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细胞的原代培养与传代培养
细胞的原代培养与传代培养
通过组织块直接长出单层细胞或用酶或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养可认为是原代培养。原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。特别是在细胞培养会合时，原代培养的某些特殊功能表达尤为强烈。在这样的培养阶段能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，采用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化等，效果很好。但应注意，原代培养组织是由多种细胞成分组成的，比较复杂。即使全为同一类型的细胞，如上皮细胞或成纤维细胞，也仍具有异质性，在分析细胞生物学特性时比较困难。其次，由于供体的个体差异及其他一些原因，细胞群生长效果有时也不一致。
原代培养也是建立各种细胞系（株）必经的阶段。假如原代培养能够维持几小时甚至更长，即可进行进一步筛选。有的细胞具有继续增殖能力，有的细胞类型只是存活而不增殖，而另外一些细胞只是在特殊条件下应用而不存活，因而细胞类型的分布将会改变。在单层培养的情况下，瓶底全部铺满细胞，达到会合以后，对密度有依赖性的细胞则逐渐减少生长，而失去密度依赖敏感性的细胞则生长增加，天然或自发转化的细胞则过度生长。借助于频繁传代，保持细胞低密度生长，有利于保存细胞的正常表型（如小鼠成纤维细胞）。而自发转化则倾向于高细胞密度的过度生长。
细胞密度过大，培养基消耗将尽，细胞代谢产物积聚过度，细胞增殖变慢，应进行传代培养。
原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代或传代培养。原代培养在首次传代时即为细胞系，能连续培养下去的为连续细胞系；不能连续培养的为有限细胞系。通常，传代培养是指扩大培养，也就是将一份细胞一分为二或者一分为三进行培养等。但严格说来，不论稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。可以理解，在任何时候，细胞从一个瓶子接种到另一个瓶子时总会丢失一部分，因此，在客观上细胞必定有所稀释。
传代代数这一概念常常容易同“增殖代数”相混淆。细胞“一代”一词仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间。如某一细胞系为第153代，即指该细胞系已传代153次。它与细胞“增殖代数”（细胞世代或倍增）不同，在细胞一代中，细胞约能倍增3～6次。由此可见，细胞代数与增殖代数相关，确切的代数则依赖于细胞株和培养条件的不同而异。但构成一个细胞系的生长条件必须是同样的，因而细胞系应该表达近似的增殖代数或倍增代数。
1.&悬浮细胞：离心后计数细胞，根据细胞增殖速度，加入新鲜完全培养基，制成适当密度后，放入新瓶培养：快速增殖的肿瘤细胞系，可调节密度为1&104细胞/ml至1&105细胞/ml，对增殖缓慢细胞可加大密度。
2.&贴壁细胞：吸弃培养基，用PBS洗一遍，沿培养瓶侧壁加入2-3ml新鲜配制的胰酶（浓度为0.2-0.3%，以PBS配制后过滤除菌），完全覆盖全部细胞层，室温静置1分钟，吸去胰酶，以残留的胰酶继续消化，镜下观察，当细胞开始变圆但尚末完全脱落时（一需3-15分钟不等，依各细胞类型而定）立即加入2-3
ml带血清的培养基，中止胰酶消化，对着培养瓶底角充分吹打细胞，使成单细胞，计数细胞，按所需密度传代，一瓶生长密集的细胞可传代3-6瓶。
1.一般传代后24小时左右，细胞进入指数生长期，是良好的实验材料。
2.贴壁细胞的消化，应掌握各类型细胞不同的消化时间，避免过度消化，损伤细胞活力；或消化不足，不能充分解离成单细胞。
3.如为长期实验，每个月重新复苏一支细胞，避免长期传代引起细胞特性变异；
4.有些肿瘤细胞需体内传代，即接种动物体内传代。对这些细胞株应避免在体外过多传代，如体外培养，应在10代以内使用。
&原代培养物经首次传代成功后即为细胞系(cell line)，
由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代，或传代次数有限，可称为有限细胞系(finite cell line)， 如可以连续培养，
则称为连续细胞系(continuous cell
line)， 培养50代以上并无限培养下去。
从一个经过生物学鉴定的细胞系由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群称细胞株(cell
strain)。所以细胞株是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞。从培养代数来讲，可培养到40-50代。
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摘要 : 细胞培养(cell culture)是从机体中将细胞取出后，在模拟生物体内生理条件下使其在体外生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命活动过程的方法。进行细胞生物学、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成为一种重要的生物学技术。
实验五 细胞的和传代培养
1. 实验目的
初步掌握哺乳动物的原代培养与传代培养的基本操作过程。
2. 实验指导
细胞培养(cell culture)是从机体中将细胞取出后，在模拟生物体内生理条件下使其在体外生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命活动过程的方法。进行、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成为一种重要的生物学技术。
细胞培养一般可分为原代培养和传代培养。所谓原代培养，是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。一般动物和人的所有组织都可以用于培养，但幼体组织和细胞(如胚胎组织、幼仔的脏器等)更容易进行原代培养。传代培养则是为了使体外培养的或细胞株在体外持续生长、繁殖。细胞持续生长繁殖就必须传代，并由此获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞。培养的贴壁细胞形成单层汇合后，由于密度过大、生存空间不足而引起营养枯竭。将培养的细胞分散，从容器中取出，以1：2或1：3以上的比例转移到另外的容器中继续进行培养，即为传代培养。
要使细胞在离体情况下生长繁殖，培养条件必须尽可能接近体内，除营养物质外，温度、PH值、等也至关重要。此外，还应避免细菌及其他微生物的污染，重金属离子及有毒化学物质及放射线的影响。
通过质膜表面的粘着蛋白贴附于培养瓶表面。加入消化液可使粘着蛋白部分水解，从而使培养的细胞游离。但消化时间不可过长，否则可能导致细胞解体死亡。
常用的消化液为和EDTA。二者可分别使用，也可共同使用。钙离子是二者的抑制剂，故实验中消化结束时，加入含有钙离子的全培养液，即可终止消化。
细胞的一代是指细胞从接种到分离再培养的一段时间，与细胞世代或倍增不同，在一代中细胞倍增3～6次。细胞传代后一般经过三个阶段：游离期、指数生长期和停止期。
原代培养和传代培养的细胞依据其生长状态，可分为贴壁生长细胞与非贴壁生长细胞。
一般说来，来自外周血的细胞，如红细胞、白细胞、白血病细胞等都是非贴壁细胞;而来自其他组织的细胞则多为贴壁细胞。
贴壁细胞依照其镜下特征，可分为以下4种类型。
① 成纤维型细胞。
②上皮型细胞。
③游走型细胞。
④多形型细胞。
本次实验中原代培养的为兔肾成纤维细胞，生长状态良好时为标准的成纤维型细胞。传代培养的HeLa细胞为黑人宫颈癌细胞，为标准的上皮型细胞。
3.实验材料
3.1器材:手术器械一套，直径9cm培养皿一套，培养瓶4个，吸管3支，离心管2个(以上用品为每只乳兔所用)，C02培养箱，超净工作台，酒精灯，倒置显微镜，HeLa细胞。
3.2试剂：0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA混合消化液，RPMI-1640培养液 (含5%小牛血清)，0.01%PBS，75%乙醇。
3.3动物：乳兔
4.实验方法
4.1细胞的原代培养
① 取材: 用颈椎脱位法处死乳兔，然后把整个动物浸入盛有75%乙醇的烧杯中，数秒消毒后取出(注意：浸泡时间过长，乙醇从口和肛门侵入体内会影响组织生长)，携入超净台，放在大平皿中。分别用碘酒和乙醇进行一次背部消毒，再用消毒过的剪刀剪开乳兔背部的皮肤和肌肉，取出肾脏，置于另一个无菌培养皿中。
②切割: 用灭菌的PBS液将取出的肾脏清洗3次，然后用眼科剪刀和镊子仔细将肾脏外包膜除去，之后将组织反复剪碎，直至剪成0.5～1mm3左右的小块。再用PBS液清洗，直至组织块发白为止。然后移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到离心管的管底，弃去上清液。
② 消化分离: 吸取0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，加上胶塞，在37℃水浴箱中消化8～10分钟，每隔几分钟轻轻摇动一下离心管，使组织与消化液充分接触。消化结束后静置3分钟，吸去上清。
④接种培养：向离心管中加入5～10ml含5%小牛血清的1640培养液，用吸管吹打混匀，移入2个培养瓶中。盖好瓶塞，做好标记，置于C02培养箱中37℃培养。
4.1.2结果观察
细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5～7天即可形成单层。
4.2细胞的传代培养
① 将长成单层的细胞从CO2培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少量消化液 (以液面覆盖住细胞即可)，之后立即弃掉消化液。
②静置3～5分钟，加入3～5ml新鲜培养液(在酒精灯上进行操作)，吹打，制成细胞悬液。
③将细胞悬液吸出2ml左石，加入另一无菌培养瓶中(在酒精灯上进行操作)，并向每个培养瓶中分别加入3ml左右培养液，盖好瓶塞，做好标记，送回二氧化碳培养箱中，37℃继续进行培养。
4.2.2结果观察
一般情况下，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶的壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，并需要再次传代。
5.结果与讨论
5.1绘出镜下所见贴壁生长的兔肾细胞及HeLa细胞的形态。
5.2讨论在细胞培养的过程中避免污染的关键环节。
6.注意事项
6.1细胞培养十分重要的事项是整个过程都要注意无菌操作。操作者操作前要洗手，并用75%乙醇消毒或0.2%新洁尔灭泡手。
6.2使用的超净工作台在操作前用紫外线照射20～30分钟，并打开吹风机。
6.3培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞。打开之前要用75%乙醇瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下。打开瓶口后全部操作过程都要在超净台内完成。操作完毕，加上瓶塞，才能拿到超净台外。
6.4使用吸管时，从消毒筒(或消毒纸)中取出时要用手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上乳胶皮头，然后再去吸取液体。
6.5细胞培养过程中要每隔一日进行常规检查，观察是否有污染，细胞生长是否正常。如果溶液清晰、透亮，细胞贴壁生长并沿壁延伸，说明无污染;如果溶液变黄或浑浊，表明已污染，培养失败。
6.6使用CO2培养箱培养时，由于CO2增多，可使液体变黄，这时可更换培养液继续培养。
7.1细胞原代培养和传代培养有什么区别?培养细胞有何用途?
7.2培养细胞为什么会发生形态变异?
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原代培养出来的细胞是原代细胞还是传代细胞
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前10次属于原代细胞，后来到40～50次属于传代细胞
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另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。
体外培养技术中所谓的传“代”概念并不等于细胞生物学中“亲代细胞”与“子代细胞”中“代”的概念。传代培养的实质就是分割后再一次培养，可以相对地衡量培养物的培养年龄。
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