DNA和RNA结合蛋白的分离
序列特异性DNA和RNA结合蛋白 (如启动子、基因调控蛋白和转录因子) 在正常细胞调控和疾病状态 (如癌症和特定的遗传疾病) 中发挥了重要作用。 这些调控蛋白是潜在的药物靶点，但这些蛋白通常是稀少的短寿命蛋白，因此您需要一种快速且灵敏的纯化方法。
选择链酶亲和素偶联的Dynabeads(R)，简单、快速且可靠地完成序列特异性DNA或RNA结合蛋白的纯化。
灵敏、快速且方便的固相磁珠操作
在30中分离均质的纯转录因子
只需一步吸附操作即可获得高产量蛋白质
富集DNA和RNA结合蛋白至20,000倍
通过链霉亲和素-生物素结合将DNA偶联至Dynabeads(R)上，其至少可以重复使用十次
Dynabeads(R)上DNA的高稳定性和结合能力使得靶蛋白可与游离溶液中具有类似动力学特点的DNA结合
将生物素标记的DNA/RNA靶序列固定至磁珠上，加入细胞提取物进行孵育。 您可以利用磁珠分离法分离结合蛋白。 您可以将蛋白质洗脱下来进行鉴定或将整个固相复合物直接用于诸如DNA酶足迹研究。
磁珠与蛋白质的非特异性结合程度较低，因此它适用于DNA和RNA结合蛋白的分离。
要固定较大的DNA片段，。
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电话：400-650-5118 & 800-810-5118艾德科技-PureLink 病毒RNA/DNA小量提取试剂盒-PureLink(R) Viral RNA/DNA Mini Kit::现货---PureLink 病毒RNA/DNA小量 提取试剂盒（）::::RNA甲基化定量︱RNA甲基化定性︱DNA甲基化定量︱DNA甲基化定性︱表观遗传学︱分子生物学︱免疫生物学︱生物信息学︱细胞生物学︱蛋白质组学︱实验仪器学︱实验试剂学︱实验耗材学︱艾德科技（北京）有限公司
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现货---PureLink 病毒RNA/DNA小量 提取试剂盒（）
PureLink 病毒RNA/DNA小量提取试剂盒
PureLink(R) Viral RNA/DNA Mini Kit
产品描述：PureLink(TM) 病毒 RNA/DNA 小量提取试剂盒 (PureLink(TM) Viral RNA/DNA Mini Kit) 是核酸纯化系统，设计用于从无细胞样品，比如血清、血浆和脑脊液快速简单地分离病毒 RNA 或 DNA。 起始样品体积可以高达 500 ul，洗脱体积低至 10 ul，从而将核酸浓缩 50 倍。 使用 PureLink(TM) 病毒 RNA/DNA 小量提取试剂盒 (PureLink(TM) Viral RNA/ DNA Mini Kit) 可获得更高的靶标浓度，从而为下游检测过程比如实时定量 PCR 或终点分析提供更高的灵敏度和精确度。 专门配制的缓冲液可纯化 RNA 或 DNA，使一个系统能用于所有病毒提取样品。 此外，试剂盒提供足够量的裂解缓冲液，可以处理大体积的起始样品
产品特点：
1·获得高度浓缩的病毒核酸，检测的灵敏度更高 - 起始样品 500 ul，洗脱体积仅 10 ul；
2·一个试剂盒提供病毒提取的完整方案 - RNA 和 DNA 病毒均能提取和浓缩；
3.一个试剂盒提供病毒提取的完整方案 - RNA 和 DNA 病毒均能提取和浓缩；
4.产生高质量的 DNA 和 RNA - 非常适合下游应用，例如实时 PCR 和终点分析；
5.由 PureLink(TM) 病毒 RNA/DNA 小量提取试剂盒 (PureLink(TM) Viral RNA/DNA Mini Kit) 制备的样品的 Ct 值普遍较低（图 2），说明灵敏度更高。
数据分析：
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定购信息：
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EpiNext RNA甲基化极易测序分析试剂盒（illumina仪器专用）
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96孔DNA甲基化极速修饰试剂盒（磁珠法）
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抗人C5a/C5a desArg单克隆抗体(克隆号2942)
抗人TNF-R II单克隆抗体(克隆号80M2),FITC标记
抗人TNF-R II单克隆抗体(克隆号MR2-1),生物素标记
抗人TNF-R I单克隆抗体(克隆号MR1-2),生物素标记
抗小鼠TREM-2单克隆抗体(克隆号6E9)
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5-hmC是近年来在动物组织中发现的，由胞嘧啶修饰而来。5-hmC在表观遗传学上的功能可能与5-甲基化胞嘧啶(5-mC)不同。尽管到现在为止还不确知其功能，有研究者猜测它在调控基因的表达与关闭过程中起着重要的作用。5-mC的发现让我们不得不重新评估DNA甲基信息，也不得不监测人类的健康组织和病理组织之间5-mC相对分布的差异。在EPI公司的MethylFlash技术之前，我们还没有发现任何直接的常规方法来检测5- hmC,以及区分5-hmC和5-mC
5-hmC 和 5-mC的区别
时下常用的DNA甲基化分析方法包括限制内切酶酶切和亚硫酸氢盐或MeDIP介导的MS-PCR和测序，这些技术都不适合用来检测5-hmC，因为它与5-mC事实上很难用这类方法区分开来。为了解决这个问题，EPIk研制了MethylFlash羟甲基化DNA定量试剂盒(荧光法)。本试剂盒提供了一种很经济的方法来检测5-羟甲基化胞嘧啶，并且区分5-hmC, 5-mC, 和 C，使得研究者能够重新评估他们的DNA甲基化信息，也能够在新样品中寻找DNA羟甲基化。
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技 术:hugasis专家指导：如何提取和分析血液DNA，RNA与蛋白
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专家指导：如何提取和分析血液DNA，RNA与蛋白
血液生物学指标的商业化检测目前主要集中在癌症领域。也有许多学术研究者尝试用这种方式改善其他疾病的检测和诊断。不过，研究者们一直没能在检测方法上达成一致。“我们还处于探索阶段，”美国转化基因组研究所的Kendall Van Keuren-Jensen说。“大家都想实现监测方法的标准化，但现在还很难说什么才是最好的方法。”血液是唯一与所有器官都有接触的组织，携带着有关机体的大量宝贵信息。在理论上，检测血液携带的 DNA、RNA、囊泡和细胞残骸可以帮助人们诊断和监控各种疾病。产前基因筛查是血液检测的一个重要应用，通过分析孕妇血液中的胎儿DNA来鉴定染色体异常（比如唐氏综合症）。此外，越来越多的研究者开始关注血液循环中的其他生物学指标，比如RNA、微囊泡和外泌体。外泌体（Exosomes）发现于上世纪八十年代中期，直到近几年才开始引起科学家们的注意。外泌体是机体绝大部分细胞都能分泌的一种小囊泡，直径在30 至100nm之间。外泌体装载的蛋白质、调控性microRNA、DNA片段和其他代谢物，可以反映相应组织的内部活动。过去在很长一段时间里，人们曾将外泌体视为无用的碎屑。但现在研究者们意识到，外泌体在细胞之间起到了信使作用，而且与肿瘤转移有关。外泌体受到广泛关注是因为它具有独特的性质。外泌体中的大分子不会受到外界核酸酶和蛋白酶的破坏，也就是说其中的生物学指标在一段时间内比较稳定。此外，外泌体上的表面标志物能够体现它的细胞来源，人们可以在此基础上进行特异性的富集，比如专门收集来自肿瘤的外泌体。外泌体还有一个明显的优势：它们只揭示活细胞的情况。因为只有活细胞才能分泌外泌体。研究者们可以通过外泌体来监控活细胞，无视那些因为药物治疗而濒临死亡的细胞。微囊泡（Microvesicles）是从细胞表面被动分离出来的，一般比较大，直径可达1,000 nm。不同类型的微囊泡持有不同的细胞信息，很可能需要特别的提取方案。近年来人们逐渐意识到，细胞外微囊泡对癌症的发展和复发起到了重要作用。华中科技大学的研究人员在Cancer Research杂志上发表文章指出，微囊泡中的miRNA会推动造血细胞的白血病转化。研究显示，慢性粒细胞白血病（CML）K562细胞的微囊泡，能使正常造血干细胞转变为白血病样细胞。血液生物学指标的商业化检测目前主要集中在癌症领域。也有许多学术研究者尝试用这种方式改善其他疾病的检测和诊断。不过，研究者们一直没能在检测方法上达成一致。“我们还处于探索阶段，”美国转化基因组研究所的Kendall Van Keuren-Jensen说。“大家都想实现监测方法的标准化，但现在还很难说什么才是最好的方法。”为了帮助大家更好的分离囊泡、提取RNA、存储样本和分析数据，The Scientist杂志与多位专家学者探讨了检测不同血液生物学指标的策略，贡献出了相应的注意事项和实验技巧。甲基化图谱分析表观遗传学修饰可以在不改变DNA序列的情况下调控基因的活性，对于人类发育、人类疾病和环境影响有深远的意义，是近年来生命科学领域的一大研究热点。DNA甲基化是最常见的一种表观遗传学修饰，广泛参与了细胞对基因表达的控制，在细胞生长、细胞分化、细胞增殖和疾病状态中起到了关键性的作用。研究者：香港中文大学的卢煜明（Dennis Yuk-ming Lo）教授卢煜明教授是分子生物学临床应用专家，尤其致力于研究人体内血液的DNA和RNA。现为香港中文大学李嘉诚健康科学研究所所长、李嘉诚医学讲座教授兼化学病理学讲座教授。他屡获国际殊荣，包括2005年国家自然科学奖、2006年国际临床化学和实验室医学联合会─分子诊断学杰出贡献奖、2006年美国国家临床生物化学学院（NACB）杰出科学家奖、2006年裘槎基金会优秀医学科研者奖等等。研究项目：根据血液中的甲基化DNA分析机体器官的状态背景：卢教授是无创产前诊断的奠基人，率先提出了在孕妇血液中检测胎儿DNA的理论。“血液DNA本质上是来源于不同器官的DNA混合物，我希望能够通过血液检测来判断机体不同部位的异常，”卢教授介绍道。工作进展：为了解决多种组织在血液中的DNA贡献，卢教授的研究团队从十四种不同组织（包括肝脏，血細胞，胎盘等等）的甲基化组中挖掘出5,820个带有足够组织信息的甲基化生物标记。然后他们利用二次规划法分析多维的方程组，求出关于各个组织在血液中贡献的最优解。这就是生物信息学重迭解析处理（bioinformatics deconvolution process）方法。研究人员发表在美国国家科学院院刊PNAS杂志上的研究显示，较低的测序覆盖度也能分辨与移植器官和肝癌有关的甲基化模式。这种方法能够给出可靠的信息，鉴定异常循环DNA的器官来源。举例来说，研究人员在血液中检测到了癌细胞基因组的拷贝数变异，并且根据相应的甲基化模式找到了这些变异的来源——肝脏肿瘤。注意事项：研究血液甲基化组会面对许多未知因素，比如甲基化模式在个体间的变化，甲基化DNA片段在血液循环中的稳定性。卢教授团队检测的甲基化标记中大约15%在志愿者之间有显著差异。由于测序过程的重亚硫酸盐转化会破坏一些DNA并且产生偏好，单分子测序等更灵敏的方法对血液甲基化研究将更有帮助，卢教授指出。前景展望：卢教授表示，分析血液中的组织特异性甲基化模式还会有更多的用途，比如追踪移植排斥或者鉴定循环肿瘤DNA的来源。“当你不知道哪个器官出现异常的时候，这是一个很好的突破口。”实际上，卢教授已经领导团队在美国国家科学院院刊PNAS杂志上发表了这方面的研究成果。他们通过分析血液中的甲基化DNA，检测到了癌症患者的肝肿瘤和淋巴瘤，以及孕妇胎盘中的遗传异常。这项工作在分子诊断与基于器官的传统医疗之间搭起了一道桥梁。外泌体蛋白外泌体发现于上世纪八十年代中期，直到近几年才开始引起科学家们的注意。外泌体是机体绝大部分细胞都能分泌的一种小囊泡，直径在40-100nm之间。一些外泌体相当于膜形成的垃圾袋，是细胞清除特定大分子的一种途径。另一些外泌体是细胞之间的一种通讯工具，能够对细胞功能产生影响。在过去很长一段时间里，外泌体并没有引起人们的注意。直到最近研究者们才逐渐意识到，外泌体所含的多种分子可以成为理想的生物学指标。外泌体内的大分子比较稳定，不会受到外界核酸酶和蛋白酶的破坏。外泌体的表面标志物能够体现它的细胞来源。而且外泌体只反映活细胞的内部情况。研究者：加州大学医学和免疫学教授Edward Goetzl研究项目：分析循环外泌体中的蛋白，开发阿尔茨海默症血液测试背景：阿尔茨海默症（AD）是一种进程性的神经退行性疾病，俗称为老年痴呆症。阿尔茨海默氏症患者的认知和记忆功能会不断恶化，极大的影响其日常生活能力，这种疾病是老龄化社会面临的一大难题。目前医生们主要通过临床症状、大脑成像和脑脊液提取来诊断阿尔茨海默症。虽然这些诊断往往是正确的，但只有尸检才能证实疾病标志的存在：大脑中的β淀粉样蛋白斑块和tau错误折叠形成的神经纤维缠结。源自神经元的外泌体含有细胞特异性的蛋白质和RNA。如果可以通过循环外泌体追踪异常的β淀粉样蛋白和tau蛋白，那么定期血检就可以用来监控阿尔茨海默症患者的疾病进程。蛋白质检测: Goetzl及其同事收集了阿尔茨海默症患者确诊前后的血样。他们先用System Biosciences公司的ExoQuick分离血样中的所有外泌体，再用结合神经元表面蛋白的抗体富集神经元外泌体，检测这些外泌体所含的蛋白质。研究显示，在阿尔茨海默症患者的神经元外泌体中，tau、磷酸化tau和β淀粉样蛋白的表达水平显著较高。举例来说，阿尔茨海默症神经元外泌体的磷酸化tau比对照多十倍。研究人员指出，寻找正确的群体进行比较是非常关键的，因为许多老年人已经表现出认知衰退的迹象。这项研究募集的志愿者不仅认知能力正常，而且没有阿尔茨海默症家族史，也不具备已知的疾病风险因子。（Alzheimers Dement, 11:600-07, 2015）注意事项：现在还不清楚血液中神经元外泌体的总量是否会随着疾病状态发生改变，因此我们应该适当处理数据，在单个外泌体水平上进行分析。此外，蛋白质从外泌体提取出来之后需要迅速分析，“外泌体把蛋白质保护得很好，一旦我们将蛋白质提取出来，它们就很容易降解，”Goetzl指出。前景展望：2013年Goetzl与人合作建立了NanoSomiX公司，以开发阿尔茨海默症血液测试。“我们希望能够提前10-15年鉴定到疾病风险，让高风险人群使用预防性药物，”他说。Exosome Diagnostics公司去年开发了一种基于离心柱的简便方法来分离外泌体，并提取出其中的RNA。研究人员在《PLoS ONE》上介绍了这种新方法。与超速离心相比，这种方法能分离出高纯度的RNA，并且对囊泡RNA有着高的特异性。离心柱能够容纳4 mL样本，实现了血清和血浆中低丰度转录本的检测。目前，基于此技术的商业化产品 – exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit – 已由QIAGEN推出。外泌体microRNA研究者：Illinois大学副教授Neil Smalheiser研究项目：从血浆外泌体鉴定阿尔茨海默症的miRNA指标研究背景：外泌体与其他囊泡的区别主要在于尺寸、浮力密度、形成机制和特定细胞内指标。MicroRNA（miRNA）是长约22nt的非编码RNA，这些小RNA在天然细胞中大量存在，它们能与靶基因的mRNA配对，在转录后水平上调控目标基因的表达。大量研究表明，microRNA控制着胚胎发育、细胞分化、器官生成等重要的生物学过程，对于正常发育、细胞生长和生物行为非常关键，而且与复杂的神经退行性疾病有关。近来不少研究者发现，阿尔茨海默症患者的大脑组织和血液都存在miRNA水平的改变。检测miRNA: Smalheiser团队使用了分离外泌体的传统方法——差速离心（differential ultracentrifugation）。他们用这种方法逐渐洗掉游离RNA、蛋白聚合物和细胞残骸，只留下外泌体。随后研究人员从外泌体提取RNA并对其进行测序，建立了成熟miRNA的数据集。他们通过计算模型鉴定了一组可以将阿尔茨海默症和对照准确分开的miRNA。(PLOS ONE, doi:10.1371/journal.pone.15)不过，超速离心速度较慢，也无法实现高通量。此外，超速离心中有许多变量需要标准化（例如转子的选择和离心条件等等），很难转化到临床中去。好在，市场上出现了多款方便的试剂盒。比如，赛默飞世尔科技推出了几款总外泌体提取试剂盒（Total Exosome Isolation Reagent），能够分别从细胞培养基、血清、血浆、尿液及其他体液中分离出完整的外泌体。实验技巧：研究人员使用的离心方法使他们能够获得相对纯净的外泌体，Smalheiser指出。在用Trizol试剂提取RNA的时候，他的团队发现添加糖原使产量提升了将近23%，这一步骤可以用于其它低产量RNA。在实验室中，RNA提取过程的痛苦是众所周知的。RNA极其脆弱，对RNAses酶的降解非常敏感，而这种酶几乎无处不在。美国佛罗里达大学的研究人员为此开发了一种新的RNA提取方法，并将其发布在《Applications in Plant Sciences》上。他们将Trizol试剂、Turbo DNA试剂盒（由Life Technologies Ambion生产）和自己开发的步骤结合起来，让RNA提取变得更迅速、更有效、更可靠。细胞外RNA研究者：加州大学圣地亚哥分校副教授Louise Laurent，美国转化基因组研究所副教授Kendall Van Keuren-Jensen研究项目：鉴定胎盘功能障碍（Laurent）和大脑损伤（Keuren-Jensen）的循环miRNA指标研究背景：近年来，人们在血浆或血清样本中成功检测到了疾病相关的RNA（exRNA）。这些细胞外RNA可以成为非侵入性的疾病诊断指标，这是RNA检测最有前景的发展方向之一。在多种细胞受到破坏的疾病中（比如大脑损伤），循环miRNA是非常重要的生物学指标。研究这些miRNA的团队很多，可供选择的实验方案也不少，不过研究者们还没有就此达成一致。Laurent和Keuren-Jensen都是美国NIH细胞外RNA交流协会的成员，他们正在努力推动循环miRNA检测的标准化，提升细胞外RNA研究的可重复性。胎盘囊泡：在妊娠期间，胎盘会将包含RNA的囊泡释放到母体血液中。Laurent希望从中鉴定胎盘疾病的miRNA指标，比如子痫前期和宫内生长受限。她和同事正在优化自己开发的方法，从外泌体和微囊泡提取miRNA并分析相关数据。初步研究结果显示，母体血液中的外泌体和微囊泡都可以分离出妊娠特异性miRNA。妊娠后期的miRNA指标与胎盘组织的关系尤为密切。大脑撞击：Van Keuren-Jensen团队将监控撞击数据的感应器装在橄榄球运动员的头盔中，并在橄榄球赛季中收集运动员的血液、尿液和唾液样本。他们对这些样本进行RNA测序，寻找与撞击数据有关的生物学指标。研究人员使用了一系列商业化试剂盒，并且对细胞外RNA收集方法进行了比较。“使用不同的试剂盒或分离方法会造成很大的差异，”Van Keuren-Jensen说。“现在还很难断言哪种试剂盒最好。”注意事项：有些测序试剂盒使用带“粘性”末端的短片段DNA来结合要扩增的目标分子。这些末端（被称为接头）可能给实验结果带来很大的变数。有些试剂盒产生的接头二聚体比较少，但测序偏好比较大。有些试剂盒提供的接头更随机化，可能与某些miRNA结合得更好。“这些因素会使结果产生较大差异，导致难以重复的结果，”Van Keuren-Jensen说。实验技巧：Laurent指出，减少样本批次、尽量由同一个人操作有助于降低结果的差异性。使用内参（比如不受疾病影响的一种RNA）是提高结果可重复性得另一条途径。在没有一个通用标准的情况下，“设立内参可以帮你去除产量或批次差异带来的许多影响，”Laurent说。Van Keuren-Jensen建议大家在论文中分享自己所用的试剂盒和分离方法，因为这些信息对实验结果的重复很有帮助。监控exRNA只需要采集血样，不像肿瘤活检那么有风险，成本也比较低。不过从血浆或血清中分离exRNA仍有一定的挑战性，一方面是因为exRNA丰度低，另一方面是因为血液中的污染物会抑制PCR。商品化的试剂盒能简化和加速exRNA提取过程，已成为循环exRNA研究不可缺少的工具。然而很少有人横向评估这些试剂盒的提取效率如何，是否能去除血浆中的污染物，是否会偏向特定的RNA。而这类评估对于结果解释和实验之间的比较都很关键。于是，美国爱因斯坦医学院的研究人员评估了市场上7种常用的exRNA提取试剂盒，分别来自贝克曼·库尔特、Life Technologies、Exiqon、Zymo、QIAGEN公司。他们具体评估了合成RNA的总体回收率、不同大小的合成RNA的回收能力、exRNA产量和纯度，以及纯化后的扩增效率。研究结果发表在《BioTechniques》杂志上。早期非小细胞肺癌（NSCLC）是无症状的，并且很难检测到，因为目前没有可用的NSCLC血液测试。最近，在Cell子刊《EBioMedicine》发表的一项研究中，南京大学生命科学学院的张辰宇教授和南京大学附属金陵医院的张春妮教授带领的研究小组，确定了一组（五个）血清microRNA（miRNA），作为NSCLC诊断的潜在生物标志物。
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DNA提取过程中所用试剂的机理
1.溶菌酶的作用机制是 溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳香族氨，酸的 比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。 溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或 N-乙酰 胞壁质聚糖水解酶，它专一地作用于肽多糖分子中 N-乙酰胞壁酸与 N-乙酰氨基 葡萄糖之间的 β-1，4 键，从而破坏细菌的细胞壁，使之松驰而失去对细胞的保 护作用，最终使细菌溶解死亡。也可以直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到 杀菌的作用， 这主要是因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷酸质组 成，其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由 N-乙酰胞壁 酸与 N-乙酰氨基葡萄糖之间的 β-1，4 键联结的。对某些革兰氏阴性菌，如埃希 氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。溶菌酶是母乳中能保护婴 儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道而保持其活性状态，溶菌酶还 可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的增加，还可以促进蛋白质的消 化吸收。 简言之,破坏细菌细胞壁，由于细菌在没有细胞壁时不能生存，从而杀死细菌。2. 十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）常用于 DNA 提取过程中 使蛋白质变性后与 DNA 分开。 SDS 是分离 DNA 时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用： a. 溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂； b. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来； c. 对 RNase、Dnase 有一定的抑制作用； d. SDS能够与蛋白质结合形成R1-O-SO3-…R2+-蛋白质复合物， 使蛋白质变 性沉淀。质粒提取常见问题1．溶液 I―溶菌液： a.溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的 β-1,4 糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中 pH 小于 8 时，溶菌酶作用受到 抑制。 b.葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止 DNA 受机械剪切力作用而 降解。C. EDTA： （1） 螯合Mg2＋、 2＋等金属离子， Ca 抑制脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在， 有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。 2．溶液 II－NaOH－SDS 液： NaOH：核酸在 pH 大于 5，小于 9 的溶液中，是稳定的。但当 pH＞12 或 pH＜3 时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液 II 中的 NaOH 浓度为 0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的 pH 就高达 12.6，因而促使染色体 DNA 与 质粒 DNA 的变性。 SDS：SDS 是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂 质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3） SDS 能与蛋白质结合成为 R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而 沉淀下来。但是 SDS 能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必 须把它去除干净，防止在下一步操作中（用 RNase 去除 RNA 时）受到干扰。 3. 溶液 III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液： NaAc 的水溶液呈碱性，为了调节 pH 至 4.8，必须加入大量的冰醋酸。所 以该溶液实际上是 NaAc-HAc 的缓冲液。 pH4.8 的 NaAc 溶液是为了把 pH12.6 用 的抽提液，调回 pH 至中性，使变性的质粒 DNA 能够复性，并能稳定存在。而 高盐的 3mol／L NaAc 有利于变性的大分子染色体 DNA、RNA 以及 SDS-蛋白 复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合， 后者是因为钠盐与 SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物， 使沉淀更完全。 4．为什么用无水乙醇沉淀 DNA？ 用无水乙醇沉淀 DNA，这是实验中最常用的沉淀 DNA 的方法。乙醇的优点 是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对 DNA 很安全， 因此是理想的沉淀剂。 DNA 溶液是 DNA 以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去 DNA 周围的水分子，使 DNA 失水而易于聚合。一般实验中，是加 2 倍体积的无水乙 醇与 DNA 相混合，其乙醇的最终含量占 67％左右。因而也可改用 95％乙醇来 替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比 95％乙醇昂贵）。但是加 95％的乙 醇使总体积增大，而 DNA 在溶液中有一定程度的溶解，因而 DNA 损失也增大， 尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀 DNA 时可用 95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用 0.6 倍体积 的异丙醇选择性沉淀 DNA。一般在室温下放置 15－30 分钟即可。 5．在用乙醇沉淀 DNA 时，为什么一定要加 NaAc 或 NaCl 至最终浓度达 0.1～0.25mol/L？ 在 pH 为 8 左右的溶液中，DNA 分子是带负电荷的，加一定浓度的 NaAc 或 NaCl，使 Na+中和 DNA 分子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电荷相 斥力，易于互相聚合而形成 DNA 钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有 部分 DNA 形成 DNA 钠盐而聚合，这样就造成 DNA 沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的 DNA 中，由于过多的盐杂质存在，影 响 DNA 的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。 6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用 SDS 与 KAc 来处理？ 加进去的 RNase 本身是一种蛋白质，为了纯化 DNA，又必须去除之，加 SDS 可使它们成为 SDS-蛋白复合物沉淀，再加 KAc 使这些复合物转变为溶解 度更小的钾盐形式的 SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯 仿抽提再沉淀，去除 RNase。在溶液中，有人以 KAc 代替 NaAc，也可以收到 较好效果。 7．为什么在保存或抽提 DNA 过程中，一般采用 TE 缓冲液？ 在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑 DNA 的稳定性及缓冲液 成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24） 等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作 DNA 的保存液，但在转化实 验时，磷酸根离子的种类及数量将与 Ca2＋产生 Ca3(PO4)2 沉淀；在 DNA 反 应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的 则要求低盐浓度，采用 Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是 TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存 DNA 时，大都采用 Tris-HCl 系统，而 TE 缓冲液中的 EDTA 更能稳定 DNA 的活性。 8．如何选择聚乙二醇（6000）的浓度来沉淀 DNA？ 采用 PEG（6000）沉淀 DNA，大小不同的 DNA 分子所用的 PEG 的浓度 也不同，PEG 的浓度低，选择性沉淀 DNA 分子量大，大分子所需 PEG 的浓度 只需 1％左右，小分子所需 PEG 浓度高达 20％。本实验选择性沉淀 4.3kb 的 pBR322 质粒 DNA， 每毫升加入 0.4 毫升的 30％ PEG， 其最终 PEG 浓度为 12 ％。PEG 选择性沉淀 DNA 的分辨率大约 100bp。 9．抽提 DNA 去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？ 酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时， 蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过 离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面， 从而与溶解在水相中的 DNA 分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下 层。 作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作 用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约 10％～15％的水溶解在酚相中，因 而损失了这部分水相中的 DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水 不相混溶，不会带走 DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。 经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二 次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合 （1:1）使用。 10．为什么用酚与氯仿抽提 DNA 时，还要加少量的异戊酵？ 在抽提 DNA 时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内 易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为 24：1 之比。也 可采用酚、氯仿与异戊醇之比为 25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚 加一份 24：1 的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上 层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。 11．为什么要用 pH8 的 Tris 水溶液饱和酚？呈粉红色的酚可否使用？如何 保存酚不被空气氧化？ 因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提 DNA 过程中， 不致吸收样品中含有 DNA 的水分，减少 DNA 的损失。用 Tris 调节至 pH 为 8 是因为 DNA 在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下（pH5～7），RNA 比 DNA 更容易游离到水相，所以可获得 RNA 含量较少的 DNA 样品。 保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解 DNA，一般不可以便用。为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和 8-羟基喹琳至 终浓度为 0.1％。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一 定程度上能抑制 DNase 的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用 Tris pH8.0 水溶 液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层 Tris 水溶液或 TE 缓冲 液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气，防止与空气接触而 被氧化。平时保存在 4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖， 这样可使酚不变质，可用数月.质粒提取过程中的几点注意事项 1.加入溶液 2 后不要剧烈振荡，只需轻轻颠倒几次离心管。 2.加入溶液 3 后，复性时间不宜过长，一般是 5 分钟，否则会使染色体复性。 3.在用苯酚、 氯仿抽提时应用 TE 缓冲液将原溶液的体积扩大， 一般是 200～300 微升，以减少 DNA 的损失。以上是本人在提取质粒时的一些体会，希望能对同行有所帮助！质粒提取与纯化部分 一、填空 1．质粒提取中细菌的裂解可采用多种方法，包括：非离子型或离子型去圬剂， 有机溶剂，碱或加热处理。 2．用于分离质粒DNA的细菌培养浓度达到 0.8×109细胞/ml时，即可通过离心收 集菌体。收集菌体使用定角转子，离心的速度以 8000r/min为宜。 3．在分离质粒 DNA 的菌体培养过程中，加入氯霉素有两个好处：可以扩增质 粒 DNA；抑制了菌体的数量，有利于裂解。 4．常使用的质粒纯化方法都利用了质粒 DNA 相对较小和共价闭合环状两个性 质。5．由于不同构型的 DNA 插入 EB 的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率 也不同，超螺旋的共价闭合环状结构的质粒 DNA（SC）的泳动速度最快，一条 链断裂的开环状质粒 DNA（OC）泳动速度最慢，二条链断裂的线性 DNA（L） 居中，通过凝胶电泳和 EB 染色的方法可将不同构型的 DNA 分别开来。 6．超离心法纯化质粒 DNA 时，选用 CsCl 作介质的优点是：CsCl 与不同 DNA 起反应； CsCl 可以自动形成密度梯度， 从而使不同分子量的 DNA 分子得以分开。 7．SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用：溶解膜蛋白及 脂肪，从而使细胞膜破裂；溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；对 RNase、 Dnase有一定的抑制作用； SDS能够与蛋白质结合形成R1-O-SO3-…R2+蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。 8．碱裂解法所用溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的体积比为：2:4:3 9．质粒提取中溶液Ⅱ的主要成分为 SDS 和 NaOH。 10． 11． 12． 13． 14． 15． 溶液Ⅲ中钾是 3mol/L，乙酸根是 5mol/L LiCl 可沉淀大量蛋白质和高分子 RNA。 1OD260=50μg质粒DNA/ml。 在碱变形法提取质粒 DNA 实验中，聚乙二醇用于沉淀质粒 DNA。 残留在 DNA 样品中的酚可抑制酶的活性。 质粒 DNA 提取中酚的 pH 值范围是 pH7.8～pH8.0。16． 乙醇沉淀核酸的沉淀混合液中常用的单价阳离子的类型有： 乙酸铵、 氯化钠和乙酸钠。 17． SSCP 电泳方式为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。18． SSCP 是依据点突变引起单链 DNA 分子立体构象的改变来实现电 泳分离的。 19． 20． 影响 SSCP 重复性的主要因素为电泳的电压和温度。 SSCP 中使 DNA 双链起变性作用的试剂是：甲酰胺21． 点突变对 SSCP 检出率的影响不仅仅取决于该点在 DNA 链上的位 置，更取决于该位置对维持立体构象作用的大小。 二、 选择1．质粒提取中溶液Ⅱ的主要成分为：B A. B. C. D. SDS 和 EDTA SDS 和 NaOH EDTA 和 NaOH SDS 和冰乙酸2．分离质粒 DNA 时，用蔗糖的目的是：B A. B. C. D. 抑制核酸酶的活性 保护 DNA，防止断裂 加速蛋白质变性 有利于细胞破碎3．关于碱解法分离质粒 DNA，下面哪一种说法不正确？：D A. B. C. D. 溶液Ⅰ的作用是悬浮菌体 溶液Ⅱ的作用是使 DNA 变性 溶液Ⅲ的作用是使 DNA 复性 质粒 DNA 分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性4．质粒 DNA 提取中酚的 pH 值范围：D A. B. C. D. pH6.5～pH7.0 pH8.0～pH8.5 pH6.8～pH7.0 Ph7.8～pH8.05．CsCl-EB 密度梯度离心法纯化质粒 DNA 的原理是：C A. B. C. D. 氯化铯可以较多地插入到线状 DNA 中去 氯化铯可以较多地插入到 SC DNA 中去 EB 可以较多地插入到线状 DNA 中去 EB 可以较多地插入到 SC DNA 中去6．同一种质粒 DNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是：B A. B. C. D. OC DNA&SC DNA&L DNA SC DNA&L DNA&OC DNA L DNA&OC DNA.SC DNA SC DNA&OC DNA&L DNA7．用碱法分离质粒 DNA 时，染色体 DNA 之所以可以被除去，是因为：C A. B. C. D. 染色体 DNA 断成了碎片 染色体 DNA 分子量大，而不能释放 染色体变性后来不及复性 染色体未同蛋白质分开而沉淀8．1OD260相当于每毫升质粒DNA：A A. B. C. D. 50μg 100μg 50ng 100ng9．加入溶液Ⅲ后出现的白色絮状沉淀不包括：A A. B. C. D. 10． A. B. C. D. 质粒 DNA 和小分子量 RNA 染色体 DNA 和高分子量 RNA 钾离子和 SDS 蛋白质和细胞膜 SSCP 电泳方式为：D 普通琼脂糖凝胶电泳 低熔点琼脂糖凝胶电泳 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳11． SSCP 中使 DNA 双链起变性作用的试剂是：B A. B. C. D. 12． A. B. C. D. 三、 EDTA 甲酰胺 溴酚兰 Tris-HCl SSCP 分离单链 DNA 片段是依据：B 单链 DNA 分子量大小 单链 DNA 片段空间构象的立体位阻大小 单链 DNA 带电量的大小 单链 DNA 分子量和带电量的大小 是非1．迄今发现的质粒都是环状的。（错） 2．质粒 DNA 提取时，溶液Ⅱ需新鲜配置。（对） 3．如果溶菌酶溶液中 pH 值低于 8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。（对） 4．碱法和煮沸法分离质粒 DNA 的原理是不同的。（错）5．CsCl-EB 密度梯度离心法纯化 SC DNA 原理是根据 EB 可以较多地插入到 SC DNA 中，因而沉降速度较快。（错） 6．酚法和碱法分离质粒 DNA 都要用溶菌酶破壁，但碱法用的溶菌酶的浓度要 高。（对） 7．氯霉素扩增 DNA 时，加氯霉素的时间是重要的，因为加得太早，菌数不够， 加入时间过迟，菌龄过老，容易自溶。（对） 8．碱法和煮沸法分离质粒 DNA 的原理是不同的。（错） 9．酚法和碱法分离质粒 DNA 都要用溶菌酶破壁，但碱法用的溶菌酶的浓度要 高。（对） 10． 11． 12． SSCP 对长链 DNA 或 RNA 的点突变检出率要比短链的高。（错） SSCP 分析中非变性 PAG 电泳分离不能反映出分子量的大小。 （对） SSCP 可以检测出所有的单点突变。（错）13． 点突变对 SSCP 检出率的影响取决于该点在 DNA 链上的位置，点 突变在 DNA 链中部要比在近端部容易被 SSCP 检测出来。（错） 四、 简答1．简述溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所包含成分及生化作用原理 溶液Ⅰ含葡萄糖和EDTA，葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受机械作用而降 解。EDTA可螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作 用（Dnase作用时需要一定的金属离子作辅基），另外，EDTA的存在，有利于 溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。 溶液Ⅱ含NaOH和SDS，核酸在pH大于 5 小于 9 的溶液中是稳定的，但当pH大 于 12 或小于 3 时，就会引起双键之间氢键的解离而变性。在溶液Ⅱ中的NaOH 浓度为 0.2N，加入抽提液液时，该系统的pH就高达 12.6，因而促使染色体DNA 与质粒的变性。 SDS是离子型表面活性剂， 它主要功能有溶解细胞膜上的脂肪与 蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；SDS能与蛋白质结 合成为R1-O-SO3-…R2+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS 能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止 在下一步操作中（用Rnase去除RNA时）受到干扰。 溶液Ⅲ是 NaAc-Hac 的缓冲液 （pH4.8）用 pH4.8 的 NaAc 溶液是为了把 pH12.6 。 的抽提液 pH 调回中性，使变性的质粒 DNA 能够复性，并能稳定存在。而高盐 的 3MnaAc 有利于变性的大分子染色体 DNA、RNA 以及 SDS-蛋白质复合物凝 聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因 为钠盐与 SDS-蛋白质复合物作用后，能形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使 沉淀更完全。 2．小量制备质粒 DNA 时发现质粒 DNA 不能被限制酶所切割，分析可能原因及 解决办法。由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意不够，没有去除干净导 致。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质，如 果总是依然存在，可用离心柱纯化 DNA。 3．溶菌酶是破碎细菌的有效方法。但有些细菌的孢子对溶菌酶不敏感，应该如 何处理？ 添加 DTT、β-巯基乙醇，或 8.0mol/L 的尿素等增加敏感性。 4．从核酸溶液中去除蛋白质的标准方法及原理。 方法是先用酚：氯仿抽提，然后再用氯仿抽提。原理：使用两种不同的有机溶剂 去除蛋白质比用单一有机溶剂效果更佳。 继而用氯仿抽提可除去核酸制品中残量 酚。（此外，酚虽能有效地使蛋白质变性，却不能完全抑制 RNA 酶的活性，它 还能溶解带有长 poly（A）段的 RNA 分子。使用酚：氯仿：异戊醇（25:24:1） 混合液可以使这两个问题迎刃而解，） 5．在用乙醇沉淀 DNA 时，为什么一定要加 NaAc 或 NaCl 至最终浓度达 0.1-0.25M? 在 pH 为 8 左右的 DNA 溶液中，DNA 分子是带负电荷的，加一定浓度的 NaAc 或 NaCl，使 Na+中和 DNA 分子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电荷排 斥力，易于互相聚合而形成 DNA 钠盐沉淀。当加入的盐溶液浓度太低时，只有 部分 DNA 形成 DNA 钠盐而聚合，这样就造成 DNA 沉淀不完全。当加入的盐溶 液浓度太高时，其效果也不好，在沉淀的 DNA 中，由于过多的盐杂质存在，影 响 DNA 的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。 6．LiCl 在质粒 DNA 提取中的作用是什么？ 沉淀大量蛋白质和高分子 RNA。 7．简述 PCR-SSCP 基本过程。 1) PCR 扩增靶 DNA；2) 将特异的 PCR 扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结 构的单链 DNA 分子； 3) 将适量单链 DNA 进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；4) 最后通过放射性自显影、 银染或溴化乙锭显色分析结果， 若发现单链 DNA 带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断 DNA 片段中有碱基突变。 8．简述 RNA-SSCP 的基本原理。 RNA 有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从 而提高了检出率，其突变检出率可达 90%以上。另外，RNA 不易结合成双链， 因此可以较大量的进行电泳，有利于用溴化乙锭染色。 9． SSCP 图谱一般是二条单链 DNA 带， 有时可能只呈现一条 SSDNA 带或三条 以上的原因是什么？主要是由于两条单链 DNA 之间存在相似的立体构象， 有时三条以上的 SSCP 图 谱是由于野型 DNA 片段和突变型 DNA 片段共同存在的结果。 10． 分子量相同的超螺旋环状、带切口环状和线状 DNA 在凝胶中迁移 率大小顺序是什么？ 超螺旋环状 DNA 迁移最快，其次为线状 DNA，最慢为带切口环状 DNA。 11． 影响 DNA 迁移率的因素有哪些？影响 DNA 迁移率的因素有：DNA 分子的大小，琼脂糖浓度，DNA 的构象，所 加电压，温度，嵌入染料的存在和电泳缓冲液的组成。基因组 DNA 的提取与检测 概 述 基因组 DNA 的提取通常用于构建基因组文库、Southern 杂交(包括 RFLP) 及 PCR 分离基因等。利用基因组 DNA 较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等 小分子 DNA 分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子 DNA 即沉淀 形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子 DNA 则只形成颗粒状 沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。 在提取过程中,染色体会发生机械断 裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组 DNA 时应尽量在温和的条件下操作,如 尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的 DNA。一般来说,构 建基因组文库, 初始 DNA 长度必须在 100kb 以上,否则酶切后两边都带合适末端 的有效片段很少。而进行 RFLP 和 PCR 分析, DNA 长度可短至 50kb, 在该长度 以上,可保证酶切后产生 RFLP 片段(20kb 以下),并可保证包含 PCR 所扩增的片 段(一般 2kb 以下)。 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组 DNA 的提取方法有所不同; 不 同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同， 分离方法也有差 异。在提取某种特殊组织的 DNA 时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的 DNA 大分子。 尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、 PCR 反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组 DNA 时, 应考 虑除去多糖和酚类物质。 本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养 物为材料,学习基因组 DNA 提取的一般方法。 从植物组织提取基因组 DNA 一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。 二、设备 移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml 离 心管（有盖）及 5ml 和 1.5ml 离心管，弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、 提取缓冲液Ⅰ： 100mmol/L Tris?Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g 葡萄糖，6.9g 二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP， 240ul 巯基乙醇，加水至 300ml。3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、 RnaseA 母液：配方见第一章。 5、 其它试剂： 液氮、 异丙醇、 缓冲液， TE 无水乙醇、 70%乙醇、 3mol/L NaAc。 四、操作步骤： （一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组 DNA 提取 1. 在 50ml 离心管中加入 20ml 提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。 2. 水稻幼苗或叶子 5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热 的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温 30-60 分钟(时间长,DNA 产量高), 不 时摇动。 3. 加入 20ml 氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室 温下静置 5-10 分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 4. 室温下 5000rpm 离心 5 分钟。 5. 仔细移取上清液至另一 50ml 离心管,加入 1 倍体积异丙醇,混匀,室温下放 置片刻即出现絮状 DNA 沉淀。 6. 在 1.5ml eppendorf 中加入 1ml TE。用钩状玻璃棒捞出 DNA 絮团,在干 净吸水纸上吸干,转入含 TE 的离心管中,DNA 很快溶解于 TE。 7. 如 DNA 不形成絮状沉淀,则可用 5000rpm 离心 5 分钟, 再将沉淀移入 TE 管 中。 这样收集的沉淀,往往难溶解于 TE,可在 60℃水浴放置 15 分钟以上， 以帮助 溶解。 8. 将 DNA 溶液 3000rpm 离心 5 分钟, 上清液倒入干净的 5ml 离心管。 9. 加入 5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10 分钟, 除去 RNA(RNA 对 DNA 的操 作、分析一般无影响，可省略该步骤）。 10. 加入 1/10 体积的 3mol/L NaAc 及 2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置 20 分钟左右,DNA 形成絮状沉淀。 11. 用玻棒捞出 DNA 沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。 12. 将 DNA 重溶解于 1ml TE, -20 贮存。 13. 取 2μl DNA 样品在 0.7% Agarose 胶上电泳, 检测 DNA 的分子大小。 同时取 15μl 稀释 20 倍, 测定 OD260/OD280, 检测 DNA 含量及质量。 [注意] 5g 样品可保证获得 500μg DNA, 足供 RFLP、PCR 等分析之用。 （二）. 从李(苹果)叶子提取基因组 DNA 1. 取 3-5 克嫩叶, 液氮磨成粉状。 2. 加入提取缓冲液Ⅱ10ml, 再研磨至溶浆状。10000rpm, 10min。 3. 去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混匀。65℃, 30-60min, 常摇动。 4. 同本节（一）中步骤 3-13 操作。 从动物组织提取基因组 DNA 一、材料 哺乳动物新鲜组织。 二、设备 移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。 三、试剂 1、分离缓冲液：10mmol/L Tris?Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。 2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml 或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异 戊醇(25:24:1)，无水乙醇及 70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。四、操作步骤: 1. 切取组织 5g 左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越 好)。 2. 倒入液氮,磨成粉末,加 10ml 分离缓冲液。 3. 加 1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。 4. 加 50ul 或 1mg 蛋白酶 K, 37℃保温 1-2 小时, 直到组织完全解体。 5. 加 1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm 离心数秒钟。 6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层 后,3000rpm 离心 5 分钟。 7. 取上层水相至干净离心管, 加 2 倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。 8. 移去上层乙醚,保留下层水相。 9. 加 1/10 体积 3mol/L NaAc, 及 2 倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀 DNA。 室温下静止 10-20 分钟，DNA 沉淀形成白色絮状物。 10. 用玻棒钩出 DNA 沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于 1ml TE 中,-20℃保存。 11. 如果 DNA 溶液中有不溶解颗粒,可在 5000rpm 短暂离心,取上清; 如要 除去其中的 RNA,可加 5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温 30 分钟, 用酚抽提后, 按 步骤 9-10 重沉淀 DNA。 细菌基因组 DNA 的制备 一、材料 细菌培养物。 二、设备 移液管, 高速冷冻离心机, 台式离心机，水浴锅。 三、试剂 1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于 80ml H2O,缓慢加入 10g CTAB,加水 至 100ml。 2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。 四、操作步骤： 1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心 10 分钟, 去上清液。 2. 加 9.5ml TE悬浮沉淀, 并加 0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或 1mg干粉) 蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温 1 小时。 3. 加 1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。 4. 加 1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温 20 分钟。 5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心 10 分钟, 将上清液 移至干净离心管。 6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 7. 加 1 倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止 10 分钟，沉淀DNA。 8. 用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于 1ml TE, -20℃保 存。如DNA沉淀无法捞出,可 5000rpm离心, 使DNA沉淀。 9. 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。 基因组DNA的检测 上述方法得到的DNA一般可以用作Southern, RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物 质,会影响酶切和PCR的效果。 所以获得基因组DNA后,均需检测DNA的产量和质 量。 1. DNA溶液稀释 20-30 倍后,测定OD260 /OD280 比值, 明确DNA的含量和质 量。 2. 取 2-5μl 在 0.7% agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。 3. 取 2μg DNA, 用 10 单位(U)HindⅢ酶切过夜, 0.7% agarose胶上电泳, 检 测能否完全酶解(做RFLP, DNA必须完全酶解)。 如果DNA中所含杂质多, 不能完全酶切, 或小分子DNA多, 影响接续的分析 和操作,可以用下列方法处理： （1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。 （2） 酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。 （3）Sepharose柱过滤, 去除酚类、多糖和小分子DNA。 （4）CsCl梯度离心, 去除杂质, 分离大片段DNA(可用作文库构建)。 DNA 是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要 对象， 因此 DNA 的提取也应是分子生物学实验技术中的最重要、 最基本的操作， 如不能有效的完成 DNA 提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面 的实验。在 DNA 提取过程中应做到 1，根据不同研究需要，保证结构的相应完 整性；2，尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及 RNA 等)；3，保证 提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。 下面结合不同 的研究对象列出几种相应的 DNA 提取方法。 方法 1，总 DNA 的大量提取 本方法通过液氮研磨粉碎动植物组织、裂解液裂解细胞、有机溶剂抽提，使进入 水相的核酸与蛋白成分分开， RNA 酶作用下， 在 降解 RNA， 得纯度较高的 DNA 样品。 一：仪器 高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、冷冻真 空干燥器、取液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外观测仪 二：试剂 细胞裂解液（100mM Tris-HCl 5mM EDTA 500mM NaCl 1% SDS pH 7.5） ；饱和酚；氯仿/异戊醇；异丙醇；70%及无水乙醇；3M NaAC（pH5.2） ； RNA 酶；TAE 缓冲液；载样缓冲液 三：操作 动植物材料 10g(鲜组织) 0.5g(干冻组织) 液氮，研碎 10ml 裂解液(含 1/10 体积酚)，(65℃预热)， 加入等体积氯仿， 65℃放置 30 分钟， 间隔 5－10min 轻摇一次， 离心(rpm， 15min ) 上清液 静止下0.6 体积冷异丙醇， 0.1 体积 3MpH5，2 乙酸钠， 挑取絮状体， 70%冷乙醇洗涤，真空干燥， 2mlTE(或水)＋10ulRNase，65℃，10-30 分复溶和除 RNA 等体积酚/氯仿，氯仿抽提 （轻轻混匀、冰浴沉淀 5min，5000RPM 离心 5min，取上清） 上清液 2V 无水乙醇、1/10VnaAC， -20，2 或-80℃，30min 10000RPM，10min 沉 淀 70%冷乙醇洗涤 真空干燥 干粉-20℃保存，或复溶于 0.5-1mlTE 或水中，分装成小体积， -20℃或 4℃保 存。 四：鉴定 所提 DNA 进行 Agarose 胶分析（电泳过程见附） ，紫外观测仪观测，凝胶成像 系统拍摄。 注意: 1.裂解液要预热，以抑制 DNase，加速蛋白变性，促进 DNA 溶解。 2.酚一定要碱平衡 3.各操作步骤要轻柔，尽量减少 DNA 的人为降解。 4.取各上清时，不应贪多，以防非核酸类成分干扰。 5.异丙醇，乙醇.NaAC，KAC 等要预冷，以减少 DNA 的降解，促进 DNA 与蛋 白等的分相及 DNA 沉淀。 6.本方法适用于以 DNA 片段的酶切分析、 Southern 印迹等中， 具有快速、 省时、 省线的特点。 7.此方法也适合菌类 DNA 的大量提取。 在病毒提取过程中,加入 triton-x100,巯基乙醇,和 EDTA 作用是什么? Triton X100 一般在阻断缓冲液中或稀释缓冲液中使用,由于存在疏水结构域,整 合蛋白和膜的结合非常紧密,用此试剂可才能从膜上洗涤下来. 巯基乙醇的作用可能有催化蛋白质完全变性和解聚,解离成亚基或单个肽链.EDTA 能与 Al3+、Fe3+、Ti4+、Mn2+、Cu2+、Pb2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等 离定量作用. 具体对病毒提取有什么作用~我也不是很清楚~你自已再想想吧!我只知道这些药 品的理论.核酸抽提的基础现状文章来源: 丁香园 - 核酸基因技术讨论版近日撰写了一个关于核酸抽提的基础现状的草稿；没有去找参考书润色，所以会 有点凌乱。首先声明的是：这篇东西只为有一定核酸抽提基础知识的人准备，同 时也将会及时修改。那些分子生物学的过客，最好不要看本文；一是我的思维有 点跳跃，二则是没有必要糟蹋自己的时间。 写这篇东西的另外一个原因是， 我一直在思考如何简化经典的无介质的核酸抽提 程序。最经典的是裂解一步，去蛋白质一步，核酸沉淀一步；DNAzol 将这三步 并成了一步，按道理已经简化到了极致。事实是，DNAzol 并没有被大家认可， 其原因大概还是质量不太可靠吧。现在也有使用 Proteinase K 消化后直接沉淀 核酸的方法，三步简化成了两步，可我总觉得醇的沉淀不可能彻底去除 Proteinase K。明年大概还没有生物学的诺贝尔奖会花落中国的，那么先求得一 个核酸抽提最简单的非介质方法世界领先如何？一笑！也一定。 1、核酸抽提原理 简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游 离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、 盐及其它杂质彻底分离的过程。 经典的裂解液几乎都含有去污剂 （如 SDS、 Triton X-100、 NP-40、 Tween 20 等） 和盐（如 Tris、EDTA、NaCl 等） 。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境（如 Tris） ，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏（如 EDTA） 、维 持核酸结构的稳定（如 NaCl）等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构 及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还 可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分 开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的 蛋白质变性剂（如 GIT、GuHCl 等）裂解的，该方法已经成为了 RNA 抽提的 主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。 最常用的纯化方法，一是 PC 抽提+ 醇沉淀，二是介质纯化。第一种方法是利 用 PC 对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再 用醇将核酸沉淀下来， 实现核酸与盐的分离。 第二种方法则是利用某些固项介质， 在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核 酸与蛋白质及盐的分离。高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省 略了 PC 操作的麻烦。当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的 PCR。其它杂质-如多糖、多酚等的去除，基本上都是在这两种方法的基础上， 通过增加一些特别的试剂，或者增加一些额外的步骤来实现的。 2、裂解方法的评价 含蛋白酶的裂解方法，仍然可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。裂解包括膜蛋 白的游离和与基因组 DNA 相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变 小，故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大的基因组 DNA 是很容 易“缠”住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，则不容易被基因组 DNA“缠”住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使最终获得的基因组 DNA 的纯度更高。另外一个思路是，如果基因组 DNA 与蛋白质“缠”在一起，在纯 化的过程中有两种可能：如果基因组 DNA 的特性占优势，则纯化时以 DNA 的 形式被保留下来，导致蛋白质的残留；如果蛋白质的特性占优势，则纯化时以蛋 白质的形式被去除，导致 DNA 的损失。另外，象有些样品，如肌肉，即使是 RNA 抽提， 也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液， 原因在于这些样品中的蛋白质， 是非常难以去除的。 高浓度蛋白质变性剂（如 GIT、GuHCl 等） 的裂解方法，是抽提 RNA 的首选。 总 RNA 的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组 DNA 相连接的蛋 白质的裂解以及基因组与蛋白质“缠”住的问题，因为都不会对以后的纯化产生 大的影响，可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，并且能迅速抑 制住细胞内的 RNA 酶，从而确保了 RNA 的完整性。除了极少量不适用该方法 的样品-主要是植物，其它绝大部分样品的 RNA 的抽提，都可以以高浓度的蛋 白质变性剂为基础的。 不使用蛋白酶的去污剂裂解方法，仍然在细胞基因组 DNA 抽提方面有优势，尤 其是当得率和纯度要求不是最高，而经济性及操作简单很重要时。控制好裂解液 /样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀，可以实现最简单的操 作，但纯度及得率的稳定性可能会比用 PC 抽提的差一些。 SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的特点。控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关 键。该方法不一定要使用 PC 纯化，但结合 PC 纯化，可以获得纯度很高的质 粒。 PCR 模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须 纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，非常快速。也正因为不纯化， 所以，假阴性（即没有扩增出来的阳性）比例也比较高。该方法最简单的裂解液 就是水，复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的 PCR 反应，而且能提高裂解 效率， 甚至还可能部分消除样品内抑制 PCR 反应杂质的东西， Triton X-100、 如 甲酰胺等。再复杂一点的就会含有诸如 Chelex 100 之类的能吸附部分杂质的介 质。操作也非常简单，多使用温度的变化来实现样品的裂解，如煮沸、或者高温 -低温的多次循环等。该方法最适合从一大堆样品中找出阳性样品，但却不适合 用于判断某一个样品是否是阳性还是阴性。降低样品使用量可以提高阳性率，因为样品量的降低，同时意味着 PCR 的抑制物量的降低。 含 CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组 DNA 抽 提的首选裂解方法。该方法成功与否与两个因素有关：一是 CTAB 的质量，二 是洗涤的彻底程度。CTAB 的质量对裂解效率有很大的影响，而且，似乎还说不 清楚原因，因为即使是同一公司生产的纯度一样的 CTAB，批号不同，效果就可 以差别很大。洗涤去除 CTAB 要比其它的盐难一些，同时，CTAB 的少量残留 也会对酶活性有巨大影响，所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。 3、纯化方法评价 PC 抽提/醇沉淀方法， 是一个永不过时的方法。 稳定、 可靠、 经济、 方便。 PC 抽 提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐，对于一般的干净的样品（杂质为蛋 白质） ，该方法完全可以获得高质量的核酸。虽然每次 PC 抽提都会损失一部分 核酸（因为不可能将水相全部移取） ，以及低浓度核酸的醇沉淀效率低，但这些 问题都可以靠操作的调整而得以解决或者减少影响。 该方法的最大的问题是不适 合大规模抽提。 高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法，同样也是一个非常不错的方法。与 PC 抽提方法 相比，除了纯度的稳定性可能要低一点外，该方法几乎克服了 PC 抽提的所有 缺点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是，可以用于大规模抽提，不足是 纯度（蛋白质残留）不够稳定。 介质纯化方法，是一个越来越受到重视的方法。其最大特点是非常适合大规模核 酸抽提，并且因为受人为操作因素影响小，纯度的稳定性很高（虽然纯度不一定 比 PC 纯化方法更高） 。其致命弱点是样品过量。介质可以分为两大类，一类是 柱式的，即介质被预先装填在下面是通的柱子里；另外一类则是颗粒状（如 Glassmilk、磁性小珠等） 。颗粒状的介质的纯化操作与经典的醇沉淀差别不大， 都是通过数次的加液-倒液过程，干燥后，溶解即可获得纯化好的核酸。柱式纯 化的操作虽然也是有加液-倒液过程，但因为加入的液体通过离心后会进入另外 一个离心管中，与含有核酸的柱子完全是分开的，所以洗涤更彻底，操作更省力 （不用操心将核酸倒掉了，或者液体的残留） 。不过，介质纯化方法的成本是最 高的。 4、醇的沉淀 醇的沉淀，目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质―主 要是盐―的分离。实际操作中，许多杂质也会与核酸一起被醇沉淀下来，尤其是 当其它杂质的浓度也比较高的时候。醇的沉淀并不是非常特异性的，任何有机大 分子及一些盐，当浓度达到一定水平后，都可能同步被沉淀下来。 就核酸而言，标准的醇沉淀要求有一定的盐及某一比例的醇用量，但这决不是说 盐是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。实际操作中不难发现，当裂解体系 中核酸的浓度达到一定水平后，即使体系中不含教科书中建议的盐，单独使用醇也可以使核酸沉淀下来； 或者含有盐， 使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下来 （当 然，得率可能会降低） 。知道这一点的意义在于：不要迷信标准方法的唯一性； 相反，当使用标准方法碰到问题―主要是纯度问题―时，完全可以通过调整沉淀 条件来改善。最有参考价值的是 TRIzol 提供的一个沉淀方案：一半异丙醇加一 半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留。另外一个问题就是，要 坚信核酸的醇沉淀过程同样也是其它杂质的沉淀过程；调整醇沉淀的条件，虽然 会降低核酸的得率，但因为可以大大提高纯度。 如果核酸抽提的起始样品是比较“脏”的，原则上不要使用低温沉淀。低温沉淀 能提高沉淀效率：当核酸浓度很低时，效果明显；当核酸浓度比较高时，效果不 明显，但却会导致杂质的大大增加。 醇沉淀使用异丙醇还是乙醇，我没有发现这二者对质量有大的影响，虽然许多人 “发现”乙醇沉淀的核酸纯度更高。异丙醇沉淀的核酸比较紧凑，帖壁紧，颜色 不是很白； 乙醇沉淀的核酸比较蓬松， 容易从壁上移动， 颜色比较白。 这是现象， 提示结论：异丙醇沉淀的核酸不容易丢掉，但比较难洗涤。结合丢失和洗涤两个 方面综合考虑，则建议：少量核酸用异丙醇沉淀（量少，洗涤不是问题，不丢失 为先） ，大量核酸用乙醇沉淀（量大，丢失不是问题，洗涤方便为先） 。至于异丙 醇沉淀更容易沉淀下盐的说法，我没有碰到过（我几乎不使用低温沉淀，难道低 温沉淀比较容易出现盐沉淀？） 我更觉得出现该现象的原因就在洗涤的不彻底。 ； 当然，也不要忘记异丙醇沉淀的最大优点是体积小，可以使绝大部分的小量抽提 操作在 1.5ml 离心管内完成。但由于其沉淀物很紧凑，洗涤时其中心部分不容 易被洗涤到，所以，洗涤异丙醇沉淀的核酸的关键是：一定要使沉淀悬浮起来， 一定要放置一段时间使沉淀最终变成蓬松的白色。如果再洗涤一次，质量决不会 有问题的。 PEG、 LiCl、 CTAB 都可以用于核酸沉淀。 虽然它们远没有醇沉淀的高使用频率， 但却各有特点。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以从含多糖的裂解 体系中将核酸沉淀下来。 5、洗涤 洗涤首先一定要将沉淀悬浮起来；第二就是要有一定的时间，尤其是当核酸沉淀 比较大时（使核酸沉淀最终蓬松） ；第三是少量多次；第四则是去上清要彻底。 教科书中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水纸上片刻” ，这一描述本身 没有问题，且十分方便，但因为他来自国外，自然就有了“水土不服”的问题。 如果离心管是经过硅化的， 因为液体几乎不挂壁， 所以上清可以去除得非常彻底； 好的管子，即使没有经过硅化，残留量也非常少，也没有什么问题；差的管子， 液体的挂壁非常可观，其残留量多到会影响后续的实验。唯一不受管子质量影响 的操作，就是倒掉液体后再短暂离心，将残液用移液器吸出。一定要牢记的是， 残液中都含有上一步操作中的杂质，其残留量与混匀程度、核酸沉淀的大小都有 关。挥发时去掉的是乙醇，杂质是不会被挥发去除的。另外， 核酸沉淀的大小也决定了洗涤的强度。 沉淀越大， 放置时间相对要长一点， 洗涤次数也要考虑增加。 6、核酸质量的检测问题 将抽提好的核酸直接用于后续的实验，是唯一可靠的检测方法；除此之外的检测 方法，都是相对的，而且并不十分可信。目前用于正式实验前检测核酸质量的方 法，一是电泳，二是紫外分光广度仪。电泳检测的主要是核酸的完整性和大小， 只要核酸不是太小或者太大（超出电泳分离范围） ，该方法还是非常可信的；另 外，电泳还可以用于估计核酸的浓度，但其准确度与经验有关；另外，电泳也可 能提供某些杂质污染的信息，但是同样与经验有关。紫外分光广度仪检测的是纯 度和核酸含量，然而，由于紫外分光广度仪不能确保非常准确，而该仪器的灵敏 度又非常高，所以，提供的结果并不十分可信。一般讲，同时进行紫外和电泳检 测， 综合二者的结果， 可以做出一个更准确的判断。 但由于这两个方法都有缺陷， 所以，即使出现坏的结果能用于后续实验而好的结果却不能用于后续实验，也不 用大惊小怪。 7、PC 抽提 PC 抽提是去除蛋白质的一个非常有效的手段。苯酚能使蛋白质变性，变性后的 蛋白质从水相中被析出，处于苯酚中或者苯酚/水相之间。PC 抽提的关键是， 一要混匀彻底，二要用量足够。彻底混匀，才能确保苯酚与蛋白质的充分接触， 使蛋白质完全变性。许多人总是担心混匀的剧烈程度是否会对核酸，尤其是基因 组 DNA 造成破坏，实际上大可不必如此小心。剧烈的混匀操作，是会对部分打 断大分子的基因组 DNA， 但该破坏作用不会强烈到 DNA 变成 10kb 以内的小片 段。手剧烈晃动混匀后，基因组 DNA 的片段，大部分会大于 20kb，这个大小， 除了一些特别的要求外，对 PCR 和酶切，都是完全适用的。如果要求的片段非 常大，如构建文库用，则不能使用剧烈的混匀方法，而只能来回温和颠倒混匀― 此时的关键是：裂解液的比例要足够大，使体系不要太粘稠。用量要足够，是因 为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的。超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质 不会被一次去除， 必须靠多次抽提， 方可彻底去除。 另外， 体系太粘稠的坏处是， 蛋白质难以彻底去除，以及基因组 DNA 会断裂得更厉害，所以要注意裂解液与 样品的比例。 8、样品与裂解液的比例 起始样品用多大，并没有具体的说法。如果不是样品量有限，则以能抽提出满足 数次成功实验所需的核酸量，作为决定样品起始量的基础，会比较合理的。不要 因为 1ml 裂解液可以抽提 100mg 样品，就一定使用 100mg 样品。裂解液的用 量，表面上与抽提的结果（纯度及得率） 没有关系，然而，在实际操作中，对 结果是有比较大的影响的。裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解样品，同时使 裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过 高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。另外，裂解液的用量是以样 品中蛋白质的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记。9、蛋白质是如何残留的 PC 纯化：a-取上清时取到中间层及下层；b- PC 用量不足；c-混匀不彻底；d溶解于上清中的少量 PC 中含有的蛋白质。 高盐沉淀：a-取上清时取到了蛋白沉淀；b-裂解不彻底；c-裂解液用量不足，使 裂解体系太粘稠；d-溶解度问题 (可以使用低温沉淀加以改善)。 介质：a-裂解不彻底；b-裂解体系太粘稠。 10、小分子物质 (苯酚、盐) 是如何残留的 醇沉淀：洗涤不彻底。其原因与管子、操作手法等有关。 介质： 颗粒状介质的原因与醇沉淀相同。 柱式的几乎都是柱子设计上的缺陷所致， 极少数由操作者未严格按要求操作所致。 11、标准化的概念 所谓的标准化，指的是一套程序，确保不同的人能获得质量接近的产物的程序。 标准化并不是以获得最高质量为目标， 而是以稳定为目标。 标准化的核心是质控。 事实上，核酸抽提的每一步操作，都有一个核心；重要的是找到可观察的指标或 者现象作为参考，从而确保实验的成功。如悬浮的核心是没有块状物的存在，彻 底消化的核心是没有块状物的存在，PC 抽提的核心是混匀-两相成为乳状，取 上清的核心是用小一点的移液器移取液体，吸取时 Tip 的尖头尽可能接近液面， 吸取速度要慢， 并且要留下 1mm 以上的液体不要再吸。 去上清的核心是先倒空， 再短暂离心将残留液体离到管低，用移液器彻底移出。洗涤的核心是彻底悬浮沉 淀， 并且要放置一段时间 （时间长短与沉淀大小有关） 使沉淀内部也能被洗涤到。 按这样的方法抽提的核酸，其质量是非常稳定的。 柱离心式实际上就是非常标准化的核酸沉淀与洗涤的操作。一般而言，柱式操作 出问题，系统性的与试剂盒有关，偶然性的与操作有关。这一点，应该是可以理 解的。 一个方法，其标准化程度越高，其稳定性就越好。步骤越少，标准化就越容易。 产品的开发也要以高标准化程度为目标。 12、QC 的概念 QC 概念远没有 QT 概念深入人心。最高境界的产品追求的是免检，或者是 Trouble-free。另外，现在的许多产品也是不允许 QT 的 （因为是一次性的） ， 因此就只能靠 QC 来保证质量了。QC 是将精力集中在过程中：原料、操作等。 只要严格按照标准去做，最终的结果就有保证。事实上，很多实验人员是不做检测而直接将抽提好的核酸用于后续实验的；他们之所以可以这么做，是因为他们 有意无意之中非常的注意 QC。也有不少人，尤其是新手，Pay no attention to QC，只知道最后的 QT。一旦发现问题，就去逆推原因；但因为过程中所出现 的现象根本就没有注意，几乎不可能准确找出真正的原因的。如果 QC 做得好， 最后的 QT 是否全部做/部分做/完全不做，取决于时间、经验、后续实验的成本 等因素。 13、EP 管的问题 几乎没有人会认为 EP 管的质量会与核酸抽提的操作有关， 与某些现象 （如核酸 在-20℃ 保存一天后发生了降解）有关系，但事实是，EP 管的质量的确与核酸 抽提的质量以及核酸保存时的稳定性有关。 硅化可以提供最高质量的 EP 管， 使某些奇怪的现象消失或者大大减轻。 最糟糕 的 EP 管对液体有较强的吸附力， 在倾倒液体时残留多， 核酸在管中保存的过程 中会发生变性。这样的管子是很有市场的，因为便宜；而正因为便宜，其材料总 是不令人放心的。 我个人认为， 只有硅化过的 EP 管， 才可能按照标准操作获得满意的结果。 否则， 某些操作步骤必须调整，才可以获得稳定的质量。 14、核酸抽提中的温度问题 核酸抽提中的温度问题，也是一个值得关注的问题。首先要明确的一点是，任何 一个温度条件，对某些方面有利，同时也一定会有不利的一面。如沉淀，低温操 作会提高得率，但也会增加杂质的残留。任何一步操作该用什么温度为好，应该 是利弊权衡的结果。基本上，除了一些特殊的步骤，如消化等外，用室温是最好 的选择。 那些认为 “低温操作可以防止降解” 之类的理由， 并没有多少可信度的。 15、如何阅读操作手册 拿到操作手册后，要倒着阅读：先阅读问题解答，再看操作步骤下面的说明，再 看操作步骤。问题解答是别人在使用过程中曾经碰到过的问题集锦，操作步骤下 面的说明是商家的警告。没有一个商家会将他的操作步骤写得非常复杂，因为这 是满足使用人员习惯的结果。一句话，PS 和 By the Way 之类的话中含有真正 的有用素材。 16、其它 核酸抽提的每一步操作， 都是利弊权衡的结果。 消化要彻底， 时间就会长； PC 抽 提时多取上清，得率会提高，但增加了蛋白质污染的风险；沉淀使用低温且时间 长，得率会提高，但增加了杂质污染的风险 … 不足详列。总之，核酸抽提是艺 术，可以根据自己的样品及当时的情况，对操作步骤进行适当的优化。17、实验的思维 核酸抽提的成功，就是每一步都没有失败。这不是玩文字游戏，而是告诉你做实 验的良好思维。就如同小学基础没有打好，早晚会发现大问题一样，做实验决不 要以成功为喜悦，以失败为痛苦。要保证实验成功，绝对不能有“这个操作应该 没有问题”“用这个可能不会有问题”之类的侥幸心理。去掉任何一个可能使实 ， 验失败的因素，这才是实验该有的出发点。用这样的出发点，实验几乎没有不成 功的，所以说，实验成功没有什么快乐；实验的快乐来自于：发现自认为不会导 致失败的某因素实际会导致实验的失败。学到了这样的知识，才有快乐的理由。 18、EB 在 NA 抽提中的运用 EB 在 NA 抽提中的应用，用于电泳，人皆尽知；用于 gDNA 抽提时提高蛋白 质与 gDNA 的分离效率， 却似乎没有人再考虑了， 因为大家都怕使用 EB。 NA 在 抽提中涉及到 EB 的另外一大类，就是胶回收操作了；EB 在胶回收中扮演的角 色，就不完全是正面的。 如果 NA 与 EB 充分接触，EB 就会以每隔数个碱基的频率均匀地插入 NA 之 中。EB 的这种插入，无疑更可能破坏核酸双链的稳定性，使核酸由双链变成单 链的压力增加。如果核酸比较短，而错配又多（错配的后果之一也是核酸容易由 双链变成单链） ，EB 的插入将更容易导致的出现。这个观点有如下的实验报告 佐证：有相当部分的 PCR 产物胶回收实验，都报告说回收后的电泳结果是：目 的条带变淡或者消失，同时出现了一条小的原来不存在的条带。 坛中曾有文描述他做胶回收的程序：两边加 Marker，中间加产物；电泳过程不 含 EB。电泳结束后，纵向割下 Marker 条带用 EB 染色后，放回胶原来的位置。 开紫外，根据 Marker 的位置割下目的条带，再回收。这是个笨办法，但这样使 用的人一定是聪明人。 19、核酸的保存 基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。虽然也有部分 实验人员发现， -20℃保存的 DNA 比-70℃保存的稳定， 我却宁可认为这是个例。 如果温度合适，保存中核酸发生降解或者消失，首要原因是酶残留导致的酶解， 第二个原因则是保存核酸溶液的 pH 值不合适导致的水解。还有一个不为人重 视的，就是 EP 管对核酸的影响。首先一定要坚信一点，那就是核酸一定会与装 它的容器的接触面发生反应， 达到某种均衡。 EP 管的材质， 首先可能媳妇核酸， 其次还可以诱导核酸的结构发生某些变化，如变性。在核酸的浓度比较高时，这 个现象可能观察不到；当核酸浓度很低时，则比较明显了。在低浓度的核酸中加 入 Geletin、Glycogen、BSA 可以稳定核酸，虽然已经为实验所证明，但许多实 验人员并没有将该建议当回事。 现在制造 EP 管的材料远多于过去。这些新出现的材料，在强度、透明度等物理特征方面可能比原来的纯 PP 材质要好许多， 但其化学特征， 尤其是对核酸稳定 性的可能影响，远没有研究透彻。正如现在的质粒可以改造得越来越适用某些要 求一样，其负面产物可能是，抽提的质粒电泳的构型越来越多：除了原来的三种 带型外，还可能出现 denatured cc 、multimeric forms of cc 等等带型。http://www.iiyi.com【求助】用异丙醇沉淀与乙醇沉淀 DNA，哪个效果比较好啊？ 请教下，用异丙醇沉淀与乙醇沉淀，哪个效果比较好啊。我上次提 DNA 用异丙 醇沉淀， 离心后沉淀不在管底， 倒上清时倒掉了不少。 用乙醇的话， 2 倍体积， 得 管又装不下。 Re: 求助：用异丙醇沉淀与乙醇沉淀 DNA，哪个效果比较好啊？ 当然是异丙醇了,乙醇应该是用来洗脱有机溶剂如(异丙醇)的,你说的乙醇应该是 无水乙醇吧,原因可能是:你的 DNA 提的量太少,或是离心时间不够,应该和所用试 剂没什么关系。 用-20 度预冷异丙醇沉淀效果较等体积乙醇沉淀好；异丙醇约和 2.5 倍体积的乙 醇效果相当；但 DNA 微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会使部分 DNA 溶解损失；所 以多选用-20 度预冷异丙醇。一般 6500 倍到 8000 倍重力 10 分钟就可以将异丙 醇沉淀的核酸紧密的离到管底。 在 DNA 的粗提取和鉴定的方法中,其中最后一个步骤为沉淀 DNA,必须用冷酒精. 实验前必须准备好大量的体积分数为 95%的酒精,并在冰箱(至少 5S 以下)中至少 存放 24 h。请问原理是什么? 此次试验一般会有两个疑问： 1.为什么用无水乙醇沉淀 DNA？ 用无水乙醇沉淀 DNA，这是实验中最常用的沉淀 DNA 的方法。乙醇的优点是可 以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对 DNA 很安全，因此 是理想的沉淀剂。 DNA 溶液是 DNA 以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去 DNA 周围 的水分子，使 DNA 失水而易于聚合。一般实验中，是加 2 倍体积的无水乙醇与 DNA 相混合， 其乙醇的最终含量占 67％左右。 因而也可改用 95％乙醇来替代无 水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比 95％乙醇昂贵） 。但是加 95％的乙醇使总 体积增大，而 DNA 在溶液中有一定程度的溶解，因而 DNA 损失也增大，尤其 用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀 DNA 时可用 95 ％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用 0.6 倍体积的 异丙醇选择性沉淀 DNA。一般在室温下放置 15－30 分钟即可。 2.在用乙醇沉淀 DNA 时，为什么一定要加 NaAc 或 NaCl 至最终浓度达 0.1～ 0.25mol/L？ 在 pH 为 8 左右的溶液中， DNA 分子是带负电荷的， 加一定浓度的 NaAc 或 NaCl， 使 Na+中和 DNA 分子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成 DNA 钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分 DNA 形成 DNA 钠盐而聚合，这样就造成 DNA 沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太 高时，其效果也不好。在沉淀的 DNA 中，由于过多的盐杂质存在，影响 DNA 的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。 用无水乙醇沉淀 DNA，这是实验中最常用的沉淀 DNA 的方法。乙醇的优点是可 以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对 DNA 很安全，因此 是理想的沉淀剂。 DNA 溶液是 DNA 以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去 DNA 周围 的水分子，使 DNA 失水而易于聚合。一般实验中，是加 2 倍体积的无水乙醇与 DNA 相混合， 其乙醇的最终含量占 67％左右。 因而也可改用 95％乙醇来替代无 水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比 95％乙醇昂贵） 。但是加 95％的乙醇使总 体积增大，而 DNA 在溶液中有一定程度的溶解，因而 DNA 损失也增大，尤其 用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀 DNA 时可用 95 ％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用 0.6 倍体积的 异丙醇选择性沉淀 DNA。一般在室温下放置 15－30 分钟即可。 配好的酚氯仿异戊醇溶液为什么会分层？ 上层是水吗？ 答：上层是水。 氯仿：使有机相和水相易分层，增加核酸得率，同时可除去脂类。 1. 说明：从核酸样品中除去蛋白质时常常使用苯酚/氯仿/异戊醇（25 : 24 : 1)。 氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离， 而异戊醇则有助于消除抽提 过程中出现的气泡。 2. 配制方法：将Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇（24 : 1）混合均匀后， 移入棕色玻璃瓶中 4℃保存。 http://www.takara.com.cn/product/2005/s/s1FH11001.html 再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次,每次回收上层水相。 http://youarezen.blogchina.com/2175456.html 第一章 质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定 第一节 概 述 把一个有用的目的 DNA 片段通过重组 DNA 技术,送进受体细胞中去进行繁 殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组 DNA 技术中常用的载体。 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从 1-200kb 不等,为双 链、闭环的 DNA 分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于 细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保 持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。 质粒的复制和转录要依赖于宿主 细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。 质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗 性等。F 质粒(又称 F 因子或性质粒)、R 质粒(抗药性因子)和 Col 质粒(产大 肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰 控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体 不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有 1 个或几个质粒分子,如 F 因 子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝, 一般在 20 个以上,如 Col E1 质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞 内蛋白质合成、染色体 DNA 复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停 止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来 20 多个扩增至
个,此时质粒 DNA 占总 DNA 的含量可由原来的 2%增加至 40-50%。 利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒 同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在 一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细 胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一 种,这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。 但利用不同复制系统的质粒 则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。 质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生 素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶 等。 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天 然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素 抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点 序}