微囊藻毒素的检测及其在鲫鱼体内生物富集和生物释放规律的研究_甜梦文库
微囊藻毒素的检测及其在鲫鱼体内生物富集和生物释放规律的研究
中国农业大学 硕士学位论文 微囊藻毒素的检测及其在鲫鱼体内生物富集和生物释放规律的 研究 姓名：李小艳 申请学位级别：硕士 专业：农产品加工与贮藏工程 指导教师：薛文通
中国农业大学硕士学位论文摘要摘要微囊藻毒素是由淡水蓝绿藻产生的一类最常见的环肽肝毒素，对动物及人类健康具有较大的 危害性。本文建立了水中、蓝藻中微囊藻毒素一ｕｔ的高效液相色谱和高效液相色谱一质谱检测 法，探讨了微囊藻毒素在鲫鱼体内的生物富集和生物释放的规律。 通过对水样及藻样提取条件、色谱条件和固相萃取条什进行的优化，建立了水中和监藻中微 囊藻毒素．ＬＲ的高效液相色谱检测方法。该方法对水样的回收率大于７３％，对藻样的回收率大丁 ７５％。采用该方法对实际水样进行检测，取得了良好的效果。 建立了水样和藻样中微囊藻毒素的高效液相色谱一质谱检测方法。该法对水样的回收率大丁 ７９％，对藻样的回收率大丁７８％。采用高效液相色谱分离、质谱定性的方法对实验室藻样进行了 定性分析。 以鲫鱼为研究对象，研究了微囊藻毒素对鱼体的急性毒性。结果表明，腹腔注射微囊藻毒素 对鲫鱼的ＬＤ５０为１２２．６ｐｇｍｇ。国内首次研究了微囊藻毒素在鲫鱼体内的生物富集和生物释放规律。结果表明，鲫鱼肝脏对 微囊藻毒素的富集能力很强，肌肉也有一定的富集能力。鲫鱼对微囊藻毒素的释放速度缓慢，即 使在非毒素环境下生活１５天，鲫鱼体内仍含有高剂量的微囊藻毒素，提示人们食用此类鱼肉食品 的潜在风险。研究中还发现，鲫鱼不同组织中均检出徽囊藻毒素，说明微囊藻毒索进入鲫鱼体内 后发生生物转化现象。关键词：微囊藻毒素，高相液相色谱，高效液相色谱质谱，定性研究，生物富集和生物释放ＡｂｓｔｒａｃｔＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎｓｍａｙ ｈａｖｅ ｈａｚａｒｄｓ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄａｒｅｃｏｍｍｏｎ ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃ ｃｙｃｌｉｃ ｔｏｘｉｎｓ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ｂｌｕｅ ａｎｄ ｇｒｅｅｎ ａｌｇａｅ ａｎｄ ｔｈｅｙＯｉｌａｎｉｍａｌ ａｎｄ ｈｕｍａｎｈｅａｌｔｈ．Ｗｅｄｅｖｅｌｏｐ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ－ＬＲ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｔｈｅ ｃｒｕｃｉａｎａｌｇａｅ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｅ ｂｉｏａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｎ ａｎｄ ｂｉｏｄｅｐｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ ｉｎ ａｌｓｏ ｓｔｕｄｉｅｄ．ｃａｒｐ（Ｇａｒａｓｓｉｕｓ ａｕｒａｔｕｓ）ＷａＳＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ａｌｇａｅ 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传播学位论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名：南、转时间：）ｕ ０６年‘月’２日别磁径、１地时阳Ｊ：）岫６年６月办只中圆农业大学硕士学位论文第一章绪论第一章绪论１．１研究的目的和意义浮游藻类是古老而又原始的白养生活的低等植物，广泛分布于江河、湖沼、海洋及陆生环境 中，是生态系统中物质循环和能量流动的重要环节【１１。近年来，由于人类活动如生活污水、工业 废水的排放以及农田肥料的流失等因素的影响，大量的营养物质注入水体，致使水域寓营养化， 水体中浮游藻类大量繁殖，形成“水华”。 水华污染不仅能使水质产生异昧，某些藻类还能够释放水溶性肝毒素和神经毒素口Ｊ，给动物和人群的健康带来严重威胁，水华污染带来的水质安全问 题和食品安全问题已成为全球性关注的环境卫生问题。 在所有的水华藻类中，毒性最强、污染范围晟广且最严重的是蓝藻。目前，已确定有毒的藻 种包括铜绿微囊藻（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、水华鱼腥藻∽ｎａｂａｅｎａ ｆｌｏｓ．ａｑｕａｅ）、水华束丝藻 （Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎｆｌｏｓ．ａｑｕａｅ）、阿氏颤藻（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ａｇａｒｄｈｉ０、颤藻（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）、泡沫 节球藻（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｒａｉｇｅｎａ）等ｐＪ。至今已检测到的藻毒索主要有微囊藻毒素（ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ，ＭＣ）、 球藻毒索（ｎｏｄｕｌａｒｉｎ，ＮＯＤ）、石房蛤毒素（ｓａｘｉｔｏｘｉｎ，ＳＡＸ）、类毒素．ａ（Ｓ）（ａｎａｔｏｘｉｎ．（Ｓ））和高类毒素．ａ （ｈｏｍｏａｎａｔｏｘｉｎ―ａ１、瘫痪性贝毒索（ｐａｒａｌｙｔｉｃ ｓｈｅｌｌｆｉｓｈｐｏｉｓｏｎｓ，ＰＳＰ）㈣（ＬＳＰ）”‘５Ｊ。其中ＭＣ是由有害蓝藻水华释放的一类具有强烈促癌作用的肝毒素和神经毒素。其单体ＭＣ．ＬＲ是目前已知的毒 性最强、急性危害最大的一种淡水蓝藻毒素。ＭＣ能够抑制丝氨酸和苏氨酸蛋白磷酸酶１（ＰＰｌ）和 ２Ａ俾Ｐ２Ａ）的活性，在低浓度时对肝脏就有专有肝毒性和癌诱发活性ｐＪ。１９９８年，ＷＨＯ、美国、 日本等联合建议饮用水中ＭＣ－ＬＲ的限制值为１／－ｇ／Ｌ１７Ｊ，我国现颁布执行的《生活饮用水卫生规范》 和《地表水环境质量标准》中都将ＭＣ－ＬＲ作为控制指标。 自１８７８年Ｆｒａｎｃｉｓ最早报道了南澳大利殂Ａｌｅｘａｄｒｉｎａ湖泡沫节球藻引起动物中毒的事件以来 佟】，许多学者都报道了藻类污染水体引起人畜患病甚至死亡的事例口４”。ＭＣ不仅能直接导致一些 水生生物如鱼类、贝类及蚌类的患病及死亡Ｉｌ”，而且一些野生动物及家畜、家禽饮用了禽有产毒 藻种及藻毒素的水后，也会引起中毒甚至死亡，同时ＭＣ还可能通过食物链的生物寓集危害人类 的健康【ｌ”。研究表明，ＭＣ可以通过多种途径进入人体，如饮用水、娱乐Ｊ＿｝ｊ水、食品等，其中通 过食品的暴露可能引起的患病风险已成为食品安全的重要课题。鱼类处于水生生态系统食物链的 最高等级，通过生物富集作用会吸收更多的ＭＣ．从而给人群健康带来南接的安全隐患，因此， 展开ＭＣ对鱼体污染的研究，是制定食品中ＭＣ的安全限量标准、提出预防对策的前提。另外，鉴 于ＭＣ的巨人危害性，发展全面的监测体系，建立有效、准确的ＭＣ的检测方法，展开对各种毒素 单体的定性研究，将起到很好的预警和预防作用。 目前，世界各地的水体都有不同程度的富营养化，美国、芬兰、澳人利亚、日本、加拿丈、 巴幽等１０多个国家，都曾报道其湖泊、水库中有毒水华的形成，并检测出了Ｍｃ的存在Ｉｌ“。我国 是世界上有毒监藻分布最广、影响最严重的国家之一。近年来调查显示，我国除了云南滇池、江 苏太湖、安徽巢湖已出现严重藻类污染外，长江、黄河中下游许多水库、湖泊也检测出Ｍｃ［１５１，２００２ 年北京密云水库首次爆发大面积蓝藻水华，不仅使以该水库为水源的供水区域出现水质异味，而中国农业大学硕十学位论文第一章绪论且也对人群健康造成了潜在威胁，引起了各方面的关注。 网此，为了降ｌ＇ｋ￡ＭＣ对人们的健康风险，建立有效的ＭＣ的检测方法，展开对ＭＣ的定性及定 量的研究，探讨ＭＣ对丁－水生生物的污染及潜在危害，是水质安全及食品安全方面的一个重要课 题。本研究首先建立了环境中ＭＣ的检测方法，同时对几种ＭＣ毒素进行了定性研究，然后试图通 过实验室内的生物富集及生物释放实验，了解鱼类对水环境中ＭＣ的富集及释放规律，以求为ＭＣ 对水产品的污染利安全限量标准的制定提供科学依据。１．２国内外研究现状１．２．１ＭＣ的结构和理化性质ＭＣ是一种环肽肝毒素，主要由淡水藻类铜绿微囊藻属（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）产生，其它如 颤藻属（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ）、鱼腥藻属（Ａｎａｂａｅｎａ）、念珠藻属（Ｎｏｓｔｏｃ），及绿色微囊藻属（Ｍ．ｖｉｒｉｄｉｓ）、惠氏微 囊藻属ＣＭｗｅｓｅｎｂｅｒｇｉｉ）能Ｊ某些种和株系也可以产生ＭＣ［…。ＭＣ的一般结构为环－Ｄ．丙氨酸．Ｌ－Ｘ．赤一Ｂ一甲基天冬氨酸山ｚ＿Ａｄｄａ＿Ｄ一谷氨酸－Ｎ－甲基脱氢丙氨酸（Ｄ－Ａｌａ－ｂＸ－Ｄ．ＭｅＡｓｐ－Ｌ－Ｚ－Ａｄｄａ．Ｄ．Ｇｌｕ．Ｍｄｈａ），Ａｄｄａ是ＭＣ所具有的特殊结构，其结构为Ｃｚｏ．Ｂ．氨基酸（３．氨基．９．甲氨基．２，６，８．三甲基．加． 苯基．４，６．癸二烯酸）【１１。构成环状七肽的七个氨基酸，其中５个是非蛋白质氨基酸，２个（２、４点 位、是蛋白质氨基酸。Ｘ、Ｚ为两个可变的氨基酸残基，这两个可变的Ｎ一氨基酸的更替及其它氨基 酸的去甲基化，衍生出众多的毒素类型，至今已从不同微囊藻菌株中分离、鉴定了近８０种单体 结构【１Ｂ】。目前已知存在的最普遍、含量相对较多，毒性较大的ＭＣ主要是ＭＣ－ＬＲ，Ｌ、Ｒ分别 代表亮氨酸、精氨酸。其它如ＭＣ－ＹＲ、ＭＣ－ＲＲ、ＭＣ－ＬＦ、ＭＣ－ＬＷ也较为常见，Ｌ、Ｒ，Ｙ、Ｆ、 Ｗ分别代表亮氨酸、精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸。 由于环状结构和间隔双键，ＭＣ的结构具有相当的稳定性Ｉｌ“。ＭＣ具有水溶性和耐热性，易溶 于水、甲醇或丙酮，不挥发，抗ｐＨ变化。研究表明，将ＭＣ）Ｊｆｌ热至ｌＪ３００。Ｃ很长时间仍未能使之分解， 同时，尽管ＭＣ是多肽类物质，但普通的蛋白水解酶不能将其水解。ＭＣ在阳光下也较稳定，但在 蓝藻色素存在的条件下或在微生物的作用下，光降解速度加快【ｌ”。水环境中藻毒素自然降解过程 是十分缓慢的【”１，当水中ＭＣ的含量为５ｕｇ／Ｌ时，３天后，仅１０％被水体中微粒吸收，７％随沙沉淀。自来水处理＿ｌ＿＝艺的混凝、沉淀、过滤、加氯也不能将其去除。有调查研究表明，在某湖周围３ 个自来水厂的出厂水中检出低浓度的ＭＣ，ＬＲ（１２８～１４００ ｎ∥Ｌ），结果提示采用常规的饮水消毒处 理不能完全消除水体中的ＭＣ。１．２．２ＭＣ的毒?性迄今为ｌＬ，世界各地由Ｍｃ引起鸟类、鱼类、家畜及人类中毒甚至死亡的事件频繁发生。凋 查显示，近３０年来，约有１００００人由于饮用或直接接触被ＭＣ污染的水而造成急性中毒，其中１００ 多人死亡１４，１９］。１９９６年，巴西东北部Ｃａｒｕａｎｌ地区某血液透析中心因使用被蓝藻污染的水库水作为 透析用水，导致１２６名患者出现急性神经毒性和亚急性肝脏毒性症状，其中６０人死亡。透析用水 经高效液相色谱检测，其中含有高浓度的ＭＣ．ＬＲ、ＲＲ、和ＡＲ【“，“””。我国江苏省的海门和旗东２中国农业大学硕士学位论文第一章绪论两个地区主要以池塘水和沟渠水作为饮用水，据报道该地区肝癌发病率据高不下。调查结果显示， 居住在该地区的肝癌患者４年中６－－９月份平均每天摄入０．１９ＰｇＭＣｌ７，２３１。 研究表明，ＭＣ的主要致毒机理是通过抑制蛋白磷酸酶１（ＰＰｌ）和蛋白磷酸酶２ＡｆＰＰ２Ａ）的活 性Ｉ列，破坏细胞融合和分裂过程，其作用的细胞主要是肝细胞，还包括少量的肾细胞及。肾附近的 小管细胞【２５ Ｊ。ＭＣ通过胆汁酸转运系统进入细胞，它对肝细胞的专一性ｊｌ！ｌＪ依赖于肝细胞膜上人量 存在的转运载体【７’２”“。ＭＣ进入细胞后，通过与蛋白磷酸酶上的丝氨酸．苏氨酸弧基结合，抑制 了蛋白磷酸酶的活性，促进了活性氧类（ＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）的产生，增加了蛋白激酶和 环加氧酶的活性，从而诱发细胞内多种蛋白质的过磷酸化，打破了磷酸化和脱磷酸化的平衡，引 起了细胞内一系列的生理生化反应的紊乱，进而导致了肝细胞的损伤口８－ｓｏ］，如细胞蛋白和一些细 胞连接蛋白的磷酸化，致使这些蛋白重新组合，最终造成细胞变形。最近，有研究者证实了Ｍ研口蛋白磷酸酶作用的机理【１９１。ＭＣ对酶活性的抑制是由于酶上的非键合基团被ＭＣ Ａｄｄａ自，ｌｌＪ链上的羟谷氨酰键合。同时，这种键台作用进一步引发了Ｍｃ甲基脱氢丙 氨酸残基上的亲电ａ、Ｂ不饱和羰基和蛋白磷酸酶１上的Ｃｙｓ－－２７３巯基的键台。尽管亮氨酸、丙 氨酸和丝氨酸上Ｃｙｓ－２７３的突变能够让Ｍｃ的这种亲和作用降低１０倍，但是，这种键合的形成对酶 活抑制作用的产生还未起到关键作用。Ｒｕｎｎｅｇａｒ等也研究了Ｍｃ对蛋白磷酸酶抑制作用的机理， 他们把ＭＣ．ＹＭ和一ＬＲ注入小鼠体内，结果发现，ＭＣ对蛋白磷酸酶活性的抑制作用先于或者伴随 着由中毒而引发的临床变化【２６１。 ＭＣ通过胆汁酸转运系统进入细胞内后，通过血液循环系统运送到机体各个组织，进而对各 个组织造成损伤，表１．１为不同染毒方式下不同时间内Ｍｃ在不同动物器官中的分布ｆ７１。ＭＣ的毒性 主要表现为肝毒性、肾毒性、胚胎及发育毒性、遗传毒性。表１．１不同染毒方式不同时间内ＭＣ在不同动物器官中的分布Ｔａｂ．１－１０ｒｇａｎ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＭＣｉｎｖａｒｉｏｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｒｏｕｔｅｓａｎｄｌｉｍｅ－ｐｏｉｎｔｓｐｏｓｔ―ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ动物毒索染毒方式时间肝脏肾脏脑肺脏脾心脏胆囊肌肉！坐ＭＣ．ＬＲ ＭＣ．ＬＲ！至２７１，５ ０．６５ ０．４ ６７ ５６ ７０ １９．２ ７８．０ ６４，６０ ４６．９９１墅！坚堕坚堕Ｏ．５０ ０．０５ ０．０１ ０．８ ０．９ ６．０ ５，３ ２．５０ １．２０ ２．１９ ―０．４ ０．０２ 一 ｎ－ｄ． ｎ．ｄ． ２．０１１！墅２一 ｎ．ｄ． ｎ．ｄ， ＜０．１ ‘１．０ ２．０ ｎ．ｄ． ｎ．ｄ． ０．０４ ０．０７１堡２一 ｎ．ｄ． ｎ．ｄ． ＜０．１ ＜１．０ｎＩ墅！０．５ １１．ｄ． ｎ，ｄ． ｎ，ｄ． ｎ．ｄ ｎ．ｄ． ｎ．ｄ． ｎ．ｄ． ｎ．ｄ． ｎ．ｄ．！墅！一 ｎ，ｄ． ｎ，ｄ． ｎ．ｄ ＜１．０ ２．０ ｎ．ｄ ｎ，ｄ． ｎ．ｄ． ｎ，ｄ．腹腔注射经口 经口１，０ ６．０ １４４．０ １．０ ６．０ ０．４５ ２．０ ６．０ ５，０ ５．０ｎ．ｄ． ｎ．ｄ． ＜０．１ ＜１．０ Ⅱ．ｄ． ｎ．ｄ． ｎ．ｄ． １－７５ ０．５５小鼠ＭＣ．ＬＲ ＭＣ．ＬＲ ＭＣ．ＬＲ ＭＣ．ＬＲ静脉＿ｊ串射 腹腔注射 静脉注射 静脉注射 静脉注射 静脉注射 静脉注射ｄ．大鼠ＭＣ－ＬＲ ＭＣ－ＬＲｄ．ｎ．ｄ． ｎ．ｄ． ０．２２ ０．２３ｎ．ｄ． ｎ．ｄ． ｎ．ｄ．猪ＭＣ．ＬＲ ＭＣ．ＬＲⅡｄ表示未检出１．２．２．１肝毒性肝脏是Ｍｃ的靶器官㈦。小鼠经腹腔注射接触各种Ｍｃ单体，其ＬＤ５０在５０一６００３ｕｇ／ｋｇ之间中国农业大学硕士学位论文第一章绪论ｕｇ／ｋｇ，波动，而小鼠经ＥＩＬＤ５０为５０００ｕ约为腹腔注射ＬＤ∞的１００倍。大鼠经口的ＬＤｓｏ大丁‘５０００ｇ／ｋ９１７１．口服灌胃和腹腔注射的ＬＤ５０差别很大１３０１。急性动物实验中，中毒症状主要表现为腹泻、呕吐、毛发直立、虚弱和苍白。肝中毒表现为肝细胞坏死、肝出血和肝，体比重增加（高达１００％）。 体外实验发现，肝脏快速颤动。血清酶学变化主要表现为乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）＝｝｜ｌ｝漏，Ｙ．谷酰基 转移酶（Ｙ．ＯＴ）｝０碱性磷酯酸合成酶（ＡＫＰ）升高，蛋白磷酸酶１｛ｐＰｌ）｝１１蛋白磷酸酶２Ａ（ＰＰ２Ａ）受抑 制ｐ“。英国水质研究中心的研究人员用ＭＣ．ＬＲ喂饲小鼠１３周后，小鼠肝损伤表现为慢性炎瘟、退 化和肝含铁血黄素沉积。Ｆａｌｃｏｎｅｒ等进行了类似的实验，用含有ＭＣ的水喂饲小鼠５２周后，小鼠死 亡率很高，肝脏损坏，肝酶水平发生变化印１。在一项对猪的跟踪调查中，研究者用水华微囊藻喂 养猪４４天。该微囊藻样品含有除了ＭＣ．ＬＲ和ＭＣ．ＲＲ以的７种单体Ｉ”。结果显示，猪肝脏发生组 织学变化。肝灌流染毒、原代肝细胞培养染毒等体外试验也表现出与体试验相似的结果。 流行病学调查表明，在一些肝癌高发地区如我国东南沿海地区同时存在饮水中ＭＣ的污染， 提示ＴＭＣ可能诱发肝肿瘤１３４１。Ｉｔｏ等给小鼠腹腔注射２０ Ａｇ／ｋｇ ＭＣ．ｕｔ，连续２８周染毒１００次后发 现小鼠肝脏产生肿瘤结块１３５】。Ｓｅｋｉｊｉｍ等发现，黄曲霉毒素ＢＩ（ＡＦＢｌ）在肝癌的形成中具有协同作 用。其研究结果证实，ＭＣ和ＡＦＢｌ在二乙基亚硝胺（ＤＥＮ）起始Ｆ能显著增加大鼠胚胎型谷胱甘 肽转移酶（ＧＳＴ－Ｐ）阳性灶的数量和面积，ＭＣ单独作用也能显著增加ＧｓＴ＿Ｐ阳性灶的面积，提示 ＭＣ为肝脏的促癌荆，并且和ＡＦＢｌ具有协同作用ｐ６－３７１。ＭＣ还可诱导小鼠皮肤内源性的肿瘤促进荆 和癌生长介质ＴＮＦ－ａ基因的表达，从而对肿瘤的形成起促进作用【３…。１，２．２．２肾毒性动物实验证实，ＭＣ不仅能造成肝损伤，而且还会导致肾损伤【３”。Ｆａｌｃｏｎｅｒ等通过腹腔注射和 经口暴露的方式对小鼠染毒ＭＣ提取物，小鼠肾脏损坏表现为肾小球内红血球减少，周围红血球 增多，管腔直径增大，近端小管上皮坏死，末梢小管出现蛋白质表膜物质。其结果暗示末梢小管 内聚集的物质为坏死的部分细胞碎片印ｊ。Ａｌｅｋｓａｎｄｒａ通过大鼠慢性毒性实验探讨ＭＣ－ＬＲ和ＭＣ－ＹＲ 的肾毒性。连续８个月实验后，组织学检查发现肾小管壁加厚、膨胀，充满嗜曙红细胞物质， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ．Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ染色显示细胞类物质凝聚，纤维状肌动蛋白丝堆积Ｉ…。Ｆｉｓｃｈｅｒ等通过鲤鱼毒 性实验发现，鲤鱼喂饲ＭＣ．ＵＵｈ后，肾近端小管出现损伤，有单个上皮细胞空泡形成，细胞凋亡、 脱落，最后在肾皮一髓质连接处出现蛋白质样脱落１４ｌｌ。Ｒｕｎｎｅｇａｒ－等认为，尽管ＭＣ具有肾毒性，但 在肾脏中，ＭＣ对蛋白磷酸酶的抑制不存在剂量一反应关系１２６１。 １．２．２．３胚胎及发育毒性目前，ＭＣ对胚胎的影响还存在争议。Ｈｓｈｅｒ等将非洲爪蟾（ＸｅｎｏｐｕｓＬａｅｖｉｓ）的胚胎暴露在ｌ、１０、１００、５００、２０００ｕｇ／ＬＭＣ－ｔＪＲ和ＭＣ．ＲＲ＠培养２４、４８、７２、９６和１２０ｈ，和对照组相比，其死亡率、畸形率及发育迟缓未见明显增长１４２Ｊ。王佩珍等给处于早期发育阶段的斑马鱼和兔子胚胎 的细胞中显微注射ＭＣ．ＬＲ，发现ＭＣ．ＬＲ诱发胚胎畸变。并且呈时间－卉Ｕ量一反应关系，同时通过干扰新癌基因Ｂ．ｃａｔｅｎｉⅡ和细胞粘合分子ｃａｄｈｅ咖的排列导致芽细胞损伤ｒ】。Ｊａｃｑｕｅｔ等在青鲋鱼（Ｏｒｙｚｉａｓｌａ咖ｅｓ）处丁单细胞胚胎、神经胚１９天和胚胎２５天时，经显微注射ＭＣ－ｕｔ，观察发现胚胎４中国农业大学硕十学位论文第一章绪论死亡率上升，星剂量一反应关系，后期孵化幼体出现肝脏畸形如肝脏肥大、肝出血等。不同研究 结果的差异可能是由于胚胎上的不渗透膜阻断了＂ＭＣ－ＬＲ进入胚胎中［４４ｌ。陈建国等将火米和油菜幼 苗暴露在滇池ＭＣ初提物中，发现大米和油菜的生长受到不同程度的抑制，ＭＣ对油菜萌芽率和幼 苗高度的抑制比大米明显ｍｊ。１．２．２．４遗传毒性 目前，研究者对ＭＣ的遗传毒性在不同的水平上进行了测试｜４６－４９］。结果表明，中高浓度的 ＭｃＬＲ并不直接具有遗传毒性。但是，ＭＣ却能促进ＲＯＳ的产生，进而导致氧化型ＤＮＡ损坏， ＤＮＡ链短暂断裂，促进肿瘤的形成。宋瑞霞等采用Ａｍｅｓ试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 和单细胞凝胶电泳技术观察太湖蓝藻水华中Ｍｃ引起的细胞染色体及ＤＮＡ损伤效应。结果发现， Ａｍｅｓ试验显示太湖Ｍｃ对鼠伤寒沙门氏菌ＴＡ９８试验菌株直接作用是现致突变性，可明显增强小鼠 骨髓嗜多染红细胞的微核率，并呈一定的剂量．反应关系，单细胞凝胶电泳技术显示可诱导中国仓 鼠ｖ７９细胞ＤＮＡ单链断裂［，“ｓ－４７１。詹立等应用人类淋巴母细胞（Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ）ＴＫ６研究 ＭＣ．ＬＲ的体外遗传毒性的分子机理。结果发现，ＭＣ－ＬＲ染毒导致ＴＫ６细胞相对存活率下降，ＴＫ 基因突变频率明显上升，诱发杂合性丢失而非点突变１４…。１．２．３ＭＣ的生物富集生物富集是指分散在自然界中的一些化学性质稳定的物质被生物体吸收后，在生物体内积 累，并通过食物链逐级传递、积累、高度浓缩的现象。被生物富集的物质通常在环境中的起始浓 度极低，但经过逐渐富集后浓度可提高数百万倍，从而造成对机体的危害，导致中毒甚至死亡。 美国某地曾经使用ＤＤＴ防治某湖内的孑孓（一种蚊子的幼虫），使该湖湖水中残存有ＤＤＴ。经检 测，湖水中浮游动物体内ＤＤＴ的含量达到湖水的１００００多倍。该湖的小鱼吃浮游动物，大鱼吃小鱼，鱼鹰义吃大鱼。从而使Ｄ毗鱼鹰体内的含量高达湖水的八百多万倍。生物富集作用的研究，在阐明物质在生态系统内的迁移和转化规律、评价和预测污染物进入生物体后可能造成的危害， 以及利用生物体对环境进行监测、狰化及食品安全等方面，具有重要的意义。ＭＣ可能通过食物链生物富集，进而对生态环境和人类健康产生不利影响ｐ“。尽管目前这个 领域的证据还很少，但是检测结果显示，某些水生动物如鱼类、浮游动物、贻贝、蚌类的组织中 含有Ｍｃｐ”，提示了ＭＣ．Ｉ恿过食物链富集的可能性。 双壳类动物是水中最重要的滤食性生物。它们作为非选择性的过滤器，每小时过滤１０５ Ｌ海 水，因此能够大量的积累周围环境中的微生物和微量的有害物质，包括ＭＣ。基于这个原因，双壳 类动物可以作为海水中ＭＣ污染的靶及指示剂。但是，由于人们对于淡水双壳类动物食用较少， 因此关丁这方面的研究较少。Ｖａｓｃｏｎｃｅｌｏ等将紫贻贝（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｇａｌｌｏｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ）暴露在铜绿微囊 藻环境中１６天，发现紫贻贝能够富集环境中２４．１％－５４．８％的ＭＣ，同时＿１生紫贻贝的消化腺、胃、 鳃及肌肉中都检测到Ｍｃ的存在１５２１。Ａｍｏｒｉｍ等在实验窒中模拟葡萄牙某河口的水体状况，研究 ＭＣ在紫贻贝体内生物富集和生物释放的动力学，发现紫贻贝能够富集高达１０．５ｕｇ／ｇ干重的ＭＣ．ＬＲ，生物释放阶段粪便中含有大量的ＭＣ．ＬＲ，但是肌肉的ＭＣ－ＬＲ含量却一直变化不火ｐ“。５中国农业丈学硕士学位论文Ｄｉｏｎｉｓｉｏ第一章绪论Ｐｉｒｅｓａ等将欧亚斑马贻贝（Ｄｒｅｉｓｓｅｎａｐｏｍｏｎａ）暴露在铜绿微囊藻和微球藻（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）环境中以研究新两兰ｌｊｓｓｅｌｍｅｅｒ湖的藻毒素污染情况。结果显示，斑马贻贝对 微囊藻的释放速度明显高于微球藻。在喂食斑马贻贝微囊藻，微球藻混合藻体的情况下，斑马贻贝 体内Ｍｃ最高翕量仅为３．９ｕｇ／９１５４Ｊ。Ｗｉｌｌｉａｍｓ等也针对紫贻贝（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｅｄｕｌｉｓ）进行了类似的研究，发现富集阶段ＭＣ主要以键合的形态存在ｐ”。Ｋａｚｕｈｉｋｏ等研究了小螺（Ｓｉｎｏｔａｉａ ｈｉｓｔｒｉｃａ）生物富集 ＭＣ的特性，发现小螺能够富集４３６Ｉｔ ｇ／ｇＭＣ，由于小螺是鱼类和水禽的主要食物，因此Ｋａｚｕｈｉｋｏ推荐将小螺作为ＭＣ污染的指标口”。浮游动物能够富集０．３－－１６．４肛如干重的ＭＣ，Ｆｅｒｒａｏ Ｆｉｌｈｏ等认为，浮游动物的生物富集作用揭示了ＭＣ通过食物链向高级营养级转移的可能性田１。 鱼类处于水环境生态系统食物链的昂高等级，通过生物富集作用会吸收更多的ＭＣ，从而给 人群健康带来安全隐患。谢立强等现场调查了我国巢湖鱼体内Ｍｃ的富集状况及其鱼体各器官中 的分布情况，结果显示鱼体肝脏、肌肉、胆汁、血液、肠、肾脏中都检出ＭＣ，其中肌肉中ＭＣ．ＬＲ 的含量为２．“～４９．７Ｉｔｇ／ｌＯＯｇ，高于日容许摄入量１＿３―２５倍，暗示了食用该水体中鱼肉的健康风 险ｐｑ。Ｍａｇａｌｈａｅｓａ等调查了巴西Ｓｅｐｅｔｉｂａ水湾鱼体利取壳类动物体内Ｍｃ的富集状况，结果显示，尽 管ＭＣ含量低于日容许摄入量，但是该地区的水生生物仍受到了Ｍｃ的污染ｐ９１。Ｚａｋａｒｉａ等调查了埃 及的一个受过蓝藻污染的渔场的淡水（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）体内的ＭＣ的污染情况，结果显示鱼 体肝脏和’肾脏＠ＭＣ的含量是分别是５３１．８ｎｇ／ｇ｝１１４００ｎｇ／ｇ【…。Ｍａｇａｌｈａｅｓ等对邮ｉＪａｎｅｉｒｏ地区鱼体ＭＣ污染引起的健康风险进行了为期３年的评估，提出该地区ＭＣ的日容摄入量应小于ｏ．５Ⅱｇ／Ｌｌ”１。 目前，针对ＭＣ的生物富集的实验室研究还不多。实验室研究可以方便的控制影响富集的各 种因素，分析各个因素各自的作用和它们的综合作用。Ｊｉｍｅｎａ Ｃａｚｅｎａｖｅ等在实验室条件下，将胡 椒甲鲶（Ｃｏｒｙｄｏｒａｓｐａｌｅａｍｓ）、峨眉腹露蚍（Ｊｅｎｙｎｓｉａｍｕｌｔｉｄｅｎｔａｔａ）暴露在５０ｕ ｇＭＣ．ＲＲ的水体中２４ｈ，发现ＭＣ．ＲＲ吸收后通过血液系统运送至各个组织，肝脏是富集ＭＣ的主要器官，胆汁也富集部分ＭＧＲＲ［“１。Ｓｏａｒｅｓ等在实验室条件下研究了黑边慈鲷（１ｉｌａｐｉａ ｒｅｎｄａ肼）的生物富集和生物释 放规律，发现黑边慈鲷的其它饮食来源可以干扰ＭＣ的生物富集旧１。 某些水生生物能够滤食蓝藻水华，富集ＭＣ而不释放到水中，利用这种特性，研究者正试图 利用水生生物来控制水华。Ｍｏｈａｍｅｄ等通过研究发现，在蓝藻水华期间，当水体中的其它可食性 藻类消失的时候，大型涵（Ｄａｐｈｎｉａｍａｇｎａ）以微囊藻作为主食，体内能够富集高含量的ＭＣ，但是 在水中却检测不到Ｍｃ，这提示ＴＮ用大型涵来生物清除蓝藻水华的可能性畔】。ＭＣ也能够在有些植物体内富集。殷立彦等将沉水植物渤ｂｍｅｒｇｅｄｍａｃｒｏｐｈｙｔｅｓ）的种子并¨种凿暴露在ＭＣ．ＲＲ的环境中。结果显示。种子、种苗的叶和根都能够富集ＭＣ．ＲＲ，并且叶子和根的 富集呈时间．剂量芙系瞄ｊ。浮游植物也能富集ＭＣ。Ｆｅｒｒａｏ Ｆｉｌｈｏ等通过研究发现，浮游植物能够富 集０．３―３．９ ｍｇ／ｇ干重ＭＣｐ“。１．２．４ＭＣ与食品安全ＭＣ可以通过多种途径进入人体，包括皮肤接触、呼吸道吸入、血液透析和消化道摄入。消 化道摄入即经口摄入又分为几种方式：饮用水、食物和蓝藻膳食补充剂。尽管目前还没有因食物 而引起人类Ｍｃ中毒的报道，但是食物链的富集作用所给来的健康风险却不能忽视。 如果灌溉用水和植物生长介质中存在ＭＣ，则可能导致一些可食用植物污染ＭＣ。Ｃｏｄｄ等发现６中国农业大学硕上学位论文第一章绪论英国某农场喷雾灌溉的莴苣叶子上有直径１ ｎＬｒｌ＿ｌ的小颗粒，显微镜Ｆ观察证实这些小颗粒是微囊藻 细胞，检测结果显示莴苣叶不同部位的ＭＣ含量在０．０９４－２．５７９，ｕｇ／ｇ，后经调查发现其灌溉ｊ＝｝；ｊ水被 蓝藻水华污染１６ｑ。Ａｂｅ等发现商业菜豆中也存在类似现象１６“。若母牛的饮食中含有ＭＣ，分泌的 牛奶中可能含有Ｍｃｌ８７”。Ｏｒｒ等用浓度为１Ｘ１０５个／ｒｒｄ微囊藻藻液喂饮母牛２８天，结果表明空白组 和处理组虹浆的各个指标没有显著差异。ＨＰＬＣ训Ｕ定结果显示母牛肝脏、血液和牛奶中不含ＭＣｌ…， Ｆｅｉｔｚ等用填喂法对母牛每天喂食ＭＣ，剂量从０１１ｇ／ｋｇ逐渐增加到１３ｕｅＪｋｇ，发现肝脏未受到损伤，牛奶中ＭＣ含量低于０．２“ｇ／Ｌ，结果提示母牛体ｔ，ｑ的Ｍｃ可能转化为无毒物质１６”。目前关于 家禽中ＭＣ的富集报道还很少，但是，澳人利亚、美国、瑞士的Ａｌｐｉｎｅ地区及我国的部分地区的家 禽由于饮用蓝藻毒素污染的水而频繁的暴露于ＭＣ，提示人们食用家禽类食品染毒ＭＣ的健康风 险。某些蓝藻的藻细胞分裂后可以从大气中同定氮，为稻米的生长提供氮源，冈此稻田里的蓝藻 是有益的。但是，研究发现水稻种子和稻苗能够富集ＭＣ，稻米也可能污染ＭＣ。ＭＣ还可以在一 些鱼类、小龙虾、甲壳类动物体内富集，其中可食部分的ＭＣ浓度分＊Ⅱ可高达３００、２７００、１６０００Ａｇ／ｋｇ。蓝藻膳食补充剂具有增加能量和使人兴奋的保健作用，可以治疗儿童多动症。目前在世界各 地特别是发达国家如美国、加拿大和欧洲广泛销售。由于这些补充剂都是浓缩物，如果被ＭＣ污 染，那么ｌ三ｌ此途径接触的ＭＣ的量可能会远远高于通过其它食品而接触的量【”１。尽管此类产品的 供应商都声称他们的产品的ＭＣ水平在１．０Ａｇ／ｇ，但是有专业机构稠查显示，其中有些产品ＭＣ含 跫高达３５ Ａｇ／ｇ。Ｓａｋｅｒ等对２０份以无毒水华束丝藻（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎｌｌｏｓ．ａｑｕａｅ）为原料的蓝藻膳食补 充剂进行分析，结果显示其中ＭＣ含量在０．１＿４．７２ｚｇ／ｇＺｌ＇ａｑｔ”Ｊ。Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ等对食用型水华束丝藻的 安全性进行了风险评估，提出束丝藻类食品的安全食用水平１０．０肛ｇ幢ＭＣ．ＬＲ［”Ｊ。初步调查显示， 我国市售螺旋藻保健品ＭＣ含量在２，１―４７６．８ ｎｇ／ｇｉ＇’”。徐海滨等对我国江苏、福建、云南和广东地 区螺旋藻类保健食品生产原料及产品中ＭＣ污染现状进行了调查，结果显示７０份螺旋藻原料粉中 的ＭＣ平均污染水平是２０６．４ ｎｇ／ｇ，７１份市售螺旋藻产品中总Ｍ斟；染水平平均为３１７．２ ｎｇ／ｇ，其中 片剂和胶囊中的ＭＣ污染平均水平分别为１４２．７ ｎｇ／ｇ和２２２．６ ｎｇ／ｇ【７５ｌ，提示我国制定符合本国特点的 藻类保健食品中ＭＣ限量标准的必要性。１．２．５ＭＣ的检测方法随着人们对于ＭＣ研究的深入以及人们对其危害的广泛了解，越来越多的分析方法阁ｒ丁定性 和定量检测Ｍｃ。目前ＭＣ的检测方法主要有生物学方法、化学分析法。１．２．５．１生物学方法 以毒理学和生化反应为基础的毒理学方法和生物测试法代表了简单、快速检洌１］ＭＣ的方法。 目前在ＭＣ检测中广泛应用的生物学方法可分为生物测试法、生物化学法和免疫检测法。 （１）生物测试法 近年来，大多数实验室仍采用小鼠测试法定性检测Ｍｃ。小鼠测试一般是经口染毒或者腹】ｊ卒７中国农业大学硕十学位论文第一章绪论注射ＭＣ，急性中毒症状主要表现为肝脏广泛充血、肝脏坏死、肿胀、淤血、肝体重比增加。小 鼠测试法结果直观、快速，但是缺乏灵敏度和专一性，所需样品量大，并且近年来遭到越来越多 的人对于采用动物进行毒理实验的抗议。有些无脊椎动物如水蚤类Ｉ”Ｊ、果蝇类及蚊子幼虫的毒理 实验结果表明其也能够定性检测ＭＣ，但是目前还没有一种能够完全有效地在实际检测中应用。 目前能够代替小鼠测试的一种简便、成本较低的方法是盐水虾法１７“，这种方法由于所需实验 设施少，适台于只具备基础实验条件的实验室采用。在２５０ｃ盐水虾生长液中将盐水虾暴嚣于不同 浓度的测试样品１８ ｈ便可得到ＬＤ，。。但是，和小鼠测试类似，该方法也缺乏专一性，受样品成 分的干扰较大。 某些植物也能用于ＭＣ的生物测试［７８－７９Ｊ。Ｍｉｃｈｅｌｌｅ等将家独行菜（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）暴露于１ｍｇ／Ｌ＊Ｕ１０ ｍｇ／Ｌ的ＭＣ提取液中６天，和对照组相比，暴露于１０ ｍｇ／ＬＭＣ提取液环境中的家独行菜根、叶子Ｋ度和幼苗鲜重急剧减小，其结果和暴露在１０ｍ删ｃ标准液中相似【７８Ｊ。Ｐｅｔｅｒ Ｋｏｓ等用芥菜种子检测ＭＣ，其灵敏度高于小鼠测试，缺点是所需时间较长１８】。 （２）生物化学法 ＭＣ能够抑制蛋白磷酸酶ＰＰＩ｝ＩＩＰＰ２Ａ的活性。近年来，利用ＭＣ的这种生化特性，蛋白磷酸酶 法被越来越多的应用于ＭＣ的实际检测中。由于蛋Ｉ气磷酸酶能够指示ＭＣ的活性程度，加上蛋白磷 酸酶已商业提取，所以这种方法灵敏度高、快速、有效、简便。其原理是以磷酸化蛋白为底物， 测定ＭＣ对蛋白磷酸酶的抑制程度，即测定ＭＣ、磷酸化蛋白、蛋白磷酸化酶反应厉释放的磷酸盐 的量来检测ＭＣ的量。用蛋白磷酸酶ＰＰｌ测试的灵敏度约蛋ｆ气磷酸酶ＰＰ２Ａ的５０％口ｏｊ。最初采用蛋 白磷酸酶法检测时多用”Ｐ来标记底物，但随着硝基苯酚磷酸酯（ｐＮＰＰ）可被蛋自磷酸酶水解现象 的发现，目前多以硝基苯酚磷酸酯为底物，根据其被水解后产生的有色产物的多少来确定毒素的 最口”。Ｂｏｕａｉｃｈａ等－－用荧光底物来检测蛋白磷酸酶ＰＰ２Ａ的抑制剂阻Ｊ，ＰＰ２Ａ可将虫荧光素磷酸盐水 解为虫荧光素和磷酸盐，此方法和硝基苯酚磷酸酯法对比，灵敏度提高２倍，重现性较好。蛋向 磷酸酶法的检测限度是ｐｇ级，低于ＷＨＯ的标准。该方法的缺点是它对各种ＭＣ的灵敏度不同，不 能够区分ＭＣ和其他的蛋白磷酸酶抑制剂，测定的是ＭＣ总量，如果蓝藻本身具有内源蛋白磷酸酶 活性，则有可能使其检测结果偏低。 （３）免疫检测法 免疫检测法的原理是利用ＭＣ诱发免疫反应产生抗体，利用抗体对抗原的特异性识别来对各 种毒素进行检测。自８０年代开始，酶联免疫法（Ｅｎｚｙｍｅ．Ｌｉｎｋｅｄ］ｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）Ｔ］ｃ：始 用于ＭＣ的检测。目前．以免疫技术为基础，ＭＣ的免疫检测方法包括酶联免疫吸附法、免疫蛋 白磷酸酶抑制法、免疫亲和色谱法。免疫检测法灵敏度较高、样品处理简单，便于操作，其检测 限低于ＷＨＯ水平，作为一种生物学方法，免疫检测方法被认为楚一种最有发展前景的方法。 近年来，免疫检测法已发展出多种单克隆抗体和多克隆抗体，用这两种抗体制成的ＭＣ酶联 免疫试剂盒已商品化。但是由丁这些试剂盒所用抗体一般是针对ＭＣ－ＬＲ设计，使得它对于ＭＣ 其它单体交叉反应性低，因此试剂盒对于许多天然存在的ＭＣ灵敏度差异较大，不能检测所有的 毒素。于是，能标记所有的ＭＣ单体的单克隆抗体的制各技术成为免疫方法应用发展的关键。８中国农业人学硕十学位论文第一章绪论１．２．５．２化学分析法和生物学方法不同，许多化学分析法不仅能定量、精确的检钡ＩＪＭＣ，还能针对样品中的各种 ＭＣ进行更详细的分析，但是由于化学分析方法需要复杂的前处理过程，并且所需的仪器价格昂 贵，限制了它的实际应用。目前，气相色谱（ＧＣｌ、薄层色谱（ＴＬＣ）、高效液相色谱ＯＩＰＬＣ）、液相 色谱，质谱分析（ＬＣ．ＭＳ）及毛细管电泳ｆｃ聊等检测技术都在ＭＣ的检测中得以应川，其中以ＨＰＬＣ法 应用最广。 化学分析法的样品前处理过程一般包括提取、浓缩过程。提取溶剂主要有５％的乙酸、甲醇、 酸式甲醇和丁醇／甲醇／水（５：２０：７５）［ｓｚ－ｓ４１，５０％－－８０％甲醇溶液以高效的提取率被越来越多的 实验宝所采用。常用的前处理浓缩方法是蒸发和同相萃取。近年来同相萃取成为浓缩的主要方法， 一般采用Ｃ１８为填料的反相柱或者采用ＨＬＢ。Ｊａｒｋｋｏ Ｒａｐａｌａ等比较了Ｃ１８和ＨＬＢ柱对于ＭＣ的回收 率，结果表明ＨＬＢ的回收率要高瞄ｌ。近年来，随着新的萃取技术的出现，固相微萃取技术（ＳＰＭＥ）、 基质固相分散萃取技术１８６ｌ（ＭＳＰＤＥ）和免疫吸附萃取技术ｉｓ”（ＩＥ）等也应用于ＭＣ检测的前处理 中。这些技术高效、快速、节省时间，耗费有机溶剂极少甚至不用溶剂，提高了样品中ＭＣ的提 取率，保证了检测数据的准确性。 （１）高效液相色谱法 大多数实验室目前常用配有二极管阵列检测器的反相高效液相色谱（ＨＰＬＣ－ＰＤＡ）来进行ＭＣ 的常规检测。样品中ＭＣ单体的分离在很大程度上依赖于分析中采用的同定相和流动相。等度洗 脱和梯度洗脱都能够将ＭＣ单体分离。目前广泛应用的高效液相色谱法采用反相Ｃ１８色谱柱，以含 有０．０５％的三氟乙酸的乙腈溶液和含有０．０５％的三氟乙酸的水溶液进行梯度洗脱【８”。三氟乙酸作 为离子配对剂能够调节流动相的极性，达到更好的分离的目的。尽管这种方法能够分离１０种以上 的极性不同ＭＣ单体。但是在实际分析样品时经常要采用多种的流动相才能保证将ＭＣ单体分离出 来，比如采用酸式乙腈／水作为流动相时，甲酯化的ＭＣ―ＬＲ经常和其它的单体一起洗脱下来，而 醋酸铵和乙腈组成的流动相则可以很好的解决这个问题。 二极管阵列检测器是目前常用的检测器，但是由于ＭＣ单体在２００ｎｍ币１３００ｎｍ处都有相似的 吸收峰，使其区分各种单体的能力受到限制。这是因为ＭＣ的士要发色基团是连接有双烯基团的 Ａｄｄａ残基，其在２３８ ｎｍ处有最大吸收波长。含有色氨酸的单体｛ｔＮＭＣ．ＬＷｌ）！Ｉ］更容易被检测器检测 到，它的最大吸收波长是２２２ｎｍ。 （２）质谱法 质谱分析法（ＭＳ）是通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一种分析方法。被 分析的样晶首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同，把离子按质荷比 （ｍ／ｚ）分开而得到质谱，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果。高效液相色谱一质谱（ＨＰＬＣ－ＭＳ）及高效液相色谱～质谱一质谱（船Ｉｃ．Ｍｓ。ＭＳ）可以更精确的检测ＭＣ／８９－９０Ｉ。快原子轰击电离、电喷雾电离、基质辅助激光解吸电离等技术提供的结构信息为毒素 单体提供详细的结构信息。近年来高效液相色谱一电喷雾电离质谱（ＨＰＬＣ－ＥＩ．ＭＳ）越来越多的应Ｊ＿｝ｊ 于各种蓝藻毒素包括ＭＣ的检测。ＨＰＬＣ－ＥＩ．Ｍｓ能够将ＭＣ电离产生【Ｍ＋ＨＩ＋和【Ｍ＋２Ｈ］“，通过该９中国农业人学硕＋学位论文第一章绪论分子量信息可以确认ＭＣ单体。在缺乏标准品的条件下，ＨＰＬＣ．ＭＳ－ＭＳ在检测来知的ＭＣ单体上具 有很人的优势。离解轰击诱导生产的碎片离子如由Ａｄｄａ产生的特征碎片离子ｍ／ｚ１３５在鉴定含有多 种干扰化合物的环境样品时是一个有利的检测条件。 （３）毛细管电泳法 毛细管电泳法（ｃＥ）是晟新的色谱分离技术，它根据分子的人小以及所带电荷来分离样品， 具有分离效率高、速度快、所需样品少、成本低及自动化程度高等特殊的优点，已广＋泛用于蛋白 质、氨基酸、核营酸、无机离子、有机化合物和药物等的分离分析方面。目前该方法发展了多种 检测模式，包括区带电泳（ＣＺＥ）、胶束电动色谱（ＭＥＫＣ）等。ＧａｂｏｒＶａｓａｓ等采用ＣＺＥ和ＭＥＫＣ模式坳ｔＪＭＣ．ＬＲ，其检测限是１－－６ ｍｇ／Ｌｔ９”。和ＨＰＬｃ法相比，ｃＥ法灵敏度不高，但是其所需样品量少，特别适合于小体积样品，如果ＣＥＳｆｌ荧光检测及电喷雾质谱一起廊用则可能提高其检测限。 （４）薄层色谱法 薄层色谱法（ＴＬＣ）是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，不仅适用于 微量样品的分离，也适用于较大量样品的精制（可达５００ｍｇ）。采用ＴＬＣ法来分离和检测ＭＣ， 所需专业设备和专业技术较少，特别适合于只具备基本实验条件的实验室。这种方法的检测限在１０ｎｇＭＣ－ＬＲ，可以和免疫学方法、蛋白磷酸酶法配合使用。（５）其它方法 当用臭氧来氧化ＭＣ时，Ａｄｄａ大量裂解产生２－甲基．３．甲氧基－４．苯基Ｊ’酸（ＭＭＰＢ）［９２１。当用 高锰酸盐和高碘酸盐来氧化ＭＣ时，也会产生这种化合物。因此，人们发展了以ＭＭＰＢ作为标准 品测定ＭＣ的方法，产生的ＭＭＰＢ可由气相色谱一质谱、带有荧光检测器的高效液相色谱来测定。 该方法用来检测样品中ＭＣ的总量，检测限可达０．４３ ｎｇ。ＭＭＰＢ法灵敏度高，并且无需ＭＣｂ？，准品． 特别适用一些复杂样品如难以苹取的沉淀的检测，但是由于时间消耗氏，不能区分ＭＣ单体，很 难在实际中应Ｊ｛ｊ。Ｍｅｒｉｌｕｏｔｏ等采用带有电流检测器的高效液相色谱来检测Ｍｃ―ＬＲ、ＭＣ．ＹＲ和 ＭＣ－ＲＲ。该方法通过将精氨酸和酩氨酸残基氧化以获得的电化学响应ｐ”，适用于含有氧化型氨 基酸残基的ＭＣ的检测。１．３研究内容和目标本课题主要的研究内容包括以Ｆ几个方面： （１）建立ＭＣ的高效液相色谱检测方法。 高效液相色谱法是目前常用的ＭＣ的检测方法，但是由于各实验室仪器条件的差异及检验稃 序的差异，该方法的普及还存在一定困难。另外，由于高效液相色谱法前处理比较复杂，如何控 制前处理的关键环节，目前研究的还比较少。本实验通过对高效液相色谱检测ＭＣ前处理过程关 键环：竹的优化研究，旨在探索更为准确、灵敏的ＭＣ的ＨＰＬＣ检测方法，为该方法的普及虑用提 供科学依据，为环境中ＭＣ的监测打下基础。 （２）建立ＭＣ的高效液相色谱一质谱检测方法，对藻样中的各种ＭＣ单体进行定性分析。ｉ０中国农业大学硕士学位论文第一章绪论高效液相色谱法能够很好的对具有标准品的己知ＭＣ单体进行检测分析。但是对于未知单体 的定性却无能为力。本实验首先建立ＭＣ的高效液相色谱一质谱检测方法，然后采用高效液相色 谱一质谱法对蓝藻样品进行定性分析，旨在研讨监藻中的未知毒素，为人制更好的认识ＭＣ并进 一步对其分析打下基础。 （３）研究ＭＣ对鲫鱼的急性毒性 ＭＣ能够对鱼体产生毒性，并且高剂最的ＭＣ则可能导致鱼体的急性死亡。本实验利用鲫鱼 为研究对象，评价ＭＣ对鲫鱼的急性毒性，阐明急性毒性的浓度．反应关系与生物中毒特征，为 进一步进行亚急性毒性和慢性毒性试验以及其它特殊毒性试验提供依据。 （４）研究ＭＣ在鲫鱼体内生物富集和生物释放的规律。 ＭＣ能够对水生生物产生毒性，并且由于食物链的放大作用，可能对人类的健康产生风险。 本实验在急性毒性实验的基础上，研究ＭＣ在鲫鱼体内生物富集和生物释放的规律，以期为制定 淡水渔业ＭＣ的限量标准及食品中ＭＣ的限量标准提供依据。１１中国农业』：＝学硕士学位论文第二二章高效液相色谱法检测微囊藻毒素第二章高效液相色谱法检测微囊藻毒素２．１前言ＭＣ产生并主要包含在蓝藻活细胞内，当细胞破裂或者衰老、死亡屙，则释放到水体中。因 此，ＭＣ通常包括胞内毒素（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ，ＩＭＣ）和胞外毒索（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ，ＥＭＣ）。但是由Ｔ。水体的稀释作用，在环境中，ＭＣ常以痕量的形式存在，且干扰物质较多，对检 测方法的要求较高。高效液相色谱法（Ｈｉｇｈ ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）是分离和检测Ｍｃ的常用手段之一。ＨＰＬＣ法准确、灵敏，结果重现性好，能够分离不周的ＭＣ单体，广 泛的麻用于ＭＣ的分离和制各中，是国内外权威机构推荐的ＭＣ检测方法。国内外许多文献都报道 了不同实验室的ＭＣ的检测方法，但是由丁各实验室仪器条件的差异及检测程序的差异，极大地 影响了相关资料之间的对比分析，给该方法的普及和实际应用带来困难。本实验通过对ＭＣ常见 单体ＭＣ－ＬＲ的ＨＰＬｃ法检测的色谱条件及前处理过程中的关键环节的优化研究，旨在探索更为准 确、灵敏的ＭＣ的ＨＰＬＣ检测方法，为该方法的普及应用提供科学依据，为环境中ＭＣ的监测打下 基础。２．２材料与方法２．２．１实验材料２．２．１．１ＭＣ标准品ＭＣ标准品ＭＣ－ＬＲ，纯度＞９６％，瑞士Ａｌｅｘｉｓ公司。２．２．１．２铜绿微囊藻的培养实验中所用的铜绿微囊藻（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｌ购于中国科学院水生生物研究所，由该实 验室于武汉宝安湖分离得到。培养基采用ＢＧ．儿培养基，培养液于１２１。Ｃ灭菌１５ ｍｉｎ。实验前将 藻种在３０００１）（、２５。Ｃ条件卜扩大培养一周左右。然后将其按照５％．１０％的体积比接种丁盛有２００ｍＬ 培养液的三角瓶中，室温下摇床培养，摇床转速为１３０ ｒ／ｍｉｎ，光暗【＝Ｅ１６：８，１５天后将培养液离 ，ｔｊ，Ｏ ａＯＯＯｇ）５ ｍｉｎ。倾去上清液，留待备用。 ２．２。１．３实验试剂 实验中所用试剂如表２．１。 ２．２．１．４实验仪器 实验中所用仪器和设备如表２．２。表２―１实验用试剂一览表Ｔａｂ．２－１ Ｓｈｅｄｕ］ｅ ｏｆｃｘｐｅｒ面ｅｎｔ ｒｅａｇｅｎｔｓ试剂名称 甲酸（色谱纯） 甲醇（色潜纯） 正丁醇（化学纯） 冰乙酸（化学纯） Ｍｉｔｌ．Ｏ超纯水 表２．２实验用仪器和设备一览表Ｔａｂ．２?２ Ｓｈｅｄｕｌｅ ｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｐｐａｒａｔｕｓ厂商 瑞士Ｆｌｕｋａ公司荧国Ｔｃｄｉａ公司北京化学试剂厂 北京化学试剂ｒ 美ｌ目Ｍｉｌｌｐｏｒｅ公司仪器名称 Ｂｒａｎｓｏｎｌｃｌ２１０水浴超声振荡器Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｖｉｓｉｐｒｅｐ周相萃取柱Ｊ商 美国Ｂｌａｎｓｏｎ公司 黄国ｓｕｐｅｌｃｏ公刊美国ｗａｔｅｒｓ公司 美国ｗａｔｅｒｓ公司Ｗａｔｅｒｓ ９９６二极管阵列检测器 Ｗａｔｅｒｓ７１７自动进样器 Ｗａｔｅｒｓ６００ｃ控制器 ＴＤＬ－５０Ｃ低速台式离心机 真空杯式过滤器 Ａｉｒ－－Ｃａｄｅｔ真空／压力泵 ＷＳＺ－１００Ａ回旋振荡器美国ｗａｔｅｒｓ公司 上海安亭科学仪器厂 德国Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公＝ｊ 美国Ｃｏｌｅ．Ｐａｌｍｅｒ公司 上海一恒科技有限公司２．２．２实验方法２．２．２．１色谱条件流动相为含０．１％甲酸的甲醇：水（８０：２０）。拄温２５。Ｃ，检测器波长：２３８ｎｍ，进样量２０，ｕＬ 流速０．８ｍｌｄｍｉｎ。２．２．２．２水样的前处理取１０００ ｍＬ水样，下杯式过滤器中经０．４５ ｕ ｍ滤膜减压过滤，置于水浴超声波中震荡３０ ｒａｉｎ，然后将其注入用１０ｍＬ甲醇、１０ｍＬ水预先活化围相萃取柱中，萃取流速３ｍｌＪｍｉｎ。样品全部吸 附后，用１０％的甲醇溶液淋洗小柱以净化样品。待用空气将周相萃取小柱吹干后，删５ｍＬ的甲醇 溶液减压洗脱，待洗脱液浓缩至０．１ ｍＬ以卜，用１００％甲醇将其定容到１ ｍＬ，待测。２．２．２．３藻样的前处理取５ ｍＬ藻浆液放入小烧杯中，加入１０ ｍＬ提取溶剂，置丁水浴超声波中提取３０ ｒａｉｎ，离心１３（１１０００ ８）１０ ｍｉｎ，取上清液，残渣再重复提取两次，合并上清液，将上清液在６０。Ｃ水浴条件下 浓缩至干，然而ｌＪＩＸＩＯ ｍＬ水。以后处理同２．２．２．２。 ２．２．２．４实验设计为优化提取效果 提取时间、甲酸浓度在溶剂选择为甲醇的基础上，选择对提取效果影响较大的提取溶剂浓度、进行提取率的响应面ｉ黏ｔ（ｎ＝ｉ５），因素水平编码见表２―３。表２．３响应面分析因素与水平Ｔａｂ．２－３ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｆｏｉ ＲＳＡ２．３结果与讨论２．３．１色谱条件的选择２．３．１．１色谱柱的选择ＭＣ属于疏水性环肽肝毒素，它的疏水性主要ｆｌｊＡｄｄａ基团和其它一些疏水氨基基团如精氨酸的存在而引起的，因此Ｍｃ的检测一般采用反相Ｃ１８色谱柱，流动相采用酸式流动相㈣。不同的Ｃ１８柱，因键合方式等的不同，对同一种化台物的保留特性和选择差异很大。实验中比较了几种 类型的反相色谱柱的，如表２－４。表２．４不同色谱柱的色谱条件Ｔａｂ．２－４ Ｃｏｌｕｍｎｓ ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄｓ结果表明，Ｚｏｒｂａｘ．Ｃ８，Ｋｒｏｍａｓｉｌ．Ｃ１８ ＸｉＪ－ＭＣ．ＬＲ的响应值较低，Ｓｕｐｅｌｃｏ―ｃ１８有较好的响应效 果并且峰形较好，因此本实验采Ｊ咱Ｓｕｐｅｌｃｏ―Ｃ１８作为分离色谱柱。 ２．３．１．２流动相的选择目前，国内外用于Ｍｃ的分析的流动相多为乙腈水溶液【“１，但是由于乙腈毒性大，本文采用 甲醇水溶液作为流动相。ＭＣ含有多肽羧酸基团，在流动相加入少量的酸使ＭＣ羧基、酚羟基的电１４中国农业大学硕士学位论文第二章高效液相色漕法检测微囊凛毒索离受到抑制，能够促进ＭＣ的分离。目前国内外采用的酸性物质主要有磷酸盐、三氟乙酸和甲酸， 但是磷酸盐容易造成管路堵塞，三氟乙酸对电离的抑制作用很强，不利丁低浓度ＭＣ的检测，冈 此本文在综合国内外文献的基础上采用容易挥发的甲酸来调节流动相的酸度。本文摸索出适合本 实验的理想的洗脱条件：采用含有０．１％甲酸的甲醇：水（８０：２０）溶液等度洗脱。紫外波长２３８ａｍｒ，其出峰时间为４．６５ ｍｉｎ。图２．１为１ ｍｇ／ＬＭＣ―ＬＲ标液ＨＰＬＣ图。图２－２为其２３８ｌｌｌｎ处紫外光谱图。㈨Ｏ㈣）ｑ８一 Ⅲ Ⅲ Ⅲｅ●：ｊ■～２．ｏｏ ●，ｏｏ６∞圈２．１ ＭＣ．ＬＲ标祥色谱图 Ｆｉｇ．２?１ＨＰＬＣｐｒｏｆｉｌｅｏｆｓｔａｎｄａｒｄＭＣ－ＬＲ：：０ ００２●０ ００２６０ ００●ｍ图２．２ＭＣ．ＬＲ的紫外光谱圈ｏｆＭＣ－ＬＲＦｉｇ．２－２ ＵＶ Ｓｐｅｃｔｒａ２．３．２固相萃取条件的选择２．３．２．１固相苹取柱的选择由于环境中的ＭＣ浓度较低，因此ＭＣ的检测一般经过固相萃取（ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＳＰＥ）处理。文献报道键合Ｃ１８柱导致了较低的回收率ｍｌ，本实验对比了Ｃ１８（２００ｍｇ）、Ｃ１８（１９）、ＨＬＢ 三种吲相萃取柱对ＭＣ富集的回收率。三种萃取枉均按照生产说明进行括化，样品洗脱前，分别 ＿Ｉ｛＝１２０％的甲醇和５％的甲醇淋洗Ｃ１８和ＨＬＢ柱。其结果如图２，３。 图２－３结果显示，Ｃ１８（２００ｍｇ）、Ｃ１８（１９）、ＨＩＭ柱对于ＭＣ的平均回收率分别为４８．３０％、 ６１．３０％、８１．２９％，经显著性分析ｐ＜０．０５．ＨＬＢ对于ＭＣ的同收率明显高于Ｃ１８枉。Ｌｅｅ等报道键合ＬＭＳ（１ＣＣ ２５ ｍｇ）适用于ＭＣ．ＬＲ、ＭＣ－ＲＲ及ＭＣ．ＹＲ的萃取雌Ｊ，Ｓｐｏｏｆ等报道Ｃ１８硅胶柱适用丁ＭＣ．ＬＲ和ＭＣ．ＲＲ的萃取【９６】，并且通过在提取溶剂中加入三氟乙酸能够提高后者的萃取效果ｐ“。土里查些查兰竺：当兰竺鲨耋，，，！，，，，，。，。，，，。。，；。耋三耋，室鍪鎏塑垒耋耋竺塑塑堑！ｉ！ｉ垒Ｄｏｎｇｉｉｎ Ｐｙｏ锝报ｉｔｉＣＮ（ＣｙａｎｏｐｒｏｐｙｌＣａｎＴｉｄｇｅｓ３柱Ｒｑ萃取效果最有效㈣。ｃ１８柱主要是基于功能基团的疏水性起作用的，ｃＮ枉则是通过将Ｍｃ和亲水基团键台在一起发挥作用的，而ＨＬＢ柱ｌｆ！ＪＪ形 成一种疏水利亲水基团的共聚体。ＭＧｕｔ上的精氨酸单元可能和ｃ１８硅胶形成疏水键而难以被洗 脱下来，ＨＬＢ则能更好的发挥效果。￡黯 擎 匣如∞弛∞如柏鲫加ｍｏ，０●｝［ＬｌＣ１８（２００ｍｇ）■一．ｃ１８（１９）ＨＬＢ图２．３不同ＳＰＥ柱对ＭＣ的回收率Ｆｉｇ．２－３ＲｅｃｏｖｅｒｙｏｆＭＣ－ＬＲｕｓｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔＳＰＥ ｃｏｌｕｍｎｓ２．３．２．２淋洗滚酌遮撵 港洗的目的魁在不造成Ｍｃ损失的同时漕赊样是中鲍千扰缀分。ＭＣ孛含蠢大量的蒺题餐鑫，５∞耥ｍｆ可踅光蕊）有典鍪特征嗷收圈。它们对潲的检测露很大的千抗伟用，必须程检测前除去。本实验鞋凇褪箍液为襻龋，持其在ＨＬＢ较上密集薏，选翊５ｍＬ包括藻红缀自、藻蓝蛋白、藻红蓝蛋白和其谨藻蛋白等，分别在３００―４００ｎｔｏ（紫外Ⅸ１和５够、１０％、２０％、３０％豹学簿溶液淋洗斛定捆，结果如图拟。续累表疆，５％警醇溶渡帮１０％警醇溶滚对于耕ｅ豹淋洗簸聚蘸蹦不大，２０％、３０％的甲酵溶液则对Ｍｃ的检测造成损失，且随赣甲醇浓发的增加损失增多。色谱 翻发现５％甲醇淋洗时起始基臻较高，杂酶较多。缔台提取量和出峰情况的综合结果，选取１０％甲 簿溶液作为淋洗方案。１５１０５０｝…翻一胃一凰一５％匿２４不间淋洗滚下ＭＣ―ＬＲ的提取鬟Ｆｉｇ，２４ Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＭＣ－ＬＲ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗａｓｈｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ２．３．２。３洗脱液的选撵 ＤｏｎｇｉｉｎＰｙｏ等报道采用乙精水溶液洗麟ｓＰＥ柱对予ＭＣ的提取拳裹‘…，健楚鑫于Ｚ；骥对予蜜１６中国农业大学硕十学位论文第二章高效液相色谱法榆测微囊藻毒索验人员危害较大，并且成本较商，闽此一般实验室推荐采用甲醇水溶液来洗脱ＭＣ。ＬｉｎｄａＡ． Ｌａｗｔｏｎ等报道７０％的甲醇对ＴＭＣ有很好的洗脱效果【９…，ＳｕｎｄａｒＲａｍａｎａｎｌ贝１］认为８５％的甲醇对丁 样品中的ＭＣ．ＬＲ和ＭＣ．ＬＡ有良好的效果ｆｌ舯Ｊ。本实验以ＭＣ粗提液为样品，采用５０％、７０％、９０ ％、１００％的甲醇水溶液米洗脱ＨＬＢ柱，结果如图２－５。结果表明，７０％的甲醇对ＭＣ－ＬＲ的洗脱效 果昂好，当甲醇浓度增加时，洗脱时会有一些杂质被同时洗脱一ｔ－来，造成色谱峰干扰严重。采用 １０％甲醇溶液淋洗ｓＰＥ柱，７０％甲醇溶液洗脱ＳＰＥ柱方案提取实验室培养铜绿微囊藻藻样的色谱 图如２．６，其紫外光谱图如图２－７。笛 加 ：２ ｍ一已＊苗＿１０＝，ｏｆｏｌ｝ ｉＬ７０％１一图２．５不同洗脱溶液下ＭＣ．ＬＲ的提取量Ｆｉｇ．２?５ＴｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＭＣ－ＬＲ ｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｌａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ０００３ＯＤ０２｛ｏ加‘ＯＤＯＯ图２－６实验室铜绿微囊藻藻样中的ＭＣ．ＬＲ的色谱图Ｆｉｇ．２－６ＨＰＬＣｐｆｏｆｉｌｅｏｆＭＣｏＬＲｏｆ ａｌｇａｅ ｓａｍｐｌｃ ｃ，ａｌｔｕｒｅｄｉｎｔｈｅｌａｂＯＯｌ ０Ｏ ００ ｓＯ０００图２―７实验室铜绿微囊藻藻样中ＭＣ－ＬＲ的紫外光谱图Ｆｉｇ．２－７ ＵＶ ＳｐｅｃｔｒａｏｆＭＣ?ＬＲ ｏｆａｌｇａｅ ｓａｍｐｌｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｂ１７中国农业大学硕士学位论文第二章高效液相色谱法检测微囊藻毒素２．３１３样品提取条件的选择２．３．３．１细胞破碎方式的选择ＭＣ主要存在于蓝藻的活细胞内，实验研究表明，在蓝藻对数生长期内。水中溶解毒素仅ｒ々总 量的１０％－－２０％。因此，一般检钡ＪＪＭＣ含量都需事先将蓝藻细胞破碎，以释放毒素。目前蓝藻细胞 的破碎方法主要有反复冻融、超声波破碎及沸水浴破碎等方法。鉴于沸水浴主要用于大龟细胞的 提取【１０１Ｊ，本实验比较了冻融三次、超声波三次、冻融一次后再超声波两次三种细胞破碎方式对 ＭＣ．ＬＲ提取效果，其结果如图２―８。篮加坫ｍ 一童∞３宙＿１０＝；ｏｆ＿．，。－｝Ｌ一ｌ―Ｌ冻融３次 冻融１次，超声波２次超声波３次图２．８不同细胞破碎方式的提取效果（超声３０ｒａｉｎ）Ｆｉｇ，２－８Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｗｉｌｈｄｉｆｆｃｒｃｎｌ ｃｅｌｌｄｉｓｎａｐｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎｆｏｒ ３０ｒａｉｎ）图２．８结果显示，超声波对于ＭＣ的提取效果最好，冻融对于ＭＣ的提取量较低，即使冻融后 再超声波３０ 方式。ｍｉｎ２次也没有使提取效果发生显著变化。因此本文选择超声波破碎作为细胞破碎的２，３．３．２提取溶剂的选择监藻细胞经细胞破碎屙，ＭＣ毒素释放到水体中。但是，在研究冷冻干燥藻粉和藻浆的提取 时发现，当采用水作为提取溶剂时，ＭＣ的提取量不高。在ＭＣ的溶剂蒂取中，因为样品中ＭＣ的 变体范围的不同，以及不同毒素的性质没有统一，所以使用的提取剂种类很多。目前，常片』的ＭＣ 的提取溶剂主要有甲醇的水溶液、５％乙酸、水：甲醇：ｒ醇（２０：７５：５）［１０２１。本实验以同样 的藻样为原料比较了三种溶剂对于藻样的提取效果，结果如图２．９。 图２―９结果显示，７０％甲醇溶液和水：甲醇：丁醇（２０：７５：５）溶液对ＭｃＬＲ的提取效果 Ｌｔ５％乙酸效果好，并且色谱图发现，采用５％乙酸提取时，ＭＣ－ＬＲ的山峰时间发生变化。Ｂａｒｃｏ 等报道，采用甲醇水溶液来提取疏水性和亲水性ＭＣ比甲醇和水的单独使用有更好的提取效果， 最有效的提取方式能够获得大约６０－－７０％的疏水性ＭＣＳＨ８０－－９０％的亲水。［牛ＭＣＩｓ３］。闫海等报道４０ ％的甲醇溶液能够有效的提取ＭＣ－ＬＲ和ＭＣ．ＲＲ［１０ａ］。尽管本文旋现７０％甲醇溶液和水：甲醇：丁 醇（２０：７５：５）溶液对于ＭＣ．ＬＲ的提取效果相当，但是鉴丁＝甲醇溶液更方便获得，因此本文采 用甲醇溶液作为提取溶剂。在此基础上，结合前人的报道，本文对影响甲醇提取ＭＣ的关键因素１８提取时间、甲酸浓度、及甲醇浓度进行优化设计，其结果见２．３．４。２５―２０量”ｉ１０５０５％乙酸７嘶甲酵水：甲醇：丁醇图２－９不同提取溶剂对实验室铜绿微囊藻藻样的提取效果ｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｔｈｅｌａｂｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｆｉｇ．２－９Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＭＣ－ＬＲ ｏｆａｌｇａｃ ｓａｍｐｌｅ２．３．４提取条件的优化２．３．４．１回归模型的建立和统计分析甲醇提取ＭＣ．ｕｔ响麻面实验结果如表２．５。试验号１―１２是析园试验点，试验号１３－１５是中心试 验点。１５个试验点分为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在ｘｌ、Ｘ２、Ｘ３所构成的三维顶点， 零点为区域的中心点，零点试验重复３次，用以估计试验误差。用ＳＡＳｖ ８．０软件对所得数据进行 回归分析，得到回归方程Ｙ１＝１６．６７―０．５３６１Ｘ１＋１．１２２Ｘ２ ４－０．７２２９）（３―１．９３１Ｘ１２ ４－１．８６０Ｘ１ｘａ＋Ｏ．２５５６Ｘ１Ｘ３一Ｏ．８１５７Ｘ２ｚ 一１ｔ６８８ＸｚＸ３―１．１４９Ｘ３２表２－５响应面设计安排及实验结果Ｔａｂ．２－５ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ＩｅｓｕｌＩｓ ｏｆｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｄａｃｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ中国农业大学顾七学位论文第二章高效液相色谱法检测微囊藻毒索２．３．４．２回归方程的失拟性检验和显著性检验同归方程的方差分析如表２―６，结合回归方程的方著分析的失拟项均方及纯误差均方，对回归 方程进行失拟性检验，Ｆ】＝１０．５８＜Ｆｏ．∞（３，２）＝１９．１６，结果表明差异不显著，即回归方程对所有的试 验点拟台度好。对回归方程进行显著性检验，Ｆ２＝６．１８４＞Ｆｏ．ｏｓ（３，２）＝４．７８，线性相关系数Ｒ２是 ０．９２４，离回归标准差为０．９９６，表明同归关系达到显著水平，由响应面所获得的模型能够反映实 际规律，是有效的。表２―６回归方程各项的方差分析表Ｔａｂ．２－６ Ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆｌｔｅｍｓ ｏｆｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏａＦ０∞（３?２）＝１９．１６，ｈｏｌ（３，２）＝９９．１７１ ｈ０５（９，５）＝４．７８；Ｆｏ．ｏｌ（９．５）＝１０１５２．３．４．３回归系数的显著性分析对同归方程系数进行ｔ检验，其结果如表２－７，从表中可以看出，回归系数Ｘ：、Ｘ。、Ｘ，ｚ、Ｘ。，２Ｘ，、Ｘ３Ｘ：?Ｘ，在置信度９０％以上显著，其它系数的ｔ检验的置信度都在９０％以下，去除不显并项，同归方程可简化为方程ＹＩ＝１６．６７＋１．１２２Ｘ２＋０．７２２９Ｘ３?１．９３１Ｘ『ｌ‘＋１．８６０Ｘ１ｘ２―１．６８８Ｘ２Ｘ３―１．１４９Ｘ３２同归系数的显著性分析结果表明，在ＭＣ―ＬＲ提取的影响因素中，甲酸浓度、甲醇浓度、提取 时间的平方、甲醇浓度的平方、提取时间和甲酸浓度的交互作用、甲酸浓度和甲醇浓度的交互作 用均为显著网素，其中甲酸浓度、提取时间的平方、提取时间和甲酸浓度的交互作用、甲酸浓度 和甲醇浓度的交互作用极为显著。甲酸浓度、甲醇浓度、提取时间和甲酸浓度的交互作用与ＭＣ―ＬＲ 提取量呈正相关性，而提取时间平方、甲酸浓度和甲醇浓度的交互作用、甲醇浓度的平方则对 ＭＣ．ＬＲ提取量的增加起抑制伟用。表２．７回归方程中回归系数的显著性分析Ｔａｂ．２－７ Ｔｈｅ ｎｏｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｃｆｆｉｅｅｎｔ ｏｆｔｈｅ ｅｑｕａｔｉｏｎ２．３．４．４主效应分析由于同！Ｊ＝Ｉ模型本身已经没有量纲形编码代换．其偏回归系数已经标准化，故可直接用绝对值 大小来判断各因子的相对重要性，即一次项系数的绝对值大小来判断各网子对响应影响的相对重 要性。由同归方程可知，一次项回归系数绝对值的大小依次为Ｘ２＞Ｘ３＞Ｘ１，说明甲酸浓度对 ＭＣ．ＬＲ提取影响最大，甲醇浓度次之，提取时间对其影响较小。 ２．３‘４５单因子效应分析在单因子效应分析中，采用降维方法，分＊Ｈ将两个因子固定在零水平，即可得到３个以其中 一个因子为主要变量的偏同归模型。Ｆｌ＝１６．６７―０．５３６１Ｘｒｌ．９３１Ｘ１２Ｆ２＝１６．６７＋１．１２２Ｘ２―０．８１５７Ｘ２２ Ｆ３＝１６．６７＋０．７２２９Ｘ３―１．１４９Ｘ３２根据上述偏回归子模型，分别令ｄｙｌ／ｄｘｌ＝０，ｄｙｆｆｄｘ２＝Ｏ，ｄｙ３／ｄｘ３＝０，由］＝ｄａｙｌ／ｄ２ｘ１＜０，ｄ２ｙｚ／ｄ２ｘ２＜０ 和ｄＺｙａ／ｄ２ｘ，＜０，故Ｘ１＝－０．１３８９，Ｘ２：０．６８７８和Ｘ３＝０．３１４６时ＭＣ．Ｕｔ有最大提取量。根据上述不同 偏刚归子模型，可分别获得各因子在不同水平１卜对ＭＣ－ＬＲ提取量影响的曲线图２－１０。 幽２．１０ａ为提取时间对ＭＣ－ＬＲ提取最的影响曲线，从图中可以看出，提取时间为３０ｍｉｎ时， ＭＣ―ＬＲ提取量的最大，其中提取时间３０．４０ｍｉｎ内的ＭＣ－ＬＲ平均提取量低于提取时间２０．３０ｍｉｎ时 ＭＣ．ＬＲ的平均提取量。图２．１０ｂ为甲酸浓度对ＭＣ－ＬＲ提取量的影响曲线，从图中可以看出，随着 甲酸浓度的增加，ＭＣ－ＬＲ提取量增加，在一定范围内甲酸浓度对ＭＣ．ＬＲ提取量的影响呈正相关， 当甲酸浓度较高，则不再保持线性关系，同时Ｍｏｕｔ提取量不再增加。幽２．１０ｃ为甲醇浓度对 ＭＣ．ＬＲ提取量的影响曲线，从图中可以看出，８０％甲醇溶液对ＭＣ－ＬＲ提取量最高，其中７０％．８０ ％的甲醇溶液对ＭＣ．ＬＲ平均提取量低于８０％．９０％甲醇溶液。中国农业人学硕十学位论文２０第二章高效液相色谱法检测微囊凛毒素ｂ１６．７厂、３０ ０ Ｘｌ／柏０ ００２５０００５０ Ｘ２ ０．００７５ ０３／／０８００＼２００９粥图２―１０提取时间（ａ）、甲酸浓度（ｂ）、甲醇浓度（ｃ）和ＭＣ－ＬＲ提取量关系曲线Ｆｉｇ．２一１０Ｔｈｅｃｕｍｏｆｃｘｔｒａｃｆｉｏｎｔｉｍｅ．ｔｈｅ ＣＯｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｌ０１１ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＭＣ．ＬＲ２．３．４．６双因子效应分析提取时间（ｘ１）一甲酸浓度（ｘ２）对ＭＣ－Ｉ展提取量（Ｙ１）的影响 采用降维分析方法，将方程中Ｘ３固定在零水平即可得到提取时间（ｘ。）和甲酸浓度（）【２）对 ＭＣ―ＬＲ提取量“１）的方程；Ｙ１＝１６．６７―０．５３６１Ｘｌ＋１．１２２Ｘ２―１．９３１Ｘ１２＋１．８６０ＸＩＸ２―０．８１５７Ｘ２２根据该方程，绘制提取时间（ｘ，）一甲酸浓度（Ｘ：）和ＭＣ－ｔａ提取量（Ｙ１）的等高线图和曲面图，如图２．１１。０００７２ ０ ００６４ ｎ ０．００５６ 硝０／３０４８０００４０ ００３２２ｌ ２４ ２７ ３０ ３３ ３６ ３９ Ｘ１图２－］１提取时间．甲酸浓度和ＭＧＬＲ提取量的关系的等高线图和曲面图（甲醇浓度为８０％）Ｆｉｇ．２－１ｌＴｈｅｃｏｎｔｏｕｒｆｉｇｕｌｃ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅｆｉｇｕｒｅ ｏｌｃｘｔｌａｃｔｉｏｎｌｉｍｅ?ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＭＣ．ＬＲａｔ８０％ｍｅｔｈａｎｏｌ ｈｉ ｗａｔｅｒ由图２．１１可知，当提取时间较短时，随着甲酸浓度的增加，ＭＣ―ＬＲ提取鸯（Ｙ。）逐渐减小，当 提取时间增长到一定值时，随着甲酸浓度的增加，ＭＣ－ＬＲ提取量（Ｙ１）先增大后减小。当提取时问２２中国农业太学硕士学位论文第二章高教液相色谱法榆测微囊藻毒素较高时，随着甲酸浓度的增加，ＭＣ－ＬＲ提取量ｆＹ，）逐渐增大；当甲酸浓度较低时，随着提取时间 的增长，ＭＣ．ｕｔ提取量（Ｙ１）逐渐减小，当甲酸浓度增长到一定值时，随着提取时间的增长，ＭＣ．ｕ≈ 提取量（Ｙ】）先增大后减小。较高的甲酸浓度和适当的提取时间可以获得较高的ＭＣ．ＬＲ提取量（Ｙ，）。提取时间（ｘ１）一甲醇浓度（憨）对ＭＣ－ＬＲ提取量ｆｙｌ）的影响采用降维分析方法，将方程中ｘ２固定在零水平即可得到提取时间（Ｘ１）和甲醇浓度（Ｘ３）对 ＭＣ．ＬＲ提取量（Ｙ】）的方程：Ｙ１＝１６．６７―０．５３６１Ｘｔ＋０．７２２９Ｘａ一１．９３１ｘ１２＋０．２５５６Ｘ１Ｘ３―１．１４９Ｘ３２根据该方程，绘制提取时间（ｘ１）一甲醇浓度（Ｘ３）和ＭＣ－ＬＲ提取量ｆｙｌ）的等高线剀和曲面图，如图２．１２。由图２―１２可知，在提取时间一定时，随着甲醇浓度的增加，ＭＣ－ＬＲ提取量ｆＹ，）先增大后减小。 当甲醇浓度一定时，随着提取时问的增长，ＭＣ－ＬＲ提取量（Ｙ１）先增大后减小。适当的甲醇浓度和 适当的提取时间可以获得较高的ＭＣ．ＬＲ提取量（Ｙ１）。０．９ ０暑７ Ｏ．９４强：。翼０．７５０．７２２ｌ ２４ ２７ ３０ ３３ ３６ ３９Ｘｌ图２－１２提取时间一甲醇浓度和ＭＣ－ＬＲ提取量冉勺关系的荨高线图和曲面图（甲酸浓度为０．５％）Ｆｉｇ．２－１２．Ｔｈｅｏｏｎｔｏｕｆｆｉｇｕｒｅ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅｆｉｇｕｒｅｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ?ｔｈｅ ｅｏｎｃｅｎＩｒａｔｉｏｎ ｏｆｍｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＭＣ－ＬＲａｔ０，５％ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｗａｔｅｒ甲酸浓度（Ｘ２）一甲醇浓度ｔＸ３）对ＭＣ－Ｉ凰提取量（Ｙ１）的影响采用降维分析方法，将方程中ｘ１固定在零水平，即可得到甲酸浓度Ⅸｚ）一甲醇浓度（ｘ３）对ＭＣ－ＬＲ提取餐（Ｙ１）的方程：Ｙｌ＝１６．６７＋１．１２２Ｘ２＋０．７２２９Ｘ３一Ｏ．８１５７Ｘ２２－１．６８８Ｘ２Ｘ３―１．１４９Ｘ３２根据该方程，绘制甲酸浓度（Ｘ２）一甲醇浓度（Ｘ３）｝ＤＭＣ－ＬＲ提取量（Ｙ－）的等高线图和曲面图，如图２．１３。由图２―１３可知，当甲酸浓度较低时。随着甲醇浓度的增加，ＭＣ－ＬＲ提取量（Ｙ１）逐渐增大， 当甲酸浓度升高到一定值后，随着甲醇浓度的增加，ＭＣ－ＬＲ提取量（Ｙ。）先增大后减小；当甲醇浓 度较低时，随着甲酸浓度的增加，ＭＣ．ＬＲ提取量（Ｙ，）逐渐增大，当甲醇浓度升高到一定值后，随２３中国农业大学硕士学位论文第二章高效液相色谱法检测微囊藻毒素着甲酸浓度的增加，ＭＣ－ＬＲ提取量（Ｙ１）逐渐增大。当甲醇浓度较高时，随着甲酸浓度的增加，ＭＣ－ＬＲ提取量Ⅳ１）最初变化不大，后又逐渐减小。较高的甲酸浓度和适当的甲醇浓度能够获得较高的ＭＣ－ＬＲ提取量（Ｙ１）。０ ９ ０．８７ ０．８４鼹０．８１０．７８ ０．７５０７２ Ｄ０７２图２―１３甲酸浓度一甲醇浓度和Ｍｃ＿ＬＲ提取量关系的等高线图和曲面图（提取时间３０ＩⅡｉｎ）Ｆｉｇ．２－１３ Ｔｈｅｃｏｎｌｏｕｒｆｉｇｕｒｅ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｆｉｇｕｒｅ ｏｆｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔＪｔａｆｉｏｎ ｏｆｆｏｒｍｊｃ ａｃｉｄ－ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆＩｍｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＭＣ．ＬＲａｔｓｏｎｉｃａｔｉｏＲ ｆｏｒ ３０ｒａｉｎ２．３．４．７模型寻优及验证根据模型方程在计算机上进行选优的结果，ＭＣ．Ｕｔ提取量最高Ｙ】＝１７．３１０时，ｘ，、墨、ｘ，三网子编码值分别为０．２５２６５、Ｏ．９２８６８、．Ｏ．２７１５２，非编码值分别为３２．５ｍｉｎ、Ｏ．７３％、７７．２８％，考虑 到实际操作的便利，将最佳条件调整为３３ｍｉｎ、０．７％、７７％。将其（Ａ）与１５个实验组合中的摄 差组合（Ｂ）和经验水平组合（Ｃ）共３个处理组搭配，进行模型验证实验。各处理组合中三因素 用量及相应ＭＣ－ＬＲ提取量见表２．８。从表中可以看出，本实验优化的最佳条件符合实际要求。表２?８验证三组合Ｘ１、ｘ２、Ｘ３的不同用量及相应ＭＣ．ＬＲ提取量Ｔａｂ．２?８ Ｄｉｔｆｅｒｅｎｔ ｖａｌｕｅｓｏｆＸｉ、Ｘ２、Ｘ３ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ望型Ａ Ｂ Ｃ茎！！卿！！３３ ３７ ３０垫０．７％ ０－３％ ０．５％銎７７％ ７５％ ８０％羔ｄ！幽一１７．４３ １１．５２ １６ ３６２．３．５方法的线形范围将ＭＣ―ＬＲ逐级稀释成系列质量浓度０．１、０．３、０．５、０．７、０．９、１．１ ｍｇ／Ｌ，在色谱条件下依次 测定，以峰面积对相应的浓度进行线性回归。当浓度范围为Ｏ．１－１．１ｍｇ／Ｌ时，同归方程为 Ｙ＝３７１４２４ｘ＋２９０７８，回归系数０．９９９５。其标准曲线如图２．１４。中国农业』＝学预上学位论文１第二章高效液相色谱ｊ去检测微囊藻毒素１５ ００Ｅ＋０５ ４．５０Ｅ＋０５ ４ ００Ｅ＋０５ ３５０Ｅ＋０５罨３．００Ｅ＋０５ 堂２ＤＯＥ＋０５ｌ ５０Ｅ＋０５ １．００Ｅ＋０５融２．∞Ｅ＋０５５ ００Ｅ＋０４ ０００Ｅ＋００ ０ ０２ ０ ４ ０６ ０．８ ｌ ｌ２ＭＧＬＲ（Ⅻ９４０ 图２．１４ ＭＣ－ＬＲ标样的标准曲线Ｆｉｇ．２－１４ Ｃａｈ“ｏｒａｔｉｏｎ ｃｕⅣｅ ｆｏｒ ＭＣ?ＬＲ ｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓａｍｐｌｅ２．３．６方法的回收率和精密度取同样水样和藻样为本底，对水样设１５Ｉｔｇ／Ｌ、２０ｕｇ／Ｌ，和４０ｕ旺个浓度添加水平，对样本进行添加回收率实验和精密度实验。结果样的回收率大于７５％，相对标准偏差小于７．２％。表２－９回收率厦精密度实验结果（ｎ＝４）Ｔａｂ．２―９Ｒｅｓｕｌｔｏｆ ｒｅｃｏｖｅｒｙａｎｄｐｒｅｃｉｓｉｏｎ（Ⅱ２４）ｕ班、５Ⅱｇ／Ｌ和１０ｕｇ，Ｌ三个浓度添加水平，对藻样设如表２－９。从表中可以看出，本法对水样的回收率大于７３％，相对标准偏差小于６．２％；本法对藻２．３．７实际样品的检测２．３．７．１采样点的选择及样品的采集北京从东到西分布有蓟运河、潮自河、北运河、永定河和大清河五大水系。北京市的主要饮 用水水源是密云水库和怀柔水库，隶属潮白河系，目前供水水源以密云水库为主。官厅水库属于 备用水源。从密云到北京市以京密引水渠作为饮用水源的输送渠道。本试验采样点的布置是沿着 潮河、白河、京密引水渠沿线采样，如图２．１５。 ２．３．７．２分析结果及评价采用建立的方法，２００５年９月对北京地区潮白河系水源水样进行ＭＣ污染的调查，结果见表２－１０。?采样，点围２．１５部分采样点示意图Ｆ追．２－１５ Ｆｉｇｕｒｅ ｏｆ￥ｏｍｆ ｓａｍｐｌｅ ｓｉｔｅ表２．１０北京地区潮白河水系水样检测结果Ｔａｂ．２－１０ＲｅｓｕｌｔｏｆＭＣ?ＬＲｉｎｗａｔｅｒ ｓａｍｐｌｅｆｒｏｍＣｈａｏｂａｌＲｉｖｅｒｉｎＢｅｉｊｉｎｇｎｄ最日ｉ束垃出资料显示，２００４年６月怀柔水库的ＭＣ含量为７４．６．ｇ／Ｌ，密云水库ＭＣ含量为１７．４ ｎｇ／Ｌ，其它 月份未见报道。本次调查结果显示，２００５年９月份怀柔水库ＭＣ含量为７９．８０ ｎｇ，Ｌ，密云水库ＭＣ含 量为６８．７５ ｎｇ，Ｌ，高于２００４年６月份ＭＣ含量。尽管两次调查不在同一时问。但仍可以看出，北京 地区处于藻类的高发季节，密云水库和怀柔水库均检出ＭＣ．ｕｔ，但其含每远低于国家生活饮用水 卫生规范的标准１０００ｎｇ／Ｌ，京密引水渠沿线、三家店水库、珠窝水库、官厅水库未检山ＭＣ．ＬＲ。 总的说来，目前北京地区供水水源ＭＣ的含量很低，远远低于国家生活饮用水卫生规范的标准。 但是，２００２年密云水库爆发蓝藻水华，其中９０％以上是微囊藻，因此对于水库的富营养化问题所 带来问题的不能忽视。治理水库的富营养化，降低水华所带来的危害，防ｌ｝：和控制水质的恶化仍 然是当前的主要任务。２．４小结中国农业丈学硕士学位论文第二章高效液相色谱法检测微囊藻毒索（１）通过优化色谱条件，选择最佳色谱系统对ＭＣ－ＬＲ进行检测：色谱柱：Ｓｕｐｅｌｃｏ－Ｃ１８， ２５０ｍｉｎｘ４．０ｍｍ（５，ｕｍ）；流动相，含有ｏ’ｌ％甲酸的甲醇：水（８０：２０）：紫外２３８ｎｍ处，出峰时间为４．６５ ｒａｉｎ。通过优化固相萃取条件，选择最佳的固相萃取条件对样品进行浓缩：ｓＰＥ枉：ＨＬＢ；淋洗液：１０％的甲醇溶液：洗脱液：７０％的甲醇溶液。 （２）通过比较冻融、超声波细胞破碎方式的提取效果，选择超声波作为细胞破碎的方式。 通过比较５％乙酸、甲醇溶液及水：甲醇：丁醇＜２０：７５：ｓ）溶液对ＭＣ．ＬＲ的提取效果，选择甲 醇溶液作为提取ＭＣ．ＬＲ的溶剂。在溶剂选择为甲醇的基础上，进行ＲＳＭ设计试验，得到回归方程Ｙ１＝１６．６７―０．５３６１Ｘ１＋１．１２２Ｘ２＋０．７２２９Ｘ３―１，９３１Ｘ１。＋１．８６０Ｘ】Ｘ２＋０．２５５６ＸｌＸ３一Ｏ．８１５７Ｘ２ｚ一１．６８８ｘ２ｘ、一１．１４９Ｘ３２，相关系数为０．９２４，其回归关系显著，能够较好的拟合在自变量变化范围 的试验点。当甲醇浓度为７７％、甲酸浓度为０．７％、提取时间为３３ｍｉｎ时可得最佳提取量。 （３）在上述条件优化的基础上．建立了水中和蓝藻中ＭＣ―ＬＲ的高效液相色谱检测方法，该 方法线性范围Ｏ．１―１．１ ｍ∥Ｌ对水样的回收率大于７３．Ｏ％，对藻样的回收率大于７５．Ｏ％。 （４）采用建立的方法，２００５年９月对北京地区潮白河系水源水样中的ＭＣ．ＬＲ进行调查，结 果显示２００５年９月份怀柔水库ＭＣ含量为７９．８０ ｎｅ，／Ｌ，密云水库ＭＣ含量为６８．７５ ｎｇ／Ｌ，含量远低丁 国家生活饮用水卫生规范的标准１０００ ｎｇ／Ｌ。中国农业大学硕十学位论文第三章高效城相色谱一质谱注检测微囊藻毒素第三章３．１前言高效液相色谱一质谱法检测微囊藻毒素质谱技术的基本原理是样品分子离子化后， 根据不同离子间的荷质比（ｍ／ｚ）的差异米分离 并确定分子量。质谱仪是一种很好的定性仪器， 但对混合物的分析无能为力。色谱仪是一种很好 的分离＿｝｝ｊ仪器，但定性能力很差，二者结合起来，则能发挥各自专长，使分离和鉴定同时进行。 １９９０年，Ｑｕｉｌｌｉａｍ等人首次将高效液相色谱一质谱联用（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ，ＨＰＬＣ－ＭＳ）技术用于蓝藻毒素的检测中【ｌ…。近年来，随着质谱技术的不断改进及设备成本的降 低，越来越多的质谱技术如快速轰击原子质谱ｆ”】、电喷雾质谱［１“１０９１、基质辅助雷射解吸离子化 ］毛行时间质谱【ｌ”Ｉ都曾应用于ＭＣ的检测当中。其中，高效液相色谱．电喷雾电离质谱（Ｈｉ曲Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．ＨＰＬＣ－ＥＩ－Ｍ鳓由于能将ＭＣ电离产生容易识别的【Ｍ＋ＨＩ＋和【Ｍ＋２Ｈ］“特征离子，在ＭＣ的质谱检测中应用最为广泛。 目前，已有近８０种ＭＣ单体被分离或定性。其中常见ＭＣ单体的结构如图３―１，其分子量如表 ３－１。但是，商业化提纯Ｍｃ只有ＭＣ．ＲＲ、ＭＣ．ＹＲ、ＭＣ．ｕｔ、ＭＣ．ＬＡ、ＭＣ．ＬＷ和ＭＣ．ＬＦ。对 这些以外的Ｍａ差行定性甚至定量，对于人们更好的认识、监测ＭＣ及对其进行风险评估具有重要意义。Ｂａｔｅｍａｎ等）ＡＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａＰＣＣ７８２０＠鉴出ｄｅｓｍｅｔｈｙｌ ＭＣ－ＬＲ（Ｄ―ａｓｐ－ＭＣ．ｕｔ，Ｄｈａ－ＭＣ．ＬＲ．Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌ－Ａｄｄａ－ＭＣ．ＬＲ）、ＭＣ―ＬＲ、ＭＣ－ＬＹ、ＭＣ－ＬＷ、ＭＣ－ＶＦ、ＭＣ－ＬＦ和ＭＣ－ＡＲ， ／Ｉｌ，Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓａｅｒｕｇｌｎｏｓａ ＵＴＥＸ ＬＢ ２３８５中鉴定出ｄｅｓｍｅｔｈｙｌ ＭＣ－ＬＲ、ＭＣ－ＬＲ、ｍｅｔｈｙｌ ＭＣ－ＬＲ、ＭＣ－ＬＷ［Ⅲ】。Ｚｗｅｉｇｅｎｂａｕｍ等采用Ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ电喷雾电离离子阱串联质谱技术分析苏格兰水华藻类Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ａｇａｒｄｈｉｉ｝Ｏ巴西ＰａｒｏｓＬａｇｏｏｎ地区Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ＠的ＭＣ，发现其中单体可能是 ＭＣ－ＬＲ、ＭＣ．ＲＲ、ＭＣ．ＬＷｔ““。Ｂａｒｃｏ等分析ＴＳｐａｎｉｓｈ某饮ｄｅｓｍｅｔｈｙｌ ＭＣ．ｕｔ、ＭＣ－ＹＲ及ｍｅｔｈｙｌ用水水库水华Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ中的ＭＣ，发现其中的单体可能是ＩＤ．Ａｓｐ３］ＭＣ－ＲＲ、【Ｄｈａ ７］ＭＣ．ＲＲ、【Ｄ－Ａｓｐ３，但）一Ｄｈｂ ７］ＭＣ－ＲＲ、ＭＣ－ＲＲ、ＭＣ－ＹＡ、ＭＣ－ＬＲ、ＭＣ－ＹＲ、【Ｄ－Ａｓｐ。］ＭＣ?ＨｔｙＲ、 【Ｄｈａ ７］ＭＣ－ＨｔｙＲ、 【Ｄ－Ａｓｐ３，（Ｅ）－Ｄｈｂ’］ＭＣ－ＨｔｙＲ、 （Ｄ－Ａｓｐ。， （ｚ）一Ｄｈｂ’］ＭＣ―ＨｔｙＲ｝ｌＪ［Ｄ－ＧＩｕ－ＯＣ２Ｈ３（ＣｎＯＯＨｄＭＣ．ｕ一”。Ｐａｒｋ等采用氨基酸分析、电喷雾串联质谱、核磁共振、紫外光谱分析等手段对加拿大Ｐｒａｉｒｉｅ湖中的一种新型未知ＭＣ单体进行了分析，将之命名为【ｄ－Ｌｅｕｌ】 ＭＣ．ＬＲ［…１。Ｓｐｏｏｆ等发现芬兰某水体水样中含有ＭＣ－ＬＲ、ｄｅｓｍｅｔｈｙｌ ＭＣ．ｕｔ、ＤｉｄｅｍｅｔｈｙｌＭＣ―ｕｔ、ＭＣ－ＹＲ、ｄｅｓｍｅｔｈｙｌ ＭＣ?ＹＲ、Ｄｉｄｅｍｅｔｈｙｌ ＭＣ－ＹＲ、ＭＣ―ＲＲ、ｄｅｓｍｅｔｈｙｌＭＣ－ＲＲ、ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＵＴＣＣ２９９中分ＤｉｄｅｍｅｔｈｙｌＭＣ．ＲＲ［““。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ等采用免疫吸附柱技术｝叭Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ离出１５种ＭＣ：ＭＣ－ＲＲ、［Ｄ－ＡｓｐＪ］ＭＣ－ＲＲ、ＭＣ－ＹＲ、ＭＣ―ｕｔ、ｄｅｓｍｅｔｈｙｌ ＭＣ－ＬＲ（［Ｄ―Ａｓｐ３］ＭＣ－ＬＲ，ｆＤｈａ’１ＭＣ―ｕ氓ｍｅｔｈｙｌＭＣ－ＬＲ、ＭＣ－ＡＲ、ＭＣ－ＦＲ、ＭＣ－ＷＲ、ＭＣ－ＬＡ、ＭＣ－ＬＡ变体、ＭＣ―ＬＦ、ＭＣ．ＬＷ和节球藻毒素Ｎｏｄｕｌａｆｉｎ［”“。Ｈｕｍｍｅｒｔ等对德国Ｔｈｕｒｉｎｇｎｉａ地区某水库中的监藻样品进行 质谱分析，发现该水库不同年份的蓝藻中存在不同的ＭＣ单体，１９９Ｓ｛ｇ的蓝藻样品中含有ＭＣ―ＬＲ、 ＭＣ．ＲＲ、ＭＣ．ＹＲ．而１９９９年的蓝藻样品中则含有ＭＣ．ＬＲ、ＭＣ．ＲＲ［“７１。 目前关于我国水华藻类中ＭＣ的鉴定还比较少。史红星等对北京官厅水库Ｍｃ进行ＬＣ－ＥＳＩ．ＭＳ中国农业大学硕士学位论文}