[发明专利]一种全血DNA快速提取方法在审
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【说明书】：
技术领域本发明涉及生物技术领域，涉及一种提取动物基因组DNA的方法，具体涉及一种用于三代测序的大量全血DNA快速提取方法。背景技术核酸测序技术如今已成为生物学研究领域的强大助手，第二代高通量测序技术的应用已取得诸多可喜可贺的成果，但技术原理决定了二代测序存在诸多弊端，如测序读长短、反复PCR扩增造成的扩增偏好性、难以覆盖高GC含量和重复序列区域等。而第三代高通量测序技术的出现，可以完美解决这些问题，其测序读长10～60kb甚至更长，无PCR扩增过程无GC偏向性等，在基因组的组装上对比二代有无与伦比的优势，也因为如此，三代测序对起始DNA样品的要求极高，尤其是在总量(至少8ug/cell)、纯度(A260/280＝1.8～2.0；A260/230＝2.0～2.2等)和完整度(片段大小在10kb以上)上。DNA提取是分子生物学的基本实验，涉及了基因克隆、基因序列分析、基因重组和基因治疗，以及遗传育种等技术领域。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，提取DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。大量血液提取流程一般是是先裂解红细胞收集有核血细胞沉淀(主要是白细胞)，或裂解所有细胞膜收集细胞核沉淀(主要是白细胞核)用于DNA提取，这一步骤可去掉血液绝大部分杂质且提高血细胞裂解效率，从而提高血液DNA的得率和纯度。但此步骤的存在，首先是人力、物力和时间成本的增加；其次血液量越大，操作越复杂；第三是增加多次清洗和离心，血液DNA完整度受影响从而难以满足三代测序要求。发明内容鉴于此，本发明为了解决现有从血液中提取DNA存在的工艺繁琐、成本高耗时长、不适应三代测序的问题，采用对大量全血进行高速离心处理，得到血细胞，再用特殊配制的全细胞裂解液一步裂解血细胞，得到的一种适于三代测序的从血液中快速大量提取基因组DNA的方法，该方法最快可在3.5h内拿到合格DNA。本发明提供了一种全血DNA快速提取方法，步骤包括：S1、将血液样本在1rpm转速下离心后去掉上清液，保留沉淀，加入裂解液后混匀至澄清状态，置于50～60℃水浴40-60min，冷却后采用有机溶剂抽提，离心后取上清液；所述裂解液组份包括：0.8～1.2M盐酸胍；pH8.0～8.5、30～100mM Tris-Cl；pH8.0～8.5、30～100mM EDTA，体积百分比4～8％Tween-20，体积百分比0.3～1％Triton X-100，质量体积比0.3～1％SDS和0.3～1mg/ml蛋白酶K；S2、向步骤S1所得上清液中加入异丙醇和NaAc，混匀后收集沉淀，清洗沉淀后晾干；S3、向步骤S2所得晾干的沉淀中加入TEN缓冲液和核糖核酸酶，混匀后置于37℃温育30min，再加入含有蛋白酶K的TEN缓冲液，混匀，置于50～60℃下30min，冷却后离心，取上清液纯化得到纯净DNA。本发明的有益效果是：(1)能一次处理大量样品，在硬件和试剂保证的情况下，单次处理的血液样品量没有上限，如在本发明的一个实施例中血液样本达到7.5ml，相比于现有一次裂解技术的几百微升的样品量有明显提升；(2)处理工艺简单；现有技术处理大量样品都是先加红细胞裂解液(温和裂解液)离心去掉红细胞，再加强裂解液裂解白细胞，或者全血加全细胞膜裂解液，得到白细胞核后再裂解细胞核来提取DNA，步骤繁琐复杂，得到的血液DNA完整度低；而本发明提供的方法通过高速离心，去除绝大部分红细胞，再将沉淀的血细胞(主要是有核白细胞等)用全细胞裂解液一次性裂解细胞膜和细胞核，再提取DNA，即仅需加一次特定组份的裂解液即可将白细胞中的DNA裂解出来，裂解充分且操作更加简单，同时减少了清洗和离心步骤，从而有效保证血液DNA的完整度，人力、物力和时间成本明显降低；(3)采用本发明提供的方法，耗时短且DNA得率和品质好，最快可在3.5h内拿到适用于三代测序的DNA。附图说明图1为实施例一中样品的凝胶电泳检测结果图，采用0.7％琼脂糖凝胶，电泳条件为150V，30min；图2为实施例一中样品的凝胶电泳检测结果图，采用0.7％琼脂糖凝胶，电泳条件为25V，15h；图3为实施例二中样品的凝胶电泳检测结果图，采用0.7％琼脂糖凝胶，电泳条件为150V，30min；图4为实施例二中样品的凝胶电泳检测结果图，采用0.7％琼脂糖凝胶，电泳条件为25V，14h。具体实施方式本发明提供了一种全血DNA快速提取方法，步骤包括：S1、将血液样本在1rpm转速下离心后去掉上清液，保留沉淀，加入裂解液后混匀至澄清状态，置于50～60℃水浴40-60min，冷却后采用有机溶剂抽提，离心后取上清液；所述裂解液组份包括：0.8～1.2M盐酸胍；pH8.0～8.5、30～100mM Tris-Cl；pH8.0～8.5、30～100mM EDTA，体积百分比4～8％Tween-20，体积百分比0.3～1％Triton X-100，质量体积比0.3～1％SDS和0.3～1mg/ml蛋白酶K；S2、向步骤S1所得上清液中加入异丙醇和NaAc，混匀后收集沉淀，清洗沉淀后晾干；S3、向步骤S2所得晾干的沉淀中加入TEN缓冲液和核糖核酸酶，混匀后置于37℃温育30min，再加入含有蛋白酶K的TEN缓冲液，混匀，置于50～60℃下30min，冷却后离心，取上清液纯化得到纯净DNA。其中，所述冷却均为自然冷却至室温15～35℃。作为优选的，在本发明的一个实施例中，步骤S1中的裂解液为：0.8M盐酸胍，30mM Tris-Cl(pH8.0)，30mM EDTA(pH8.0)，5％Tween-20，0.5％Triton-100，0.5％SDS和0.5mg/ml Proteinse K。因为Triton X-100和Tween-20是非离子的表面活性剂，它们的头端基团是没有极性的亲水基团，可以破坏蛋白质-脂质以及脂质-脂质之间的连接，而红细胞和白细胞中除了蛋白质，另外还有氨基酸、脂肪、碳水化合物等，采用Triton X-100与Tween-20可以较好地分解细胞。盐酸胍是强电解质，因此变性总是伴随着高离子强度，在脲和盐酸胍变性的条件下，大多数的蛋白被变性，形成一种非常接近于无规卷曲的状态；SDS是一种非常高效的表面活性剂，几乎可以使所有的蛋白质溶解，它可以破坏蛋白质的非共价键，从而使蛋白质变性，并丧失天然构象和功能。蛋白酶K在SDS和EDTA存在下保持很高的活性。SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离。EDTA则抑制Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。而Tris-Cl和EDTA形成的缓冲液利于DNA的稳定和储存。各个组分相互配合协同，只加一次裂解液即可将白细胞中的DNA裂解出来。优选的，步骤S3所述TEN缓冲液组份为：50～100mM Tris(pH8.0～8.5)、50～100mM EDTA(pH8.0～8.5)、1～1.5M NaCl。优选的，步骤S1中，裂解液添加量为血液样本体积的1.5～2.5倍，且裂解液预热至20～40℃后再添加至沉淀中。无需裂解红细胞步骤，直接取沉淀后加入裂解液即可，加入预热的裂解液后需充分打散沉淀混匀，保证裂解充分。所述血液样本需解冻完全，具体的，可将血液样本置于室温下解冻，或于37℃水浴解冻，37℃下仅需几十秒钟即可完成解冻，方便快捷。若采用新鲜血液，亦可按照此方案提取，可考虑先冻融一次，否则步骤S1离心时间和转速应适当增加，且务必保证血液没有凝聚。理论上此方案一次性处理的血液并没有上限，但是为保证DNA得率，优选每次2ml以上的血液样本量。1ml血液样本量可得8～10ug DNA，2ml血液样本量可得20～30ug DNA，5mL血液样本量可得至少120ug DNA。优选的，步骤S1所述有机溶剂为氯仿异戊醇混合液，所述氯仿异戊醇体积比为23～25:1。更加优选的，步骤S1中，抽提次数为1次。采用最佳的有机溶剂配比，保证抽提效果，只抽提1次，最大限度保证DNA的完整。优选的，步骤S1中，所述水浴过程中每5～10min混匀1次。混匀操作应轻柔，上下颠倒须动作轻柔防止DNA断裂，定期混匀保证裂解更充分。优选的，步骤S1中，所述离心时长8～15min，温度4～16℃。常温离心过程离心机易发热，不推荐使用。使用冷冻离心机保持16℃左右的低温可有效保护DNA。优选的，步骤S2所述异丙醇用量为上清液体积的0.7～1倍，所述NaAc用量为上清液体积的0.1倍。异丙醇、NaAc添加后DNA一般会形成丝状或絮状沉淀，在本发明的实施例中，沉淀收集方式为挑出絮状沉淀，沉淀收集方式还可以是4℃下rpm离心5～10min。优选的，步骤S3所述含有蛋白酶K的TEN缓冲液稀释5～10倍使用，蛋白酶K的浓度为0.5～1mg/mL。
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高智&让创新无法想象2000万件&专利数据一般dna亲子鉴定要多久才能拿到结果_百度宝宝知道今天去做了无创dna！还要十个工作日以后才能拿到！好紧张！希望结果好好的_百度宝宝知道TE煮沸法快速获得可扩增DNA
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|个人分类:|系统分类:|关键词:小麦 DNA TE EDTA PCR
非常感谢何老师的分享。近期sci-hub.cc不能访问了，大家可以试试下面的两个网址：1、 &https://scihub22266oqcxt.onion.link2、 &https://sci-hub.bzTE煮沸法快速获得可扩增DNA 何华纲近日盟主推送了“史上最快核酸提取方法，30秒内完成”，这里跟大家分享一下我们实验室使用的民间版DNA提取方法，发表论文时（Genetic,Physical and Comparative Mapping of the Powdery Mildew Resistance Gene Pm21 Originating from Dasypyrum villosum. Front. Plant Sci. 2017, doi:10.3389/fpls..）也没有好好考虑命名，为了交流方便，不妨叫作“TE煮沸法”，具体如下：1、剪取1厘米左右叶片放入1.5ml离心管，玻璃棒手工研磨数下可至匀浆。2、加入150微升TE（成分及浓度见原文），90度煮10分钟，释放DNA，同时灭活各类核酸酶。3、10000rpm离心1分钟，可避免颗粒物对PCR的干扰，提高PCR稳定性；离心后无需倒管，直接取上清液作为PCR模板。4、PCR扩增时，根据提取液中EDTA的用量及模板用量，按比例增加Mg离子，消除EDTA对Taq酶活性的影响。全过程花费时间：平均每个样品的处理时间差不多就是剪叶片编号所花时间。在对簇毛麦Pm21进行遗传作图时，面临了着这样一个问题：Pm21所在染色体区域存在严重的交换抑制（大约1/20染色体片段的总遗传距离仅0.3cM）。想用一个超大的群体来解决，但小作坊里人手紧缺。问过公司，报价不低，于是狠下心来自己摸索DNA提取方法。刚开始，想用一个相对简单的方法来提取质量较好的DNA，但是方法再简单，有些步骤总不能少的，要过上万单株的群体，恐怕还是要得抑郁症。痛定思痛，改变观念，放低要求，不讲质量，只要释放出“可扩增DNA”就行，这样就有了“TE煮沸法”，完成了Pm21的精细定位。文中Figure2的多重PCR就是用这个方法做出来的。“TE煮沸法”，除了高浓度的TE，不使用其他试剂，避免了试剂因素对后续PCR的干扰，至于提取液中过多的EDTA，在PCR体系里按比例多加Mg2+就可以了。整个提取过程是一管式的，无需倒管，减少了人工出错环节。获得的DNA粗提液相当稳定，在4度放置几个月后PCR照扩不误。“TE煮沸法”也同样适合于小麦、大麦、玉米、水稻等单子叶植物和拟南芥、油菜、番茄等双子叶植物。“TE煮沸法”操作简单、快速，但主要还是基于人工磨样，后续或可结合磨样机实现自动化操作。此外，由于DNA完整性可能比较差（直接电泳是看不出条带的），做做分子标记没什么问题，但要用来克隆基因，还需慎重。有需要的实验室可以试一试，同时也欢迎大家分享自己的学习和实验等的心得体会。想法不怕不成熟，就怕没想法。欢迎关注“小麦生信联盟”，了解小麦新进展
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