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转膜时间缩短点试试
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最好是称量质量按n比例加裂解液，再就是bca测下裂解后的蛋白浓度，实在不行蛋白变性后跑个内参调平
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上面盖个盖玻片，效果好很多
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应该是巨噬细胞及其衍生细胞
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三明治夹紧了吗？
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目标蛋白分子量多大
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多大浓度的分离胶，增加胶的浓度试试看
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买商品化的吧，省时省钱
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western blot有过碧云天，价格便宜效果还可以，组化没试过
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我做过石蜡切片，用的高压修复，结果还行
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胶的问题，其实你的跑的挺好的
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是计量资料，做相关性比较不可靠
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上样量大了，marker被挤歪了，跟胶没关系。建议做总蛋白定量，适当降低上样量
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放心好了，没问题的！
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非特异性条带，实验条件要优化！
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怎么查具体得分啊？系统只能查到总分啊？
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想问楼主，三道阅读原题是出自哪里的啊？GRE还是GMET？
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建议提蛋白后进行蛋白定量，根据定量结果决定上样量！很可能与蛋白浓度低有关！
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建议把实验步骤写出来，这样更方便大家帮你找到原因！
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新手求助western转膜时间问题
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0.22um的膜是不会转过的，marker颜色淡可能是没转过去，整个转膜体系是不是安装不正确？你转完后有没有观察胶，胶上还有marker吗？
哦。谢谢！转膜体系是对的。你说0.22um的膜是不会转过的，那&20KD的蛋白是不是不容易转到0.22um的PVDF膜上呢？
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这时间也太久了吧！我做43的转一个小时都嫌过，不过我用的0.45的膜。
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用0.45的，0.22的背景太高，把你的条带遮挡了
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我们这边350MA 90min
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用0.45的，0.22的背景太高，把你的条带遮挡了
原来是这样。真是太感谢了！
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田大夫加把劲
我们这边350MA 90min
哦。跟我的蛋白分子量差不多吗?还是说湿转不需要考虑分子量的问题？
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你的膜用的不合适，大于20KDa的要用0.45um的.换张膜在做一下.以上仅供参考，如有错误请指正.
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你的膜用的不合适，大于20KDa的要用0.45um的.换张膜在做一下.以上仅供参考，如有错误请指正.
哦。我以为没什么影响呢~非常感谢！我下次换张0.45um的膜试试。
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1.5h还不错，一直在这样。
真的是非常感谢，用你的转膜条件做出来了。
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时间太长了吧，转膜有计算公式啊，与面积有关啊
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时间太长了吧，转膜有计算公式啊，与面积有关啊
我的是湿转，你说的是半干转吧？
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0.22um的膜是不会转过的，marker颜色淡可能是没转过去，整个转膜体系是不是安装不正确？你转完后有没有观察胶，胶上还有marker吗？
哦。谢谢！转膜体系是对的。你说0.22um的膜是不会转过的，那&20KD的蛋白是不是不容易转到0.22um的PVDF膜上呢？
不会的。我用0.2的膜主要为了看20kd的蛋白，但是也需要看内参40kd，完全没问题。有时觉得膜扔了很可惜，就会把更大的目的条带也看了，虽然在50kd以上的蛋白不能完全转过去，但是趋势和0.45的膜做出来的一样。我用0.2的膜一般转膜条件是恒压100V，90min
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0.22um的膜是不会转过的，marker颜色淡可能是没转过去，整个转膜体系是不是安装不正确？你转完后有没有观察胶，胶上还有marker吗？
哦。谢谢！转膜体系是对的。你说0.22um的膜是不会转过的，那&20KD的蛋白是不是不容易转到0.22um的PVDF膜上呢？
不会的。我用0.2的膜主要为了看20kd的蛋白，但是也需要看内参40kd，完全没问题。有时觉得膜扔了很可惜，就会把更大的目的条带也看了，虽然在50kd以上的蛋白不能完全转过去，但是趋势和0.45的膜做出来的一样。我用0.2的膜一般转膜条件是恒压100V，90min
100V时电流大概是多少？我昨天用0.22和0.45的PVDF膜一起转，250mA，90min，很奇怪，转膜后0.22上的marker比0.45的亮，曝光结果是0.22的膜上的蛋白亮，0.45的膜上蛋白很少，几乎没有（marker放在中间，两个膜共用一个marker），难道是0.45的膜上的蛋白转过了？我只转了一块胶，难道跟胶的数量有关？因为我那个同学她一直做4块胶，然后转膜条件一直是380mA，90min，她能做出结果，而我做不出来。对了，我昨天曝光的时候的曝光液换了别人的millipore的，有结果。后来，另外2个条带用自己的曝光液，几乎没有蛋白。我都怀疑我的曝光液是不是也有问题？
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100V时电流在300mA左右，我不太懂你一块胶转两张膜是什么意思？两张膜各转一半吗？
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100V时电流在300mA左右，我不太懂你一块胶转两张膜是什么意思？两张膜各转一半吗？
我一块胶上一共跑了5个孔，贴了2个膜（一个0.45um的PVDF膜，一个0.22um的PVDF膜）从左到右，
顺序是这样的：目的蛋白，空白，marker，空白，目的蛋白。转膜250mA，1.5h。曝光结果，0.22um的膜上条带亮，0.45um的膜上几乎没有条带。
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300ma 2小时
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aydhm 新手最近在做western，我的蛋白大概48KD，用的0.22微米的PVDF膜，转膜条件，湿转，380mA，2h。曝光结果几乎不见条带。不知道是不是转过了？转膜时间是不是与胶的数量有关？还是说与胶的体积有关？普通胶1个小时就够了，phos-tag胶两个小时。另外看不见条带也可能是你孵一抗二抗的问题，确保膜上的Marker蛋白能看到就说明转膜没问题。
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恒流273mA，1h就够了
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LDD0821 恒流273mA，1h就够了谢谢！
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温大帅归来 aydhm 新手最近在做western，我的蛋白大概48KD，用的0.22微米的PVDF膜，转膜条件，湿转，380mA，2h。曝光结果几乎不见条带。不知道是不是转过了？转膜时间是不是与胶的数量有关？还是说与胶的体积有关？普通胶1个小时就够了，phos-tag胶两个小时。另外看不见条带也可能是你孵一抗二抗的问题，确保膜上的Marker蛋白能看到就说明转膜没问题。谢谢！
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是不是一片黑，不见条带。如果是这样的话就是烧焦了。
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mabledingli 是不是一片黑，不见条带。如果是这样的话就是烧焦了。不知道你说的烧焦了是什么意思？应该不是吧，但是本实验的其他人也是这个转膜条件能做出来。
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&&新手求助western blot
新手求助western blot
新手做western blot ！我们的目的蛋白是25KD，用bio-rad的湿法转膜，试过很多时间和电流了就是每次都转不上呢？不知道问题出在哪里？郁闷啊！请各位指点指点哈！ 谢谢！
谢谢！PVDF膜式可以用的，我们的内参的转上了的，
PVDF 膜的的孔径是0.22 um。
转移缓冲液的配方：
甘氨酸：2.9g
甲醇：200ml
定容至1L。
60v转移2h。
祝你成功，我们配方很好用的。
用0.45的膜可以吗？我现在没有0.22的膜!
为什么呢？呵呵~我想学习下，请赐教哦~
用0.45的膜肯定转不上去，我有亲身经历，0.22的milipore的PVDF膜很好用的。每卷大约2000元左右。试试吧。
额！可以试试！谢谢哈！
不加SDS可以吗？
SDS等去垢剂影响膜和蛋白的结合，抵消掉一部分甲醇固定的作用。
所以小分子量的蛋白尽量不要引入SDS，大分子量的倒是没有太大关系。
反正我就是这么弄得，我用0.44的膜可以做10几kD的蛋白。
谢谢！我用这个方法试试！
恩！谢谢了！
我用考马斯亮蓝染没有转过的胶，在20kd左右是有条带的。就是转不上膜。
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【求助】求助western-blot时小分子蛋白转膜条件
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这个帖子发布于4年零104天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
向各位做western-blot的大虾请教，我目的蛋白是14kD，跑的细胞色素C，转膜条件用90V，30分钟转过，立春红染色条带很不清楚，显影没有条带，后来又用90V,20分钟转膜，用立春红染色没有条带。请问各位大虾跑小分子蛋白时条件一般是什么啊？为什么我总是发不出来小分子的啊？**赐教！
不知道邀请谁？试试他们
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0.04A 4度 转过夜
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小分子还是不要过夜转，快速转就好，机器规格不同，别光听别人的，自己设置几个时间梯度看看。
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两张膜叠起来，转一片胶，时间和电压掌握好，如果转的合适，第一张上就有，如果转透了，第二张上就有！
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不同的仪器条件不尽相同。我用的是biorad湿转，110 mA恒流 20 min，保持冰水浴的低温状态。另外，低于20 kD的蛋白做转印，强烈建议用0.22 um的PVDF膜。
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谢谢各位高手的指点，我用的也是biorad湿转，现在用的是90V，25min，条带不是很清晰，但是可以看到。只是条带都成了一条直线，样本与样本之间分不清楚，是因为我上样量大了吗？我上的是50ug蛋白，而且杂带也很多，不知道是什么问题，请高手们指点
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上样量的问题可以做胶染色观察下条带都成一条直线的问题，可以间隔泳道上样试试
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