体外可包装成病毒颗粒（将重组DNA包装进入头部或尾部蛋白中），并高效感染大肠杆菌。&&&&&&&&粘粒载体（又称柯斯质粒载体）&&&&粘粒载体由质粒DNA和λ噬菌体DNA两部分组成。粘粒具有质粒的特性，在宿主细胞中能自主复制，有克隆位点，也有抗药性基因。同时粘粒又具有λ噬菌体的特性。在λDNA中主要是λDNA的粘性末端COS位点及其与包装有关的短片段。能按λ噬菌体DNA分子的同样方式环化起来，克隆外源DNA后，经体外包装能高效进入大肠杆菌细胞。粘粒的一大特点是能容纳长达35－45kb的大片段外源DNA，因此常用作大片段外源DNA的克隆。外源基因插入到两个线状粘粒之间λ噬菌体的A蛋白切下COS位点以外部分，中间部分包装到外壳蛋白中，组成成熟的噬菌&&&&&&&&&&&&体颗粒。重组子与λ噬菌体DNA体外包装系混合&&&&&&&&真核细胞用载体&&&&真核细胞用作克隆基因的表达具有很多优点，如它能识别和剪切外源基因中的内含子并加工成成熟的mRNA，对表达的蛋白质进行翻译后加工和修饰（如糖基化）等，这些都是原核细胞办不到的。目前所用的真核载体大多是所谓穿梭载体，它既含有原核细胞的复制原件，又含有真核细胞的复制原件，因此它既可以在原核细胞中复制扩增，也可以在真核细胞中扩增、表达。由于在原核体系中基因工程的重组、扩增、测序等易于进行，所以利用穿梭载体，首先把要表达的基因装配好后再转到真核细胞中表达，这为真核细胞基因工程操作提供了很大的方便。真核细胞载体又可分为哺乳动物细胞载体，酵母细胞载体和昆虫细胞载体。哺乳动物细胞载体通常是用能在真核细胞中复制的DNA或RNA病毒来构建，如腺病毒载体、逆转录病毒载体等。人工染色体前面我们提到过用粘粒载体可以克隆长达35－45kb的外源基因片段，但是还有许多基因过于庞大，不能作为单一片段克隆于这些载体中。人类基因组、水稻基因组工程的工作需要能容纳更长DNA片段的}