试剂B 封闭缓冲液（封闭用） 20 mL

试剂C （原装进口分装）已稀释的即用型(CCA)一抗（2.5ml）

三羟基氨基甲烷1.21g

2．抗原修复液（依检测抗原不同而选择不同的修复液）

石蜡包埋组织切片免疫染色

实验步骤（建议方案）：

1.烤片： 将待做切片置于切片架上于60℃恒温烤箱中至少烤1 hr；

2.脱蜡： 切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3 次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min；

4.抗原修复： 根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复常采用高压、微波（温度达到98~100℃）或酶消化修复法，室温自然冷却自来水冲洗，ddH2O 洗2×2minTBS 洗涤（2×2min）（具体修复方法见附1）* 注：有些抗原勿需修复，直接进入第5 步封闭

5.封闭： 滴加试剂B，37℃湿盒孵育30 min；

6.加一抗：滴加用试剂C（即用型一抗）37℃湿盒孵育2 hr 或4℃；

8.封闭： 滴加试剂B，37℃湿盒孵育10 min；

9.加二抗： 滴加鼡抗体稀释液稀释的生物素化二抗（试剂D）37℃湿盒中孵育30 min；

14.显色：应用DAB 溶液（试剂F）显色；

15.复染：自来水充分冲洗，复染脱水，透明；

16.封片： 待组织标本干后用试剂缓冲甘油封固剂封片；

17.观察成像： 显微镜下观察成像。

注意事项：1. 修复后缓冲液须自然冷却自来水冲洗后方能把切片取出，骤冷有可能导致结晶或抗原封闭

2. 缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用

3. 若试剂为微量浓缩液，用前应低速离心将内盖和管壁附着的溶液离到底部。

4. 封片前一定要换用TBS 充分洗涤以便洗去组织上残留的Tween 20，否则會影响结果观察

5. 如须复染细胞核，则在封片前复染或直接采用含有染核试剂的封片剂进行封片

常用抗原修复液：柠檬酸缓冲液（0.01M pH6.0）、EDTA 忼原修复液（pH8.0 或9.0）等等。

切片脱蜡水化处理TBS 冲洗，在组织上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶37℃孵育20~30min 后TBS 冲洗即可。

微波盒中加入抗原修复液微波加热至沸腾将脱蜡水化后的切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中中档或高档继续微波10~15min，取出微波盒冷却至室温后自来水冲洗，取出切片因不同微波炉微波处理时间存在差异，须自行调整

三、直接高压抗原修复法

取修复液于不锈钢高压锅中加热臸沸腾，将组织切片置于耐高温切片架上修复液沸腾后放入切片架，盖上锅盖待喷气后计时1.5~2.5min 即可脱离热源，自然冷却至室温后自来水沖洗取出切片。此方法适用于较难检测或核抗原的修复

四、隔水式高压抗原修复法

不锈钢高压锅中加自来水加热至沸腾，微波盒中加叺修复液于微波炉中加热至沸腾将切片放入微波盒中，再将微波盒放入高压锅中盖上锅盖待喷气后计时4~255 min 即可关闭热源，自然冷却至室溫后自来水冲洗取出切片。此方法适用于较难检测或核抗原的修复