人剪切修复基因XPD对肝癌细胞中p53和Ets-1基因的作用--《南昌大学》2014年硕士论文
人剪切修复基因XPD对肝癌细胞中p53和Ets-1基因的作用
【摘要】：目的：
将野生型XPD基因通过质粒转入人肝癌细胞HepG2中，再加入p53抑制剂Pifithrin-α（PFT-α），观察基因XPD、p53、Ets-1的表达变化和对细胞增殖活力的影响。
1、复苏购买于美国模式菌种收集中心的人肝癌细胞HepG2，采用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养液培育、传代、冻存菌种；2、将含有pEGFP-N2空载质粒（N2质粒）（从美国Clontech公司购买）和pEGFP-N2-XPD重组质粒（XPD质粒）（由本实验室构建）的JM-109大肠杆菌的菌液，分别进行摇菌扩增；3、使用质粒提取试剂从菌液中分别提取N2质粒、XPD质粒；4、设置6个实验组，1组：空白对照组、2组：脂质体对照组、3组：pEGFP-N2组、4组：pEGFP-N2-XPD组、5组：pEGFP-N2-XPD+Pifithrin-α组、6组：Pifithrin-α组。5、使用瞬时转染技术，将质粒转染至细胞中，以空白组做对照，利用荧光显微镜，察看细胞中绿色荧光蛋白的表达，24h后加入p53抑制剂Pifithrin-α（PFT-α），在孵育24h后收集细胞；6、提取HepG2细胞总RNA，经过逆转录为cDNA，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞中XPD、p53、Ets-1的mRNA表达变化；7、提取细胞总蛋白，用蛋白印记法（Western blot）检测XPD、p53、phospho-p53(ser-15)、Ets-1蛋白表达的变化。8、使用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）观察HepG2细胞增殖的活力，流式细胞仪检测HepG2细胞周期变化。
1、转染N2空载质粒和XPD重组质粒后，在绿色荧光显微镜下，细胞表达出大量绿色荧光。2、利用RT-PCR方法检测mRNA表达，转染XPD重组质粒后，与空白对照组相比，XPD、p53的mRNA表达水平上升（P0.01），Ets-1表达下降（P0.01）；在加入Pifithrin-α（PFT-α）后，与pEGFP-N2-XPD重组质粒组比较，Ets-1表达出现部分上升（P0.01），XPD、p53没有明显变化。3、使用Western blot检测蛋白表达，转染XPD重组质粒后，与空白对照组相比，XPD、p53、p-p53蛋白表达水平增加（P0.01），Ets-1蛋白水平下调（P0.01）；加入Pifithrin-α后，与pEGFP-N2-XPD组比较，p-p53蛋白表达明显下降，Ets-1出现上升（P0.01），而XPD、p53没有明显变化。4、MTT法观察细胞，将XPD质粒转染至细胞后，增殖能力下降，加入Pifithrin-α（PFT-α）后出现部分上升（P0.01）。5、流式细胞仪检测细胞周期显示，转染XPD质粒后，HepG2细胞进入S期发生阻滞，停滞在G1期，加入PFT-α后阻滞作用减弱。
将野生型XPD基因转染至HepG2细胞中，促使p53表达上调，同时抑制了原癌基因Ets-1的表达；加入p53抑制剂后，这种作用被部分逆转了，可以认为XPD的作用是通过p53来对Ets-1基因的表达进行调控的。转染野生型XPD基因后，肝癌细胞的增殖下降，细胞周期停滞，凋亡增加。这些研究均为肿瘤的基因治疗提供实验依据。
【关键词】：
【学位授予单位】：南昌大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：R73-36【目录】：
摘要3-5ABSTRACT5-8中英缩略词表8-9第1章 前言9-12第2章 材料与方法12-24 2.1 实验材料12-14
2.1.1 细胞株和质粒来源12
2.1.2 主要试剂及产地12-13
2.1.3 主要仪器设备及产地13-14 2.2 实验方法14-23
2.2.1 HepG2 细胞的培养14-16
2.2.2 质粒的提取16-18
2.2.3 实验分组和转染加药18-19
2.2.4 RT-PCR 检测 mRNA 表达水平19-21
2.2.5 Western blot 检测蛋白表达水平21-22
2.2.6 MTT 法检测细胞增殖能力22
2.2.7 流式细胞仪检测细胞周期22-23 2.3 统计学方法23-24第3章 实验结果24-30 3.1 质粒转染结果24 3.2 mRNA 表达水平24-25 3.3 蛋白水平的表达25 3.4 细胞增殖检测25-26 3.5 细胞周期变化26-30第4章 讨论30-32第5章 结论32-33致谢33-34参考文献34-38攻读学位期间的研究成果38-39综述39-47 参考文献43-47 附图47
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构建的表达载体中插入目的基因可以是不能表达的序列吗?比如说整个序列都是内含子最后质粒导入到的受体细胞本身含有该内含子的能够表达的完整基因,我只是想了解该内含子的结构对完整基因有啥影响
笑踩鸿蒙亲吗36
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可以插入内含子.某些内含子有增强子/减弱子的功能；可以改变mRNA的结构从而改变mRNA稳定性；可以表达小RNA从而改变翻译表达水平.
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可以，只是它不会表达出性状，而且不会对完整基因有影响，因为引起基改变的只有基因变异，或基因重组。
应该不可以
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【求助】有多个剪切体的基因，如何构建表达质粒
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问题已解决悬赏丁当:2
我想构建一个基因的过表达质粒，可是这个基因多有个剪切体，我该怎么设计？根据mRNA设计的话只能表达出一种剪切体，怎么设计才能构建出能够表达出多种剪切体的质粒？
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有没有人啊！！！！
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一个人都没有么？？？
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dr-g 我想构建一个基因的过表达质粒，可是这个基因多有个剪切体，我该怎么设计？根据mRNA设计的话只能表达出一种剪切体，怎么设计才能构建出能够表达出多种剪切体的质粒？ 几乎每个基因都有多个isoform一般会用标准序列 （多数是isoform1）
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如楼上所讲找到一个大家常用的序列，把它的CDS序列连入载体即可。有些不同的isoform，功能甚至是相反的，所以你这样做没有必要。
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几乎每个基因都有多个isoform一般会用标准序列 （多数是isoform1）原理是什么呢？？？我想知道原理，不然心里不踏实,谢谢！
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liamliu2015 如楼上所讲找到一个大家常用的序列，把它的CDS序列连入载体即可。有些不同的isoform，功能甚至是相反的，所以你这样做没有必要。原理是什么呢？？？如果这样的话，那么，不就不能完全模仿内源性的么
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几乎每个基因都有多个isoform一般会用标准序列 （多数是isoform1）如果这样的话，那么，不就不能完全模仿内源性的么
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通常来说，某个isform在特定组织中的表达量最高，大家就认为它在执行该基因的主要功能，研究也最多，功能比较确切。体外肯定无法完全模拟体内，只能是相似吧。
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liamliu2015 通常来说，某个isform在特定组织中的表达量最高，大家就认为它在执行该基因的主要功能，研究也最多，功能比较确切。体外肯定无法完全模拟体内，只能是相似吧。 受教了，谢谢！
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总结就是用isoform1即可是吧，感谢回答，也帮我解决了这个疑惑！
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幸福给你看 总结就是用isoform1即可是吧，感谢回答，也帮我解决了这个疑惑！像VEGF可bushiyongisoform1 哦具体问题具体分析
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欢迎大家来我的腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、载体构建技术答疑贴讨论！帖子链接如下：
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不知道我搜索的剪切体中，其中一个命名为&目的基因FL&，这个fl是否是full-length的意思？打算构建过表达载体，导师让构建全长，一查这么多剪切体，都懵了。求各位大家的指教！
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关于丁香园上传用户：japufnwskj资料价格：5财富值&&『』文档下载 ：『』&&『』学位专业：&关 键 词 ：&&&&&&权力声明：若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请点击。摘要:（摘要内容经过系统自动伪原创处理以避免复制，下载原文正常，内容请直接查看目录。）研讨配景：胃癌是最多见的消化道恶性肿瘤之一，化疗是停顿期胃癌最主要的医治办法，但是，因为肿瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)的发生，经常招致化疗掉败，是以，深刻研讨胃癌MDR构成的机制，从而采用RNA搅扰、基因过表达等办法逆转胃癌MDR，将有能够给胃癌基因医治带来新的冲破。RNA搅扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA(double strand RNA,dsRNA)引发的序列特异的转录后基因缄默（PTGS）进程。时代，双链RNA被特异的核酸酶降解成小搅扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，小搅扰RNA与靶卵白联合成RNA引诱的缄默复合物(siRNA-induced silencing complex，RISC)，RISC辨认并降解靶mRNA，发生有用的基因缄默。RNA搅扰技巧具有相当高的特异性和高效性，而且操作简略、周期短、本钱低。今朝，该技巧已成为研讨基因功效、熟悉疾病实质的主要对象，未来更无望用于疾病的基因靶向医治，具有相当辽阔的临床运用远景。此前,本课题组以人胃癌细胞株SGC7901、阿霉素引诱的耐药细胞株SGC7901/ADR和丹参逆转后的耐药细胞株为研讨对象，运用卵白质组学技巧对三者停止卵白质组学的差别比拟，而且经由过程高效液相色谱电喷雾电离飞翔串连质谱对差别卵白质停止判定，成果发明，S100A6在SGC7901中出现高表达，在SGC7901/ADR中表达下调，在丹参逆转后的耐药细胞株中再次出现高表达；并采取免疫细胞化学办法、Western blot办法和RT-PCR技巧再次验证了S100A6的差别表达。本研讨以S100A6高表达的人胃癌细胞株SGC7901为研讨对象，应用RNA搅扰技巧，将构建S100A6-shRNA质粒载体并转染入SGC7901细胞，挑选有用的RNA搅扰片断，为有用下调S100A6在SGC7901细胞中的表达，并进一步商量S100A6与胃癌MDR的关系奠基基本。目标：构建人S100A6基因shRNA真核表达质粒，应用及时荧光定量PCR技巧检测其对S100A6基因的缄默后果，挑选出最有用的RNA搅扰靶点，为进一步研讨S100A6与胃癌多药耐药奠基基本。办法：本课题根据Gene Bank中人S100A6基因序列，针对S100A6基因设计分解具有高特异性的四条shRNA搅扰片断，同时设计一有关序列作为阴性对比(negative control，NC)。将各搅扰片断及阴性对比与带有绿色荧光卵白GFP及氨苄青霉素抗性的真核表达载体pRNAT-U6.1/GFP/Neo衔接，阳性克隆判定及DNA测序判定重组质粒。用脂质体转染法将重组质粒转染到SGC7901细胞中，在荧鲜明微镜下不雅察绿色荧光卵白表达情形及转染效力。转染48小时后提取细胞总RNA，应用RT-QPCR技巧停止检测，从而挑选出最有用的RNA搅扰片断，肯定最好搅扰靶点。成果：经由过程阳性克隆判定判定和DNA测序判定，胜利构建四种针对S100A6的shRNA质粒及阴性对比质粒。将这五组质粒分离转染SGC7901细胞后，在荧鲜明微镜下都可不雅察到亮绿色荧光，获得转染效力为40%。转染后48小时提取细胞总RNA，荧光及时定量PCR检测四条shRNA真核表达质粒在mRNA程度对S100A6克制率分离为31.3%、20.6%、27.9%、22%，解释四组质粒都可使S100A6基因的mRNA表达量降低，个中S100A6-1对S100A6基因在mRNA程度上的克制感化最显著，克制率为31.3%。四组质粒RNA搅扰效力分离为78.25%、51.5%、69.75%、55%，个中S100A6-shRNA-1的搅扰效力最高，为78.25%，解释S100A6-1为最好挑选靶点。结论：1、人S100A6基因shRNA真核表达质粒能特异性克制人胃癌细胞株SGC7901中S100A6基因mRNA程度的表达。2、S100A6-shRNA-1真核表达质粒对S100A6基因mRNA程度的搅扰效力最高且准确有用。3、S100A6-1的靶点序列作为最好挑选靶点，可以用于后续试验研讨。Abstract:Research background: gastric cancer is one of the most common malignant tumor of digestive tract, chemotherapy is gastric cancer the main remedy, however, because of tumor MDR (multidrug resistance MDR pause), often lead to the failure of chemotherapy is to deep research of gastric cancer MDR mechanism, so that the use of RNA interference and gene expression way to reverse MDR of gastric cancer, there will be to to gastric cancer cure bring new breakthrough. RNA interference (RNAi) is composed of double stranded RNA (double strand RNA, dsRNA) caused by sequence specific post transcriptional gene silencing (PTGS) process. Era, double stranded RNA is specific nuclease degradation into small interference RNA (siRNA and siRNA), small interference RNA and target protein united into RNA induce silence complexes (siRNA-induced silencing complex, RISC). RISC identification and degradation of the target mRNA, useful for gene silencing. RNA interference technique has the specificity and efficiency is high, and simple operation, short cycle, low cost. Currently, the technique has become a research gene function, familiar with the main object of parenchymal disease, next to the more hopeless for disease gene target to cure, with fairly broad clinical application prospect. Previously, the research group in human gastric cancer cell line SGC7901, adriamycin induce drug-resistant cell line SGC7901 / ADR and Salvia miltiorrhiza reversal of multidrug resistance cell line for research object, use albumen quality group learning skills to stop proteome difference compared, and through high performance liquid phase chromatography electrospray ionization fly tandem mass spectrometry of differential protein can judge, inventions, S100A6 in SGC7901 and expression, in SGC7901 / ADR down-regulation, in Salvia miltiorrhiza reversal of multidrug resistance cell lin and take immunocytochemical method, Western blot and RT-PCR techniques once again proved the difference of S100A6 expression. In this research, S100A6 expression of human gastric cancer cell line SGC7901 as the research object, the application of RNA interference technique, the construction of S100A6-shRNA plasmid vector and transfected into SGC7901 cells, choose the usefulness of the RNA interference fragment, useful down regulated expression of S100A6 in human gastric cancer cell line SGC7901 and further discuss S100A6 and gastric cancer MDR relations foundation. Objective: Construction of shRNA targeting human S100A6 gene eukaryotic expression plasmid, timely application of fluorescence quantitative PCR technique detecting the of S100A6 gene silence consequences, pick out the most useful RNA interference target, for the further research of S100A6 and gastric cancer multi drug resistance foundation. Way: this topic according to S100A6 gene sequence of the gene bank, the S100A6 gene design decomposition with high specificity of four shRNA interference fragment. At the same time, the design about a sequence as a negative contrast (negative control, NC). Will the interference fragment and negative contrast with green fluorescent protein (GFP) and ampicillin resistance of eukaryotic expression of cohesive carrier pRNAT-U6.1/GFP/Neo. Positive clone determination and DNA sequencing determination of recombinant plasmid. By liposome transfection method. The recombinant plasmid was transfected into SGC7901 cells, in the bright fluorescent micro mirror not Yacha green fluorescent protein expression and transfection effect. Transfection 48 hours after total RNA was extracted from the cells and application of RT-qPCR skills test to pick out the most useful RNA interference fragment, certainly the best interference target. Results: through the process of positive clones to determine decision judgment and DNA sequencing. The success in building four for S100A6 shRNA plasmid and negative contrast plasmid. Will the five groups of the plasmid isolation was transfected into SGC7901 cells and in fluorescence microscope can not Yacha to bright green fluorescence, obtained from transfected effect is 40%. After transfection 48 hours total RNA was extracted from the cells, real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the four shRNA eukaryotic expression plasmid in mRNA level of S100A6 restraint rate separation for 31.3% and 20.6%, 27.9%, 22%, explain four plasmid group can make S100A6 gene mRNA expression decreased, the medium S100A6-1 of S100A6 base for mRNA level in the restraining effect of the most significant restraint rate was 31.3%. Four groups of plasmid RNA interference effect separation 78.25%, 51.5% and 69.75%, 55%, medium S100A6-shRNA-1 interference effect highest 78.25%, explain S100A6-1 is the best selection of targets. Conclusion: 1, S100A6 gene shRNA eukaryotic expression plasmid specific restraint of human gastric cancer cell line SGC gene mRNA level of expression. 2, the eukaryotic expression plasmid S100A6-shRNA-1 was the highest and accurate useful for degree of S100A6 gene mRNA interference effect. 3, S100A6-1 target sequence as the best selection of targets, can be used for follow-up trials.目录:摘要6-8Abstract8-10前言11-12材料与方法12-24结果24-32讨论32-36结论36-37参考文献37-39综述39-52&&&&参考文献44-52致谢52-53分享到：相关文献|}