转化生长因子β诱导上皮细胞-间质细胞转分化与肺纤维化关系的研究现状与展望
来源：国际呼吸杂志
作者：陈 娟 等
肺纤维化是一组多种病因引起的以气道受损、炎症因子大量分泌、间充质细胞增生和细胞外基质（extracelluiar matrix，ECM）异常沉积为特点的渐进性疾病。肺泡上皮细胞紧密附着于相邻细胞或基底部，保护肺免于损伤和感染。在致病因素的长期作用下，肺泡上皮细胞的完整性和特征被打乱并重排，引起形态学或生理学上的改变，部分上皮细胞表型发生改变，发生上皮细胞一间质细胞转分化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）。EMT过程有多条信号通路参与，各条信号通路之间通过配体相互交联，使EMT过程在一定程度上维持稳态。本文就各条通路的可能机制及他们之间的相互关联作一综述。 1转化生长因子β（TGF-β）/Smad通路与肺纤维化 TGF-β是一种多效性的细胞因子，是目前肺纤维化的研究热点和重要的药物作用靶点。TGF-β可由淋巴细胞、单核细胞、上皮细胞和成纤维细胞等多种细胞产生，通过自分泌和旁分泌的方式调节细胞的增殖、分化、迁移、黏附，调节ECM的代谢，参与肺胚胎发育、组织损伤和修复。最新研究表明，TGF-β诱导EMT在肺纤维化中起关键性的作用。Kolosova等用TGF-β1处理肺上皮细胞系（HAE）96 h后观察细胞的形态和功能的改变，发现上皮细胞一细胞间接触减少，上皮细胞延长，上皮细胞标记物E-钙黏蛋白下调，间质细胞标志物α-肌动蛋白（α-SMA）、纤连蛋白、胶原Ⅰ上调。Doerner等发现TGF-β1诱导EMT伴随着形态学上的改变，细胞变成了纺锤体样，胞浆内α-SMA增多。同样的情况在很多研究中被证实。 TGF-β已被证实是关键的致纤维化细胞因子，Smad是TGF-β的直接底物。Smad蛋白分为3型：①受体调节型，主要包括Smadl、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8；②共同中介型，主要包括Smad4;③受体抑制型，主要包括Smad6、Smad7。Smad蛋白将TGF-β的信号由细胞浆传到细胞核，与其他转录因子一起共同调节相应的靶基因转录。TGF-β家族有2种类型的跨膜丝氨酸／苏氨酸激酶受体，分别为I型受体和Ⅱ型受体，TGF-β诱导其Ⅱ型受体活化并与配体结合后磷酸化TGF-βⅠ型受体，TGF-βⅠ型受体和Smad2或Smad3蛋白结合并使这两个蛋白C端的SSXS（S丝氨酸）结构域上的丝氨酸磷酸化，从而使其激活，磷酸化Smad2或Smad3蛋白与Smad4蛋白形成复合物后转移到细胞核进行靶基因调控。Smad7能够与TGF-βⅠ类受体牢固结合，阻止Smad2和Smad3发生磷酸化，从而终止TGF-β的信号转导。Smad7还能与TGF-β受体复合物结合，在相关配体和酶的协同作用下诱导其降解。徐国萍等在体外培养的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞中加入TGF-β后，于不同时间段收取细胞进行研究，结果认为TGF-β1能在体外诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转变，其机制与Smad信号转导途径相关。李玉花等用大黄素处理博莱霉素导致的肺纤维化大鼠，大黄素中、低剂量组大鼠TGF-β1、Smad3表达减弱，Smad7表达明显增强，表明大黄素的中、低剂量组能够减轻大鼠肺纤维化程度，其作用机制与调控TGF-β1的Smad3/7信号转导蛋白表达有关。 Smad是EMT的重要作用因子，但是，Smad2、3敲除小鼠仍然表达EMT，这一点在前列腺上皮细胞及一些癌上皮细胞得到了验证，说明有非Smad通路存在。Kolosova等也表明，TGF-β同样可以诱导非Smad通路而调节EMT。 2 非TGF-β/Smad通路与肺纤维化 2.1 TGF-β-MAPK通路 在非TGF-β/Smad通路中，TGF-β-MAPK通路被认为是最重要的一条。MAPK信号转导通路是一条广泛存在于各种细胞内的信号转导途径，由一组丝／苏氨酸蛋白激酶组成，以MAPKKK-MAPKK-MAPK级联反应的方式相继磷酸化激活，将细胞外信号转导至细胞内以及细胞核中，调控细胞周期和基因表达。目前已知，MAPK由4个主要成员构成，即细胞外信号调节激酶（ ERKI/ERK2）、应激活化蛋白激酶（SAOK/JNK）、p38MAPK和ERK5，其中p38MAPK与肺纤维化过程密切相关。李飞凤等用SiO2刺激HBE细胞后，E-钙黏蛋白表达水平下降，而α-SMA和V-波形蛋白表达水平增加，部分细胞形态上呈梭形改变，呈现明显的间质细胞特性，证实EMT的发生。用p38MAPK特异抑制剂SB203580干预HBE细胞后，皆不同程度减弱V-波形蛋白和a-SMA表达并增加E-钙黏蛋白表达，且呈现浓度依赖性，表明p38MAPK信号通路参与Si02介导的HBE细胞EMT。MAPK参与EMT的过程可能有以下几条机制：①TGF-β诱导活化TGF-β受体复合物，级联活化p38MAPK。TGF-βⅠ型受体具有丝/苏氨酸和酪氨酸激酶活性，活化ERK-MAPK，TGF-βⅡ型受体磷酸化ERK-MAPK的丝/苏氨酸基团而活化ERK-MAPK，活化的p38MAPK诱导转录因子ATF-2和ELK-1调节相关基因转录，调控EMT蛋白表达。②TGF-βⅠ型受体通过聚泛素化活化TNF受体结合蛋白6和TGF-β联合激酶1（TAK1），同时Smad7起衔接蛋白的作用，衔接TGF-βⅠ型受体与TAKI、p38MAPK、JNK并活化这些因子，这些因子进而可能通过活化活化蛋白1复合物，调节转录因子c-Jun和c-Fosc，进而调节EMT过程。 EMT是肺纤维化的关键过程。但是最近一些学者提出间质细胞向上皮细胞转分化（MET）的概念，认为有些因子可以逆转EMT。在肾纤维化中，已经证实骨形成蛋白7可以诱导成人肾成纤维细胞MET，促进受损肾脏的再生。Ramos等研究表明成纤维细胞生长因子-1（FGF-1）加肝素可以抑制肿瘤生长因子-1诱导的EMT，表现为纺锤体样的间质细胞转变成圆形的、鹅卵石样的上皮细胞。伴随着这种细胞表型改变，在FGF刺激后维持上皮细胞紧密连接状态的E-钙黏蛋白有效地恢复表达，而间质细胞标志物α-SMA、V-波形蛋白明显下调。这种作用在人和大鼠的肺上皮细胞都得到了验证。FGF-1逆转TGF-β诱导的EMT可能通过PI3K/Akt、MEK1/2-ERK、p38MAPK通路，在体外实验中验证得到，FGF-1调节ERK/MAPK通路，上调Smad7，对Smad2去磷酸化而逆转EMT成为最相关的可能机制。 2.2
Rho/ROCK信号通路 Rho家族蛋白是Ras超家族中最早被克隆出来的蛋白，它们是一组相对分子质量约为20 000～25 000的三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）结合蛋白，具有GTP酶活性，习惯被称为Rho GTP酶。Rho是诱导应力纤维形成、调控细胞骨架蛋白、细胞黏附及能动性的主要分子。ROCK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，是Rho目前研究最为清楚的下游靶效应分子。Rho受多种细胞因子的调控，鸟苷酸交换蛋白或鸟苷酸交换因子（GEF）为Rho激活剂，GTP酶激活蛋白和GDP解离抑制因子（GDI）为Rho灭活剂。Rho与GDI结合成复合物（Rho·GDI），当细胞受到细胞外信号刺激时，GEF催化Rho的GDP转化成GTP而活化，活化的Rho从复合物中解离出来，转位到细胞膜，将信号传递给ROCK，使其丝氨酸/苏氨酸磷酸化激活，活化的ROCK诱导其底物肌球蛋白磷酸酶磷酸化而使之失活。失活的肌球蛋白磷酸酶解除对MLC脱磷酸化作用，使胞浆中MLC磷酸化水平上调。MLC磷酸化水平在乎滑肌细胞中决定细胞的收缩功能，在非平滑肌细胞中则控制肌动蛋白微丝骨架的聚合动力学。众所周知，细胞的移动、趋化、黏附和收缩都是通过微丝骨架的聚合和延伸来实现的。Rho/ROCK信号转导通路就是通过这样一个复杂的磷酸化/脱磷酸化级联反应来调节微丝骨架的聚合，控制细胞的多种生物学行为。Rho通过细胞骨架蛋白的直接作用参与EMT。研究表明，Rho/ROCK信号通路在TGF-β诱导的肾小管上皮细胞、肝星状细胞、肺间质成纤维细胞、角膜成纤维细胞等的转分化过程中发挥了重要作用，Rho/ROCK信号通路抑制剂能够抑制EMT的发生。研究证实，Rho/ROCK通路参与了TGF-β介导的上皮细胞EMT，ROCK特异性抑制剂Y-27632能够通过抑制TGF-β诱导的α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白和V-波形蛋白的表达的上调，从而抑制EMT，而对E-钙黏蛋白的表达下调没有抑制作用。 2.3
核转录因子κB（NF-κB） NF-κB是调控炎症和免疫反应的主要核转录因子之一。在胞浆中NF-κB因与抑制蛋白（IKBs）结合而表现为无活性的形式。当机体受到外界刺激后，IKBs在蛋白磷酸化酶的作用下被磷酸化，磷酸化的IKBs在蛋白激酶的作用下被降解，并从NF-κB二聚体上解离，NF-κB即被激活，暴露出p50，转位到细胞核内与相应的靶基因κB序列相结合，诱导和增强EMT相关蛋白的核定位信号基因的表达。Huber等研究证实，在Ras转染的上皮细胞中抑制NF-κB信号可以阻止EMT的发生，而激活此通路可以在缺乏TGF-β的情况下促使细胞向间叶细胞形态的转化。此外，在间叶细胞中抑制NF-κB的活性可以导致EMT过程的逆转，也提示NF-κB对诱导和维持EMT是必需的。 2.4
肿瘤坏死因子α（TNF-α） 研究证实，EMT在胚胎发育、肿瘤侵入和组织纤维化的细胞转分化中扮演着非常重要的角色，很多的生长因子和细胞因子能够协同TGF-β调节EMT，TNF-α已经证实可以显著增强TGF-β促进EMT的作用。在A549人腺癌上皮细胞系的研究中发现，TNF-α能促进TGF-β诱导的EMT，细胞表现为间质细胞表型、间质细胞标记物α-SMA、Ⅰ型胶原上调，上皮细胞标记物E-钙黏蛋白下调，细胞侵袭力和基质金属蛋白酶分泌增加。其可能机制为增强Smad，MAPK、NF-κB信号通路对EMT的影响。 2.5整合素 整合素大多为亲异性细胞黏附分子，其作用依赖于Ca2+，整合素有α、β两个受体，接受细胞外信号传导进入细胞内，影响细胞迁移、增殖、分化、重塑，参与ECM调节。Margadant等研究证实，整合素能通过Smad和非Smad信号通路影响TGF-β的活化，在纤维化和系统性硬化中，整合素协同TGF-β诱导成纤维细胞分化成有收缩能力的肌纤维细胞，肌纤维细胞可通过表达胶原纤维、表达整合素a1β1和α2β1调节胶原重塑和收缩、表达α-v结合素活化TGF-β潜分化三条途径调节EMT。Mu等也认为结合素促进TGF-β活化通过非Smad信号通路是肯定的。 2.6
过氧化物酶体增生物激活受体（PPAR） PPAR是近年来发现的一种G蛋白耦联受体，研究表明PPAR作用于A549细胞或原代肺泡上皮细胞，同样发生EMT现象。Buckley等研究证实，血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂和PPAR-γ能促进Ⅰ型胶原的合成，抑制EMT。Tan等研究证实，PPAR-γ能显著减少TGF-β诱导的Ⅰ型胶原、结缔组织生长凼子和钙黏蛋白，对E-钙黏蛋白的下调作用也很明显。但PPAR通过哪些具体分子机制调节EMT还有待进一步研究。 2.7 Wnt/Wingless信号通路 Wnt/Wingless信号通路与许多种生长因子包括TGF-β共同作用参与EMT这个过程。抑制GSK-3（Wnt的重要组成部分）的反应，可以下调E-钙黏蛋白，下调离体培养的上皮细胞EMT，表明Wnt信号通路对特发性肺纤维化的调节是正性的。 3小结 肺纤维化是一个不可逆的渐进性疾病，并且是很多基础疾病的终末表现，目前缺乏有效的治疗手段和治疗药物。TGFF-β诱导的细胞转分化（EMT）在肺纤维化的形成过程中扮演非常重要的角色，EMT的分子机制及逆转EMT的分子机制目前尚不是很明确，对上述机制进行更详细的研究可为临床上寻找新的药物作用靶点提供依据。
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APE1和p53蛋白在A549细胞和HeLa细胞中的结合作用
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目的探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(apurinic/apyrimidinicendonuclease,APE1)和p53蛋白内源性和外源性相互结合作用。方法将重组质粒pET42a-hAPE1转染E.coliBL21(DE3)，应用IPTG诱导GST-APE1蛋白表达，鉴定后经金属螯合层析技术纯化，通过Westernblot鉴定纯化蛋白，得到GST-APE1融合蛋白。免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)和GST蛋白沉降实验分别检测内源性和外源性APE1和p53蛋白结合作用，免疫荧光标记结合激光共聚焦显微镜技术确定APE1和p53蛋白亚细胞定位。结果转染质粒经IPTG诱导表达，应用SDS-PAGE发现GST-APE1在预期位置64×103处存在阳性条带，“Ni”柱纯化后得到GST-APE1融合蛋白，通过Westernblot鉴定。免疫共沉淀和GST蛋白沉降实验证实APE1和p53存在内源性和外源性结合作用。激光共聚焦显微镜观察免疫荧光标记的APE1和p53蛋白均为核浆共表达蛋白，氧化应激处理后，蛋白逐渐由胞浆向胞核移位，二者共定位于核膜处较明显。结论APE1和p53蛋白在A549和HeLa细胞中存在内源性和外源性结合作用,可能与其转录调控及肿瘤放化疗疗效有关。
References
[]&&张？, 李梦侠, 程？, 等. APE1和p53蛋白在A549细胞和HeLa细胞中的结合作用[J].第三军医大学学报,):.
[]&&李懿,孟刚,郭乔楠.P53和P63蛋白在人骨肉瘤组织及恶性转化细胞株中的表达变化及意义[J].第三军医大学学报,):763. [2]曹晓静,王东,张沁宏,等.原发性肝癌患者血清P53蛋白检测的临床意义[J].第三军医大学学报,):140. 　CAO Xiao-jing,WANG Dong,ZHANG Qin-hong,et al.Serum P53 protein detection for hepatocellular carcinoma patients[J].J Third Mil Med Univ,):140.
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SB431542 对HSC T6 细胞Smad4 蛋白细胞内转位及表达的影响
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芪连扶正胶囊调控TGF_smad信号通路抑制肺癌转移的研究
导读：芪连扶正胶囊调控TGF－β/smad信号通路抑制肺癌转移的研究，要：目的：观察芪连扶正胶囊对TGF－β/smad通路相关分子表达的影响，培养肺癌A549细胞，制备芪连扶正胶囊含药血清，结果：芪连扶正胶囊含药血清可上调TβＲⅠ、TβＲⅡ、Smad2/3、Smad4表，下调Smad7、TGF－β1mＲNA在肺癌A549细胞中的表达，各药组分子表达量除芪连扶正胶囊低剂量组外，联合组及芪连扶正胶囊各组第32卷第11期中华中医药学刊Vol．32No．月CHINESEAＲCHIVESOFTＲADITIONALCHINESEMEDICINENov．2014DOI：10．13193/j．issn．．1芪连扶正胶囊调控TGF－β/smad信号通路抑制肺癌转移的研究齐元富，李慧杰（山东中医药大学附属医院，山东济南250014）摘要：目的：观察芪连扶正胶囊对TGF－β/smad通路相关分子表达的影响，探讨其相关机制。方法：体外培养肺癌A549细胞，制备芪连扶正胶囊含药血清，按实验分组干预，Westernblotting检测TβＲⅠ、TβＲⅡ、Smad2/3、Smad4、Smad7的表达，ＲT－PCＲ检测TGF－β1mＲNA表达。结果：芪连扶正胶囊含药血清可上调TβＲⅠ、TβＲⅡ、Smad2/3、Smad4表达，下调Smad7、TGF－β1mＲNA在肺癌A549细胞中的表达，其中，各药组分子表达量除芪连扶正胶囊低剂量组外，与对照组相比均有显著性差异（P＜0．01），与化疗组相比，联合组及芪连扶正胶囊各组亦有显著性差异（P＜0．05或P＜0．01）。结论：芪连扶正胶囊含药血清可通过纠正TGF－β/smad通路紊乱发挥抗肺癌转移作用。关键词：芪连扶正胶囊；TGF－β/smad通路；肺癌；转移中图分类号：Ｒ284．1文献标志码：A文章编号：1673-）11-2567-03ＲesearchofQilianFuzhengCapsule’sFunctiononAnti－LungCancerMetastasisbyＲegulatingTGF－ΒPathwayQIYuanFu，LIHuiJie（TheAffiliatedHospitalofShandongUniversityofTCM，Ji’nan250014，Shandong，China）Abstract：Objective：ToobservetheeffectofQilianFuzhengCapsuleaffectingtheexpressionofthefactorsofTGF－βpathwayandstudyitspossiblemechanism．Methods：ForthepreparationofcontainingserumofQilianFuzhengCap-sule，A549cellswereculturedinvitroandintervened．WesternblottingwasusedtodetectedtheexpressionsofTβＲⅠ，TβＲⅡ，Smad2/3，Smad4andSmad7．ＲT－PCＲwasusedtodetecttheexpressionofTGF－β1mＲNA．Ｒesults：QilianFuzhengCapsulecanraisetheexpressionsofTβＲⅠ，TβＲⅡ，Smad2/3andSmad4andlowertheexpressionsofSmad7andTGF－β1mＲNA．Comparedwiththecontrolgroup，exceptQilianFuzhengCapsulelow－dosegroup，otherdruggroupshadsignificantdifferences（P＜0．01）．Comparedwithchemotherapygroup，thecombinedgroupandeachQilianFuzhengCapsulegroupshadsignificantdifferences（P＜0．05orP＜0．01）．Conclusion：QilianFuzhengCapsulehasfunctionofanti－lungcancermetastasisbycorrectingdisordersofTGF－β/smadpathway．Keywords：QilianFuzhengCapsule；TGF－βpathway；lungcancer；metastasis转化生长因子－β（transforminggrowthfactor，TGF－β）1材料与方法是一多功能生长因子超家族，调节细胞增殖和分化是其主1．1细胞与动物高转移人肺腺癌细胞系A549细胞株，要作用之一，TGF－β通路具有介导细胞生长抑制功能，通购自山东省医学科学院细胞室。SPF级SD雄性大鼠，购自路异常与多种肿瘤的发生、发展、肿瘤细胞的浸润及转移密山东中医药大学实验动物中心，质量合格证编号为SCXK切相关［1］。大量实验与临床研究证实中医药具有抑制肿（鲁）。瘤转移作用，笔者选用具有解毒化痰、消积散结、扶正抗癌1．2药品试剂芪连扶正胶囊（山东中医药大学附属医之效的院内制剂芪连扶正胶囊为研究对象，观察其对TGF院药剂科，批号：Z），顺铂（DDP，齐鲁制药有限－β/smad通路相关分子表达的影响，以期为防治肺癌复发公司，批号：207062DC）。胎牛血清（浙江天杭生物科技有转移筛选有效中成药。限公司），改良型ＲPMI－1640培养基（赛默飞世尔生物化学制品有限公司），PVDF膜（美国millipore公司），预染收稿日期：marker（加拿大Fermentas公司），蛋白抽提剂、兔抗人TβＲ基金项目：国家中医药管理局重点学科项目（）Ⅰ、兔抗人TβＲⅡ、兔抗人Smad2/3、兔抗人Smad4、兔抗人作者简介：齐元富（1963－），男，山东寿光人，主任医师，博士研究Smad7多、兔抗人β－actin、WesternBlottingDAB显色试剂生导师，博士，研究方向：中西医结合肿瘤防治研究。盒（武汉博士德生物工程有限公司），BCA蛋白定量试剂博士导师新论中华中医药2567学刊第32卷第11期CHINESE中华中OF医药学刊MEDICINEVol．32No．11Nov．20142014年11月AＲCHIVESTＲADITIONALCHINESESuperＲT二步法ＲT－PCＲ试剂盒盒、总ＲNA提取试剂盒、（北京康为世纪生物科技有限公司）。TGF－β1与β－actinTGF－β1上游引物：由上海生工生物技术有限公司合成，5’－CAGACTCTAGAGACTGTCAG－3’，下游5’－GTCAC-CAGAGAAAGAGGAC－3’，分子量：384bp；β－actin上游5’－TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA－3’，下游5’－TCAGGAG-GAGCAATGATCTTG－3’，分子量：302bp。1．3主要仪器CO2培养箱（德国Heraeus公司），超净工作台（美国ThermoForma公司），倒置相差显微镜（日本O-lympus公司），三恒电泳仪、蛋白电泳槽、转移电泳（北京市六一仪器厂），梯度PCＲ仪、电泳仪（德国Biometro公司），PCＲ仪（英国ThermoHybaid公司），凝胶成像分析系统（美国Alpha公司）。1．4芪连扶正胶囊含药血清制备购买体重（200±5）g、雄性SD大鼠25只，适应性喂养5d；分为芪连扶正胶囊组小心拔出梳子，加样，恒压电泳跑胶，直入电泳缓冲液，PVDF膜与胶按要至底部，准备转膜；将预处理的滤纸、裁剪合适，半干法恒流转膜2h；揭去滤纸，丽春求放好，5%脱脂奶粉封红染色观察蛋白带情况，去离子水漂洗，闭结合位点1h，一抗4℃过夜，二抗恒温摇床1h；DAB显色，显色完全终止反应，观察拍照，凝胶成像系统分［2］计算相对表达量。析，1．7PT－PCＲ检测TGF－β1mＲNA表达常规培养细胞，制备细胞悬液，平均分瓶，待细胞长满时按实验分组加48h后按试剂盒说明书逐步提取总ＲNA，药干预，紫外分光光度仪测定ＲNA样品纯度，各组样品吸光度比值均在1．93～1．96之间，可进行后续实验。按试剂盒说明书逐步扩增PCＲ，制胶、上样，跑电泳约30min，完毕后合成cDNA、将胶板至0．5μg/mLEB溶液中室温染色20min，凝胶成像分析系统观察拍照，凝胶成像系统分析，计算相对表达量。1．8统计学处理采用SPSS18．0统计软件对实验数据单因素方差分析，检验标准以P＜0．05表示有统计学意前者予以芪连扶正胶囊溶液灌胃，后者给予与空白对照组，1次/d；给药第7天末次灌药前12h禁食，等量生理盐水，末次给药后1h戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉采血，离心，取0．22μm微孔滤膜过滤除菌，－80℃冰箱保存备用。上清，1．5共分6组：对照组（10%胎牛血清），芪连扶正胶囊低剂量组（5%含药血清），芪连扶正胶囊中剂量实验分组组（10%含药血清），芪连扶正胶囊高剂量组（20%含药血清），化疗组（顺铂终浓度为2μg/mL），联合组（10%含药血清+顺铂）。1．6Westernblotting检测TGF－β/smad通路相关分子蛋白表达常规培养细胞，制备细胞悬液，平均分瓶，待细胞48h后提取蛋白，BCA基本长满时按实验分组加药干预，试剂盒蛋白定量，绘制标准曲线接近直线，可进行后续实验。组装玻璃胶版，灌分离胶，完全聚合后灌浓缩胶，插入梳子，浓缩胶完全聚合后将放入电泳槽内固定好，加表1组别对照组芪连扶正低剂量芪连扶正中剂量芪连扶正高剂量化疗组联合组n666666TβＲⅠ（%）10．23±1．．15＊＊14．14±1．47▲▲＊16．27±1．42▲▲18．11±1．25▲▲＊TβＲⅡ（%）11．84±1．．88＊＊15．61±1．17▲▲＊17．62±1．13▲▲19．14±0．86▲▲＊义。2结果2．1Westernblotting检测TGF－β/smad通路相关分子蛋TβＲⅡ、Smad2/3、白表达与对照组相比，各药组TβＲⅠ、Smad4的蛋白表达均高于对照组、Smad7低于对照组，其中余药组芪连扶正胶囊低剂量组无显著性差异（P＞0．05），均有显著性差异（P＜0．05或P＜0．01）；与化疗组相比，TβＲⅡ、Smad2/3、Smad4、Smad7芪连扶正胶囊各组TβＲⅠ、Smad7高于化疗组，的蛋白表达均低于化疗组、比较均有显TβＲ著性差异（P＜0．05或P＜0．01），而联合组TβＲⅠ、Smad2/3、Smad4的蛋白表达高于化疗组，Smad7低于化Ⅱ、疗组，比较亦有显著性差异（P＜0．05或P＜0．01），见表1。Smad2/3（%）Smad4（%）13．04±1．．29＊＊15．49±1．11▲▲＊＊16．87±0．82▲▲＊＊18．69±1．06▲▲20．06±0．95▲▲＊Smad7（%）34．50±1．．64＊＊30．35±1．85▲▲＊＊27．12±1．41▲▲＊24．83±1．56▲▲22．07±0．96▲▲＊＊TGF－β/smad通路相关因子蛋白相对表达量9．52±1．009．91±0．86＊＊11．20±1．01▲＊＊12．61±1．08▲▲＊14．16±1．07▲▲15．68±1．14▲▲＊12．39±1．16▲▲＊＊13．87±1．32▲＊＊*P0．05，注：单因素方差分析，与对照组比较，▲P0．05，▲▲P0．01；与化疗组比较，＊＊P0．01。2．2中华中医药2568学刊ＲT－PCＲ检测TGF－β1mＲNA表达对照组、芪连扶正低剂量、中剂量、高剂量组、化疗组及联合组的TGF－0．05）。3讨论多种肿瘤发生与TGF－β通路异常相关，肺癌也不例外。TGF－β被激活后具有生物学活性，与TβＲⅡ结合形成二聚体使TβＲⅠ磷酸化，随后Ｒ－Smads被磷酸化并与Co－Smad形成异源复合物移至核内，调节靶基因的转录；TGF－β信号通路调控着上皮细胞的生长分这些细胞由于TGF－β受体表达的下降或缺失、化，Smad突变导致细胞对TGF－β信号失去反应，从而导致［3］肺部肿瘤的发生。大量文献报道，非小细胞肺癌患者Hasegawa等的血清TGF－β水平显著高于健康对照组，（29．53±β1mＲNA相对表达量依次为（31．11±1．58）%、（27．28±1．75）%、（25．23±1．38）%、（23．03±1．50）%、1．59）%、（20．72±1．38）%；与对照组相比，各药组TGF－β1mＲNA的相对表达量均低于对照组，但芪连扶正胶囊低剂量组与之无显著性差异（P＞0．05），余药组均有显著性差异（P＜0．01）；与化疗组相比，芪连扶正胶囊各组TGF－β1mＲNA的相对表达量均高于化疗组，比较均有显著性差异（P＜0．05或P＜0．01），而联合组TGF－β1mＲNA的比较亦有显著性差异（P＜相对表达量低于化疗组，第32卷第11期CHINESE中华中OF医药学刊MEDICINEVol．32No．11Nov．20142014年11月AＲCHIVESTＲADITIONALCHINESE对非小细胞肺癌组织中的TGF－β1水平进行检测，结果发现TGF－β1水平在淋巴结转移、Ⅲ期患者中明显高于无淋巴结转移及Ⅰ、Ⅱ期的患者，同时发现TGF－β1水平较高的患者愈后较差［4］。TGF－βＲⅡ是TGF－β信号转导中的必需分子，对上皮细胞生长起着主要的抑制作用，也是重要的抑癌基因，其表达降低或缺失会导致多种肿瘤包括非小细胞癌的发生。研究表明，TGF－βＲⅡ表达可以促进肿瘤细胞的浸润与转移，而抑制其高表达则可阻止或减少肿瘤细胞的转移［5］。国内相关研究发现，TGF－β1、TβＲⅡ及Smad2的表达与肺癌的组织学类型、TNM分期、淋巴结转移、淋巴管侵袭、肿瘤微血管类型、肿瘤微血管数量、肿瘤间质反应及神经纤维周围间隙侵袭等有关［6］。而Smad2与Smad4是调节转录和TGF－β抗增殖应答的重要分子，也是重要的抑癌因子，突变和表达丢失与肺癌发生相关，可能是其异常导致TGF－β的细胞增殖抑制作用丧失，从而诱发癌变［7］。此外，有报道认为肺癌发生与Smad7密切相关，一方面，过表达的Smad7可通过抑制Smad3活化及核转位使TβＲⅠ、TβＲⅡ表达降低，STＲAP蛋白表达增高，进而减弱TGF－β/Smads通路的活性；另一方面，过表达的Smad7还可促进TGF－β对EＲK通路的活化，使细胞生长增殖能力大大增强，从而有利于肺癌的发生、发展［8－9］。研究对象芪连扶正胶囊是山东中医药大学附属医院肿瘤科长期反复临床、实验探索验证而获得，并由药剂科经过提取、纯化等工艺制备而成的具有抗肿瘤作用的中药复方制剂，在相关药效学研究及安全性评价的基础上，目前已广泛应用于临床。胶囊由生黄芪、连翘、莪术、清半夏、天南星、白花蛇舌草、仙鹤草、全蝎、蜈蚣、壁虎、女贞子11味中药组成，方中黄芪乃补气药之长，可补中益气，营运中州，且生用力专，取其益气托毒之功；连翘不仅能解疮毒，又能散气血凝聚、具有消痈散结之功，为疮家圣药；莪术有破血行气，消积止痛之效，为医家治积聚最药；清半夏、天南星、白花蛇舌草、仙鹤草、全蝎、蜈蚣、壁虎多具有解毒祛瘀散结之效；女贞子则补益肝肾、滋阴清热，反佐诸药伤阴之弊；纵观全方，药精力专，可针对肿瘤患者病机特点发挥解毒消积、扶正抗癌作用。且大量现代药理研究证实本胶囊所选药物可通过不同机制、不同程度的抑制肿瘤细胞、调节机体免疫力达到抗肿瘤作用，印证了芪连扶正胶囊组方的合理性与治疗恶性肿瘤的有效性［10］。本研究结果表明，芪连扶正胶囊含药血清可上调TβＲⅠ、TβＲⅡ、Smad2/3、Smad4表达，下调Smad7、TGF－β1mＲNA在肺癌A549细胞中的表达，进而纠正TGF－β/smad通路紊乱，发挥抗肿瘤转移作用，可作为防治肺癌复发转移的中成药选择之一。参考文献1］刘成敏，张成仁，王秀梅．Smads介导的TGF－β信号转导通路与肿瘤关系的研究进展［J］．中华肿瘤防治杂志，）：631－6342］齐元富，李慧杰，聂奔．纳米雄黄对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株增殖抑制及诱导凋亡作用的研究［J］．中国实验方剂学杂志，）：244－248．［3］FischerAN，FuchsE，MikulaM，etal．PDGFessentiallylinksTGF－betasignal－ingtonuclearbeta－cateninaccumulationinhepatocellularcarcinomaprogression［J］．Oncogene，）：．［4］HasegawaY，TakanashiS，KanehiraY，etal．Transforminggrowthfactor－betalevelcorrelateswithangiogenesistumorpro-gression，andprognosisinpatientswithnon－smallcelllungcar-cinome［J］．Cancer，）：964－969．［5］PardaliK，MoustakasA．ActionsofTGF－betaastumorsuppres-sorandpro－metastaticfactorinhumancancer［J］．BiochimBiophysActa，（1）：21－62．［6］程慧敏，贾晓民，王鹏程，等．非小细胞肺癌TGF－β1、TＲFⅡ及Smad2的表达及临床病理学意义［J］．徐州医学院院报，）：334－338．［7］ChinD，BoyleGM，ParsonsPG，etal．Whatistransforminggrowthfactor－beta（TGFCβ）［J］．BrJPlastSurg，）：215－221．［8］王莉．在肺癌发生中Smad7对TGF－β信号通路的调控［D］．重庆：重庆医科大学，．［9］SeckerGA，ShorttAJ，SampsonE，etal．TGFbetastimulatedre－epithelialisationisregulatedbyCTGFandＲas/MEK/EＲKsig-naling［J］．ExpCellＲes，（1）：131－142．［10］李慧杰．芪连扶正胶囊联合GP方案治疗晚期非小细胞肺癌的临床研究［D］．济南：山东中医药大学，．健康饮食可提高男性生育能力男人想要提高生育能力，就要注意饮食。一项新的研究显示，男性吃得健康，均衡摄取鱼类、蔬菜以及坚果等食物，与不常吃这些食物的男性相比，精子较不易老化。过去已经有研究显示，年龄较大的男性精子DNA较易碎裂，染色体也较易出现异常，因此产生不孕的机率相对较高，即使有孩子，孩子也可能会出现出生缺陷。而该研究发现，如果男性的饮食富含维生素C、维生素E、锌与叶酸，就能帮助保护精子中的DNA，特别是对于40岁以上的男性，这一效果更明显。这项由英国卡利生育组织对44岁以上男性所进行的研究发现，那些摄取像橘子、胡椒、草莓、花椰菜和马铃薯等富含维生素C食物量最大的男性，与不常吃这些食物的男性相比，其精子DNA的受损情况可降低近20%。研究人员表示，类似的饮食方式还包括摄取富含锌的食物，比如鱼类和贝类；而富含维生素E的食物以坚果和中种子类居多，叶酸则多半存在于绿色叶菜类蔬菜当中。华中研究人员指出，如果男性想要有小孩，千万不要低估饮医食的重要性，饮食好坏会对男性生育能力产生不同的效果，药有些食物容易造成自由基横行，而自由基会损害细胞。有2569的营养素会预防精子受到损害，或让精子更加健康。因此，学男性吃东西时要特别注意，像肉类这种含有环境荷尔蒙或刊类似雌激素的物质，可能会损害精子的形成，最好少吃为妙。［［包含总结汇报、教学研究、行业论文、农林牧渔、表格模板、自然科学、外语学习、经管营销、计划方案、党团工作以及芪连扶正胶囊调控TGF_smad信号通路抑制肺癌转移的研究等内容。
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