人乳头瘤病毒（HPV）基因分型检测试剂盒
好评中评差评[发明专利]一种检测HPV的试剂盒有效
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【说明书】：
技术领域本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种检测人乳头瘤病毒（HPV）的试剂盒。背景技术人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV）属于乳多空病毒科的乳头瘤病毒A属，能引起人类皮肤和黏膜组织的多种良性乳头状瘤或疣，可导致组织的异常增生，某些亚型感染还具有潜在的致癌性。分子流行病学研究说明HPV的持续感染是导致子宫颈癌的必要条件。从1976年开始发现4种HPV病毒至今，已经陆续鉴定出130多种不同的亚型，有近40种可以特异性地感染生殖器，其中20多种与宫颈肿瘤相关。根据致病力的危险程度，可将不同的亚型分为低危型HPV、高危型HPV和潜在高危型HPV，其中HPV16的致癌率最高。Richard Roden等人在2006年的研究统计表明在世界范围内，高达53.5%的宫颈癌病例与HPV16的感染息息相关。传统宫颈癌筛查的标准是对宫颈病理组织或者脱落细胞进行细胞形态学的检查，但这一方法的灵敏度有所欠缺，特别是在诊断上皮内瘤样病变CIN2/3中存在漏检；另外，细胞形态学检测还要求操作人员有相当成熟的经验，减少发生主观误判。目前，理想的HPV特异性标志物是癌蛋白，但在实际应用中，癌蛋白的含量极低，难以实现准确快速的检测。随着基因科学的发展，HPV基因型的分析包括利用HPV的DNA和RNA进行分析，不仅能够较为精准的分析出不同的亚型，还能极大的提高分析的准确度，减少误判。因此，使用细胞学联合HPV分型检测的方法进行筛查在宫颈癌筛查过程中逐渐发展起来。目前，关于商品化的HPV基因检测主要引进国外产品，并且在国内仍处在研究阶段。目前，一般采用RT-PCR法或核酸序列扩增法对病毒的mRNA进行的扩增检测。虽然此方法在国外已经开发出相关检测方法和仪器，但是该方法需要高精密度的仪器和复杂的实验操作过程，价格较高，不利于在广大欠发达地区推广普及应用。因此，针对目前流行病学统计中易感HPV的mRNA开发一种经济实用的HPV的基因检测试剂盒，能够结合细胞形态学的检查对宫颈癌及其癌前病变进行筛查，具有很重要的现实意义。发明内容本发明提供一种检测HPV的试剂盒，其特征在于，包括如下组分，1）等温扩增反应液：所述等温扩增反应液中包含RNA反转录酶、RNA聚合酶、RNA酶H、用于扩增HPV的引物、扩增反应缓冲液、金属离子溶液、还原剂溶液、dNTP和NTP；2）芯片毛细管电泳缓冲液：所述芯片毛细管电泳缓冲液中包含分离缓冲液、染料和甲酰胺。其中，RNA反转录酶是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶；RNA聚合酶是以一条DNA链或RNA链为模板、以三磷酸核糖核苷酸为底物、通过形成磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶；RNA酶H是一种能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链，但不能消化单链或双链DNA和独立的RNA的核糖核酸内切酶。在一个具体实施例中，所述引物选自用于检测HPV16型的引物，且所述引物的序列为如上游引物SEQ ID NO:1和下游引物SEQ ID NO:2所示的序列。在一个具体实施例中，所述RNA反转录酶选自AMV反转录酶，RNA聚合酶选自T7RNA聚合酶。在一个具体实施例中，在组分1）的等温扩增反应液中，所述RNA反转录酶、RNA聚合酶、RNA酶H、用于扩增HPV的引物、扩增反应缓冲液、金属离子溶液、还原剂溶液、dNTP、NTP和DMSO可以任意组合为一种或多种溶液；但优选地为RNA反转录酶、RNA聚合酶和RNA酶H组合为一种溶液E-I，而组分1）中其余成份组合成另一种溶液S-II。在一个具体实施例中，组分2）的芯片毛细管电泳缓冲液可以任意组合为一种或多种溶液，但优选地组合为一种溶液B-III。在本发明中，将各种溶液在反应体系中的使用浓度分别定义为1×，举例来说，如果AMV在反应体系中的使用浓度为0.24U/μl，则该浓度定义为1×，那么在试剂盒中的浓度如果为10×，其实际浓度为2.4U/μl；再如，如果Tris在反应体系中的使用浓度为40mM，则该浓度定义为1×，那么在试剂盒中的浓度如果为25×，其实际浓度为1M。因此，在一个具体实施例中，所述E-I在试剂盒中的浓度选自10×：2.4U/μl RNA反转录酶，20.0U/μl RNA聚合酶，0.08U/μl RNA酶H；所述S-II在试剂盒中的浓度选自10×：400mM的Tris(pH8.5)、120mM的MgCl2、700mM的KCl、50mM的二硫苏糖醇、10mM的dNTP、20mM的NTP、2.0μM的上游引物、2.0μM的下游引物；所述B-III在试剂盒中的浓度选自1×：79%(v/v）的分离缓冲液（含2%羟乙基纤维素的TBE溶液），20%(v/v）的甲酰胺和1%(v/v）的荧光染料SYBR Gold稀释液（其中，所述SYBR Gold稀释液是由SYBR Gold稀释100倍得到的）组成的芯片毛细管电泳缓冲液。在一个具体实施例中，所述RNA酶H、RNA反转录酶和RNA聚合酶的组合比例为1-6:50-100:350-600；优选地其比例为2:60:500，即1:30:250。在一个具体实施例中，还包括内标，所述内标选自如SEQ ID NO:3所示的序列；且内标的上游引物序列为SEQ ID NO:4所示的序列，下游引物序列为SEQ ID NO:5所示的序列。在一个具体实施例中，所述试剂盒中还包括HPV阳性对照和HPV阴性对照。在另一个具体实施例中，所述RNA反转录酶的浓度选自10-100×；RNA聚合酶浓度选自10-100×；RNA酶H浓度选自10-100×；所述扩增反应缓冲液选自2-50×Tris，pH=8.0-9.0；所述金属离子溶液选自5-100×的MgCl2和5-100×的KCl；还原剂溶液选自10-200×的二硫苏糖醇或β-巯基乙醇；dNTP的浓度选自10-100×；NTP的浓度选自10-100×。在一个具体实施例中，组分1）的等温扩增反应液中还包括DMSO，优选其在组分1）中不与其他成份形成混合液。本发明还提供一种用于检测HPV16型的引物对，其特征在于，其序列为如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的序列。附图说明图1为实施例1的HPV16的检测流程图；图2为实施例1的响应曲面法对等温扩增过程进行条件优化的结果；图3为实施例2中得到的总mRNA的芯片毛细管电泳（MCE）检测结果；图4为实施例2的空白实验和经等温扩增法（NASBA）扩增后产物HPV16的反义mRNA的MCE定性检测结果，其中，峰a为引物峰，峰b为产物峰；图5为实施例3的HPV16反义mRNA的MCE半定量检测，其中，峰a为引物峰，峰b为产物峰。具体实施方式本试剂盒采用等温扩增法（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）结合芯片毛细管电泳（Microchip capillary electrophoresis，MCE）检测技术对样品检测。下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。但本发明并不仅限于下述实施例。所述实施例中所涉及的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1本实施例为试剂盒的开发过程以及所得的试剂盒。HPV的具体检测流程为（见图1）：在获得待检测的宫颈细胞样品后，进行mRNA的提取，之后以获得的RNA为模板，在等温扩增反应液的作用下，在一定的温度下（如44℃）进行等温扩增，扩增结束后，对所扩增的样品进行芯片毛细管电泳检测。其中，试剂盒中的具体组分为：1）等温扩增反应液：所述等温扩增反应液中包含RNA反转录酶、RNA聚合酶、RNA酶H、用于扩增HPV的引物、扩增反应缓冲液、金属离子溶液、还原剂溶液、dNTP、NTP和DMSO；2）芯片毛细管电泳缓冲液：所述芯片毛细管电泳缓冲液中包含分离缓冲液、染料和甲酰胺。为了获得最优的等温扩增条件：本发明采用了响应曲面法对等温扩增过程进行条件优化。即利用Design-Expert软件进行响应曲面法试验，建立连续变量曲面模型如图2，确定最佳等温扩增条件。对影响等温扩增过程的AMV反转录酶、T7RNA聚合酶、等温扩增温度、扩增时长四个因素进行考察，各因素的考察低值分别为6U、30U、38℃、60min，各因素的考察高值分别为10U、50U、44℃、180min；将芯片毛细管电泳检测扩增产物产生信号的强度作为因变量。拟合因素和因变量之间的函数关系，得到最佳等温扩增条件。
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