甲基化特异性定量PCR技术的应用研究进展--《山东医药》2014年19期
甲基化特异性定量PCR技术的应用研究进展
【摘要】：正表观遗传是指DNA序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变,表观遗传改变主要从三个层面调控基因表达:DNA修饰(DNA甲基化)、蛋白修饰以及非编码RNA的调控(如micro RNA)[1]。DNA甲基化作为研究最为深入的一种,在人类胚胎发育、基因印记、肿瘤发生发挥重要作用[2]。原癌基因和抑癌基因在表观遗传学上的异常改变是肿瘤发生的重要机制之一[3]。1996年Herman等[4]发明
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R440【正文快照】：
表观遗传是指DNA序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变,表观遗传改变主要从三个层面调控基因表达:DNA修饰(DNA甲基化)、蛋白修饰以及非编码RNA的调控(如micro RNA)[1]。DNA甲基化作为研究最为深入的一种,在人类胚胎发育、基因印记、肿瘤发生发挥重要作用[2]。原癌基
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【参考文献】
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五且昆·吐尔逊;陈艳;李惠武;;[J];地方病通报;2009年02期
李鑫;胡兰;季安全;郗永义;;[J];法律与医学杂志;2006年04期
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府伟灵,黄庆;[J];国外医学(临床生物化学与检验学分册);2004年04期
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甲基化特异性定量 PCR 技术的应用研究进展
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甲基化特异性定量 PCR 技术的应用研究进展
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基因甲基化检测
技术服务信息
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上海捷兰生物技术有限公司
漕宝路500号4号楼4206室
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技术服务详细描述
简介：甲基化检测主要包括MSP和BSP,以及QMSP.基因启动子甲基化检测在临床诊断、药物敏感性检测等方面具有很高的应用价值,所以目前是一项比较热门的研究手段。
原理与应用
甲基化是在DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧***嘧***环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程。DNA甲基化修饰现象广泛存在于多种有机体中，是最早发现的修饰途径之一，是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分。大量研究表明，DNA甲基化不改变DNA的一级结构，但是能引起染色质结构、DNA 构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而在基因的表达及其调控、DNA的复制、细胞的生长发育、X染色体失活、衰老以及许多人类疾病(如发育畸形、癌症、心血管疾病、糖尿病和神经心理失调等)发生过程中发挥重要作用。
DNA的甲基化主要形成5-甲基胞嘧***和少量的N6- 甲基腺嘌呤及7-甲基鸟嘌呤。在高等生物中，5-甲基胞嘧***多发于CpG二核苷酸序列中，基因组中60%-90%的CpG是甲基化的。在甲基转移酶(DNMT)的催化作用下，利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的甲基，使CpG二核苷酸序列中的胞嘧***转变为5-甲基胞嘧***。由于甲基化胞嘧***极易在进化中丢失，高等真核生物中CpG序列远远低于其理论值，但在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子和第一外显子区，CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧***的富集区，形成所谓的CpG岛。哺乳类基因组中约存在4万个CpG岛，大多位于转录单元的5&区。CpG岛的高甲基化是肿瘤中存在的普遍现象，而启动子CpG 岛的高甲基化是除突变和缺失外肿瘤中抑癌基因失活的第三种机制。因此，基因启动子甲基化检测在临床诊断、药物敏感性检测等方面具有很高的应用价值。
◇ BSP分析
◇ Msp分析
◇ QMSP分析
◇焦***酸测序法进行甲基化分析
◇ 甲基化芯片（QIAGEN EpiTect Methyl PCR Array）
亚硫酸盐修饰克隆测序法，巢式PCR法，荧光定量PCR法，焦***酸测序法
使用美国ABI公司的9700 PCR仪和Step-one PLUS realtime RCR System为主的PCR装置及QIAGEN公司PyroMark Q96 ID焦***酸测序仪。
服务项目说明
亚硫酸盐测序法 (bisulfite sequencing PCR, BSP)
先抽提基因组DNA，再进行亚硫酸盐修饰，甲基化PCR后装克隆，通过最后对PCR产物进行克隆测序，可以得到目的片段中每个CG位点的甲基化情况，这种方法更加准确，所以目前BSP法受到更多研究者的青睐！ 最后通过对测序结果分析, 可以得到如下数据:
& 测序序列与目的序列的相似度（%）
& C-T转化效率（%）
& 目的序列中每个CG的甲基化情况（点状图）
& 目的序列中每个CG的甲基化比例（%） （柱状图）
■ 甲基化特异性PCR (methylation-specific PCR，MSP)
甲基化特异性PCR(Methylmion Specific PCR，MSP)及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法．MSP法的原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧***都被转化为尿嘧***，而甲基化的胞嘧***则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。
■ QMSP分析
QMSP是采用荧光定量的方法进行甲基化分析，可确切定量出甲基化的比例。但具体方法没有标准，详情请电联我们的技术服务人员。
■ 焦***酸测序法（Pyrosequencing）分析
焦***酸测序（Pyrosequencing）技术可以给出启动子一段区域绝对的测序结果和甲基化程度的精确比率、可以说是甲基化检测的金标准，是甲基化精确定量的检测平台，它不仅能测定邻近CpG区域的单个甲基化水平，甚至还包括测序的引物区域。
■ 甲基化芯片（QIAGEN EpiTect Methyl PCR Array）使用MethylScreen& 技术，无需亚硫酸氢盐转化，适用于信号通路或疾病相关的区域DNA甲基化分析。可实现单个基因以及疾病和信号通路相关的一组基因中CpG
岛DNA 甲基化的快速准确检测。该技术无需亚硫酸氢盐转化。通过一步简单的限制性内切酶消化然后进行实时定量PCR，即可利用DNA Methylation PCR
Array 同时分析22 个或94 个不同基因的DNA 甲基化水平。操作过程的简单让这个技术非常适合DNA 甲基化图谱分析和生物标志物鉴定。
&&&&& & & & & & & & & & & && &
实验流程及服务要求
◇ 如果您需要进行此项服务,请电话联系我们公司或发送E-mail给我们。
◇ 请寄送足量的并且保证纯度的基因组DNA(浓度在500 ng/&l以上，体积在 20 &l以上)。
◇ 如果提供的材料为细胞或组织，DNA的提取费用另收。 同时应保证材料新鲜，动物细胞数为106以上，动物组织为100 mg以上。
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DNA甲基化检测方法
□ 范保星 张开泰 等
摘　要:DNA甲基化是真核细胞基因组重要修饰方式之一，参与基因的表达调控。目前，DNA化检测的方法主要有：酶切、限制性酶切－KPCR（restriction enzyme PCR）、甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MS PCR）、Southern印迹亚硫酸盐测序（bisulifite DNA sequencing）、为性高效液相色谱（denature high-performance liquid chromatography,DHPLC）、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸（methylation-sensitive single nucleotide primer extensio,MS-SNuPE）、PCR荧光为性曲线分析（PCR and fluorescence melting cureve analysis）、亚硫酸盐PCR－SSCP（bisulfite-PCR-SSCP）、COBRA（combined bisulfite restriction analysis）和MethLight。
特别说明：本文献摘要信息，由维普资讯网提供，本站只提供索引，不对该文献的全文内容负责，不提供免费的全文下载服务。
金月芽期刊网 2017：>>动物实验>药理实验>甲基化特异性PCR(MSP)检测基因启动子甲基化
甲基化特异性PCR(MSP)检测基因启动子甲基化
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更新时间： 8:27:51
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厂商性质：
生产型,贸易型,
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上海迪奥生物科技有限公司
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甲基化特异性PCR(MSP)检测基因启动子甲基化
甲基化是在DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下,利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程.
DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，它不改变DNA的一级结构，却在细胞的发育、基因的表达、及基因组的稳定性中起着重要的作用。
CpG岛的高甲基化是肿瘤中存在的普遍现象，而启动子CpG岛的高甲基化是除突变和缺失外肿瘤中抑癌基因失活的第三种机制。
因此，基因启动子甲基化检测在临床诊断（如甲基化检测与低剂量CT相结合）、药物敏感性检测等方面具有很高的应用价值。
目前甲基化特异性PCR(Methylmion Specific PCR，MSP)及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法．MSP法的原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。MSP法灵敏度较高，应用范围广。
MSP实验流程：
& 抽提基因组DNA，并定量
&（组织、细胞、全血、血浆/清等）
亚硫酸氢钠处理DNA
（pH5.0 50℃ 8-16hr所有试剂新鲜配制）
DNA修饰后纯化回收
PCR/Real-time PCR检测（引物、退火温度）
琼脂糖凝胶电泳/拷贝数 &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
1、&实验流程长，操作烦琐，不易控制；
2、&起始DNA量不能太多，否则修饰不完全；但量太少，在漫长的修饰、回收过程中容易丢失，所以要求熟练而精细的实验操作。
3、&修饰过程中的pH值要绝对准确、所有试剂要求新鲜配置，并且需要反复摸索找出合适的反映时间。
4、&PCR引物设计、退火温度选择、Taq酶及Buffer的选择都需要不断优化。
总之，在MSP过程中，影响结果的因素比较多，想要得比较好的实验结果，不仅要求高质量的实验试剂，更要求丰富的实验经验和良好的实验习惯。
迪奥生物凭借多年分子生物学实验经验和稳定的技术平台，还有数百例MSP的成功经验，已经建立了Taqman探针法检测基因启动子甲基化的技术体系，并且在临床应用方面与多家医院建立了稳定的合作关系！
使用仪器：美国应用生物系统公司（ABI）VeritiTM梯度PCR仪MSP实验流程：
& 抽提基因组DNA，并定量
&（组织、细胞、全血、血浆/清等）
亚硫酸氢钠处理DNA
（pH5.0 50℃ 8-16hr所有试剂新鲜配制）
DNA修饰后纯化回收
PCR/Real-time PCR检测（引物、退火温度）
琼脂糖凝胶电泳/拷贝数 &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
1、&实验流程长，操作烦琐，不易控制；
2、&起始DNA量不能太多，否则修饰不完全；但量太少，在漫长的修饰、回收过程中容易丢失，所以要求熟练而精细的实验操作。
3、&修饰过程中的pH值要绝对准确、所有试剂要求新鲜配置，并且需要反复摸索找出合适的反映时间。
4、&PCR引物设计、退火温度选择、Taq酶及Buffer的选择都需要不断优化。
总之，在MSP过程中，影响结果的因素比较多，想要得比较好的实验结果，不仅要求高质量的实验试剂，更要求丰富的实验经验和良好的实验习惯。
迪奥生物凭借多年分子生物学实验经验和稳定的技术平台，还有数百例MSP的成功经验，已经建立了Taqman探针法检测基因启动子甲基化的技术体系，并且在临床应用方面与多家医院建立了稳定的合作关系！
使用仪器：美国应用生物系统公司（ABI）VeritiTM梯度PCR仪MSP实验流程：
& 抽提基因组DNA，并定量
&（组织、细胞、全血、血浆/清等）
亚硫酸氢钠处理DNA
（pH5.0 50℃ 8-16hr所有试剂新鲜配制）
DNA修饰后纯化回收
PCR/Real-time PCR检测（引物、退火温度）
琼脂糖凝胶电泳/拷贝数 &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
1、&实验流程长，操作烦琐，不易控制；
2、&起始DNA量不能太多，否则修饰不完全；但量太少，在漫长的修饰、回收过程中容易丢失，所以要求熟练而精细的实验操作。
3、&修饰过程中的pH值要绝对准确、所有试剂要求新鲜配置，并且需要反复摸索找出合适的反映时间。
4、&PCR引物设计、退火温度选择、Taq酶及Buffer的选择都需要不断优化。
总之，在MSP过程中，影响结果的因素比较多，想要得比较好的实验结果，不仅要求高质量的实验试剂，更要求丰富的实验经验和良好的实验习惯。
迪奥生物凭借多年分子生物学实验经验和稳定的技术平台，还有数百例MSP的成功经验，已经建立了Taqman探针法检测基因启动子甲基化的技术体系，并且在临床应用方面与多家医院建立了稳定的合作关系！
使用仪器：美国应用生物系统公司（ABI）VeritiTM梯度PCR仪
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