[流式细胞仪应用——利用PI检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)]&本文主要讲述PI单染检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)PI（碘化丙啶）染色特点：一是能够与双链DNA/RNA螺旋的大沟部位结合，二是不能通过功能正常的完整细胞膜。基于以上特性，目前主要有两大方面的应用，配方也不同：一方面的应用是检测细胞周期，检测细胞周期时，为了保证所有的细胞都能染上PI，因此要将细胞用乙醇固定，并加入Triton&X-100&，以增加膜的通透性；同时由于DNA使细胞的粘&[细胞周期&细胞凋亡&荧光强度&流式细胞仪&亚二倍体&散点图&上清&荧光]
本文主要讲述PI单染检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)
PI（碘化丙啶）染色特点：一是能够与双链DNA/RNA螺旋的大沟部位结合，二是不能通过功能正常的完整细胞膜。基于以上特性，目前主要有两大方面的应用，配方也不同：
一方面的应用是检测细胞周期，检测细胞周期时，为了保证所有的细胞都能染上PI，因此要将细胞用乙醇固定，并加入Triton X-100 ，以增加膜的通透性；同时由于DNA使细胞的粘附性增大，加入以降低细胞粘附性；为了消除RNA的干扰，要加RNAase。由于要鉴定DNA含量，因此PI染料必须过饱和，所以PI终浓度很高，一般50ug/mL。由于晚期凋亡细胞DNA断裂形成亚二倍体峰，因此可同时检测凋亡。
另一方面的应用是检测膜通透性（凋亡），由于PI不能进入完整的活细胞膜，因此一般认为PI染色阳性的细胞是死细胞。Annexin V/PI凋亡检测试剂盒中就是这种染液，它的作用是鉴定死细胞，从而与凋亡细胞区分开来。它的配制就是将PI溶于PBS，终浓度较低，一般2.5ug/mL。
所需试剂：
1、PI染液：
用于检测细胞周期的PI配制如下：
方法一：10×PI配制方法, 用时用PBS稀释至工作液：5mg-----PI0.1ml---Triton X-1003.7mg--10ml----PBS
2、RNaseA——2mg
方法二, 直接配制PI工作液：
PI -----5mg
RNaseA——2mg
1.0%Trition X-100——0.25ml
枸椽酸钠——100mg
生理盐水——65ml
调pH值至7.2-7.5
加水至100ml, 棕色瓶分装，保存在4℃
操作步骤1.细胞培养铺细胞至6孔板或者35mm 培养皿，约4－5*10e5 cells/well, 如果要加药物，在此时可以加以不同种或不同浓度的药物。流式侧细胞周期对细胞的种板密度非常讲究，如果密度过高就会出现接触抑制，所以建议刚开始做预试验时可以种个细胞密度梯度。
2细胞收集，细胞培养至一定时间后，如果是贴壁培养的细胞，常规胰酶消化， PBS洗2-3次，制成单细胞悬液，并调整细胞数量至1－5*106 cells/ml。3.细胞固定3.1.加入3ml 预冷PBS重悬细胞，800 rpm×5 min，吸净上清。3.2.加入500ul PBS，轻轻重悬细胞，使细胞分离为单个，逐滴加入预冷的100% 乙醇（-20℃）1.5 ml，使其终浓度为 75% ，-20℃ 放置过夜固定，最长可以放置1周左右。
注意：固定细胞时，确保PBS悬浮细胞为单个，加入无水乙醇的时候要慢速，保证逐滴。细胞保存在4℃也可以。4.细胞标记4.1.取出固定的样品，800 rpm×5 min，弃上清。4.2.加入3 ml预冷PBS重悬细胞，800 rpm×5 min，离心收细胞。
注意：可重复1-2次，以除去乙醇4.3.加入150 ul RNaseA（250-500 ug/ml PBS稀释）重悬细胞，37℃消化30分钟。
注意：做细胞周期时，RNaseA加与否对结果影响不大；如果要同时测凋亡，尽量加入RNaseA。另外，在做这步之前，可用200目滤网过滤4.4.加入150 ul PI工作液，4℃避光染色30分钟。
注意：如果用方法二配制的直接PI工作液，其已含有RNaseA，因此4.3步应省略。PI染液的量可根据细胞的多少来加，比如说有的人喜欢加500ul或1ml，其实只要和细胞完全孵育就可以，量多量少对结果不会影响太大。4.5.转至流式检测管，上机检测，PI用488nm氩离子激光器激发，由630带通滤光片接收，通过FSC/SSC散点图收集 10000个细胞，采用设门技术排除粘连细胞和在碎片，分析PI荧光直方图上细胞各周期的百分率和凋亡细胞百分率。
5、细胞周期分析：
正常人静止体细胞有46条染色体，为二倍体细胞，而正常增殖细胞则存在不同的DNA含量。在细胞周期的各个时期（G0、G1、S、G2、M）中DNA含量随各时相呈现出周期性变化，在G1期细胞开始合成RNA和蛋白质，但DNA含量仍保持二倍体，进入S期后开始合成DNA，此时细胞核内DNA的含量介于G1和G2期之间。当DNA复制成4倍体时细胞进入G2期并继续合成RNA和蛋白质，直到进入M期，因此单纯从DNA含量无法区分G2期和M期，一旦有丝分裂分裂成2个细胞，同样G0和G1期的DNA含量也无法区分。PI与DNA结合，其结合量与DNA含量成正比。因此，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时将细胞周期各时相区分为G1 /G0期 ,S期和G2 /M期。 G1 /G0期具有二倍体细胞的DNA含量 (2N) ,而G2 /M期具有四倍体细胞的DNA含量 (4N) ,而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。
如何看这个图：横坐标表示荧光强度，纵坐标表示细胞数量。在每个图的旁边都会配有一些这个图的相关说明，如此图中我们看到Dip G1: 57.46 % at 48.73，表示G1/0期的细胞占总细胞的57.46，荧光强度在48.73；Dip G2: 10.49 % at 94.96同理表示：G2/M0期的细胞占总细胞的10.49%，荧光强度在94.96；大家可以算一下，二者之间荧光强度的比94.96/ 48.73应该是约等于2的，这就是说G2/M期DNA含量为G1/0期的2倍，又验证了理论的推断。同样S期所占百分比也会体现出来。
在肿瘤病理学中，通常以S期细胞数量来判断肿瘤增殖状态。细胞增殖指数是指S期和G2/M期细胞之和占总细胞数的百分比，它反映细胞的增殖能力。
6、调亡的结果判定
在FSC/SSC散点图上显示凋亡细胞比正常细胞小（FSC小），在PI荧光图上，G0/G1期峰前出现亚二倍体峰。
从这个图，我们可以看到在G0/G1期峰前出现了亚二倍体峰（绿色），右边有各项参数，其意义上文我已讲述过，大家可以仔细看一下，上文没讲过的地方，相信大家一看就明白了。
比如在右侧最后一行，写了Apoptosis:36.76% Mean:34.12,就指的是凋亡细胞占36.76%，其荧光强度在34.12。
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标题: annexin V-FITC和PI双染流式测细胞凋亡(Apoptosis)图片分析(细胞凋亡,活细胞)
摘要: [annexin V-FITC和PI双染流式测细胞凋亡(Apoptosis)图片分析(细胞凋亡,活细胞)] 见到两个同学做双染测细胞凋亡(Apoptosis)，好像是请别人帮忙做的，结果，一个所有的象限（除了左上）细胞都是红色的，看着很漂亮；一个右上象限有些红色，其他地方又几乎全是绿色。问他们怎么回事，他们也讲不清。书上讲左下象限是活细胞，那是不是不应该着色呢，怎么要么红要么绿啊？希望问的不是太幼稚，让各位见笑了，只是，不做这个还真是弄不明白。 关键词:[细胞凋亡 活细胞]……
见到两个同学做双染测细胞凋亡(Apoptosis)，好像是请别人帮忙做的，结果，一个所有的象限（除了左上）细胞都是红色的，看着很漂亮；一个右上象限有些红色，其他地方又几乎全是绿色。问他们怎么回事，他们也讲不清。书上讲左下象限是活细胞，那是不是不应该着色呢，怎么要么红要么绿啊？希望问的不是太幼稚，让各位见笑了，只是，不做这个还真是弄不明白。
回复图中的红色、绿色跟细胞着色无关，是圈了门的缘故，只是用作区分细胞是属于门内还是门外分的。一般圈了一个门的话只有一种红色，如果圈了两个门就会有另一种颜色，一般我们都选绿色。
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品牌：凯基
货号：KGA108
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