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静脉移植人羊膜间充质干细胞在陈尔茨海默病小鼠的体内迁移及治疗机制研究1
ｌ ８ ５．７ ２ ８ ７Ａ ｔｈｅｓｉｓ（ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ）ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ ｔｏＺｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ＭａｓｔｅｒＲｅｓｅａｒｃｈｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｍｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｏｆＡＩｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｖｉａ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎＢｙ Ｃｈｅｎｇｃｈｕｎ?Ｗａｎｇ．，ＧｕａｎＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．Ｆａｎｇｘｉａ、Ｃｅｌｌ ＢｉｏｌｏｇｙＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＭａｙ ２０１０＼ｒ‘．１１．一’―Ｊ；Ｉ㈨ＩＩＩ Ｉ Ｉ Ｉ ＩＩＩ Ｉ Ｉ Ｉ Ｉ Ｉ ｌ ｔｌ ｌＹ１ ８３３８７８原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：王磁鸯日期：即年∥月８Ｅｔ学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：互硪务日期：砷年∥月吕日
摘要静脉移植人羊膜间充质干细胞在阿尔茨海默病 小鼠的体内迁移及治疗机制研究硕士研究生：王成春 导师：关方霞教授摘要阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓｄｉｓｅａｓｅＡＤ），俗称老年性痴呆（ｓｅｎｉｌｅｄｅｍｅｎｔｉａ）， 是一种中枢神经系统原发性退行性变性疾病。发现至今，研究者一直没有停止 对阿尔茨海默病的病因和发病机理的研究，但对于这一疾病的治疗至今还没有 突破性的进展。随着细胞工程的迅速发展，干细胞移植治疗中枢神经系统疾病 的研究为治疗ＡＤ开辟了新天地。 人羊膜间充质干细胞（ａｍｉｎｉｏｔｉｃｍｅｍｂｒａｎｅｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，Ａｄ－ｈＭＳＣｓ）是近些年分离培养的多潜能干细胞。本实验深入探索静脉移植 人第三代羊膜间充质干细胞在阿尔茨海默氏症转基因鼠体内的迁移存活，以及 在脑部的归巢和疾病治疗的机制。 本论文共分为三部分。第一部分：人羊膜间充质干细胞的体外分离培养； 第二部分：第三代人羊膜间充质干细胞静脉移植在转基因阿尔茨海默症小鼠体 内的迁移及存活；第三部分：第三代人羊膜间充质干细胞静脉移植在转基因阿 尔茨海默症小鼠脑部的归巢以及疾病治疗机制研究。 第一部分：从胎盘分离出人羊膜间充质干细胞，体外培养扩增，传至第三 代，选择形态保持良好，生长旺盛的细胞做后续实验。 第二部分：采用原代培养后传至第三代的人羊膜间充质干细胞进行转基因 阿尔茨海默病小鼠的尾静脉移植，调整细胞浓度为ｌｘｌ０６＋／ｍｌ，注射量Ｏ．５ｍｌ／只。采用组织冰冻切片，荧光显微镜观察人羊膜间充质干细胞移植后，不同时 间点在转基因阿尔茨海默症小鼠体内心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及脑部的 迁移情况。结果发现移植第三代的人羊膜间充质干细胞后，在不同的时间的小 鼠的肝脏、脾脏、肺脏及脑组织都可以发现归巢的细胞存活；而任何时间在小 鼠的心脏以及肾脏均未能检测到归巢细胞。并且所有实验小鼠生长良好，无明摘要显的体重降低，及其他竖毛、抓狂、癫痫等不良反应。 第三部分：第三代人羊膜干细胞静脉移植ＡＰＰ转基因鼠模型后３ １ｄ，通过免 疫组化技术，对第三代的人羊膜间充质干细胞在转基因阿尔茨海默病小鼠的脑 组织中的分化功能进行研究，探讨可能的疾病治疗机制。结果发现小鼠脑组织 中星形胶质细胞表达明显增多，神经干细胞、神经祖细胞以及神经元细胞也明 显增加，并且没有致瘤现象，小鼠肝肾功能正常。表明人羊膜间充质干细胞尾 静脉移植对治疗转基因阿尔茨海默病小鼠有积极的治疗效果，安全可行。 本研究首次采用人羊膜间充质干细胞以静脉途径移植观察第三代人羊膜干 细胞在阿尔茨海默氏症转基因鼠模型体内不同时间点的迁移情况，并研究人羊 膜间充质干细胞移植３１ｄ后，在小鼠脑组织中的分化以及发挥的生物学功能。本 研究结果将为今后的临床实验提供理论基础和直接证据。关键词：人羊膜间充质干细胞（ｈＡＭＳＣｓ）；静脉移植；阿尔茨海默病；转基因 阿尔茨海默病小鼠：归巢；星形胶质细胞；神经干细胞；神经组细胞Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｈｕｍａｎｖｏｎ ｍｉ ｇｒａｔ ｉｏｎａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｅｃｈａｎ ｉｃｅｓｍＳｏｆ ｉｎａｍｎｉ ｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａ Ｉ ｓｔｅｍＩ ＩＶｉ ｖｏ ｏｆ Ａ Ｉ ｚｈｅ ｉ ｍｅｒ’ｓ ｔｒａｎｓｇｅｎ ｉ ｃｍｏｕｓｅｉａｉ ｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｐ Ｉ ａｎｔａｔ ｉ ｏｎ●’Ｓｔｕｄｅｎｔ：Ｃｈｅｎｇｃｈｕｎ ＷａｎｇＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｆａｎｇｘｉａ ＧｕａｎＡｂｓｔｒａｃｔＡｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅ（ＡＤ），ｉｓ ａｌｓｏ ｋｎｏｗｎａｓｓｅｎｉｌｅ ｄｅｍｅｎｔｉａ，Ｉｔｉｓａｐｒｉｍａｒｙｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｙｉｎｇｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｃｅｎｔｒａｌｎｃＴｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ．Ｓｏ ｆａｒ，ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ ｈａｖｅ ｎｏｔ ｓｔｏｐ ｔｈｅｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｂｏｕｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ｂｕｔｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｉｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｈａｓ ｙｅｔ ｔｏｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ．Ｗｉｔｈｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆｔｈｅｃｅｌｌ吼舀ｎｅｅｒｉｎｇ，ｔｈｅｎｅｒ、阳哪ｓｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎａｏｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆ ｃｅｎｔｒａｌｓｙｓｔｅｍｄｉｓｅａｓｅ ｈａｓ ｂｒｏｋｅｎｎｅｗ ｇｒｏｕｎｄ ｆｏｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆ 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Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ａｔ ｔｈｅｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｅｔｉｍｅｅｘａｍｉｎｅｄ．Ｗｅ ｆｏｕｎｄ ａｌｌＰａｒｔ ＩＩＩ：Ｔｈｅ ｔｈｉｒｄｇｒｏｗｅｄｖｅｒｙ ｗｅｌｌ，ａｎｄ ｗｅ ｎｏｔ ｆｏｕｎｄａｎｙ ａｄｖｅｒｓｅｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｉｃｅ．ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｈｕｍａｎａｍｎｉｏｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｉｎｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｂｙ ｖｅｉｎ ｇｒａｆｔ．Ａｆｔｅｒ ３ １ ｄａｙｓ，ｗｅ ｔｈｅｅｘａｍｉｎｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｈｕｍａｎａｍｎｉｏｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｏｕｓｅ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｔｈｅｎｗｅｓｔｕｄｉｅｄｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．１ｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｉｎｔｈａｔ ｔｈｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ．ｏｆ ｔｈｅｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓａｎｄｎｅｕｒｏｎｓｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅＡｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｃｏｕｌｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅ，ａｎｄ ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏａｎｙｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ，ｔｈｅｉｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ａｎｄｋｉｄｎｅｙ Ｗａｓ ｈｅａｌｔｈｙ．１１ｌｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｌｌｉｒｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｔａｉｌｈｕｍａｎ ａｍｎｉｏｔｉｃｔｒｅａｔｍｅｎｔｔｈｅｓｔｅｍｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅｖｅｉｎ ｇｒａｆｔ ｔｏＡｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅｈａｄａｐｏｓｉｔｉｖｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔ，ｉｔ Ｗａｓ ｓａｆｅａｎｄｆｅａｓｉｂｌｅ．ＴＭｓ ｉｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｔｉｍｅ ｔｈａｔｈｕｍａｎ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｅ埴＇ｅ ｕｓｅｄ ｔｏＡｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓｄｉｓｅａｓｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｅｘａｍｉｎｅ ｔｈｅｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎｄｌｉｖｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｏｆ ｔｈｅｍｏｕｓｅＩＶＡｂｓｔｒａｃｔｂｙ ｔｈｅ ｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｇｒａｆｔ，ａｎｄｔｏｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｏｕｓｅ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄｈｕｍａｎａｍｎｉｏｔｉｃ ｔｈｅｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ３ １ ｄａｙｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｏｒｅｐｒｏｖｉｄｅｄｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｈｕｍａｎａｍｎｉｏｔｉｃ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ｈＡＭＳＣｓ）；ｖｅｉｎｇｒａｆｔ；Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｎｅｒｖｅ ｃｅｌｌｓｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｏｕｓｅ；ｈｏｍｉｎｇ；ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ；Ｖ
目录目录附表Ａ实验主要试剂……．．…ｊ．．．……．．…．…．．．…．１ 附表Ｂ实验主要仪器…………………．．．．………．．．２ 英文缩略词………………．．．………．．．．…．……．．３ 引言．．．．．．．…………．．…………．……………．４ 第一部分：人羊膜间充质干细胞的体外分离培养……………６ 前言…．．………．…．．．．…………．．．．…………６ 刖舌…．．………．…．．．．…………．．??…………ｂ １．材料与方法…………………．…．．……………．６１．１羊膜标本来源…………………………………………６ １．２主要试剂配置…………………………………………６ １．３人羊膜间充质干细胞的体外分离培养………………………．７ １．４第三代人羊膜间充质干细胞的选择…………………………８２．结果…．………………………………．…．．９２．１人羊膜间充质干细胞原代细胞的体外分离…．．………………．９ ２．２人羊膜间充质干细胞体外增殖……………………………．９ ２．３第三代人羊膜间充质干细胞的收集…………………………９３．讨论……．…．．………………．．．………．．．１０第二部分：第三代羊膜间充质干细胞静脉移植在转基因阿尔茨海默病小鼠体内的迁移……．……．．………．．．……．．……１１ １ 前言……………．……………………………１ 日ＩＪ舌……………．……………………………ｌ上 １．材料与方法……………………………………１２１．１第三代人羊膜间充质干细胞……………………………．．１２ １．２实验动物……………………………………………１２ １．３第三代人羊膜间充质干细胞荧光标记………………………１２ １．４动物分组及尾静脉移植…………………………………１２１．４．１动物分组：……………………………………………．１２ＶＩ目录１．４．２静脉移植：……………………………………………．１２１．５第三代人羊膜间充质干细胞移植后不同时间点的标本采集………１３ １．６第三代人羊膜间充质干细胞移植后在小鼠体内迁移……………１４２．结果……………．．…．…．．………．．………．１４２．１实验动物数量分析……………………………………．１４ ２．２荧光标记第三代人羊膜间充质干细胞在小鼠体内的归巢检测……．１４２．２．１荧光标记第三代人羊膜间充质干细胞在小鼠心脏中的归巢及存活……１４ ２．２．２荧光标记第三代人羊膜间充质干细胞在小鼠肝脏中的归巢及存活……１５ ２．２．３荧光标记第三代人羊膜间充质干细胞在小鼠脾脏中的归巢及存活……１５ ２．２．４荧光标记第三代人羊膜间充质干细胞在小鼠肺脏中的归巢及存活……１６ ２．２．５荧光标记第三代人羊膜间充质干细胞在小鼠肾脏中的归巢及存活……１６ ２．２．６荧光标记第三代人羊膜间充质干细胞在小鼠脑部中的归巢及存活……１７２．３荧光标记第三代人羊膜间充质干细胞在小鼠体内的归巢及存活…．．１７３．讨论．．．………………．．…．．…．．．．…．．．．．．．．１８第三部分：第三代羊膜间充质干细胞静脉移植在阿尔茨海默病转基因鼠脑部的治疗机制…………………………………２０ 前言…………．．…………．……………．……．２０ 刖舌…………．．…………．……………．……．２０ １．材料与方法．……………．…．．…．……………．２０１．１第三代人羊膜间充质干细胞的收集………………………．．２０ １．２主要试剂……………………………………………２１ １．３实验动物……………………………………………２１ １．４人羊膜间充质干细胞的Ｂｒｄｕ标记…………………………２ｌ １．５动物分组及尾静脉移植…………………………………２１１．５．１动物分组………………………………………………２１ １．５．２人羊膜间充质干细胞的移植：………………………………２１１．６细胞迁移观察………………………………………．．２１ １．７脑组织中ＧＦＡＰ、Ｎｅｓｔｉｎ和ＮＳＥ表达的检测…………………．２２ １．８统计学处理…………………………………………．２２２．结果…．．…．．…．．．．．．．．…．．．．．…．…．…．．…．．２２２．１人羊膜间充质干细胞的Ｂｒｄｕ标记鉴定……………………．．２２ ２．２脑组织形态学表现……………………………………．２３ＶⅡ目录２．３脑组织中ＧＦＡＰ表达检测………………………………．．２３ ２．４脑组织中Ｎｅｓｔｉｎ表达检测………………………………２４ ２．５脑组织中ＮＳＥ表达检测…………………………………２５３．讨论．．………．…．．…．．．．…．．．．．．………．．…２７ 小结……．…．．………．……………．…．．．．．．．．３０ 参考文献………．．．．…………．．．．．．．．…………．．３ｌ 综述．．．．．………………．．…．．．．．．．…．………．．３５ 阿尔茨海默病现状及治疗的研究进展．．．．．………．．．…．．．３５ １．药物疗法．…．……………………．．．…．…．．．．．３６１．１抗６淀粉样蛋白（ＡＢ）类药物…………………………．．３６１．２胆碱能抑制剂类药物（ＣＨＥＩ）……………………………３７ １．３抗氧化类药物………………………………………．．３７７１．４抗炎症类药物………………………………………．．３８ １．５脑代谢激活剂类药物…………………………………．．３８ １．６中国中医药复方类药物………………………．．．………３９２．基因疗法（ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ）．………………………４０ｖｉｖｏ）………………………………．．４ｌ２．１间接体内法（ｅｘ ２．２体内法（ｉｎｖｉｖｏ）……………………………………４２３．干细胞疗法．…．………．…………．．．．．………．４３３．１神经干细胞（ＮＳＣｓ）…………………………………．．４３３．２骨髓间充质干细胞（ＢＭＳＣｓ）………………………………４５３．３脐血间充质干细胞（ＨＵＣＢＣｓ）……………………………４５ ３．４脂肪间充质干细胞（ＡＤＳＣｓ）……………………………．４６ ３．５羊膜间充质干细胞（ＡＭＳＣｓ）………………………………４７４．展望…………………．……………………４７ 参考文献．．……．……．……．．．…………．．……．．４９ 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果．．…．．．．．…．５５ⅧＩＸ附表附表Ａ实验主要试剂ＤＩ＾ＥＭ／Ｆ１２培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ） 无支原体胎牛血清（ＦＢＳ） 外用人碱性成纤维细胞生长因子 胰蛋白酶（Ｈｙｃｌｏｎｅ） 胶原酶ＩＶ（１００ｍｇ） 生理盐水（氯化钠注射液） ＰＢＳ磷酸盐缓冲液 台盼兰 ＤＩＯ（细胞膜绿色荧光探针） ９５％医用酒精 新吉尔灭消毒液 安捷８４消毒液 ＳＰ免疫组化染色试剂盒赛默飞世尔生物化学制品有限公司 杭州四季青生物工程材料研究所 北京双鹭药业股份有限公司 赛默飞世尔生物化学制品有限公司Ｇｉｂｃｏ公司郑州永和制药有限公司 北京中杉金桥生物技术有限公司 上海化学试剂分装厂 碧云天生物技术研究所 新乡市三伟消毒制剂有限公司 山东利尔康消毒科技有限公司 山东德卅Ｉ安捷高科消毒制品有限公司 北京中杉金桥生物技术有限公司鼠抗人巢蛋白单克隆抗体（Ｎｅｓｔｉｎ） 北京中杉金桥生物技术有限公司 兔抗人胶质纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ） 多克隆抗体 鼠抗人神经元特异性烯醇化酶 （ＮＳＥ）单克隆抗体ＤＡＢ显色剂北京中杉金桥生物技术有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司 北京中杉金桥生物技术有限公司 北京中杉金桥生物技术有限公司 北京天泽基因科技有限公司 洛阳市化学试剂厂 天津市富宇精细化工有限公司 上海山浦化工有限公司苏木素染液 水溶性封片剂 青链霉素溶液（１００×）二甲苯无水乙醇 多聚甲醛附表附表Ｂ实验主要仪器ＳＺ－９３自动双重纯水蒸馏其器 手提式不锈钢蒸汽消毒器ＹＸ２８０Ｂ 干燥箱 电子天平ＨＺＴ－Ａ２００ 超净工作台 上海亚荣生化仪器厂 上海三申医疗器械有限公司 ＧＺＸ―ＧＦ一２型，上海跃进医疗器械厂 福州华志科学仪器有限公司 ｓｗ－ｃｊ―Ｆ１型，苏净集团苏州安泰空气技 术公司 ５０ｕｌ，２００ｕｌ，１０００ｕｌ移液器 低速离心机ＬＤ４―２型 倒置光学显微镜 ＣＯｓ培养箱ＣＰ－ＳＴ２００Ａ 高速离心机ＴＧＬ－１６Ｇ 电热恒温烤箱ＤＨ一５００型 容声低温冰箱Ｍｅｉｄｅａ电磁炉Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ北京离心机厂 ＯＹＬＭＰＵＳ，ＣＫＸ４１ＳＦ型，日本 长沙长锦科技有限公司 上海安亭科学仪器厂 北京中兴伟业仪器有限公司 广东容声电器股份有限公司 广东美的生活电器制造有限公司 上海医疗器械（集团）有限公司手术器械ｒ台式低速离心机８０－２恒温冰冻切片机ＳＹＤ－Ｋ２０３０ 荧光显微镜 普通光学显微镜ＺｏｏＭ 保湿盒 徕卡石蜡切片机 数码相机 一次性注射器 一次性橡胶手套 一次性滤器（０．２２ｕｍ） 不锈钢手术剪、镊子、筛网２０００沈阳誉德电子仪器有限公司 苏州欧卡精密光学仪器有限公司Ｌｅｉｃａ公司协力塑料制品厂Ｌｅｉｃａ公司ＯＹＬＭＰＵＳ，日本 河南圣光集团医用制品有限公司 新乡市亚太医疗用品有限公司 北京仪和方圆科技有限公司 郑州市售２英文缩略词９英文缩略词英文缩写 英文全称 ［１－ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎＡｌｚｈｅｉｍｃｒ ｄｉｓｅａｓｅ‘‘ Ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ中文名称 Ｂ一淀粉样蛋白 阿尔茨海默病 脂肪间充质干细胞 羊膜间充质干细胞邱ＡＤＡＤＳＣｓＡＭＳＣｓ锄ｎｉｏｎ ｍｃｍｂｒａｎｃｅ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ ａＮＳＣＡＰＰ ＢＢＢ ＢＤＮＦａｄｕｌｔ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ成体神经干细胞 淀粉样前体蛋白 血脑屏障ｆａｃｔｏｒＡｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｂｏｎｅ ｍａｌＴｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ脑源性神经营养因子 碱性成纤维细胞生长因子ｂＦＧＦＢＭＳＣｓＥＤＴＡ ＥＳＣ ＦＢＳ ＦＦｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ骨髓间充质干细胞 乙二胺四乙酸 胚胎干细胞胎牛血清。Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａｅｍｂｒｖｏｍｃａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄｓｔｅｍ ｃｅｌｌｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍＨＵＣＢＣ―ｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃ―ａｌＧＦＡＰｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｆｉｍｂｒｉａｆｏｍｉｘ ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎ穹窿海马伞 胶质纤维酸性蛋白 人脐血间充质干细胞ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ．ｍ．．．．ｏ．．．．ｎ．．．ｏ．．．ｎ．．．ｕ．．．ｃ．．．１．ｅ．．．ａ．．．ｒ．．．ｃ．．．ｅ．．．１．１．．ｓ．ＭＳＣｓｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅｓｅｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ间充质干细胞 神经原纤维缠结 神经生长因子 神经干细胞 神经元特异性烯醇化酶 神经营养因子 磷酸盐缓冲液 老年斑ｍ．ＮＧＦ ＮＳＣｓ ＮＳＥ ＮＴ ＰＢＳ ＳＰｆａｃｔｏｒｃｅｌｌｎｅｌｆｆａｌｎｅｕｒｏｎｅｓｔｅｍｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｏｌａｓｅｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ Ｓｅｎｉｌｅ ｐｌａｑｕｅ３
阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ ｄｉｓｅａｓｅ ＡＤ），俗称老年性痴呆（ｓｅｎｉｌｅｄｅｍｅｎｔｉａ），是一种中枢神经系统原发性退行性变性疾病。阿尔兹海默病通常临床上表现为 进行性痴呆、神经精神异常，记忆减退、认知功能、语言功能障碍及人格的改 变等；病理表现有：大脑皮质广泛性萎缩，出现大量的老年斑（ｓｅｎｉｌｅ ｐｌａｑｕｅｓ，ＳＰ），神经细胞内神经纤维缠结（ｎｅｕｒｏｆｉｂｆｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ，ＮＦａ３，神经炎斑 和空泡颗粒的退行性变化；生化上主要表现为大脑皮质神经元丢失，引发皮质 动脉和小动脉的血管淀粉样变性。 发现至今，研究者一直没有停止对阿尔茨海默病的病因和发病机理的研究。 普遍认为年龄是诱发ＡＤ的最主要危险因素。随着人口老龄化进程的加速、社会 家庭结构的改变，社会老龄化步伐日益加快，ＡＤ的发病率也逐年上升。据ｗＨＯ（世 卫组织）估计，目前全球每７秒钟就新增一名ＡＤ患者，预计到２０５０年全球ＡＤ患者 将会过亿。按照这一速度计算，在４０年后，全球每８５个人中就将有１个人患上老 年痴呆症。由此可见，随着世界人口老龄化的日益严重，这一老年性疾病将在 未来给世界带来越来越沉重的负担。可以说，如果我们能在预防或治疗阿尔茨 海默氏症上取得哪怕一点进展，也将对全球公共健康以及全球经济产生非常重 要的影响。 迄今，人类认知并研究阿尔茨海默氏症已经长达１００多年的时间，但对于 这一疾病的治疗至今还没有突破性的进展。传统的药物治疗存在着有药物依赖 性、毒副作用大，且通常治标不治本，容易复发等弊病；前些年兴起的基因疗 法可以有针对性的靶向治疗，但是存在着操作技术复杂，容易引发致死感染， 不容易普及推广的缺点；最近随着细胞工程的迅速发展，干细胞移植治疗中枢 神经系统疾病为治疗ＡＤ开辟了新天地。目前，普遍采用的神经干细胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＮＳＣｓ）脑室局部注射治疗阿尔茨海默病动物模型的体内实验早已获得成功， 技术也日趋完善。随之兴起的骨髓间质干细胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）脑室移植治疗阿尔茨海默病动物模型也取得令人兴奋的结果。 可以说采用神经干细胞（ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ，ＮＳＣｓ）和骨髓间质干细胞移植治疗阿尔茨海默病是阿尔茨海默病治疗史上的一大突破。但是神经干细胞主要由胚胎组 织细胞培养分化而来，存在伦理道德束缚；而骨髓间质干细胞需要供体，且会４引言对供体造成创伤，实用性受限；并且通常采用的是脑室局部移植，需要手术， 精密仪器、术后护理等程序，操作复杂，不容易临床普及。因此，寻求一种新 的干细胞移植方法，以及一种来源充分，易于取材，没有伦理道德束缚的新型 干细胞材料显得意义非凡。人羊膜间充质干细胞是近些年分离培养的多潜能干 细胞。研究发现人羊膜间充质干细胞免疫表型与骨髓间充质干细胞相似，但比 骨髓间质充干细胞具有更强的增殖分化能力。另外，羊膜属于医疗废弃物，来 源广泛，取材方便，且不存在太多的伦理道德问题。这都预示人羊膜间充质干 细胞将会成为移植治疗阿尔茨海默病的最佳选择。 本课题组既往已经在体外成功分离培养人羊膜间充质干细胞，发现人羊膜 问充质干细胞可诱导表达神经元的特异性标志ＮＳＥ以及Ｎｅｓｔｉｎｎｌ。近年来本课题 组对该细胞的生物学特性深入的研究，进行了急性脑损伤以及急性脊髓损伤的 移植治疗实验研究，发现该细胞能促进神经功能的恢复呐３。本课题组近期又发 现人羊膜间充质干细胞尾静脉移植可明显改善阿尔茨海默病小鼠的学习，记忆 能力，未见致死致瘤现象发生，心、肝、肾功能未受影响，安全可行陆一１。基于 本课题组这一系列令人欣喜的研究结果，本实验将进一步深入探索人第三代羊 膜间充质干细胞静脉移植在阿尔茨海默氏症转基因鼠体内的迁移及生存命运以 及在脑部的归巢和疾病治疗机制。５第一部分：人羊膜间充质干细胞的体外分离培养第一部分：人羊膜间充质干细胞的体外分离培养．＾厶―Ｊ－刖吾近年来随着细胞生物学的飞速发展，以及大型精密仪器在生物学领域的广 泛应用，干细胞做为一种特殊的细胞，也日益得到研究者的青睐。干细胞所具 有的独特性，也使得他在临床医学上日益活跃。干细胞是一类未分化的细胞， 具有分化多潜能性，能分化成不同类型的细胞。近年来的大量研究表明，干细 胞体外培养不仅可以增殖、分化，而且在一定的外来刺激下，可以发生转分化， 由一种组织来源的干细胞分化成另一种不相关的组织功能细胞。例如造血干细 胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ）在一定外来刺激条件下可以分化为成熟的神经细胞；本实验室体外成功定向诱导人羊膜间充质干细胞表达ＮｅｓｔｉｎⅢ等。神经干细胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＮＳＣｓ）及其再生能力的研究发现，改变了传统认为神经细胞不能再生的观点，为神经修复的可行性奠定了基础呻１。 人羊膜间充质干细胞是一种具有独特优势的新型种子干细胞。本课题组既往 实验均表明人羊膜间充质干细胞体外诱导、体内移植都可以分化为神经类细胞， 对治疗创伤性的神经损伤有积极的疗效。为了进一步研究人羊膜间充质干细胞 的可能治疗机制，本实验部分重在分离培养出足够的第三代人羊膜间充质干细 胞，为后续实验作基础准备。１．材料与方法１．１羊膜标本来源郑州大学第一附属医院妇产科联系，健康足月剖腹产产妇志愿提供的新鲜 胎盘（１４ＣＶ、乙肝七项、梅毒、ＩＩＩＶ等其他相关传染性指标均呈阴性）ｎ１。１．２主要试剂配置ＰＢＳ缓冲液：一包装袋ＰＢＳ干粉溶于２Ｌ三蒸水，常温不停搅拌直至完全溶６第一部分：人羊膜间充质于细胞的体外分离培养解。分装保存。使用前高温高压蒸汽灭菌，待用。 胰蛋白酶：胰蛋白酶终浓度为０．２５％。用电子天平准确称取０．２５９粉剂溶入 ＩＯＯｍｌＰＢＳ液，缓慢搅拌，尽量避免泡沫出现，溶解完全后，４＂Ｃ放置过夜。在超 净台内用５０ｍｌ注射滤器通过Ｏ．２２Ｂｍ微孔滤膜过滤除菌。然后分装，－２０℃低温保存备用。使用前先放４℃溶解。 胶原酶Ⅳ：一支胶原酶ＩＶ（１００ｍｇ）溶于１０ｍｌ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基，用滴管充分 吹打混匀后，在超净台内用１０ｍｌ注射滤器通过０．２２ ｐ １１１微孔滤膜过滤除菌，然 后分装，一２０℃低温保存备用。使用前先放３７℃溶解。 人碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）：每瓶ｂＦＧＦ在超净工作台内加入５ｍｌ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基，用移液器充分吹打混匀，密封后放置４１２保存备用。１．３人羊膜间充质干细胞的体外分离培养参照文献ｎ一，在超净工作台内，无菌条件下，从健康足月剖腹产胎儿的胎 盘脐带面，尽可能取平整光滑的羊膜，用镊子钝性分离羊膜，约２０ｃｍＸ２０ｃｍ，置于培养皿中，无菌ＰＢＳ缓冲液中充分冲洗，洗去羊膜表面的血块及血丝。然 后将羊膜充分剪碎，剪成约ｌｃｍＸ ｌｃｍ块状。加入质量分数为０．２５％的胰蛋白酶， ３７＂Ｃ细胞培养箱中消化３０分钟，终止胰蛋白酶消化，弃去消化液，再加入终浓 度为１．０ ｇ／Ｌ胶原酶Ⅳ，在３７＂Ｃ细胞培养箱中消化１小时，分别过８０目，２００ 目灭过菌的不锈钢筛网，消化下来的细胞液转移到１５ｍｌ离心管，加入适当体积 的无菌ＰＢＳ缓冲液，用无菌滴管吹打混匀，１０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，重复３次， 最后收集细胞，台盼兰染色，计数活细胞，以２～５×１０５／ｍｌ的密度接种细胞到 ７５ｍｌ细胞培养瓶中，细胞培养瓶中补入含１０％的胎牛血清，终浓度为２０Ｉｌｇ／ＬｂＦＧＦ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液，混匀（图ｌａ）。最后将细胞培养瓶置于３７℃、体积分数为５％的饱和湿度ＣＯ：培养箱中培养。 换液：原代培养的细胞生长缓慢。培养４８ｈ后，更换培养液（图ｌｂ）。弃去 未贴壁的羊膜间充质干细胞和其他类型的羊膜中细胞，培养瓶中加入新鲜的含 １０％的胎牛血清，终浓度为２０Ｂｇ／ＬｂＦＧＦ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液。根据细胞生长情况，每３－－－４天换液一次（图ｌｃ）。 传代：待羊膜间充质干细胞生长达到融合铺满瓶底８０％～９０％时，开始传代。 在超净工作台内，倾去培养基，用灭菌ＰＢＳ缓冲液洗３次，加入含０．０２％ＥＤＴＡ７第一部分：人羊膜问充质干细胞的体外分离培养的体积分数为０．２５％的胰蛋白酶，超净工作台内消化３０－－－６０秒，消化过程中用 倒置显微镜观察细胞消化情况。待细胞大部分胞体回缩、开始隆起成球形时， 立即加少量血清终止消化。然后加适量无菌ＰＢＳ缓冲液，用吸管反复吹打均匀， 转入１５ｍｌ无菌离心管内，１０００ｒ／ｍｉｎ，离心５分钟，重复３次。倾去上清，再 加２ｍｌＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基，吹打均匀成单细胞悬液。按ｌ：３比例稀释后转到新培养瓶中继续培养，记为Ｐｌ代（图ｌｄ）。传代培养过程中根据细胞生长状况每３ｄ全量换液一次。贴壁细胞生长再次融合铺满瓶底８０％－－－９０％时（图ｌ ｅ），重复上 类推。图ａ原代培养２４ｈ细胞未贴壁图ｂ原代培养４８ｈ细胞贴壁图ｃ原代培养８ｄ细胞良好图ｄ细胞Ｐ１代开始贴壁图ｅ细胞Ｐ２代生长良好图ｆ细胞Ｐ３代铺满培养瓶底图１人羊膜间充质干细胞的体外培养１．４第三代人羊膜间充质干细胞的选择细胞传代至Ｐ３代，按照每孔２Ｘ １０３个细胞，在９６孔板内种植细胞，采用多 功能酶标仪测定细胞传代后培养细胞在第ｌｄ、３ｄ、５ｄ、７ｄ、９ｄ时每孔的ＯＤ值，然后以培养时间为横坐标，每孔的ＯＤ值为纵坐标，作出第三代人羊膜间充质干细胞的生长曲线图（图２）。 第三代人羊膜间充质干细胞传代后，贴壁生长再次融合铺满瓶底时，不再传８／ｌ≯－，；：?飞：：，’ｔ；辜／．≯：一’，第一部分：人羊膜间充质干细胞的体外分离培养代，倒置显微镜下镜检，选取那些细胞生长状态旺盛（图２），形态保持较好， 梭形明显的细胞（图１ｆ），胰蛋白酶消化后，离心，洗涤，收集备用。２．结果２．１人羊膜间充质干细胞原代细胞的体外分离采用本课题组ｎ一１体外分离获取人羊膜间充质干细胞的方法，每份胎盘标本 可以获取约（３～７．５）ｘ １０＇人羊膜间充质干细胞，分３个７５ｍｌ细胞培养瓶培养 （图ｌａ）。细胞４８ｈ内开始贴壁生长，但分布不均匀（图ｌｂ）。，广／∥、／／／‰…ｍ舶。，。如？。ｈ。‰‰．觇；＾诜。：ｔ？ｊ。挚一。一㈣＾孝。二。ｊ协。…举，。？，ｋ；旌图２第三代人羊膜间充质干细胞的生长曲线２．２人羊膜间充质干细胞体外增殖人羊膜间充质干细胞培养８ｄ左右，细胞在培养瓶底不均匀铺满（图ｌｃ）， 第１０ｄ左右开始按照１：３传代，记为Ｐ１代细胞（图ｌｄ）。以后细胞开始快速增 殖，从传代Ｐ１代到到细胞生长铺满瓶底，约需要７ｄ左右，然后仍然按照１：３ 传代，记Ｐ２代。传代７ｄ左右以后，细胞铺满培养瓶底（图ｌｅ）。２．３第三代人羊膜间充质干细胞的收集待传至Ｐ３代细胞，前７ｄ，细胞生长旺盛，呈级数增殖（图２），表明细胞 活力较强。待长满培养瓶底，倒置显微镜观察，大多数细胞呈梭形，保持良好 的细胞形态（图ｌｆ）。用含０．０２％ＥＤＴＡ的体积分数为０．２５％的胰蛋白酶消化，９第一部分：人羊膜间充质干细胞的体外分离培养离心收集第三代人羊膜问充质干细胞，台盼兰计数活细胞数。每个胎盘标本约 收集（６～７．２）Ｘ １０７第三代人羊膜间充质干细胞。３．讨论羊膜间充质干细胞位于人羊膜基底层下，附着在绒毛膜上的一层松软组织 的细胞。目前包括本课题组在内，常用的收集羊膜问充质干细胞的方法都是胰 蛋白酶一胶原酶消化法，各个实验室在具体操作流程上也有很大的不同，缺乏统 一标准化的分离流程。另外，一份羊膜标本实际分出的有效羊膜间充质干细胞 究竟能有多少也待进一步研究。有研究者分离出人羊膜间充质干细胞数可达 （６．７２±１．２１）×１０７（ｎ＝１２），细胞活力＞９０％ｎ们。这和本课题组有很大出入。因此 对于体外分离人羊膜间充质干细胞的方法流程还有待于进一步的探索研究。 长久以来，羊膜一直在伤口愈合、烧伤等治疗中用作皮肤覆盖物。近年来 发现，羊膜中含有一层间充质干细胞，可以表达神经胶质母细胞的表型ｎ１１，随 之开始对人羊膜问充质干细胞在治疗神经系统疾病方面的研究。人羊膜问充质 干细胞的表型特征与骨髓间充质干细胞相似，表达ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ７３、 ＣＤ９０及波形蛋白等标志ｎ羽．。本课题组已发现人羊膜间充质干细胞可诱导表达神 经元的特异性标志ＮＳＥⅢ，在前期体外成功定向诱导人羊膜问充质干细胞表达 Ｎｅｓｔｉｎｎｌ。这就更近一步提示我们可以用人羊膜间充质干细胞治疗神经系统疾 病，这首先需要分离培养人羊膜间充质干细胞。 本实验旨在培养、收集足够的第三代人羊膜间充质干细胞，为后续实验做 好充分的准备。１０．ｊ上－－■－Ｉ刖舌阿尔茨海默病的病因和发病机制比较复杂，至今尚未确切的结论。其主要 的病理变化是Ｍｅｙｎｅｒｔ基底前核胆碱能神经元的损伤和丢失ｎ射，神经元细胞外有 大量老年斑沉积，神经细胞内有神经纤维缠结，神经元之间的联系受阻，从而 导致痴呆。利用干细胞体外诱导具有分化成神经细胞潜能的特点，研究如何用 外源性或者自体性的干细胞替代变性或丢失的胆碱能神经元，达到治疗阿尔茨 海默病疾病，成为近年阿尔茨海默病治疗的研究热点。邬伟等ｎ铂利用骨髓间充 质干细胞治疗阿尔茨海默病鼠的研究表明，阿尔茨海默病鼠注射骨髓间充质干 细胞后可以明显改善其空间学习和记忆能力。李义召等Ⅱ朝采用阿尔茨海默病患 者自体骨髓间充质干细胞移植治疗阿尔茨海默病患者自身发现，疗效显著，不 良反应少。利用神经干细胞治疗阿尔茨海默病更是表明，可以明显改善阿尔茨 海默病鼠的学习记忆能力，对缓解或恢复脑损伤具有明显疗效ｎ６’１７１。可以说不同 来源的干细胞在治疗阿尔茨海默病疾病上所显示出的独特疗效，必将促使其得 到研究者的日益青睐。 本课题组近期又发现人羊膜间充质干细胞尾静脉移植可明显改善阿尔茨海 默病小鼠的学习，记忆能力，未见致死致瘤现象发生，心、肝、肾功能未受影 响，安全可行口’８１。但是人羊膜间充质干细胞尾静脉移植后，在宿主体内的迁移 情况以及存活时间尚不清楚。本实验重在确定人羊膜间充质干细胞尾静脉移植 后，在小鼠体内的迁移归巢以及存活情况；并进一步探讨人羊膜间充质干细胞 尾静脉移植后能否通过转基因阿尔茨海默病小鼠的血脑屏障（ｂｌｏｏｄｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒ。ＢＢＢ），进入小鼠的脑组织，如果能够归巢脑组织，在脑组织中存活的时 间等。第二部分：第三代人羊膜间充质干细胞静脉移植在转基因阿尔茨海默病小鼠体内的迁移１．材料与方法１．１第三代人羊膜问充质干细胞．本实验采用第一部分体外培养增殖收集的第三代人羊膜间充质干细胞。移植 一共所需人羊膜间充质干细胞数为２ Ｘ１０７。１．２实验动物、．本实验采用清洁级Ｃ５７ＢＬ／６系ＡＰＰ转基因鼠。种鼠由郑州大学药物实验中 心李国栋老师惠赠，合笼繁殖，后代采用ＰＣＲ技术鉴定阳性。本实验共使用２５只ＡＰＰ＋鼠。实验方案经郑州大学生命伦理委员会审查批准。实验过程中对动物的处置 符合２００６年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。１．３第三代人羊膜间充质干细胞荧光标记将人羊膜间充质干细胞培养至第三代后用含０．０２％ＥＤＴＡ的体积分数为 ０．２５％的胰蛋白酶消化，离心收集细胞，台盼兰计数活细胞数。调整细胞液终浓 度为ｌ×１０６个／ｍｌ的单细胞悬液。然后在避光的条件下，按照每毫升细胞悬液加 入１０微升荧光标记液的比例，对收集的细胞悬液进行荧光标记。加入荧光标记 液的细胞悬液置于３７＂Ｃ细胞培养箱中１０－－一２０分钟，取出细胞液，加入无菌生理 盐水，１０００ｒ／ｍｉｎ，离心５分钟，重复３次，洗去未标记到细胞上的荧光标记 液。倾去上清，加入荧光标记Ｉｉ｛『体积的生理盐水，吹打混匀细胞，制成单细胞 悬液，备用。１．４动物分组及尾静脉移植１．４．１动物分组：观察人羊膜间充质干细胞在阿尔茨海默病转基因小鼠体 内的归巢，实验随机动物分六组：每组４只。１．４．２静脉移植：静脉注射时，首先要将动物固定在固定器内或立体固定仪上。本实验采用自制简易固定器。取５０ｍｌ离心管，在离心管管底塞入３ｃｍ左１２第二部分：第三代人羊膜间充质干细胞静脉移植在转基因阿尔茨海默病小鼠体内的迁移右的脱脂棉、泡沫等填充物，管壁四周钻若干小孔，管盖正中间钻直径为３珊左右的孔。使用时，先将小鼠尾巴穿过离心管管盖中间小孔，使小鼠尾巴外露， 将小鼠尾巴向上装入５０ｍｌ离心管，旋紧离心管盖，然后将小鼠尾巴拉直绷紧。 用７５％酒精擦拭小鼠尾巴几分钟，或者用温水浸泡数分钟，使小鼠尾巴静脉血管 扩张，鼠尾表皮角质软化，有利于注射。选取鼠尾两侧的静脉血管（上下两条 为动脉血管），采用一次性胰岛素注射器吸取０．５ｍ１细胞悬液进行注射，注射速 度要平缓，注射时间不低于１分钟，注射后用酒精棉球按压注射部位数秒，并观察小鼠有无不良反应。每注射争５只小鼠，更换新的一次性胰岛素注射器。移植组和正常组每只小鼠尾静脉注射量为０．５ｍｌ的细胞悬液。对照组注射等量 生理盐水。１．５第三代人羊膜间充质千细胞移植后不同时间点的标本采集采用尾静脉移植处理各实验组小鼠后，分别在１ｄ、２ｄ、３ｄ、７ｄ、ｌＯｄ、１４ｄ 的时候，每组小鼠各取４只，腹腔注射１０％水合氯醛０．７ｍｌ，待小鼠麻醉成功后， 取小鼠仰卧位，四肢固定，打开小鼠胸腔，用剪刀剪开小鼠的心包膜，用眼科 镊夹着心尖小心提起，暴露小鼠心脏动脉，用输液器针头小心穿过小鼠心脏， 并延伸进入心脏动脉，用手术缝合线扎紧，然后在小鼠心脏上剪口，用含有肝 素的生理盐水进行灌注（如图３所示）。灌注结束后，分取各实验鼠脑组织，一２０ ℃避光保存。ｌ、。图３小鼠心脏灌注１３。蔓：ｊｏｉ、一一二：?’。：一．～：？’ｔ第二部分：第三代人羊膜间充质干细胞静脉移植在转基因阿尔茨海默病小鼠体内的迁移１．６第三代人羊膜间充质干细胞移植后在小鼠体内迁移第三代人羊膜间充质干细胞尾静脉移植到小鼠体内后，分别于ｌｄ、２ｄ、３ｄ、 ７ｄ、１０ｄ、１４ｄ这六个时间点取出小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及脑组 织，做连续冰冻切片，然后用荧光显微镜观察细胞移植后不同时间在这些脏器 中的归巢以及存活状况。、２．结果２．１实验动物数量分析本实验动物分五组共２５只。注射细胞时，可能因为技术不熟练，注射速度 过快，或者细胞没有充分混匀打散，注射后立即死亡１只，弃去死亡小鼠。其 他小鼠在实验各个时间点均未出现感染，致死等现象，小鼠康状况良好。全部 纳入实验分析。２．２荧光标记第三代人羊膜间充质千细胞在小鼠体内的归巢检测转基因Ａｐｐ＋小鼠尾静脉移植荧光标记的人第三代羊膜间充质干细胞后，不 同时间点取出的小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及脑组织进行连续冰冻切 片，切片厚度为１５ｕｒｎ，荧光显微镜观察。２．２．１荧光标记第三代人羊膜间充质干细胞在小鼠心脏中的归巢及存活图ａ（Ｉｄ）图ｂ（２ｄ）图ｃ（３ｄ）１４”．，＾～‘。＿二．．ｊ、．？‘ｋ一，’｝！ｊ；ｊｉｊ－．＝‘ｒ＋－．．１’ｆ｝ｒ、：’：ｔｏ‘耳！?专Ｗ≯！７｝！！：’：？‘ｏ≯７：，ｆ、￡：?ｊ，ｌ’’二一。，ｔ＾－‘．第二部分：第三代人羊膜间充质干细胞静脉移植在转基因阿尔茨海默病小鼠体内的迁奄生图ｄ（７ｄ）图ｅ（１０ｄ）图ｆ（１４ｄ）２．２．２荧光标记第三代入羊膜间充质干细胞在小鼠肝脏中的归巢及存活图ａ（１ｄ）图ｂ（２ｄ）图ｃ（３ｄ）图ｄ（７ｄ）图ｅ（１０ｄ）图ｆ（１４ｄ）２．２．３荧光标记第三代入羊膜间充质干细胞在小鼠脾脏中的归巢及存活图ａ（１ｄ）图ｂ（２ｄ）图ｃ（３ｄ）１５壬。？．：；＝ｆ，＾Ⅵ、～；…’。。‘…”÷”≈。‘．ｆ－?．‘ｊ？’。＋’“，｝｛。’ｊ：，每～，０第二部分：第三代人羊膜间充质干细胞静脉移植在转基因阿尔茨海默病小鼠体内的迁移一图ｄ（７ｄ）图ｅ（１０ｄ）图ｆ（１４ｄ）２．２．４荧光标记第三代人羊膜间充质干细胞在小鼠肺脏中的归巢及存活图ａ（１ｄ）图ｂ（２ｄ）图ｃ（３ｄ）图ｄ（７ｄ）图ｅ（１０ｄ）图ｆ（１４ｄ）２．２．５荧光标记第三代人羊膜间充质干细胞在小鼠肾脏中的归巢及存活图ａ Ｏｄ）图ｂ（２ｄ）１６图Ｃ（３ｄ）～、 ～ｆ＿第二部分：第三代人羊膜间充质干细胞静脉移植在转基因阿尔茨海默病小鼠体内的迁移图ｄ（７ｄ）．图ｅ（１０ｄ）图ｆ（１４ｄ）２．２．６荧光标记第三代人羊膜间充质干细胞在小鼠脑部中的归巢及存活图ａ（１ｄ）图ｂ（２ｄ）图ｃ（３ｄ）图ｅ（１０ｄ）图ｆ（１４ｄ）图４ ｈＭＳＣｓ移植后不同时间点小鼠脑组织中荧光标记细胞检测（×２００）２．３荧光标记第三代人羊膜间充质干细胞在小鼠体内的归巢及存活由荧光显微镜镜检图片分析可知，在所有的检测时间点，小鼠的心脏和肾 脏中均未检测到荧光标记的人羊膜间充质干细胞存活；而各个时间点，在小鼠 的肝脏、脾脏、肺脏、及脑组织中都发现有绿色荧光标记的移植细胞存在。其中：在肺脏中荧光标记细胞数量较多，随时间变化不明显；在肝脏和脑组织中荧光标记细胞随着时间延长呈现先增加后减少的趋势。，ｊ＾■＿矗，，ｒ麓｛．惫，’．？’．Ⅵ，！ｊ ’．～。：．‘?‘ｊｔ’一！’、’：’：卜ｉ．．｛ｏ二．专，’，、ｖ?，．．‘‘’：．’ｉ一。．■’、ｔ一：ｔ 、、●，第二部分：第三代人羊膜间充质干细胞静脉移植在转基因阿尔茨海默病小鼠体内的迁移人第三代羊膜间充质干细胞移植后第１ｄ、２ｄ，迁移到小鼠脑组织中的荧光 标记细胞较少，主要分布在血管周围（图４ａ、ｂ）；随着时间延长，大部分荧光 标记细胞开始向小鼠脑髓质区域弥散迁移，并且有部分细胞迁移到海马区及附近区域（图４ｃ、ｄ）；人羊膜间充质干细胞移植一周以后，在各实验小鼠脑组织中仍可检测到绿色荧光标记的人第三代羊膜间充质干细胞存在，但此时的细胞 不再聚集在血管周围，细胞的数量也相对减少了，细胞呈不均匀弥散分布在小 鼠脑组织髓质区域，在皮质区域也会检测到零星细胞的存在（图４ｅ，ｆ）。在荧光 标记的人第三代羊膜间充质干细胞移植后的第卜１４天，各实验小鼠生长发育良 好，体重未见明显减少，未见发狂、发热、竖毛等任何异常行为。并且显微镜 下检测也未见任何致瘤现象出现。３．讨论本实验表明，第三代人羊膜间充质干细胞经尾静脉注射移植到转基因阿尔 茨海默病小鼠体内后，细胞不能迁移Ｎｄ，鼠的心脏和肾脏存活；细胞在不同时 间可以迁移到小鼠的肝脏、脾脏、肺脏以及脑组织中并存活。这提示我们可能 用采用干细胞移植来治疗肝脏、脾脏、肺脏以及脑部的某些疾病。本课题着重 探讨人羊膜间充质干细胞移植后，在小鼠脑组织中的迁移归巢状况。 传统研究认为，人及其他任何动物都存在一个血脑屏障（ｂｌｏｏｄｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒ，ＢＢＢ）系统，外源性的药物及细胞很难通过该屏障系统进入脑组织中 对中枢神经系统发挥治疗作用。近年来，许多国内外研究者ｕｐ２２１认为，外周血中 骨髓来源的造血、神经干细胞等都可以透过血脑屏障，进入中枢神经系统。国 外学者已经发现，阿尔茨海默病患者脑组织中血脑屏障不完整晗３１，中枢神经系 统的损伤，神经元细胞的丢失，神经纤维缠结，以及Ａ ｔ３一淀粉样蛋白沉淀的形 成脑部病变等，都可以破坏血脑屏障的完整性，致使白细胞穿过血脑屏障进入脑组织，进一步加深对血脑屏障的破坏乜制。本实验采用绿色荧光标记第三代人羊膜间充质干细胞，尾静脉注射移植入ＡＰＰ＋转基因小鼠体内，最初移植细胞聚 集在脑组织血管周围向脑组织弥散迁移，随着时间变化，以可以发现有大量绿 色荧光标记的细胞迁移Ｎｄ，鼠脑组织髓质区域，并会迁移Ｎｄ，鼠脑组织海马区 部位。在移植两周后观察，仍可在小鼠脑组织中发现存活的绿色荧光标记细胞。 而采用正常的小鼠重复本实验操作时，在任何时间小鼠脑组织中几乎都检测不１８第二部分：第三代人羊膜间充质干细胞静脉移植在转基因阿尔茨海默病小鼠体内的迁移到绿色荧光标记细胞，这表明正常小鼠的脑组织结构中可能因为血脑屏障比较 完整，或者正常脑组织对于外源性细胞的免疫排斥更强，细胞不能通过。 本实验结果表明，绿色荧光标记第三代人羊膜间充质干细胞尾静脉注射， 在阿尔茨海默病转基因小鼠体内可以顺利通过血脑屏障，到达小鼠的脑组织内， 并可迁移到病灶部位。这就提示可以采用尾静脉注射的移植干细胞方法对中枢 神经系统疾病进行治疗。本实验重在为第三代人羊膜间充质干细胞尾静脉移植 治疗阿尔茨海默病转基因鼠，对于人羊膜间充质干细胞如何迁移到小鼠脑组织 的可能机制没有涉及，这也是本实验有待进一步完善的地方。１９第三部分：第三代羊膜间充质干细胞静脉移第三部分：第三代羊膜间充质 病转基因鼠脑．▲厶?ＪＬ?刖罱阿尔茨海默病（ＡＤ）是一种神经变性疾病，主要侵犯大脑皮质神经元，是 老年期痴呆的主要类型。由于人类老龄化的日趋严重和目前疗法的不确定性， 寻求能够改善和治疗ＡＤ患者症状的疗法迫在眉睫。近年来，干细胞所具有的独 特性质及在难治性疾病上的治疗效果为其带来新的契机。 作为神经系统疾病细胞治疗的供体细胞应容易获得，能够迅速扩增，可在 宿主脑内长期存活，易于外源基因的转染和长期表达口副。其中人羊膜间充质干 细胞是很好的来源之一。Ｉｎ’ｔ Ａｎｋｅｒ等啮１从羊膜培养出间充质干细胞，经免疫 表型鉴定与骨髓来源的间充质干细胞相似，且其比骨髓来源的间充质于细胞具 有更强的扩增能力。本实验室于２００６年成功分离培养了人羊膜间充质干细胞并 进行了定向诱导为神经元的体外研究ｎ１。近期发现人羊膜间充质干细胞尾静脉 移植可明显改善阿尔茨海默病小鼠的学习，记忆能力，未见致死致瘤现象发生， 心、肝、肾功能未受影响，安全可行口’８１。但静脉途径移植人羊膜间充质干细胞归巢Ｎｄ，鼠脑组织后，细胞命运以及如何治疗ＡＤ疾病的机制尚不清楚。因此在前期研究的基础上利用Ｂｒｄｕ标记的人羊膜间充质干细胞经 尾静脉移植到转基因ＡＰＰ＋ｄ、鼠３１ｄ，通过观察细胞的迁移，检测其生存及向神 经细胞的分化，并与神经功能的恢复的一致性进行分析，从而明确静脉移植归 巢后的细胞分化，以及发挥治疗作用的可能机制，进而探究移植途径治疗ＡＤ的 疗效和意义。１．材料与方法１．１第三代人羊膜间充质干细胞的收集本实验采用第一部分体外培养增殖收集的第三代人羊膜间充质干细胞。移 植一共所需人羊膜间充质干细胞数为２×１０７个。２０第三部分：第三代羊膜间充质干细胞静脉移植在阿尔茨海默病转基因鼠脑部的治疗机制１．２主要试剂蹦ＥＭ／Ｆ１２培养基；胎牛血清；碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦ６Ｆ）；胰蛋白酶； 胶原酶ＩＶ；ＰＢＳ干粉；ＳＰ通用检测试剂盒；兔抗人胶质纤维蛋白（ＧＦＡＰ）多克 隆抗体，鼠抗人巢蛋白（Ｎｅｓｔｉｎ）单克隆抗体，鼠抗人神经元特异性烯醇化酶 （ＮＳＥ）单克隆抗体等。１．３实验动物本实验采用清洁级Ｃ５７ＢＬ／６系ＡＰＰ转基因鼠。由郑州大学药物实验中心李 国栋老师惠赠，合笼繁殖，后代采用ＰＣＲ技术鉴定阳性。本实验共使用雄性３６ 只ＡＰＰ＋鼠，其中转ＡＰＰ一基因小鼠１１只，转Ａｐｐ＋基因小鼠２５只。实验方案经郑 州大学生命伦理委员会审查批准。实验过程中对动物的处置符合２００６年科技部 《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。１．４人羊膜间充质干细胞的Ｂｒｄｕ标记取第三代羊膜间充质干细胞，以含ｌＯｕｍｏｌ／１ ５一溴脱氧尿嘧啶（Ｂｒｄｕ）的培 养液孵育４８ｈ后，用２．５ｍｇ／ｍｌ胰酶消化、离心、收集细胞，备用。１．５动物分组及尾静脉移植１．５．１动物分组：成年的各小鼠体质量在２３～２７９时，转基因ＡＰＰ一小鼠１１只，作为正常组；转基因ＡＰＰ＋２５只小鼠，随机分成两大组：对照组和移植组。其中 对照组１０只，移植组１５只。１．５．２人羊膜间充质干细胞的移植：转基因ＡＰＰ＋小鼠移植Ｂｒｄｕ标记的第三代人羊膜间充质干细胞。用ｌｍｌ胰岛素用注射器猫取细胞悬液（浓度为ｌ×１０６个／ｍ１）０．５ ｍｌ经尾静脉缓慢注入小鼠体内。对照组经尾静脉注射同等体积的生理盐水。正常组不做处理。１．６细胞迁移观察对移植后７２ｈ处死的移植组、对照组以及正常组小鼠的脑组织切片，并进２ｌ第三部分：第三代羊膜间充质干细胞静脉移植在阿尔茨海默病转基因鼠脑部的治疗机制行免疫组化染色，观察移植组小鼠体内Ｂｒｄｕ标记的第三代人羊膜间充质干细胞在脑组织中的迁移情况。１．７脑组织中ＧＦＡＰ、Ｎｅｓｔ ｉ ｎ和ＮＳＥ表达的检测对移植后３１ｄ处死的正常组、移植组和对照组小鼠的脑组织石蜡切片，并 进行免疫组化染色，具体操作按照试剂盒说明书进行，鉴定检测ＧＦＡＰ、Ｎｅｓｔｉｎ 和ＮＳＥ的表达情况。每张切片选取５个不同视野，采用Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ 像分析系统进行定量分析，计算阳性区面积百分比。Ｐｌｕｓ６．０图１．８统计学处理采用ＳＰＳＳｌ３．０处理数据，计量资料数据采用Ｘ±ｓ表示，两样本均数比较 采用ｔ检验，检验水准Ｑ＝０．０５２．结果２．１人羊膜间充质干细胞的Ｂｒｄｕ标记鉴定光镜下检测结果，可见，移植组小鼠脑组织中大部分细胞核被染成蓝色， 但有一些细胞核被染成棕色或褐色，Ｂｒｄｕ呈阳性，表明有Ｂｒｄｕ标记的第三代人 羊膜间充质干细胞迁移进入小鼠的脑组织中（图５）。图５Ｂｒｄｕ标记第三代人羊膜问充质干细胞在小鼠脑组织中表达（Ｘ ２００）一Ｉ 二？ｉ委“ｔｏｙ，ｒ÷？。疆，“．二?｛０ｒ｛’，４釜ｌ≥：二：＼寸，．、．．、¨ｊｉ，一’，’ｒ：’≯霉‘卞ｌ／，ｆ』．．ｉ、Ｃ１１ ：ｃ．ｉ｝，；?ｆ。ｊ‘：ｉｉ；：：，ｊ．‘＿’．．ｂ‘。：；’鼍；｛ｊ？？…专ｉ！‘，ｌ－：ｒ。。。一，ｉ第三部分：第三代羊膜间充质干细胞静脉移植在阿尔茨海默病转基因鼠脑部的治疗机制２．２脑组织形态学表现光镜下可见，正常组脑组织中，染成蓝色的细胞核较多，且有典型的结构 （图６ Ａ）；对照组脑组织中，染成蓝色的细胞核较少，部分细胞核固缩（图６ Ｂ）； 移植组脑组织中，相对于对照组，蓝色的细胞核明显增多（图６Ｃ）。Ａ图正常组Ｂ图对照组 图６脑组织形态学结果（ＨＥ，×４００）Ｃ图移植组２．３脑组织中ＧＦＡＰ表达检测光镜下观察结果，以棕色或褐色的星形细胞为阳性细胞，其他为阴性细胞。 可见，在对照组小鼠脑组织中，ＧＦＡＰ表达量很少，甚至不表达，表达主要分布在 海马区及其两侧（图７Ａ）。但是在大脑的髓质区只有零星表达，甚至不表达（图 ７Ｄ）。在移植组小鼠脑组织中ＧＦＡＰ表达也是以海马区及其两侧较多（图７Ｂ），同时在大脑髓质区也有一定的表达（图７Ｅ）。而在正常组小鼠脑组织中ＧＦＡＰ表达以海马区及其两侧较多，且显著高于对照组和移植组（图７Ｃ），在髓质区却和对 照组一样只有微量表达或者不表达（图７Ｆ）。采用Ｉｍａｇｅ―ＰｒｏＰｌｕｓ６．０图像分析系统进行定量分析，计算阳性面积百分比（表１，图８）。ＧＦＡＰ在正常脑组织 中表达最高可达８．４４％，但是在对照组保组织中最高仅２．８４％，移植组却达到了 ６．７０％，相比对照组的表达，提高了近２／３。图Ａ图Ｂ图Ｃ２３Ｉ亡？。，１。！．ｊ。１卜第三部分：第三代羊膜问充质干细胞静脉移植在阿尔茨海默病转基因鼠脑部的治疗机制图Ｄ 图７图Ｅ图ＦＧＦＡＰ在小鼠脑组织的表达Ｘ２００ Ａ图对照组小鼠脑组织海马区Ｂ图移植组小鼠 脑组织海马区：Ｃ图正常组小鼠脑组织中海马区；Ｄ图对照组小鼠脑组织中髓质区；Ｅ图 移植组小鼠脑组织中髓质区；Ｆ图正常组小鼠脑组织中髓质区 表１ ＧＦＡＰ各组小鼠脑组织中的阳性表达面积测定结果（ｘ±Ｓ，％）组别 正常组 对照组 移植组Ｐ＜０．０５ｎＧＦＡＰ（Ａｒｅａ％）７．８２±０．６２△ １．６７±０．１７▲ ６．２３±０．４７＊１０１０ １０注：移植组与对照组比较，宰Ｐ＜０．０５；移植组与正常组比较，△Ｐ＜Ｏ．０５；正常组与对照组比较▲ＧＦＡＰ在各实验组小鼠脑组织的阳性表达９曩毋黑８ ７ ６ ５ ４ ３ Ｚ ｌ Ｏ正常组对照组移植组组别图８ ＧＦＡＰ在各实验组小鼠脑组织中的阳性表达２．４脑组织中Ｎｅｓｔｉｎ表达检测光镜下观察结果，以胞浆染色棕色或褐色者为阳性细胞，其他为阴性细胞。 可见，移植组小鼠脑组织中Ｎｅｓｔｉｎ表达介乎于正常组小鼠和对照组小鼠之间， 具体表达为：正常组小鼠脑组织中Ｎｅｓｔｉｎ表达量最多，其次是移植组，最后是、２４：ｉ．；！．。』 、?王＿ｉｉｊ．。ｊｊ，ｊｔ≮－？‘！曼．！÷ｉ》；．，、，第三部分：第三代羊膜间充质干细胞静脉移植在阿尔茨海默病转基因鼠脑部的治疗机制对照组（图９）。采用Ｉｍａｇｅ―ＰｒｏＰｌｕｓ６．０图像分析系统进行定量分析，计算阳性面积百分比（表２，图１０）。Ｎｅｓｔｉｎ在正常组的表达量最高达２．３９％，比对照组的１．２４％高出约一倍。移植组的Ｎｅｓｔｉｎ最高表达可达１．３７％，虽然仍较正常 组低，但是比对照组却有了近１０％的提高。图Ａ对照组图Ｂ移植组图Ｃ正常组图９各实验组小鼠脑组织中Ｎｅｓｔｉｎ阳性表达Ｘ４００ 表２ Ｎｅｓｔｉｎ在各组小鼠脑组织中的阳性表达面积测定结果（ｘ±Ｓ，％）组别 正常组 对照组 移植组Ｐ＜０．０５ｎＮｅｓｔ ｉｎ（Ｋｒｅａ％）１０ ｉ０ １０１．５９±０．０８△ １．１８±０．０６▲ １．２９±０．０８，注：移植组与对照组比较，宰Ｐ＜ｏ．０６：移植组与正常组比较，△Ｐ＜０．０５：正常组与对照组比较▲薹◆Ｎｅ－ｔｉｎ在各蜜验组小鼠脑组织中的阳性衰选图１０ Ｎｅｓｔｉｎ在各实验组小鼠脑组织中的阳性表达２．５脑组织中ＮＳＥ表达检测光镜下检测，以胞浆弥散性染色棕色或褐色者为阳性细胞，其他为阴性细ｊ‘Ｐｌ―ｆ＋．ｔｆ：ｔ”＿．一４，。。?ｊｉ ；’ｊｉ’．ｉ：ｆ：：ｌ▲¨．．、‘１。ｉ；如：ｉ辞曼ｊ森＝ｉ：×一．：ｊ，鼍批３．１ｊ 』１’，ｉＦ－。：第三部分：第三代羊膜间充质干细胞静脉移植在阿尔茨海默病转基因鼠脑部的治疗机制胞。可见，移植组小鼠脑组织中ＮＳＥ表达介乎于正常组小鼠和对照组小鼠之间，具体表达为：正常组小鼠脑组织中ＮＳＥ表达量最低，其次是移植组，对照组最高（图１１）。采用Ｉｍａｇｅ－ＰｒｏＰｌｕｓ６．０图像分析系统进行定量分析，计算阳性面积百分比（表３，图１２）。ＮＳＥ在正常组的表达量偏低，约为０．４７％左右：但 是对照组的ＮＳＥ表达却可以高达１．０８％左右，比正常组高出２倍多；移植组的 ＮＳＥ表达相对于对照组，有了很大的降低，下降了几乎１／３（表３，图１２）。图Ａ正常组图Ｂ对照组图Ｃ移植组图ｌｌ实验组小鼠脑组织中ＮＳＥ阳性表达Ｘ４００ 表３ ＮＳＥ在各组小鼠脑组织中的阳性表达面积测定结果（ｘ±ｓ，％）组别 正常组 对照组 移植组ｎＮＳＥ（Ａｒｅａ％）０．４７±０．Ｏｌ△ ｌ－０５±０．０３▲ ０．７３＋０．０１．１０ １０ １０注：移植组与对照组比较，婶＜０．０５；移植组与正常组比较，△Ｐ＜Ｏ．０５；正常组与对照组比较▲Ｐ＜Ｏ．０５’ ’：～№Ｅ斑鲁安●ｔ组小鼠硇越双中的阳蚀衰＿迭图１２ ＮＳＥ在各实验组小鼠脑组织中的阳性表达，、’，～～．），“ｊｒ。、。第三部分：第三代羊膜间充质干细胞静脉移植在阿尔茨海默病转基因鼠脑部的治疗机制３．讨１陀１９０６年，德国医生阿洛伊斯－阿尔茨海默首次公布了一位５ｌ岁的女性病人 奥古斯特的病历，使人们得以了解老年痴呆症。老年性痴呆（ｓｅｎｉｌｅ 亦称阿尔兹海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’Ｓｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｍｅｎｔｉａ），ＡＤ），是一种中枢神经系统原发性退行性变性疾病田１。随着社会老龄化问题的日趋突出，ＡＤ的发病率逐年上升。 据“九五’’期间，在北京、上海、成都、西安等地进行大样本人群调查发现。 年龄＞６５者ＡＤ患病率为４．８％。按照中国１９９９年人口年龄构成标化，中国＞５５ 岁人群中，约有３１０万ＡＤ患者啪１。据世界卫生组织估计，目前全球每７秒钟就 新增一名ＡＤ患者，每年新增病例４６０万，到２０１０年末全球ＡＤ患者将达到３５００ 万，预计未来２０年将会翻一番，而到２０５０年全球ＡＤ患者将会过亿。按照这一 速度计算，在４０年后，全球每８５个人中就将有１个人患上老年痴呆症。由此 可见，随着世界人口老龄化的日益严重，这一老年性疾病将在未来给世界带来 越来越沉重的负担。可以说，如果我们能在预防或治疗阿尔茨海默氏症上取得 哪怕一点进展，也将对全球公共健康产生非常重要的影响。 阿尔茨海默病的治疗目前还是以药物为主，包括抗Ｂ淀粉样蛋白药物、拟 乙酰胆碱和促乙酰胆碱释放药物、抗炎药物、抗氧化药物、钾通道阻滞剂及脑 代谢激活剂等。但由于这些药物的治疗作用主要集中在维持退化的胆碱能神经 元功能及疾病的早期，并不能真正治愈晚期ＡＤ患者。神经干细胞的发现使人们 对神经系统再生的机制和神经系统疾病的治疗均有了新的认识啪１。而人羊膜间 充质干细胞体外诱导分化为神经元细胞则为治疗阿尔茨海默病提供了新的治疗思路。神经系统主要由神经元细胞和神经胶质组成。神经元细胞是构成神经系统 结构和功能的基本单位。神经元细胞的基本功能是通过接受、整合、传导和输 出信息实现信息交换。有研究表明，足够的神经元数量及其正常形态是大脑功 能正常的物质基础。胎鼠神经干细胞经脑局部注射移植对阿尔茨海默病小鼠脑 组织中神经元表达有显著影响啪１。星形胶质细胞是大脑中一种主要的非神经元 细胞类型，因为不参与大脑的电流活动很少被研究。实际上星型胶质细胞中的 线粒体是细胞能量代谢及氨基酸类神经递质谷氨酸、ＧＡＢＡ等物质前体合成的主 要场所，这些均与神经元的存活有关口¨。研究表明星型胶质细胞还可以发挥神 经保护的作用［３２］ｏ在脑组织中，神经干细胞可以分泌多种神经营养因子，促进第三部分：第三代羊膜间充质干细胞静脉移植在阿尔茨海默病转基因鼠脑部的治疗机制损伤细胞的修复，还可以增强神经突触之间的联系，建立新的神经环路。所以， 作为星形胶质细胞的特异标识蛋白－ＧＦＡＰ和作为神经干细胞的特异性标识蛋白 一Ｎｅｓｔｉｎ，以及作为神经元细胞损伤的特异标识蛋白－ＮＳＥ，这三种蛋白在脑组织 中的阳性表达对大脑正常功能的发挥起着重要作用。 脂肪间充质干细胞、神经干细胞以及骨髓间充质干细胞移植后，都可以迁 移到大脑病变部位，分化成合适的细胞类型，替代阿尔茨海默病病程中丢失的 细胞，从而对阿尔茨海默病有一定的疗效ｎ ４’１６’蚓，其中最常用的是神经干细胞。 而与传统不同，本实验室课题组采用尾静脉移植人第三代羊膜间充质干细胞治 疗转基因阿尔茨海默病小鼠，前期实验结果显示，可以明显改善阿尔茨海默病 小鼠的学习，记忆能力，未见致死致瘤现象发生，心、肝、肾功能未受影响， 安全可行。脂肪间充质干细胞，神经干细胞以及骨髓间充质干细胞治疗ＡＤ疾病 时，所采用的动物模型通常是手术机械性损伤致使的阿尔茨海默病大鼠。该模 型制备过程中，可能存在手术人为操作损伤程度不同，假阳性，容易感染致死 等问题，使得实验结果可能会有偏差。本实验采用转基因ＡＰＰ＋鼠，完全避免了 上述问题。在传统干细胞移植中，多采用脑部手术，脑室局部注射的方法，操 作过程中，不容易找准注射部位，容易致死，术后易引发感染，术后护理麻烦。 本实验采用小鼠尾静脉注射，无需手术，操作容易，且不引起感染，便于护理。 另外，神经干细胞以及骨髓干细胞，或取自胚胎，或取自成体组织，存在伦理 问题，或者来源局限性等问题。本实验采用的羊膜间充质干细胞来源于羊膜。 而羊膜属于医疗废物，这既不存在伦理问题，也不受材料来源限制。所以，本 课题的实验设计无论是材料来源，动物模型，还是移植途径都较传统试验设计 有很大的创新。 实验中，采用Ｂｒｄｕ标记第三代人羊膜间充质干细胞，经尾静脉注射移植入ＡＰＰ讣鼠体内，采用免疫组化检测，在脑组织中发现Ｂｒｄｕ阳性表达（图５），表明，静脉移植的第三代人羊膜间充质干细胞可以通过ＡＰＰ＋小鼠的血脑屏障，迁 移到脑组织中，实现归巢，并在脑组织中存活，发挥生物学作用。 本实验结果显示，尾静脉移植人第三代羊膜间充质干细胞的ＡＰＰ＋小鼠，其 脑组织中海马区及两侧ＧＦＡＰ表达显著升高。移植后的表达比移植前提高了近４ 倍（表ｌ，图８），几乎接近于正常组小鼠的表达量。在各实验组小鼠脑组织的 髓质区，正常组和对照组几乎不表达，或零星表达，而移植组小鼠的ＧＦＡＰ表达 远高于对照组和正常组（图７）。而在神经干细胞移植治疗ＡＤ鼠实验中，ＧＦＡＰ第三部分：第三代羊膜间充质干细胞静脉移植在阿尔茨海默病转基因鼠脑部的治疗机制表达却是正常组＜移植组＜对照组，这与本实验对照组＜移植组＜正常组有些 不同。ＧＦＡＰ是星形细胞的特异蛋白，广泛的生理生化损伤等可刺激成熟星形细 胞合成ＧＦＡＰ，此过程是星形细胞对脑内任何严重损害的～种特有反应ｍ１。神经 干细胞移植所用的是手术机械损伤制备的ＡＤ大鼠模型，在损伤发生后，大鼠脑 组织中的ＧＦＡＰ在很短的时间内高表达，参与保护神经元细胞免受损伤，在移植 入神经干细胞后，当ＮＳＣｓ进入病损区后，进行增殖、分化形成新的神经元，ＮＳＣｓ 间以及新形成的神经元与宿主脑内原有的神经元之间形成了新的突触联系，构 成新的神经回路，使脑内病损区的内环境发生改变，打破了病理条件下的ＧＦＡＰ 应急反应，ＧＦＡＰ的表达也就随之下降了。本实验采用ＡＰＰ＋转基因小鼠是基因突 变产生的，其脑组织中ＧＦＡＰ是低表达的。移植入人羊膜间充质干细胞后，改变 了脑组织中的为环境，为了给神经元和神经干细胞的增值及恢复提供生长支撑 及营养保证等生化作用，致使ＧＦＡＰ高表达。 实验结果显示，尾静脉移植人第三代羊膜间充质干细胞的ＡＰＰ＋小鼠，其脑 组织中Ｎｅｓｔｉｎ阳性表达量，移植组相对于对照组，也有１０％左右的提高，但不 超过正常组（图９，表２，图１０）。采用神经干细胞移植，干细胞可以迁移到大 脑皮层和海马，提高ＡＤ鼠脑组织中Ｎｅｓｔｉｎ的表达，并可分化为神经细胞和星 型胶质细胞，显著改善衰老大鼠的认知功能口５’蚓。移植后迁移到脑组织中的神 经干细胞能被特异性吸引到脑内神经退行性病变区域。对ＡＤ转基因小鼠的研究 表明，神经干细胞能迁移到Ａ Ｂ堆积区，说明神经干细胞具有Ａ Ｓ损伤区的趋向 性，可以在治疗ＡＤ等全脑神经退行性病变中发挥作用∞＂。有研究表明，ＡＤ大鼠 脑室内连续注射碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）、表皮生长因子（ＥＧＦ）１４ ｄ后， 再连续注射神经生长因子（ＮＧＦ）１４ｄ，结果发现内源性的神经干细胞显著增生， 动物的认知功能得到明显改善嘲。本实验采用的是人羊膜间充质干细胞，迁移 到脑组织中时，其在脑组织中的分布是随机的（图５），并没有像神经干细胞那 样有Ａ Ｂ损伤区的趋向性。提示人羊膜间充质干细胞提高Ｎｅｓｔｉｎ的表达可能不 是直接作用于ＡＤ鼠脑内受损部位，而是迁移到脑组织中后，通过改变脑部微环 境，从而诱导ＡＤ鼠脑内的内源性神经干细胞增生，并分化为功能完整的神经元 细胞。 神经元特异性烯醇化酶（ＮＳＥ）是细胞能量代谢活动中参与糖酵解过程的关 键酶，以二聚体形式存在于胞浆中，特异性地存在于神经元细胞和神经内分泌细 胞内，在脑脊液和血液中的含量甚微．脑损伤时神经细胞受损，血脑屏障破坏，该第三部分：第三代羊膜间充质干细胞静脉移植在阿尔茨海默病转基因鼠脑部的治疗机制酶进入脑脊液和血循环中，且脑脊液和血液中ＮＳＥ浓度变化与脑损伤的程度正相 关。即ＮＳＥ是神经元损伤的特异标志蛋白嘲。实验结果中，尾静脉移植人第三 代羊膜间充质干细胞的ＡＰＰ＋小鼠，其脑组织中ＮＳＥ阳性表达量，移植组相对于对照组，下降了近ｔ／３，但仍高于正常组（图ｌｌ，表３，图１２）。表明尾静脉移植人羊膜间充质干细胞迁移到小鼠脑组织后，干细胞可能通过不同的途径分化、 增殖、恢复、重建新的神经联系，减轻受损区神经元的损伤程度。从而对阿尔 茨海默病起到了积极的治疗效果。 综上所述，作者认为转基因阿尔茨海默病小鼠可以通过尾静脉移植人第三 代羊膜间充质干细胞，来增加脑组织中星形胶质细胞和神经干细胞以及神经元 细胞的表达，从而对转基因阿尔茨海默病小鼠有积极的治疗效果。本研究结果 为治疗阿尔茨海默病提供了一种新思路，新疗法。小结本实验在前期课题组研究成果的基础上，进一步深入探明人第三代羊膜间 充质干细胞采用尾静脉注射到小鼠体内，人羊膜间充质干细胞在小鼠体内迁移 过程中，可以顺利通过血脑屏障（ＢＢＢ）实现向小鼠脑组织的归巢；归巢后人羊 膜间充质干细胞可能通过自身分化，或者改变小鼠脑组织为环境后，诱导小鼠 自身中枢神经细胞分化等途径增加小鼠脑组织中的胶质细胞、神经元细胞以及 神经干细胞的表达来实现对小鼠阿尔茨海默病的治疗。本实验为临床应用干细 胞治疗阿尔茨海默病，在新干细胞材料以及移植途径的选择上，提供了重要的 依据。３０参考文献参考文献［１】李国喜，杨波，关方霞，等．人羊膜间质干细胞的分离，培养及鉴定［Ｊ］．郑州大学学报 （医学版），２００６，４１（２）：２４４－２４７ ［２］王公平，关方霞，杨波，等．Ｆｅ舢纳米化颗粒标记人羊膜间充质干细胞的合适条件．中国 组织工程研究与临床康复［Ｊ］．２００８，１２（６）：１０４３一１０４６ 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