您所在位置： &
&nbsp&&nbsp&nbsp&&nbsp
鈉钙交换体基因稳定转染及药物筛选细胞模型的建立.doc 9页
本文档一共被下载：
次 ,您可全文免费在线阅读后下载本文档。
下载提示
1.本站不保证该用户上传的文档完整性，不预览、不比对内容而直接下载产生的反悔问题本站不予受理。
2.该文档所得收入(下载+内容+预览三)归上传者、原创者。
3.登录后可充值，立即自动返金币，充值渠道很便利
需要金币：100 &&
鈉钙交换体基因稳定转染及药物筛选细胞模型的建立
你可能关注的文档：
··········
··········
钠钙交换体基因稳定转染及药物筛选细胞模型的建立龙雁，袁辉，王晓良*中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所先农坛街1号，北京，100050摘要：目的构建三种不同亚型的CHO-NCX稳定转染细胞株，以便筛选可能的钠钙交换体（NCX）调节剂。方法采用脂质体法将NCX目的基因稳定导入CHO细胞中，检测稳定转染细胞株中NCX的蛋白表达和电流大小，并观察温度和NCX抑制剂KB-R7943对电流的影响。结果Westernblot结果显示与CHO-pcDNA3.1空白细胞相比，CHO-NCX稳定转染细胞株中NCX蛋白的表达量显著升高；电生理结果提示CHO-NCX稳定转染细胞株中NCX电流远大于CHO-pcDNA3.1空白细胞；温度从22℃升高到35℃时，NCX电流显著增大；NCX抑制剂KB-R7943对INCX具有显著抑制作用。结论本试验成功的建立了特异性表达NCX1.1，NCX1.4，NCX1.5三种亚型的细胞模型，为脑缺血等疾病的研究提供了良好的药物筛选平台。NCX1.1；NCX1.4；NCX1.5；NCXKB-R7943；膜片钳EstablishmentandEvalutionofCellModelTargetedatSodium-CalciumExchangerLongYan,YuanHui,WangXiaoliang(InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)ABSTRAT:OBJECTIVETodeveloppotentialNCXmodulatorwith3differentkindsofCHO-NCXcellswhichstablyexpressedNCXproteins.METHODSTheNCXgeneswereligatedwithpcDNA3.1+vectorandthenstablyintroducedintoCHOcellsbyliposome.UsingwesternblotandpatchclamptechniquetomeasuretheexpressionlevelsofNCXproteinsandNCXcurrents,afterwhichtoobservethemagnitudeofNCXcurrentswhentemperaturechangedandNCXinhibitorutilized.RESULTSComparedwithblankCHO-pcDNA3.1cells,theproteinamountsofstablytransfectedCHO-NCXcellsweresithecurrentsofCHO-NCXcellsweremuchhigherthanthatofblankCHO-pcDNA3.1cells.Whentemperaturechangedfrom22℃to35℃,thecurrentsofCHO-NCXcellsup-regulatednotably,afterNCXinhibitorKB-R7943added,thecurrentsofCHO-NCXcellsdecreasedsignificantly.CONCLUSIONOurstudysuccessfullyconstructedacellmodelwhichexpressedaspecifickindofNCXisoforminCHOcells,whichprovidedausefultooltosearchnewdrugsofcerebralischemiatargetedatNCX.KEYWORDS:NCX1.1;NCX1.4;NCX1.5;NCXinhibitorKB-R7943;patchclamp作者简介：龙雁，女，博士研究生Tel：(010)longyan@钠钙交换体（NCX）是细胞膜上具有9个跨膜片段的一种双向转运体，根据细胞膜内外离子浓度梯度和膜电位的不同，NCX可以通过正向转运（Ca2+外流）或者反向转运（Ca2+内流）两种转运方式将Na+和Ca2+以3：14：12+的稳定[1-3]。生理状态下，NCX主要利用细胞内外的Na+浓度梯度排出细胞中的Ca2+[4]，而在病理状态下，当细胞内Na+浓度升高时，NCX反向转运可以导致细胞内钙超载。近年来越来越多的研究表明NCX与脑缺血关系非常密切，但结论并不一致。有的研究者认为抑制NCX反向转运具有脑保护作用，而有的研究者却认为激活NCX的反向转运可以有效保护神经元[5]。此外，在低氧缺氧，脊髓损伤后的白质退行性病变，大脑损
正在加载中，请稍后...SNCG基因转染对PC-3细胞抗肿瘤药物作用效果的影响--《中华男科学杂志》2008年12期
SNCG基因转染对PC-3细胞抗肿瘤药物作用效果的影响
【摘要】：目的:观察转染了质粒PCI-NEO-SNCG后的前列腺癌激素非依赖性细胞系PC-3细胞对抗肿瘤药物顺铂(DDP)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿霉素(ADM)、长春新碱(VCR)、紫杉醇(TAX)的敏感性,探讨SNCG的表达对各种抗肿瘤药物作用效果的影响。方法:转染质粒PCI-NEO和PCI-NEO-SNCG至PC-3细胞,采用RT-PCR法检测PC-3细胞中SNCG的表达;MTT法检测各抗肿瘤药物对转染后PC-3细胞的抑制作用;流式细胞术分析转染细胞经TAX作用后的细胞周期及凋亡。结果:5种抗肿瘤药物对转染了空载体PCI-NEO质粒及PCI-NEO-SNCG质粒细胞的生长抑制作用均存在时间依赖性;转染PCI-NEO的PC-3细胞组与转染PCI-NEO-SNCG的PC-3细胞组中各种抗肿瘤药物的抑制效果比较显示,DDP、5-FU、ADM、VCR的抑制效果两组间没有显著性差异(P0.05),而TAX对转染PCI-NEO-SNCG的细胞的抑制率较转染PCI-NEO的细胞显著降低(P0.01);经TAX处理48 h后,在转染PCI-NEO质粒的细胞中,停留在G2-M期的细胞比例显著高于转染PCI-NEO-SNCG质粒的细胞(P0.01),而停留在G0-G1期及S期的细胞比例,在转染PCI-NEO质粒的细胞中显著低于转染PCI-NEO-SNCG质粒的细胞(P0.01);在转染PCI-NEO质粒的细胞中Caspase-3的表达显著高于转染PCI-NEO-SNCG质粒的细胞(P0.01)。结论:TAX对转染了SNCG基因的PC-3细胞中的生长抑制作用明显降低,提示SNCG的表达可抑制TAX的作用效果,这一发现可为前列腺癌的个体化治疗提供理论依据和指导。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R737.25【正文快照】：
前列腺癌是男性生殖系统常见的恶性肿瘤。大多数前列腺癌开始时是雄激素依赖性的,意味着采取雄激素阻断治疗后,骨痛、排尿困难等症状好转,但一般经12~18个月后转变为激素非依赖性前列腺癌(hormone independent prostate cancer,HIPC)[1],即前列腺癌细胞在雄激素阻断后仍不断
欢迎：、、)
支持CAJ、PDF文件格式，仅支持PDF格式
【同被引文献】
中国期刊全文数据库
王玉栋;刘巍;张志刚;张祥宏;王俊灵;严霞;;[J];中华肿瘤防治杂志;2006年09期
侯仁好;初晓艺;刘希双;;[J];中华肿瘤防治杂志;2006年24期
张淑华;葛银林;罗达亚;田润华;;[J];中国生物化学与分子生物学报;2007年01期
蔡瑞霞;盛霞;袁志浩;叶增强;;[J];实用肿瘤杂志;2006年05期
张惠卿,张宇新,张作凤,刘志忠,周洪霞,张国志;[J];中国肿瘤临床;2005年01期
吴后男,李玉林,张丽红,朱桂彬,蔡今花;[J];中华病理学杂志;2002年03期
杨维良,张东伟;[J];中华实验外科杂志;2005年05期
张嘉庆,王殊,乔新民;[J];中华外科杂志;2002年03期
卢小东,覃文新,潘东宁,李锦军,万大方,温传俊,李朝军,顾健人,杨胜利;[J];中华医学杂志;2004年16期
凌茂英，王明辉，郭伶伶，王波;[J];中华医学杂志;1995年03期
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库
孙明,李虹,杨宇如,魏强,卢一平,李响,李杜渐;[J];四川大学学报(医学版);2004年06期
孙明,杨宇如,李虹,陈一戎,王志平,卢一平,魏强,岳中瑾;[J];中华男科学;2004年09期
【相似文献】
中国期刊全文数据库
伞玖;;[J];茶.健康天地;2011年08期
黄忠献;夏庆华;;[J];泌尿外科杂志(电子版);2011年01期
常进军;米振国;;[J];中国药物与临床;2011年07期
闵治超;华立新;;[J];现代泌尿外科杂志;2011年03期
朱秀;邓松华;;[J];医学综述;2011年11期
邓震;矫力;蔡小兵;张振声;钦曽松;许传亮;孙颖浩;;[J];上海医学;2011年07期
罗振国;王天喜;王超;辛华;;[J];黑龙江医药科学;2011年03期
陈磊;;[J];泌尿外科杂志(电子版);2011年01期
孔繁飞;王中显;孙朝阳;吕煊;翁丹卉;卢运萍;陈刚;吴明富;;[J];肿瘤防治研究;2011年08期
杜然;郑莉;张惠箴;黄文涛;蒋智铭;;[J];临床与实验病理学杂志;2011年06期
中国重要会议论文全文数据库
解杰;陈安民;郭风劲;王建超;廖晖;柳昊;;[A];中华医学会疼痛学分会第八届年会暨CASP成立二十周年论文集[C];2009年
;[A];华东六省一市泌尿外科学术年会暨2011年浙江省泌尿外科、男科学学术年会论文汇编[C];2011年
韩晓燕;刘箐;高丽萍;马建秀;黄超杰;张红;;[A];中国活性氧生物学效应学术会议论文集（第一册）[C];2011年
俞建军;徐月敏;陈嵘;谷宝军;乔勇;金三宝;胡晓雄;;[A];华东六省一市泌尿外科学术年会暨2011年浙江省泌尿外科、男科学学术年会论文汇编[C];2011年
周娟;彭御冰;王忠;;[A];华东六省一市泌尿外科学术年会暨2011年浙江省泌尿外科、男科学学术年会论文汇编[C];2011年
刘永霞;朱小丽;陈玉华;郭飞;沈默;陈占国;徐威;陈德莹;陶志华;;[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
沈建军;刘家云;苏明权;缪应业;张青;郝晓柯;;[A];第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2006年
王平;;[A];第十五届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2008年
段志文;张玉敏;马明月;裴秀丛;;[A];第十届中国科协年会论文集（三）[C];2008年
段志文;张玉敏;马明月;裴秀丛;;[A];中国科学技术协会第十届年会21分会场论文汇编[C];2008年
中国重要报纸全文数据库
江西医学院一附院
彭轼平;[N];家庭医生报;2004年
中国博士学位论文全文数据库
董青川;[D];第四军医大学;2010年
杨俊;[D];华中科技大学;2010年
陶志华;[D];重庆医科大学;2010年
孟平;[D];第四军医大学;2010年
曲发军;[D];第二军医大学;2012年
田媛;[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
王刚;[D];天津医科大学;2010年
张岩;[D];山东大学;2005年
熊晖;[D];山东大学;2012年
张军;[D];中国人民解放军军医进修学院;2006年
中国硕士学位论文全文数据库
王川;[D];河北联合大学;2011年
陈骁驰;[D];大连医科大学;2010年
孙新平;[D];山东大学;2010年
曹戌;[D];南京医科大学;2009年
李文杰;[D];汕头大学;2011年
董欣洁;[D];吉林大学;2012年
李博;[D];山西医科大学;2010年
何龙;[D];辽宁医学院;2011年
刘四明;[D];辽宁医学院;2011年
陈杰;[D];山东大学;2012年
&快捷付款方式
&订购知网充值卡
400-819-9993
《中国学术期刊（光盘版）》电子杂志社有限公司
同方知网数字出版技术股份有限公司
地址：北京清华大学 84-48信箱 大众知识服务
出版物经营许可证 新出发京批字第直0595号
订购热线：400-819-82499
服务热线：010--
在线咨询：
传真：010-
京公网安备75号您现在的位置是： &
血小板因子4基因转染对肺癌细胞中血管生成因子基因表达的影响
□ 郝好杰 谷志远 等
摘　要:目的：进一步探讨人血小板因子4（hPF4）抑制血管生成的作用机制，方法：构建含全长hPF4cDNA重组真核表达载体pcDNA3-hPF4，北朝鲜其转染到有肺巨细胞癌细胞系PLA801D细胞内，应用RT-PCR及免疫组化法观察肿瘤细胞自分泌的血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、白细胞介素8（IL-8）等的mRNA和蛋白表达水平的变化，结果：导入pcDNA3-hPF4,PLA801D细胞能稳定表达hPF4mRNA，其VEGF、bFGF、IL-8的mRNA和蛋白表达水平均明显降低，hPF4可直接调控VEGF、bFGF、IL-8等基因转录，影响其蛋白质生物合成，结论：提示hPF4可直接下调肿瘤细胞自分泌的VEGF、bFGF及IL-8等血管生成因子基因转录，抑制肿瘤细胞释放肿瘤血管生成因子，是hPF4抗血管生成抑制肿瘤细胞生长的机制之一。
【关键词】& 肺癌
本文为PDF版，打开PDF格式文件需要使用Adobe Acrabat Reader，请点击页码下载：[]
......(请点击下方“在线阅读”)
特别说明：本文献摘要信息，由维普资讯网提供，本站只提供索引，不对该文献的全文内容负责，不提供免费的全文下载服务。
金月芽期刊网 2017用作体外和体内dna转染与基因治疗载体的完整微细胞的制作方法
专利名称用作体外和体内dna转染与基因治疗载体的完整微细胞的制作方法
背景技术 本发明涉及使用完整细菌微细胞将寡核苷酸和多聚核苷酸转运至宿主细胞，尤其但不专属于基因治疗的背景中。本发明还涉及一种药学上兼容的方法，用于提纯完整的细菌微细胞。
Salser等人的一项U.S.patent No.4,497,796阐述了在1980年左右可用于转化哺乳动物细胞的各种早期方法。特别的，Salser等人公布使用DNA共沉淀技术和磷酸钙将编码二氢叶酸还原酶的基因(其能够产生甲氨蝶呤耐药性)转染至小鼠的L1210细胞或骨髓细胞中。
Salser等人还提到了“许多其他方法……，用于将遗传物质插入细胞”，除了“病毒载体”外，还包括某些细胞融合技术“细胞-细胞融合涉及将包裹在核膜中的有限数量的染色体融入细胞中；……微细胞融合；……与含有质粒DNA的细菌原生质体融合；以及与用DNA包裹的红细胞影融合”(第18-30行，第5栏；引用被省略)。这些技术的共同点是使用一种通过单层膜界定的含有DNA的细胞结构，在存在细胞融合促进剂，例如聚乙烯乙二醇(PEG)的条件下，将其与目标哺乳动物细胞接触。哺乳动物细胞与细胞结构融合，形成一种杂交细胞，后者所含有的DNA被释放入前者的细胞质中并传输至杂交细胞的细胞核中，随后该杂交细胞可能表达DNA。
Salser公布的内容提到了“红细胞影”，即缺乏细胞质成分但保持原始形态学的红细胞残余物，以及“细菌原生质”，或者被剥离了外膜(细胞壁)的细菌细胞，其典型的通过水解酶或抑制肽聚糖合成的抗生素产生。Salser等人还间接提到了使用简化细胞结构的第三种类型，即微细胞原生质。
微细胞是大肠杆菌或其他细菌细胞的一种无核形式，其通过在分离DNA的细胞分裂二分体中干扰协调机能产生。原核染色体的复制物被联接至正常的二分体，其涉及细胞中隔的形成。例如，在大肠杆菌中，min基因的突变，比如minCD，可以在细胞分裂过程中解除对细胞极处隔膜形成的抑制作用，导致产生一个正常的子细胞和一个无核微细胞(de Boer等人，1992年；Raskin&de Boer，1999年；Hu&Lutkenhaus，1999年；Harry，2001年)。
除了min操纵子突变外，还可以通过一类影响隔膜形成的其他基因重排或突变，例如在枯草杆菌的divIVB1中产生无核细胞(Reeve和Cornett，1975年；Levin等人，1992年)。还可以在细胞分裂/染色体分离过程中通过在蛋白质的基因表达水平进行干扰形成微细胞。例如，minE的过度表达会导致极性分裂并产生微细胞。类似的，染色体分离的缺陷也可能产生少染色体微细胞，例如枯草杆菌中的smc突变(Britton等人，1998年)，枯草杆菌中的spoOJ缺失(Ireton等人，1994年)，大肠杆菌中的mukB突变(Hiraga等人，1989年)，以及大肠杆菌中的parC突变(Stewart和D’Ari，1992年)。可以提供反式基因产物。例如，当cafA通过一种高拷贝数质粒过度表达时，可以提高细胞分裂的比例和/或在复制后抑制染色体的分离(Okada等人，1994年)，导致连锁细胞和无核微细胞的形成(Wachi等人，1989年；Okada等人，1993年)。
微细胞与在某些情况下同时产生并释放的其他小泡截然不同，后者与微细胞相反，它们不是特殊基因重排或游离基因表达所产生的。这种其他小泡的例子有细菌气泡，它是小膜泡(Dorward等人，1989年)。在例如农杆菌、芽孢杆菌、博尔德氏杆菌、埃希氏菌、奈瑟氏菌、假单胞菌、沙门氏菌和志贺氏菌等数种细菌中已经观察到了气泡。细菌气泡可以通过比如操纵生长环境(Katsui等人，1982年)以及使用外源性膜失稳剂(Matsuzaki等人，1997年)产生。
存在其他亚细菌成分，比如细菌影(Lubitz等人，1999年)，它是当phiX174溶解基因E表达时，在多种革兰氏阴性菌中形成的细菌空壳。细菌影的形成来自一种穿透细菌细胞包膜的跨膜管道结构。由于细胞内的高渗透压，细胞质成分被排出至周围介质中，导致形成细菌细胞空壳。
因为原核细胞内的质粒复制依赖于染色体复制，所以在上述异常细胞分裂过程中，质粒可以分离入正常的子细胞和微细胞中。因此，来自重组min大肠杆菌的微细胞携带大量的质粒拷贝，具有除染色体外的全部细菌细胞成分，并且已经被用作比如体外表达质粒编码基因的研究中。参见Brahmbhatt(1987年)，Harlow等人(1995年)和Kihara等人(1996年)。Brhambhatt(1987年)证明，例如，大肠杆菌微细胞可以携带含有20kb DNA插入物的重组质粒，不含有任何染色体DNA，并且能够同时表达9种或更多种重组蛋白质。
这种无复制性但具有代谢活性的完整微细胞已经被用于分析质粒运载基因所编码的蛋白质。但是，在Salser等人所提到的“微细胞融合”背景中，微细胞被剥离外膜以产生一种类似于细菌原生质的结构，当与PEG或其他细胞融合促进剂一起培养时，其能够与靶细胞融合。同样与细菌原生质相仿，这种微细胞原生质必须保存在等张条件下以防止渗透性溶解，并且它们极易受到酶的攻击。因此，它们不适合用于基因治疗。另外，随着其他更方便的转化方法的出现，Salser等人所说的微细胞技术便陷于无用的境地。
新近，基因治疗的进展已经突出了多种用于介导外源性遗传物质进入受体哺乳动物基因组的方法。参见Romano等人(年)，Balicki和Beutler(2002年)以及Wadhwa等人(2002年)的回顾。由于严重的安全性考虑，这些技术的临床应用，比如腺病毒和重组逆转录病毒载体的使用，已经被搁置。目前转化方法学所提出的直观问题是用野生型病毒进行重组、插入和致癌潜力、病毒诱导的免疫抑制、病毒载体携带治疗性DNA大片段的能力有限、减毒病毒的毒性回复、重组病毒的制造和分布困难、稳定性差以及不良反应，例如现有免疫性造成的炎症反应。能够解决这些问题的方法将提供显著的收益，使得基因治疗更加安全并且更加有效。
已经研究了活的减毒细菌载体作为人类基因治疗的基因传输载体，包括沙门氏菌(Darji等人，1997年；Paglia等人，2000年；Urashima等人，2000年)，志贺氏菌(Sizemore等人，1995年；Grillot-Courvalin等人，2002年)，李斯特氏菌(Dietrich等人，1998年)和侵袭性大肠杆菌(Grillot-Courvalin等人，1998年)。但是，细菌载体具有显著的局限性，因为活的细菌尽管被减毒，还必须经过操作以携带吞噬溶酶体结构以使足够数量的重组DNA逸出至哺乳动物细胞液与细胞核中。这种操作对于大量的细胞内细菌病原体而言困难较大并且或许是不可能的。此外，只有少数细菌种类的减毒细菌突变体是已知的，例如沙门氏菌、大肠杆菌以及志贺氏菌的芳香氨基酸生物合成基因突变体。
由于许多细菌种类的减毒突变体仍然未知，细菌基因传输系统就无法使用大组的细菌性细胞内病原体。由于部分染色体DNA可以被转染至接受基因治疗的人或动物宿主体内的其他微生物群落中，故细菌载体提出了有关染色体DNA存在的其他问题。由于可能出现新型的有毒和/或耐药菌，这种细菌物种之间的混杂DNA转染是不符合要求的。
为了说明这些和其他需要，本发明根据一方面提供了一种组合物，其含有(i)重组的完整微细胞以及(ii)一种药学上可接受的载体，其中微细胞含有一种治疗性核酸分子，其编码例如白介素-2。在一个优选实施例中，该组合物含有的污染细胞少于1个污染亲代细胞/107、108或109个微细胞。
根据另一方面，本发明为重组完整微细胞在药物制剂中的使用提供了含有治疗性核酸分子的微细胞，用于治疗疾病或通过将该药物给予细胞、组织或器官以改变特性的方法。在此范围内治疗的疾病可以是比如肿瘤，或者一种获得性疾病，比如艾滋病、肺炎、肺气肿，或者由先天性代谢失调产生的疾病，比如囊性纤维化。换句话说，该治疗可以影响特性，比如繁殖能力或者与一种变态反应原或传染剂相关的免疫反应。
根据另一方面，本发明还提供了一种遗传转化方法，其包括(i)提供含有由一种核酸序列，优选编码治疗性表达产物的核酸序列所组成质粒的重组完整微细胞，以及随后(ii)将微细胞与具有噬菌作用或内吞作用的哺乳动物细胞相接触，使得微细胞被哺乳动物细胞吞噬，后者借此产生核酸序列的表达产物。微细胞与哺乳动物细胞的接触可以在体外或体内进行。前面提到的质粒也可以含有功能为调节成分的第二核酸片段，例如促进子、终止物、增强子或一种信号序列，其经过操作连接至第一核酸片段。另外，质粒可以含有一种指示成分，例如一种编码绿色荧光蛋白的核酸片段。
根据本发明的另一方面提供了一种提纯方法，其包括将含有微细胞的样品通过(i)一系列横向流动滤器以及随后(ii)通过终端滤器，借此将微细胞与该样品中的污染物分离以获得纯化的微细胞制剂。此方法选择性的包括用抗生素处理提纯的微细胞制剂。还可以选择一个预备步骤，对含有微细胞的样品进行差速离心。在一个优选实施例中，该系列横向流动滤器包括(A)至少一个或两个孔径大于或等于0.45微米的滤器以及(B)至少一个或两个孔径小于或等于0.2微米的滤器。
图1显示了一幅正常细菌细胞分裂以及min基因突变如何导致微细胞形成的示意图。
图2显示了一幅用于产生产微细胞细菌株的质粒制剂示意图。特别的，该图显示了可用于生成一种产伤寒杆菌来源微细胞细菌株的质粒结构。显示了克隆的插入DNA以及环形质粒载体部件的素描。质粒的名称以粗体显示在插入DNA的左侧以及环形载体图的内部。在使用PCR引物产生克隆的地方，引物编号显示在邻近虚线箭头处。
图3显示了一幅可用于产生一种产微细胞细菌株的质粒制剂示意图。特别的，该图显示了一种质粒结构，以产生一种产志贺氏痢疾杆菌2a来源微细胞的细菌株。
图4显示了一幅可用于产生一种产微细胞细菌株的质粒制剂示意图。特别的，该图显示了一种质粒结构，以生成一种产李斯特单胞菌来源微细胞的细菌株。
图5显示了经伤寒杆菌来源的微细胞转染的小鼠巨噬细胞的透射电子显微镜像。对于每一幅照片提供了转染后的时间和放大倍数。照片显示了巨噬细胞空泡内的微细胞样电子致密颗粒(箭头)。
图6显示了微细胞介导的基因传输至乳腺癌细胞和异种基因表达。照片A显示用非重组微细胞转染96小时后的对照乳腺癌细胞系SK-BR-3，标记物为抗HER-2抗体，检测物为与Alexafluor结合的第二抗体。照片B显示了用携带pEGFP-C1质粒的重组微细胞转染96小时后，SK-BR-3细胞中GFP的表达(GFP的真核表达)。照片C显示了用微细胞/pEGFP-C1转染的SK-BR-3细胞，标记物为抗HER-2抗体，检测物为与Alexafluor结合的第二抗体。图像可以用共焦显微镜观察。
图7显示了腹膜内给予携带pEGFP-C1质粒的重组微细胞和灭活伤寒沙门氏菌14天后的小鼠血清抗GFP反应。在图例以及图8-10的图例中，10*8和10*9分别代表108和109。
图8显示了腹膜内给予携带pEGFP-C1质粒的重组微细胞和灭活伤寒沙门氏菌14天后的小鼠血清抗LPS反应。
图9显示了腹膜内给予携带pEGFP-C1质粒的重组微细胞14天后，小鼠的血清抗GFP反应。
图10显示了腹膜内给予携带pEGFP-C1质粒的重组微细胞14天后，小鼠的血清抗LPS反应。
具体实施例方式
本发明者已经测定具有完整细胞壁的微细胞(“完整微细胞”)是用于在体外或体内将寡核苷酸与多聚核苷酸(总的说来，“核酸分子”)传输至宿主细胞(优选人或动物体内的哺乳动物细胞)的有效载体。因此，发明者发现完整的微细胞可以被哺乳动物细胞所吞噬，就像吞噬取得微细胞的细菌细胞(“亲代细菌细胞”)那样。另外还发现，令人惊讶的，完整重组微细胞的成分被宿主细胞吞噬后，经过这种方式的处理，至少有一些来自微细胞的质粒DNA能够逃脱降解并被运输穿过胞浆，直至宿主细胞核，随后宿主细胞可以表达该质粒DNA。
因此，依据本发明，将一种携带需要进行异源性表达之DNA的完整微细胞在体内或体外与一种能够以细胞内细菌致病原的方式吞噬亲代细菌细胞的哺乳动物细胞相接触。出于同样的原因，那种哺乳动物细胞，这里表示为“有吞噬能力的”，能够吞噬微细胞并表达所讨论的DNA。
在完整微细胞被给定类型宿主细胞吞噬的过程中涉及到多种机制，而本发明在这方面不依赖于任何一种特殊机制。例如，噬菌作用是一种经过良好证明的程序，其中巨噬细胞以及其他吞噬细胞，例如嗜中性粒细胞，通过伸展伪足覆盖颗粒表面直至完全包裹颗粒来摄入颗粒。尽管被描述为“非特异性”的噬菌作用，在此过程中仍然显示涉及到特异性受体。见Wright&Jong(1986年)；Speert等人(1988年)。
因此，一种形式的噬菌作用涉及表面配体与伪足膜上配体受体之间的相互作用(Shaw和Griffin，1981年)。这种由特殊受体介导的附着步骤被认为依赖于细菌表面的粘附因子。至于毒性更低的细菌，例如不产肠毒素的大肠杆菌，噬菌作用还可以在缺乏噬菌细胞受体的表面配体的条件下发生。例如，参见Pikaar等人(1995)。因此，本发明包括但不局限于具有或缺乏表面粘附因子的完整微细胞的使用，其保持了它们亲代细菌细胞的特性，并且为噬菌细胞(例如“具备噬菌能力”的宿主细胞)所吞噬，哺乳动物体内的主要噬菌细胞类型是嗜中性粒细胞和巨噬细胞。
另一种吞噬过程是内吞作用，其中细胞内致病原的示例为进入哺乳动物上皮细胞并在那里复制的沙门氏菌、埃希氏菌、志贺氏菌、哈比特属菌、假单胞菌和乳酸杆菌等菌属。在这一点上的两种基本机制是内涵素依赖受体介导的内吞作用，又称作“被膜小窝内吞作用”(Riezman，1993年)以及内涵素非依赖的内吞作用(Sandvig&Deurs，1994年)。根据本发明，当一种具吞噬能力的细胞通过内吞作用(例如，“具内吞能力的”宿主细胞)吞噬完整的重组微细胞并表达微细胞所携带的DNA时，可以涉及一种或两种机制。代表性的具内吞能力的细胞有乳腺上皮细胞、胃肠道内的肠细胞、胃上皮细胞、肺上皮细胞以及尿道和膀胱上皮细胞。
本发明尤其可以用于将核酸分子导入具吞噬能力的细胞，通过转录和/或翻译，用于改善或另外治疗疾病或改变与患者的特殊细胞、组织或器官类型相关的特性。为了进行此项描述，这些分子被划分为“治疗性核酸分子”。
例如，给定治疗性核酸分子的转录或翻译可以用于治疗肿瘤或一种获得性疾病，比如艾滋病、肺炎、肺气肿，或纠正先天性代谢失调，比如囊性纤维化。治疗性核酸的转录和翻译还可能实现绝育性灭菌，包括野生动物的绝育性灭菌。依据本发明，通过给予治疗性核酸分子，在患者体内表达，影响与相应的变态反应原和感染因子相关的免疫反应，还能够抵抗变态反应原介导的炎性疾病以及感染因子介导的炎性疾病。一种治疗性核酸分子还可以具有一种表达产物，或者有一种表达产物的翻译后变体的下游产物，能够减少与移植相关的免疫后遗症或帮助促进组织生长和再生。
换句话说，表达产物或相关的翻译后介质可以是一种蛋白质，其代表为促红细胞生成素，一种生长因子比如TGF-β，一种细胞因子比如IL-2、IL-10、IL-12或其他白介素，一种血清无色蛋白酶抑制剂，或者一种抗体比如CTLA4-Ig，其能够为宿主提供所需的受益。其他类型的该种蛋白包括，没有限制的，α-、β-和γ-球蛋白，胰岛素，粒-巨噬细胞集落刺激因子，巨噬细胞集落刺激因子，促红细胞生成素，肿瘤坏死因子，MGF，腺苷脱氨酶，肿瘤表面相关抗原比如病毒、突变或错误表达的抗原(CDK4，β-连接素，GnT-V，Casp8)，肿瘤特异性抗原比如MAGE、BAGE、GAGE、PRAME和NY-ESO-1，分化抗原比如酪氨酸酶、Melan-A/MART-1、gp100和TRP-1/gp75，以及过度表达的抗原比如Her2/neu和CEA。治疗性核酸分子的进一步分类示例为分别编码囊性纤维化跨膜调解器(CFTR)，VIII因子或其他血液蛋白，低密度脂蛋白受体，β-葡糖脑苷脂酶，α-和β-半乳糖苷酶，胰岛素，甲状旁腺素，α-1-抗胰蛋白酶，fasR以及fasL的DNA。
依据本发明，由宿主细胞进行的治疗性核酸分子的表达能够提供一种所需的化合物，其能够调解靶向免疫反应或干扰病变。例如，一种治疗性核酸分子可以用于反义或核糖酶治疗。在此背景下，反义治疗涉及引介一种依据本发明的多聚核苷酸序列拷贝，使得拷贝的转录产物与多聚核苷酸序列相应的信使RNA(mRNA)转录产物进行原位杂交。这种杂交能够典型的防止转录产物被翻译成蛋白或者开始破坏mRNA的降解途径。
治疗性核酸还可以在哺乳动物细胞中编码短干扰RNA二联体(siRNA’s)。更确切的说，siRNA’s已经显示能够在哺乳动物细胞中抑制目标基因。干扰RNA(RNAi)的这种过程是一种发生于动物、人类以及植物中的，序列特异性的转录后基因静默法，并且由与被静默基因同源的双链(ds)RNA所发动。在多种细胞类型中已经成功的显示了SiRNA的病毒介导传输能够特异的减少目标基因的表达(Haibin等人，2002年)。
对于所有这些以及其他各种治疗性核酸分子的使用，本说明采用的标题为“基因治疗”，它的意思也包含短语“基因转染”、“基因传输”以及“基于基因的疫苗”，涉及用于将治疗性核酸分子在体内和体外转染入宿主细胞的方法学或系统，就像例如U.S.patent No.5,399,346中所描述的。因此，本发明的含微细胞组合物可以用于达到原位治疗效果，以及用于在体外转化细胞然后将其介导入患者体内。依据本发明，适合于体内和体外方法的细胞可以是那些具有吞噬能力的细胞，例如噬菌细胞和上皮细胞。
如上所述，基因治疗可以治疗或防止遗传性或获得性疾病或病症。治疗性核酸分子编码一种产物，比如功能性RNA(例如，反义或siRNA)或一种肽、多肽或蛋白，需要其在体内产生。例如，所关心的遗传物质可以编码一种具有治疗价值的激素、受体、酶或(多)肽。这种方法可以导致非整合的被转染DNA的短暂表达、染色体外复制以及被转染复制子比如游离基因的表达，或者被转染遗传物质整合入宿主细胞的染色体组DNA。
治疗性核酸分子可以是一种基因的正常对应物，其编码的蛋白质功能异常或在疾病状态下以异常水平存在，通常是这样，例如囊性纤维化中的囊性纤维化跨膜传导性调解器(Kerem等人，1989年；Riordan等人，1989年；Rommens等人，1989年)，镰刀状细胞贫血中的β-球蛋白，以及地中海贫血中的任一种α-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。如上所述，治疗性核酸分子可以具有一种反义RNA转录产物或小的干扰RNA。因此，依据本发明，使用一种经过操作含有质粒的完整微细胞，基因治疗可以改善特性为α-球蛋白相对于β-球蛋白过度产生的β-地中海贫血，该质粒整合了一种序列，其具有与α-球蛋白mRNA的目标序列相对的反义RNA转录产物。
在肿瘤的治疗中，依据本发明适合使用的治疗性核酸分子可以具有一种序列，其相应于或来自与肿瘤抑制相关的基因，例如p53基因、视网膜母细胞瘤基因、以及编码肿瘤坏死因子的基因。依据本发明，通过这种方法可以治疗多种实体肿瘤-癌、乳头瘤以及疣。在这一点上的代表肿瘤包括结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、头部和颈部肿瘤以及淋巴瘤。作为例证的乳头瘤是鳞状细胞乳头瘤、脉络丛乳头瘤以及喉部乳头瘤。疣病的实例为生殖器疣、足底疣、疣状表皮发育不良以及恶性疣。
用于本发明的一种治疗性核酸分子还可以含有一个DNA片段，其编码将无活性前体药物转化成一种或多种细胞毒性代谢物的酶，使得在体内引入前体药物时，有效的靶细胞被强迫，可能与邻近细胞一起，进行自杀。Spencer(2000年)，Shangra等人(2000年)以及Yazawa等人(2002年)回顾了该种非人类来源和人类来源“自杀基因”的临床前以及临床使用。非人类来源自杀基因的例子包括那些分别编码HSV-胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(rk)、胞嘧啶脱氨酶(CDA)+尿嘧啶磷酸核糖转染酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转染酶(GPT)、硝基还原酶(NTR)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP，DeoD)、细胞色素P450(CYP4B1)、羧肽酶G2(CPG2)以及D型氨基酸氧化酶(DAAO)的基因。人类来源自杀基因的例子包括分别编码羧肽酶A1(CPA)、脱氧胞苷激酶(dCK)、细胞色素P450(CYP2B1，6)、LNGFR/FKBP/Fas、FKBP/Caspases以及ER/p53的基因。
依据本发明的自杀基因疗法可以用于治疗艾滋病。该方法已经使用自杀载体进行了测试，一旦经处理的哺乳动物细胞被HIV-1感染，该载体就表达一种毒性基因产物。在被HIV-1感染后，这些载体使用HIV-1调节成分，Tat和/或Rev来诱导毒性基因比如α-白喉毒素、胞嘧啶脱氨酶或干扰素-a2的表达(Curiel等人，1993年；Dinges等人，1995年；Harrison等人，1992a；Harrison等人，1992b；Ragheb等人，1999年)。使用本发明的重组微细胞法，在HIV感染后，细胞可以被这些载体转换并比未转换细胞清除的更快，以细胞死亡为代价防止病毒的复制。
通过本发明的方法引入的一种核酸分子可以包括一种指示成分。指示成分典型的通过编码一种在其他情况下宿主无法产生的多肽，使得它的重组宿主具有易于检测的表型或特性，经过表达后，该多肽可以被组织学或原位分析，比如体内成像技术所检测到。例如，依据本发明的完整微细胞所传输的一种指示成分可以编码一种能够在吞噬性宿主细胞中产生比色分析或荧光分析改变的蛋白，该变化可以通过原位分析检测并且是转录活性的一种定量或半定量函数。这些蛋白的示例包括酯酶、蛋白酶和其他酶，它们的活性能够产生一种可检测的发色团或荧光团。
优选的实施例是大肠杆菌β-半乳糖苷酶，其通过裂解产靛青底物吲哚-β-D-半乳糖苷来导致色彩变化，以及一种荧光素酶，其能够氧化一种长链醛(细菌荧光素酶)或一种杂环羧酸(荧光素)，伴随光的释放。在此范围内同样有用的是一种指示成分，其能够编码水母Aequoreavictoria的绿色荧光蛋白(GFP)，正如Prasher等人所述(1995年)。两项已经发布的PCT申请，WO095/21191(公布了编码一种238个氨基酸的GFP脱辅基蛋白的多聚核苷序列，该脱辅基蛋白含有从氨基酸65至氨基酸67组成的发色团)和WO095/21191(公布了A.Victoria GFP脱辅基蛋白cDNA的一种变体，其提供了一种肽，具有改变的荧光特性)举例说明了GFP相关技术的领域，并且Heim等人(1994年)报告了一种突变GFP，其特性为激发振幅提高了4至6倍。
其他类型的指示成分涉及一种表达产物，其能够使重组微细胞抵抗毒素。例如，neo基因能够保护宿主抵抗毒性水平的抗生素G418，而一种编码二氢叶酸还原酶的基因能够产生甲氨蝶呤耐药性，并且氯霉素乙酰基转染酶(CAT)基因能够赋予对氯霉素的耐药性。
用作指示成分的其他基因包括那些能够转化宿主微细胞以表达特异细胞表面抗原，例如病毒外壳蛋白比如HIV gp120或疱疹gD的基因，其易于为免疫测定所检测到。
按照本发明方法引介的核酸分子还可以具有操作连接至调节成分，例如启动子、终止子、增强子和/或信号序列的所需编码片段。一种合适的启动子可以是组织特异性或者甚至肿瘤特异性的，如同治疗范围所规定的那样。
当启动子偏向于在特定的组织中激活，并且因此在靶组织中生效，促进操作连接的结构序列表达时，它是“组织特异性”的。组织特异性启动子的范畴包括，例如白蛋白和a1-抗胰蛋白酶各自的肝细胞特异性启动子；弹性蛋白酶I基因控制区，其在胰腺泡细胞中是具有活性的；胰岛素基因控制区，在胰腺β细胞中具有活性；小鼠乳腺肿瘤病毒控制区，其在睾丸、乳房、淋巴和肥大细胞中具有活性；髓磷脂基础蛋白基因控制区，其在大脑的少突细胞中具有活性；以及促性腺释放激素基因控制区，其在下丘脑细胞中具有活性。参见Frain等人，(1990年)，Ciliberto等人(1985年)，Pinkert等人(1987年)，Kelsey等人(1987年)，Swift等人(1984年)，MacDonald(1987年)，Hanahan(1985年)，Leder等人(1986年)，Readhead等人(1987年)以及Mason等人(1986年)。
还有偏向于在某些肿瘤细胞或本质是肿瘤细胞中表达的启动子，依据本发明其可以用于治疗不同的肿瘤。此类肿瘤细胞特异性启动子的示例有酪氨酸酶启动子，目标为黑色素瘤；MUC1/Df3启动子，目标为乳腺癌；杂交myoD增强子/SV40启动子，表达目标为横纹肌肉瘤(RMS)；癌胚抗原(CEA)启动子，其为CEA表达细胞比如大肠癌细胞特异性的，以及己糖激酶II型基因启动子，目标为非小细胞肺癌。参见Hart(1996年)，Morton&Potter(1998年)，Kurane等人(1998年)以及Katabi等人(1999年)。
依据本发明，可以使用一种信号序列来实现表达产物的分泌或将一种表达产物定位至特殊的细胞室。因此通过完整微细胞传输的一种治疗性多聚核苷酸分子可以包括一个位于合适的阅读框架中的信号序列，使得所关心的表达产物由吞噬细胞或其子代分泌，从而影响周围的细胞，与所选择的治疗范例相一致。信号序列的示例包括U.S.patentNo.5,143,830中描述的溶血素C末端分泌序列，U.S.patent No.5,037,743中公开的BAR1分泌序列，以及U.S.patent No.6,025,197中描述的zsig32多肽的信号序列部分。
如上所述，本发明的完整重组微细胞保持体内完整性的能力使得它们可以用于基因治疗。完整微细胞不携带重组细菌细胞例如，志贺氏痢疾杆菌、李斯特单胞菌、大肠杆菌或伤寒沙门氏菌中存在的细菌染色体组DNA，而其他细胞已经用其将真核表达质粒转染入宿主细胞。参见Sizemore等人(1995年)；Gentschev等人(2000年)；Catic等人(1999年)；Dietrich等人(1998年)；以及Courvalin等人(1995年)。因此，依照本发明使用完整微细胞的基因治疗不会伴有与使用重组细菌和将一种细菌或耐抗生素标记基因无意识的转染至患者固有微生物菌丛相关的风险。另外，必须通过细胞介导的免疫性从患者体内清除重组细菌，因此重组细菌不适合用于对患有例如肿瘤或艾滋病的免疫受损患者进行基因治疗。
可以从任何革兰氏阳性或革兰氏阴性来源的细菌细胞中制备微细胞。由于本发明使用完整微细胞而不是微细胞原生质，本发明不需要并且优选不涉及对微细胞进行任何抗生素或化学预处理。
可以通过min基因的突变，例如minCDE基因序列的部分缺失来生成产微细胞细菌株，如下面的实例1和2中所示。为了获得重组的完整微细胞，依据本发明，通过标准技术对所选择产微细胞菌株的细菌细胞进行转化，标准技术包括但不局限于使用电穿孔(Shigekawa&Dower，1988年)，化学方法(Hanahan，1983年)，往复式载体(Marcil&Higgins，1992年)以及结合作用(Firth等人，1996年)或传导(Davis等人，1980年)。为了这种转化，将来自任何真核、原核或合成来源的治疗性核酸分子插入一种合适的市售或终端用户专有的质粒载体中。所选择的DNA可以被操作连接至所需控制成分，用于体内的基因传输和/或DNA在吞噬重组微细胞的细胞中进行表达。
优选在体外对重组微细胞进行分析以确保它们能够将重组质粒或DNA序列传输至靶细胞核，并且在靶细胞中发生重组基因的表达。对表达的检测将取决于异源性基因的特性。可以通过多种方法监测表达，包括免疫学、组织化学或活性检验。荧光标记基因的表达可以通过显微镜观察，并且此特性提供了一种特别方便的检验。例如，处于真核基因表达启动子，例如CMV启动子控制下的编码绿色荧光蛋白的基因，可以在质粒上通过重组微细胞转染至真核靶细胞(参见下面)。另外，使用合适的DNA或RNA探针，northern印迹分析或逆转录酶PCR(RT-PCR)可以用于评价转录。如果可以获得异源性基因所编码多肽的抗体，Western印迹分析、免疫组化或其他免疫学技术均可用于评价多肽的产生。如果异源性基因是一种酶，则也可使用合适的生化检验。例如，如果异源性基因编码抗生素耐药性，那么测定被感染细胞对抗生素的耐药性可以用于评价抗生素耐药基因的表达。
可以通过测定培养物中的DNA传输效率来评价推定宿主(“靶”)细胞的吞噬能力。因此，可以对靶肿瘤进行活检，所产生的组织样品将以传统方式使用，通过培养获得代表肿瘤细胞，以测定其吞噬本发明中携带，例如，一种合适指示成分的重组微细胞的能力。除了测定这种主要细胞培养物外或者另外，依据本发明，可以通过测试治疗方案中关键类型组织的代表细胞系来测量吞噬微细胞的能力。细胞培养技术的文献很多，例如Freshner(1992)。
依据本发明，可以通过数种方法从母细胞中提纯重组微细胞。一种方法使用例如Reeve(1979年)和Clark-Curtiss等人(1983年)所描述的蔗糖梯度法，随后用抗生素，比如庆大霉素进行处理(200微克/毫升，2小时)以杀灭残存的活菌。
使用传统方法所获得的最佳纯度为1个污染母细胞/106-107个微细胞。依据本发明，对于体内使用而言，所需剂量高于106并且可能高达1010/每剂，按照前述污染比率，将转化为10,000个活母细胞/每剂。这种污染水平会是致命的，尤其是在免疫受损的患者中。
另外，传统方法使用含有梯度形成剂的介质，比如蔗糖、甘油或Percoll·，它们的存在对于体内使用是有害的，正如现在所考虑的。因此，Percoll·的毒性将其限制于“仅用于研究目的”的范围内，而用于产生梯度的蔗糖会产生高渗透压，导致微细胞发生生理学改变。
因此，为了应用于依据本发明之基因治疗，优选将母细胞污染最小化并使用生物兼容性更好的介质。为了达到这些目标，本发明者已经发现将横向流动过滤(供液与膜表面平行)与终端过滤(供液与膜表面垂直)联合使用会有意想不到的好处。通常的，参见Forbes(1987年)。在这种联合前可以选择进行差速离心，在低离心力下除去一部分细菌细胞并从而使微细胞的上清液浓缩。还可以选择在联合后进行抗生素处理以杀灭残存亲代细菌细胞。
横向流动过滤可以依靠滤器的孔径将微细胞从更大的污染物，比如亲代细菌细胞，以及更小的污染物，比如细菌气泡、游离内毒素、核酸细胞碎片以及多余的液体中分离。为了从更大的污染物中分离微细胞，横向流动滤器的标称孔径应当允许微细胞透过滤器，而留下更大的细菌细胞。优选0.45微米的孔径用于此目的，因为微细胞的直径大约为0.4微米，而细菌细胞更大。为了从更小的污染物中分离微细胞，横向流动滤器的标称孔径应当允许更小的污染物透过滤器，而留下微细胞。优选0.2微米的孔径用于此目的，其他更小的污染物都小于0.2微米。
在此条件下有效的使用活性流动滤器典型的需要至少有一个步骤涉及大孔径，大约0.45微米，然后至少有一个步骤涉及小孔径，大约0.2微米。在连续横向流动过滤的步骤之间或之中，可以进行透滤以尽可能多的回收微细胞。
横向流动过滤的使用可以容纳携带大量颗粒物质的悬浊液，例如细菌培养物，其携带的细胞负荷为个细菌和微细胞群体/升培养物。为了使滤器淤塞与随后的微细胞丢失最小化，可以将细菌/微细胞培养物进行稀释，优选稀释5至10倍。稀释后还能使用适当的低大气压与流率。
为了在横向流动过滤后除去残存的亲代细胞残余物，进行终端过滤。为此，优选使用大约0.45微米的孔径进行至少一次终端过滤。
通常，过滤可以提供适合于转基因研究的微细胞无菌制剂。为了进行体内基因转染，优选进一步用抗生素处理以降低细菌细胞污染的风险。例如，可以用含有亲代细菌株敏感抗生素的生长介质重悬微细胞。事先可以用传统技术测定为此应给予抗生素的合适数量。
连续横向流动过滤/终端过滤排列，正如所述，不但省却了梯度形成剂的使用，还提供了超过10-7的纯度(也就是少于1个亲代细胞/107个微细胞)。优选纯度超过10-8，并且更优选近似于10-9的纯度。连续横向流动过滤/终端过滤还提供了更好的质量控制。另外，无需氨卞青霉素、环丝氨酸或其他抗生素的耐药基因，如Clarke-Curtiss和Curtiss(1983)的技术所需的。此外，与Sancar等人(1979年)描述的方法不通，连续纯化法不使用任何破坏DNA的射线；因此，使用通过连续横向流动过滤/终端过滤排列制备的微细胞所传输的治疗性核酸分子不含有放射线诱导的非特异性突变。
本发明中实质由重组微细胞组成的组合物(更确切的说，一种化合物，其包括该微细胞和其他不对组合物的DNA传输质量产生不当影响的成分)可以使用一种和多种生理学上可接受的载体和赋形剂，通过传统方法制造。用于注射的配方可以以单位剂量的形式，例如在安瓿或小瓶，或在多剂容器中提供，含有或不含辅助额外的防腐剂。配方可以是溶液、悬浊液或在油性或水性媒介中的乳剂，并可以含有配剂，比如悬浮、稳定和/或分散剂。合适的溶液是接受者血液的等张液，其示例有生理盐水、林格氏液以及右旋糖溶液。另外，微细胞可以是冻干粉的形式，用于与合适的媒介，例如无菌、无热源水或生理盐水重新复原。微细胞还可以制成长效制剂。这种长效配方可以通过移植(例如，皮下或肌肉内)或者肌肉内注射给药。
本发明的含有微细胞组合物可以通过各种途径给药至哺乳动物身体的各种部位，以获得所需的局部或全身治疗效果。可以通过例如口服、将制剂用于体腔、吸入或吹入、或经肠道、肌肉内、静脉内、门脉内、肝内、腹膜、皮下、肿瘤内或皮内给药完成传输。
所考虑应用的特性同样影响(或者受影响)用于传输治疗性核酸分子的重组微细胞细菌源的选择。例如，沙门氏菌、埃希氏菌和志贺氏菌属携带的附着因子能够被胃肠道中肠细胞上的内吞作用介导受体所识别，可能适合于口服给药，用于传输对结肠癌细胞有效的治疗性核酸分子。类似的，来自幽门螺旋杆菌的微细胞携带胃上皮细胞特异性的附着因子，适合于目标为胃癌细胞的口服传输。对于来自假单胞菌属的完整微细胞，其携带的附着因子能够为肺上皮细胞所识别，则吸入或吹入可能是理想的给药方法；将编码比如CFTR蛋白的治疗性核酸分子传输至囊性纤维化患者的肺部。来自乳酸杆菌的微细胞携带尿道和膀胱上皮细胞特异的附着因子，非常适合于将治疗性核酸分子从尿道内传输至尿道或膀胱肿瘤。
本发明可以用于传输一列核酸分子，它可以是cDNA和染色体组DNA或RNA，并且其方向可以是顺义或反义。依照本发明，在完整微细胞中存在的核酸分子可以是质粒、表达载体或其他遗传结构的形式，但不能是来自产生微细胞的细菌细胞的染色体组DNA。适合于在本发明中使用的序列包括来自真核、原核或合成来源的任何所需DNA或RNA序列，其能够受控于真核基因表达启动子的翻译和转录控制，或能够使用来自宿主细胞的反激活因子在哺乳动物细胞中表达。
实例1从革兰氏阴性细菌，伤寒沙门氏菌，大肠杆菌和志贺氏痢疾杆菌中产生细菌微细胞如这里所述(A，B和C)以及图2和3所示，从革兰氏阴性细菌中产生产微细胞细菌株。
常规材料和方法在下面的例子中所用的细菌株列在并请参考表1。所有的细菌都生长自保存于-80摄氏度的甘油原料。沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌以及李斯特菌株都生长在胰酶解酪蛋白大豆肉汤(TSB)(BBL牌，购自Bacto Labs，Liverpool，NSW，Australia)中。根据制造商的说明制备成30克/升，并在121摄氏度高压灭菌15分钟。液体培养物生长于37摄氏度的摇动培育箱内。通过放置于XLD琼脂(木糖-赖氨酸-去氧胆酸盐)盘上分别产生红色和黄色群落来区分志贺氏菌株与大肠杆菌。XLD购自Oxoid(Melbourne，Australia)。根据生产商的说明制备成53克/升，然后煮沸2分钟。在液体和固体媒介中按照下列浓度使用抗生素氨卞青霉素，100微克/毫升，氯霉素，30微克/毫升，卡那霉素，30微克/毫升。
所用的细菌株
当需要时，将菌株生长于补充1％葡萄糖的M9最小培养基中。根据菌株加入额外的补充成分。对于大肠杆菌株ENIh003，加入1mM维生素B1。对于志贺氏痢疾杆菌株ENSf001，用0.4mM丝氨酸、0.2mM脯氨酸、0.001％苯丙氨酸、0.001％色氨酸、0.001％组氨酸、0.002毫克/毫升缬氨酸、0.0125毫克/毫升烟碱酸、0.001％维生素B1以及0.0225毫克/毫升蛋氨酸补充M9培养基。
使用Qiaprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen Inc.，Victoria，Australia)提纯质粒DNA。使用来自《分子生物学》
(第2章，第I节，2.4部分；John Wiley&Sons，Inc.)中现行规程的基本规程制备沙门氏菌、志贺氏菌以及大肠杆菌菌株的染色体组DNA。除了Deep Vent DNA聚合酶购自New England Biolabs(Beverly，MA，USA)外，所用的全部限制和修饰酶均购自Promega(Madison，WI，USA)或Roche(CastleHill，NSW，Australia)。
通过如上述修改的传统方法(Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley and Sons Inc.)来提纯李斯特单胞菌(ENLM001)的染色体组DNA。将1.5毫升过夜培养物的样品以13,200rpm离心3分钟，弃去上清液。在含有2.5毫克/毫升溶解酶的1毫升TE缓冲液(10mM Tris pH8.0；1mM EDTA pH8.0)中重悬细菌细胞，并在37摄氏度下培养1小时。然后加入RNAse A至终浓度为15毫克/毫升，将溶液在室温下培养1小时。接着加入100微克/毫升蛋白酶K以及0.5％SDS，将混合物在37摄氏度下进一步培养1小时。随后，将200微升5M NaCl彻底混入溶液，再混入160微升CTAB/NaCl溶液(10％CTAB溶于0.7M NaCl)。然后将该混合物在65摄氏度下培养10分钟。用等体积的氯仿/异戊基乙醇提取样品，然后用等体积的苯酚/氯仿/异戊基乙醇进行提取。用0.6体积的异丙醇和1/10体积的5M醋酸钠沉淀染色体组DNA。在用TE缓冲液重悬之前，经乙醇洗涤并空气干燥DNA小球。
PCR引物合成并购自Sigma-Genosys(Castle Hill，NSW，Australia)。所遵循的基本PCR规程如下。用于50微升PCR的反应成分包括1×缓冲液，200微摩尔dNTPs，每种引物各50pmol，1单位Deep Vent DNA聚合酶，50pmol染色体组DNA模板(质粒用25pmol)，用无核酸酶水定容至50微升，PCR发生于0.2ml的试管中，在来自Thermo Hybaid(Ashford，Middlesex，UK)的Gradient PCR Express Thermalcycler中进行。获取minCDE基因簇的PCR条件如下94摄氏度下持续4分钟；然后在94摄氏度下持续35秒钟，60摄氏度下持续30秒钟，72摄氏度下持续2.5分钟，进行30个循环；接着进行终循环94摄氏度下持续35秒钟，60摄氏度下持续35秒钟，72摄氏度下持续5分钟。获取ΔminCDE盒的PCR条件如下94摄氏度下持续4分钟；然后在94摄氏度下持续35秒钟，60摄氏度下持续30秒钟，72摄氏度下持续2分钟，进行30个循环；接着进行终循环94摄氏度下持续35秒钟，60摄氏度下持续35秒钟，72摄氏度下持续4分钟。获取ΔminCDE∷Cml盒的PCR条件如下94摄氏度下持续4分钟；然后在94摄氏度下持续35秒钟，60摄氏度下持续30秒钟，72摄氏度下持续3分钟，进行30个循环；接着进行终循环；94摄氏度下持续35秒钟，60摄氏度下持续35秒钟，72摄氏度下持续6分钟。
在Sambrook等人(1989年)和CURRENT PROTOCOLS INMOLECUULAR BIOLOGY(John Wiley&Sons，Inc.，NJ，USA)中描述了所遵循的标准分子生物学规程。
使用能够通过Leica DC照相机和Leica IM照片管理软件进行照片分析的Leica Model DMLB光学显微镜，经显微镜测定所产生的微细胞。用暗视野显微镜在40×或油浸的100×放大倍数下观察样品。用1.5％琼脂糖封闭玻片上的盖玻片。通过将10％体积放在胰酶解酪蛋白大豆琼脂平板上并在37摄氏度下培养过夜来测定每批微细胞的纯度。该方法能够常规提供非常高的纯度，可达1个污染细胞/109个微细胞。将微细胞悬浊液在含有合适的亲代细菌敏感抗生素的TSB中重悬，并将培养物在37摄氏度下培养并摇动4小时以杀灭所有残存亲代细菌。例如，伤寒沙门氏菌minCDE菌株被测定为对氨卞青霉素敏感，因此将微细胞悬浊液在含有50微克/毫升氨卞青霉素的TSB中培养4小时以确保如果存在任何残余细菌，则它们都会被杀灭。然后通过在10.000g离心30分钟收集微细胞，在1×BSG缓冲液中洗涤4次(以清除培养基)并按所需的体积重悬，用于下游实验。
从伤寒沙门氏菌的两种不同菌株中产生产微细胞菌株在图2中显示了质粒结构的示意图。在表1、2和3中分别显示了所用的细菌株、质粒和PCR引物。
采用FASTA分析法(Pearson和Lipman，1988年)将大肠杆菌minCDE基因序列，参见Mori(1996年)，用于在Genbank数据库中寻找同源DNA序列。发现来自S.typhi基因组(CT18)的TYPN3 contig 101DNA序列与大肠杆菌minCDE序列同源。根据这些数据设计了寡核苷酸引物ENOL001和ENOL002，并用于启动来自伤寒沙门氏菌株ENIh008的完整minCDE基因的合成，作为一种EcoRI-minCDEHindIII片段。
将这种片段克隆入pNEB193的EcoRI/HindIII位点，产生标明为pEN001的一种质粒，其在大肠杆菌株JM109中繁殖产生菌株ENE001。引物ENOL003和ENOL004的设计为从pEN001的minCDE盒中删除总共1081bp的序列，同时插入含有独特Kpnl、SmaI和XbaI限制位点的16个碱基对(bp)作为未来插入一个或更多标记基因的位点。
所缺失的序列包括从minC基因3’未端开始的386个碱基对，minD基因上游的23碱基对插入序列以及从minD基因5’末端开始的672个碱基对。这导致质粒pEN002中的ΔminCDE缺失盒(755个碱基对)隐匿于菌株ENE003中。将来自PHSG415(图2，表2)的氯霉素耐药基因，1330-碱基对HaeII片段/钝尾克隆入pEN002的SmaI位点以获得质粒pEN003，其携带ΔminCDE∷CmlR缺失盒，其中CmlR基因以顺时针方向克隆。这被指定为菌株ENE006。
本研究中所用的质粒
使用引物ENOL001与ENOL002，通过多聚酶链式反应(PCR)从质粒pEN003中扩充ΔminCDE∷CmlR缺失盒，将其钝化并克隆入自杀质粒pGP704的SmaI位点(图2，表2)。将命名为pEN005的质粒转化入菌株ENIh001(SM10λpir；表1)以产生菌株号ENE007。在结合实验中使用菌株ENE007作为供体菌株，而伤寒沙门氏菌株ENIh007和ENSm083(表1)作为受体。过夜，将供体与受体的静态培养物生长于37摄氏度的TSB中。在一个滤器中混合培养物，以1∶3的供体受体比率在TSA板上的Hybond N+膜上搭配结合，并在37摄氏度培养8小时。回收细胞并在无菌盐水溶液中洗涤两遍。在盐水中重悬细胞小球，并涂在150mm Petri板上。将板在37摄氏度下培养近72小时。
在含有1.5％葡萄糖和30微克/毫升氯霉素的M9最小培养基上选择前接合体。由于额外的营养缺陷要求，在这些条件下逆选择供体菌株，同时由于氯霉素敏感性，受体机制无法生长。因此该实验选择携带质粒编码的氯霉素耐药性的伤寒沙门氏菌前接合体。通过将分离物在含有氨卞青霉素(Amp)或氯霉素(Cml)的M9最小培养基上来在集落中筛查所需的CmlR和Amps显型。从显示CmlR的ENE007×ENIh007结合的79种分离物中，总共发现18种分离物是Amps的。类似的，从ENE007×ENSm083结合的56种分离物中，总共发现19种分离物是Amps的。
为了确定分离物是否在染色体中缺失了minCD基因，通过暗视野显微镜在40×放大倍数下观察过夜培养物。在全部27种分离物的混合培养物中都观察到了微细胞。所有分离物都显示微细胞的存在而微细胞中不存在亲代对照菌株。用4-0沙门氏菌体凝聚血清(兔)ZC13(MurexDiagnostics，Norcross，Georgia USA)测定纯化微细胞的凝集作用。
重组细菌株生长于产生重组微细胞的最佳实验室条件下。使用例如那些在Sambrook等人(1989年)中所描述的标准细菌学媒介来完成细菌生长，并使用最佳生长条件，其易于为传统技术所测定。
从志贺氏痢疾杆菌中产生产微细胞菌株。
图3描述了从志贺氏痢疾杆菌血清型2b中遗传构造一种产微细胞菌株的相应步骤。克隆规程类似于构造产微细胞伤寒沙门氏所遵循的规程，上面已经详细的描述过。
为了从志贺氏痢疾杆菌血清型2b(表1)中克隆minCDE基因簇，根据数据库设计了PCR克隆引物来为完整的志贺氏痢疾杆菌血清型2a基因组序列寻找进展中的排序方案。携带EcoRI和HindIII尾的PCR引物ENOL059和ENOL060分别(表3)被用于扩充来自志贺氏痢疾杆菌血清型2b提纯基因组DNA的18008bp minced基因簇。将所扩充片段克隆入质粒pNEB193(表2)的EcoRI和HindIII位点，形成质粒pEN055。插入DNA经过排序，并被证实为来自亲代志贺氏菌的minCDE DNA。
表3.在本研究中所用的寡核苷酸。在相应DNA片段前的括号中显示了限制酶位点和DNA序列特性。(F)和(R)分别代表前向和反向PCR引物。
在反向PCR反应中使用PCR引物ENOL062和ENOL063(表3)和质粒pEN055作为模板DNA获得缺失minCDE基因簇。这导致缺失271bp(minC的3’末端区域)，23bp(minC和minD之间的基因间序列)，和608bp(minD的5’末端区域)。同时，PCR引物序列插入了一个携带KpnI-SmaI-XbaI限制位点的多克隆位点。用SmaI消化PCR产物并转染，产生质粒pEN056。
从质粒pHSG415(表2)中凝胶提纯作为一种1330bp HaeII片段的CmlR标记物，用T4 DNA聚合酶钝化末端并克隆入质粒pEN056的SmaI位点。新的ΔminCDE∷CmlR质粒命名为pEN057。
通过使用引物ENOL059和ENOL060(表3)并使用质粒pEN057作为模板的PCR获得ΔminCDE∷CmlR盒。将2,272bp片段末端钝化克隆入自杀质粒pGP704的EcoRV位点(表2)。新的自杀质粒被命名为pEN060，而携带它的SM10λpir菌株被命名为ENE105。
使用滤器配对结合将质粒pEN060从ENE105转染至志贺氏痢疾杆菌株ENSf001(表1)，受体供体比例为5∶1，将受体和供体的过夜培养物(静态生长)以所计算的比例在TSA板的Hybond N+膜上混合，并在37摄氏度培养过夜。回收细胞并洗涤2遍，然后在含有补充成分以及30微克/毫升氯霉素的选择性最小培养基上析出。由于营养缺陷的需要(供体)或抗生素敏感性(受体)，供体和受体不能在这种介质上生长，因此所发现的任何菌落都应当是接合后个体。采集到三十二(32)种分离物并将它们补缀在含有补充物与30微克/毫升氯霉素的新鲜最小培养基板上。
将32种接合后个体在37摄氏度培养过夜后，补缀至含有补充物与100微克/毫升氨卞青霉素的新鲜最小培养基板上，然后在37摄氏度培养24-48小时。所有32种分离物都能在氨卞青霉素上生长，显示整个质粒已经完全整合。在暗视野显微镜(40×)或油浸(100×)下检查每种分离物。发现3种分离物存在微细胞。将分离物在含有30微克/毫升氯霉素的XLD板上划线以证实分离物是志贺氏菌而非大肠杆菌供体。当用志贺氏痢疾杆菌凝集血清(BIODESIGN International，Saco，Maine，USA)测试时，分离物还显示强阳性的凝集反应。质粒纯化以及凝胶电泳分析证实在接合后个体中不存在游离体形式的供体质粒。
从大肠杆菌中产生产微细胞菌株已知大肠杆菌与志贺氏菌的基因组之间具有98％的遗传同源性，故本研究的目的是测定异源性ΔminCDE基因序列是否可以用于产生产微细胞菌株，尤其是基因组序列关系密切时。因此使用滤器配对接合将质粒pEN060(携带来自志贺氏痢疾杆菌的ΔminCDE∷CmlR；图3)从ENE195(表1)转染至大肠杆菌株ENIh003(JM109；表1)，受体供体比例为3∶1。将受体和供体的过夜培养物(静态生长)以所计算的比例在TSA板的Hybond N+膜上混合，并在37摄氏度培养过夜。回收细胞并洗涤2遍，然后在含有补充成分以及30微克/毫升氯霉素的选择性最小培养基上析出。由于营养缺陷的需要(供体)或抗生素敏感性(受体)，供体和受体不能在这种介质上生长，因此所发现的任何菌落都应当是接合后个体。采集到106种分离物并将它们补缀在含有补充物与30微克/毫升氯霉素的新鲜最小培养基板上。在37摄氏度培养过夜后，将分离物补缀至含有补充物与100微克/毫升氨卞青霉素的新鲜最小培养基板上，并在37摄氏度培养24-48小时。所有106种分离物都能在氨卞青霉素上生长，提示整个质粒已经完全整合。在暗视野显微镜(40×)和油浸(100×)下观察了二十四(24)种分离物。6种分离物显示存在微细胞。尽管在过去使用了许多不同的常规诱变和定点诱变规程，本发明是第一个显示在本研究中所采用的独特克隆/定点诱变规程是通用的，并且能够可靠的用于从一列革兰氏阴性和革兰氏阳性菌中产生产微细胞菌株(下面显示的例2)。
例2从李斯特单胞菌中产生微细胞正如所述，在这个例子里，可以从革兰氏阳性菌中产生产微细胞菌株。图4中显示了质粒结构的示意图。细菌株、质粒和PCR引物分别列在表1、表2和表3中。
为了克隆来自李斯特单胞菌的基因组，使用引物ENOL038和ENOL048(表2)并用李斯特单胞菌基因组DNA作为模板进行PCR。使用Platinum·Pfx DNA聚合酶试剂盒(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，USA)进行体积为50微升的PCR反应。反应物包括1×Pfx缓冲液，2mM硫酸镁，0.2mMdATP，dTTP，dGTP和dCTP，每种引物各50pmol，以及1个单位Pfx聚合酶。循环条件包括一个94摄氏度下的变性步骤，持续2分钟；接着是35个循环94摄氏度下持续30秒，55摄氏度下持续30秒以及68摄氏度下持续2分钟；然后在68摄氏度下进行最终扩展步骤，持续5分钟。将每种PCR反应混合物各取2-5微升样品，在用溴化乙锭着色的1％琼脂糖凝胶上进行观察。从琼脂糖凝胶上切下，然后根据生产商的说明，使用422型洗提器(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)进行电洗提，使扩充的minCD片段纯化。
用SacI和HindII消化minCD片段(1，556bp)，并定向克隆入质粒pNEB193的相应位点(表2；图4)。通过限制酶消化与凝胶电泳分析描述在菌株ENIh003(表1)中转化的重组克隆。将正确的克隆(命名为pEN045的质粒)排序以证实minCD基因的身份。
使用引物ENOL039和ENOL040(表3)在质粒pEN045中的克隆minCD片段上进行PCR删除。引物分别携带限制酶位点XbaI和KpnI，作为ΔminC和ΔminD之间选择标记物的插入位点。用于删除minCD和观察片段的条件如上所述，但另外有一个4分钟的扩展步骤。随后用XbaI和KpnI消化ΔminCD片段，并用422型电洗提器通过电洗提进行纯化，作为与选择标记物绑缚的制剂。
在pEN045中ΔminC与ΔminD基因之间的KpnI和XbaI位点上插入来自革兰氏阳性细菌的两种不同的抗生素选择标记物。使用来自枯草杆菌质粒pMK4(表2)的氯霉素耐药性标记物(CmlR)和来自血链球菌质粒pVA838(表2)的红霉素耐药性标记物(EmR)分别构建质粒pEN062和pEN063(图4)。使用表2中所列和图4中所显示的含有XbaI和KpnI位点的寡核苷酸通过PCR扩增每种标记物。使用与如上所述相同的反应体积和反应物浓度进行CmR和EmR的PCR。循环条件包括一个94摄氏度下的变性步骤，持续2分钟；接着是35个循环94摄氏度下持续30秒，55摄氏度下持续1分钟以及68摄氏度下持续2分钟；然后是一个68摄氏度下的扩展步骤，持续5分钟。按照生产商的说明，使用MinElute试剂盒(Qiagen Inc，Victoria，Australia)对PCR片段进行凝胶提纯。然后用KpnI和XbaI消化CmR和EmR，在MinElute柱上提纯，并连结至pEN045中ΔminC与ΔminD基因之间的相应位点上。通过使用酶EcoRI和DdeI(CmR)以及EcoRI和AvaI(EmR)的限制酶消化来描述JM109重组体，分别得到菌株分离物ENE110和ENE112。
为了李斯特单胞菌和大肠杆菌SM10λpir(ENIh001)之间的接合实验，使用接合质粒pGP704构建了4种新型质粒。改造质粒pGP704使其包含由neo基因编码的卡那霉素耐药标记物(KmR)，或者用于在革兰氏阳性菌中进行质粒复制的KmR以及ori。前者的作用是在缺乏革兰氏阳性复制源时作为自杀质粒，而neo基因(KmR)的作用是作为质粒存在的标志。相比之下，后者的作用是作为接合实验的阳性对照。
使用表3中所列的一组寡核苷酸通过PCR从pRB373中扩充将含有neo基因的DNA片段以及包含革兰氏阳性ori的neo基因。PCR反应体积与反应物浓度如上所述。循环条件包括一个94摄氏度下的变性步骤，持续2分钟；接着是35个循环94摄氏度下持续30秒，55摄氏度下持续1分钟以及68摄氏度下持续2分半钟；然后是一个68摄氏度下的长扩展步骤，持续5分钟。使用MinElute柱从琼脂糖凝胶中纯化产物。用EcoRI切割含有neo基因以及neo基因加上革兰氏阳性ori的片段，并连接入pGP704的EcoRI位点(图4)。这个过程产生名为pEN064和pEN066的质粒。
然后将来自pEN062和pEN063的ΔminCD∷CmlR或ΔminCD∷EmR分别切割成SacI-HindIII片段，末端钝化并连接入质粒pEN064和pEN066的EcoRV位点，以产生如图4所示的4种不同的质粒pEN069、pEN071、pEN073和pEN075。将4种质粒转化入ENIh001(大肠杆菌SM10λpir)分别产生菌株ENE124、ENE126、ENE128和ENE130。因此ENE124包含具有ΔminCD∷CmR和neo基因(KmR)的质粒，而ENE126另外还含有革兰氏阳性ori。类似的，ENE128包含具有ΔminCD∷EmR和neo基因(KmR)的质粒，而ENE130另外还含有革兰氏阳性ori。
将4种菌株ENE124、ENE126、ENE128和ENE130作为供体菌株用于李斯特单胞菌(ENLM001)的接合实验。接合实质上按照Trieu-Cuot等人(1991年)的描述进行。所有的菌株都生长至中对数期并以2∶1的比例(受体∶供体)混合，定容至1毫升。在BHI中洗涤接合混合物2遍，然后在1ml BHI中重悬。将200微升涂布在BHI板的0.45微米硝化纤维膜滤器(Millipore)上，并在37摄氏度下培养18小时。培养后，将硝化纤维膜切成条状并放在3毫升BHI中。使用剧烈的涡流从滤膜中除去细菌细胞。将300微升样品在含有BHI、萘啶酸(Nal；50微克/豪升)、肠杆菌素(Col；多粘菌素E)(10微克/毫升)以及氯霉素(10微克/毫升)或红霉素(10微克/毫升)的大平板上析出。将平板在37摄氏度下培养48小时，然后收集菌落。
将菌落补缀至含有卡那霉素(15微克/毫升)的BHI/Nal/Col板以及含有氯霉素(10微克/毫升)或红霉素(10微克/毫升)的BHI/Nal/Col板上，用于抗生素敏感性测定。所有的接合后个体都显示一种抗生素特征，提示minCD缺失的染色体整合而没有质粒的整合。也就是说，所有的接合后个体都能生长于含有内标记红霉素或氯霉素的抗生素板上，而接合后个体都不能生长于含有卡那霉素的板上(KmR由供体质粒上的neo基因编码)。
使用暗视野显微镜(40×)和油浸(100×)检测了超过100种接合后个体的微细胞表型。在显微镜下，与亲代细胞(ENIh001和ENLm001)相比，在李斯特单胞菌亲代杆群体中所有的分离物都显示出不同数量的微细胞结构。这个结果与minCD缺失的整合以及正常旁中心分裂的破坏是一致的。
选择了30种接合后个体进行再次培养以测试微细胞表型的保持情况。在确认保持的情况下，将分离物作为甘油原料储存，用于未来的实验。
实例3.提纯来自细菌的微细胞通过下面的独创性方法来提纯微细胞。这个例子详细描述了来自minCDE-伤寒沙门氏菌的微细胞的提纯过程。相同的程序还用于提纯来自附加min突变菌株的微细胞，包括伤寒沙门氏菌的两种突变体，以及大肠杆菌、志贺氏痢疾杆菌以及李斯特单胞菌各自的一种突变体。将此程序优化并重复超过50次以产生纯化的微细胞。这种方法是可靠的，并且从10升细菌培养物中常规能够产生108至109的纯化微细胞。
从50毫升含抗生素氯霉素和卡那霉素(终浓度为50微克/毫升)TSB内的甘油原料中产生一种伤寒沙门氏菌minCDE-/pEGFP-C1培养物。将培养物在37摄氏度下摇动培养过夜。将2.5毫升等分过夜培养物用于接种在1升(装在2升的带挡板锥形瓶中)含有上述抗生素的TSB中，并将5瓶在37摄氏度下摇动培养过夜。
(A)预制备(阶段1)使用经过一个0.2微米滤器的无菌软管，用1型水(MQ)充满100升的Bioprocess袋。通过蠕动泵将18升无菌程序水转染至两个含有2升10×BSG的20升高压灭菌大玻璃瓶中。一个大玻璃瓶用于稀释微细胞悬浊液，另一个用于透滤。
(B)差速离心和预制备(阶段2)将细菌培养物在2000g离心10分钟(Sorvall Legend T/RT；TTH 750rotor)。将上清液轻轻倒入装有一个0.2微米通风滤器和一个快速断开装置的5升无菌大玻璃瓶中。移注过程在一个II级生物危害橱中进行。密封大玻璃瓶，将无菌导管连接至5升大玻璃瓶，导管的另一端连接至含有20升如上所述1×BSG的预填充20升大玻璃瓶。携带微细胞的悬浊液从5升大玻璃瓶泵入20升大玻璃瓶，产生1∶5的稀释度。
(C)微细胞连续提纯系统将来自Sartorius的3个横向流动系统串联在一起。一式两份，将0.45微米Sartocon Slice Cassette滤器装在前两个切片固定器中，并将一个0.2微米Sartocon Slice滤器盒装在最后一个固定器中。用转矩扳手将每个滤器元件的转矩固定为20Nm(牛顿·米)。每个部件通过清洁元件连接至一个泵。接上进料、保留物以及透过物的管道。在连接大玻璃瓶之前，用6升1N氢氧化钠以2bar的压力内部洗涤整个系统15分钟。这个步骤可以内部消毒各种软管和滤器。通过反转液体流动的泵方向从系统中排出氢氧化钠，并进行通量率检测以确保适当的滤器清洗。检测根据生产商的说明(Sartorius使用说明书)进行。在进行微细胞过滤前保证可接受的通量率，其对保留物为毫升/分，对透过物为800毫升/分。系统仍携带高pH值，因此通过用无菌的1×PBS(pH7.4)冲洗并回流通过每个系统来进行中和，直至PBS池的pH测量值位于7.0至8.0的范围内。然后接上大玻璃瓶(20升)。微细胞悬浊液(25升)装在第一个大玻璃瓶中，其通过一条软管连接至第一个0.45微米滤器盒。为了防止滤器结垢，在进行过滤步骤时稀释微细胞悬浊液(即透滤)。稀释剂(20升1×BSG)装在第二个大玻璃瓶中。因此，在第一个横向流动滤过步骤中，微细胞悬浊液滤过体积为45升。起初关闭渗透阀，微细胞悬浊液以2bar的压力泵至0.45微升滤器表面，持续5分钟。这使滤器得以适应微细胞悬浊液介质。然后打开渗透阀，微细胞悬浊液透过(压力为2bar，600毫升/分钟)0.45微米滤器，并将透过物收集在第三个大玻璃瓶中。随着第一个大玻璃瓶中的体积减少，不滤过固体的数量增加，因此当第一个大玻璃瓶中的体积降至15升时接通透滤。这样可以稀释第一个大玻璃瓶中的固体，防止滤器结垢并使第三个大玻璃瓶中的微细胞回收最大化。一旦第三个大玻璃瓶中的透过物体积达到大约12.5升，调节第二个0.45微米横向流动滤器以适应第三个大玻璃瓶中的微细胞悬浊液。当第三个大玻璃瓶中的体积达到15升的标记，打开渗透阀，允许微细胞悬浊液透过，进入第四个大玻璃瓶。
在这个阶段，微细胞悬浊液中更大的亲代细菌污染物被清除。下一阶段是除去悬浊液中更小的污染物，比如细菌气泡、游离内毒素、核酸、细胞碎片以及过多的液体。这通过经由一个0.2微米横向流动滤器的过滤来完成。微细胞的直径大约为0.4微米，因此不能透过0.2微米的孔径。另一方面，细菌气泡的大小(直径)范围是0.05微米至0.2微米，因此可以滤出。其他污染物也小于0.2微米，因此在此滤过步骤中唯一保留的成分是微细胞以及任何残余的亲代细菌细胞。
当第四个大玻璃瓶中的体积达到大约15升时，调节0.2微米横向流动滤器以适应第四个大玻璃瓶中的微细胞悬浊液。然后打开渗透阀，允许透过物进入第五个大玻璃瓶中的废液，同时保留微细胞并在第四个大玻璃瓶中浓缩。由于加入了透滤系统，微细胞被连续稀释并过滤，保证在程序结束时彻底的清除污染物。因此浓缩步骤将微细胞悬浊液的体积从45升的初始体积减少至大约4升。
(D)微细胞悬浊液的缓冲液交换通过用1×BSG透滤来清除微细胞悬浊液中残余的盐、介质成分以及低分子量废物。如前所述装配并均衡器械，微细胞悬浊液放在第一个4升大玻璃瓶中，20升无菌1×BSG(透滤介质)装在第二个大玻璃瓶中。横向流动元件装有两个0.1微米滤器盒以确保微细胞不能通过而所有小于0.1微米的污染物都被清除。接通泵并调节速度以提供0.5bar的压力。打开渗透阀，微细胞悬浊液通过进料管流到0.1微米滤器上。微细胞通过保留物管回到第一个大玻璃瓶。废物流过透过物管并被收集在第三个大玻璃瓶中。这减少了微细胞悬浊液的体积，因此接通透滤系统将1×BSG泵入第一个大玻璃瓶。这个步骤持续补充微细胞悬浊液的体积，保持它始终为4升。该程序持续进行，直至第二个大玻璃瓶排空，将微细胞悬浊液的缓冲液替换5遍。
(E)微细胞悬浊液的无菌过滤在这个阶段，微细胞悬浊液仍然携带某些亲代细菌污染物，因为0.45微米横向流动滤器并非无菌滤器。因此，除去所有残余亲代细菌以获得体外和体内使用的最佳微细胞悬浊液是很重要的。将来自先前步骤的4升微细胞悬浊液在无菌1×BSG中初始稀释至20升。用2升无菌1×BSG预湿装载大表面积(500平方厘米)0.45微米滤器的终端滤器元件，并按照生产商的说明检测完整性。以700毫升/分钟(即慢流率以防止迫使亲代细菌细胞穿过0.45微米滤器)的流率将微细胞悬浊液抽吸通过终端滤器。滤器留下细菌细胞，而微细胞可以通过，经由滤出液管道进入第二个大玻璃瓶。
(F)纯化微细胞的浓缩将20升悬浊液中的纯化微细胞浓缩至更小的体积。但是，由于体积大并且在实践中无益于离心技术，所以这个步骤不易于通过标准的离心和小球重悬技术完成。
浓缩步骤通过下面4个阶段进行。
阶段1将微细胞悬浊液以0.5bar的压力泵出第一个大玻璃瓶，通过一个清洁元件泵至一个100kDa横向流动滤器上。微细胞通过保留物管道返回第一个大玻璃瓶，而透过的液体通过渗透废物管收集在第二个大玻璃瓶中。
阶段2一旦微细胞悬浊液的体积降至4升，则该程序终止，并且悬浊液被转染至第三个无菌4升大玻璃瓶中。与用于处理上述更大体积的12.5毫米软管相比，后者装配有直径6.4毫米的软管。这减少了管道的空隙体积。由于进料和保留物管都是直径12.5毫米的管道系统，设计了一种适配器来将软管装配在瓶盖贴封中。类似的，设计了一种适配器来装配进料和保留物管更大的钻孔管道系统。如同前一阶段那样进行第二个浓缩阶段，直至微细胞进一步减至大约200毫升。
阶段3将200毫升微细胞悬浊液转染至一个含有用于进料和保留物的内瓶管道系统的改良Schott瓶中。瓶管道系统钻孔穿过Scott瓶的顶盖，并用Marprene管道系统和硅密封。在瓶盖上也携带一个通气滤器(0.2微米)。为了进一步减少空隙体积，用无菌6.4毫米Marprene管道取代先前所用的进料、清洁元件以及保留物管道系统，并用更小的泵取代先前所用的泵。同前进行浓缩步骤(100kDA横向流动滤器)，直至微细胞体积减少至50毫升。
阶段4将高度纯化的微细胞悬浊液在无菌条件下转染至一支50毫升的Falcon管中。
实例4.来自革兰氏阴性与革兰氏阳性minCD菌株的微细胞的扫描电子显微镜特性使用来自伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏痢疾杆菌、李斯特单胞菌以及相应亲代细胞的微细胞的扫描(SEM)和透射(TEM)电子显微照片测定各种微细胞的形态学和尺寸。简单说来，将携带微细胞的细菌培养物以13,200rpm离心20分钟，然后在含有2.5％戊二醛的PBS中重悬，并在室温下固定40分钟。将样品离心并用蒸馏水洗涤3次。对于TEM，按照下列程序进行。为了替换溶液，将细胞在10,000rpm离心1分钟，吸去上清液，然后使用涡流混合器在新试剂中重悬细胞。加入试剂的次序为(a)四氧化锇的0.1M二甲胂酸盐(pH7.2)溶液-10分钟，(b)4％醋酸钠的蒸馏水溶液-1分钟，(c)乙酸双氧铀的蒸馏水溶液-5分钟，(d)70％乙醇-5分钟，(e)100％乙醇-5分钟，(f)100％丙酮-5分钟，(g)丙酮与Spurr’s环氧树脂单体的1∶1混合物-30分钟，(h)纯Spurr’s环氧树脂-在60摄氏度下固化48小时。借助金刚石刀具采用Reichert Ultracut E超微切片机从固化的树脂块上切下片段。将片段用乙酸双氧铀染色10分钟，然后用柠檬酸铅染色2分钟。用Hitachi H-7000透射电子显微镜检测片段，所用电子束能量为75千伏(University of New South Wales，NSW，Australia)。用AnalySisMegaView II广视野CCD相机记录数字影像。
对于高分辨率扫描电子显微镜，按照下面的方法进行。为了替换溶液，将细胞以13,200rpm离心20分钟，吸去上清液，然后使用涡流混合器将细胞在新试剂中重悬。目的是从细胞上洗下所有离子和生物材料并让它们悬浮于少量的蒸馏水中。加入试剂的次序为(a)1毫升蒸馏水-重新丸化，(b)1毫升蒸馏水-重悬，(c)将250微升沉积于清洁黄铜试样板上，(d)在30摄氏度下干燥过夜，(e)在用于显微镜观察前，置于Xenosput清洁真空喷射涂布机中涂上2纳米金属铬。用Hitachi S-900场致发射扫描电子显微镜检测涂层后的样本，所用电子束能量为3千伏(University of New South Wales，NSW，Australia)。用ImageSlave数字转换器记录不同放大倍数的数字影像。
结果显示来自革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的微细胞直径都是大约400纳米，除了李斯特单胞菌外，SEM看到它们的表面都有皱纹，大概是由于脂多糖细胞表面结构的缘故。所有种类微细胞和亲代细菌的表面超微结构没有明显的差别。TEM结果显示李斯特单胞菌微细胞的细胞壁结构僵硬，预期为革兰氏阳性菌的细胞膜。在显微镜电子束下，沙门氏菌、志贺氏痢疾杆菌以及大肠杆菌的细胞膜更易于萎陷。在全部样品中都观察到微细胞形成事件，即不对称细胞分裂。
实例5.微细胞被哺乳动物细胞，例如巨噬细胞摄取为了显示重组微细胞被巨噬细胞摄取，首先需要加入一种示踪剂比如GFP，使得重组微细胞可以被清楚的从哺乳动物细胞中看出来。因此，将质粒pEGFP转化入产伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和志贺氏痢疾杆菌minCDE微细胞的菌株，以检测微细胞是否能稳定携带EGFP并发出绿色荧光。
质粒pEGFP(表2)示一种细菌表达质粒，其从lac启动子中表达野生型绿色荧光蛋白(EGFP；最大激发488纳米；最大发射507纳米)的红移变体。质粒主干是pUC19、pPD16.43的衍生物(Fire等人，1990)，其能够提供一种高拷贝数的复制源以及一种氨卞青霉素耐药基因，用于在细菌细胞中增殖并筛选。质粒被转染入伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和志贺氏痢疾杆菌minCDE菌株，并将重组细菌在脑心灌注肉汤(BHI；DifcoLaboratories，Detroit，Michigan USA)中培育，直至OD600达到0.6。从混合培养物中分离并提纯微细胞，用荧光显微镜观察(荧光显微镜DMLM，Leiea Microsystems)。结果显示所有微细胞都发出亮绿色荧光，而从非重组伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和志贺氏痢疾杆菌minCDE菌株(对照)中提纯的微细胞不显示任何绿色荧光。按照30分钟、1小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、1周以及2周的间隔用荧光显微镜观察保存的微细胞(4摄氏度和室温下)。结果显示微细胞完整无缺，并在整个研究中持续发出亮绿色荧光。因此质粒pEGFP提供了一种示踪剂(发绿色荧光的微细胞)，可以用于追踪重组微细胞被哺乳动物细胞，比如巨噬细胞，以及其他细胞比如肿瘤细胞的摄取。这些结果表明，由于缺少染色体编码的蛋白酶，重组蛋白一经表达或分离入微细胞，就能够在显著的时段内保持稳定(可能直至微细胞的细胞完整性受损)。
将取自美国细胞、菌种库(ATCC)的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞以105/阱的细胞密度进行体外培养，并用纯化的，携带来自伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和志贺氏痢疾杆菌的质粒pEGFP的重组微细胞，按照50∶1和100∶1的微细胞巨噬细胞比例进行传染。
在巨噬细胞传染千，通过荧光显微镜观察纯化的微细胞以证实大多数微细胞携带EGFP并因此能够发出亮绿色荧光。作为阳性对照，将携带相同质粒的伤寒沙门氏菌aroA-菌株SL3261(表1)也用于按照相同的细菌巨噬细胞比例来转染巨噬细胞。同样按照实验传染细胞的相同方法处理阴性对照(非传染的巨噬细胞)。将培养板在37摄氏度下以1000克离心10分钟。对于微细胞转染研究，加入抗生素庆大霉素(100微克/毫升)和氨卞青霉素(200微克/毫升)以杀灭任何残存的活亲代细菌细胞。也用相同的抗生素处理杀灭阳性对照沙门氏菌。将板在5％CO2中37摄氏度下培养30分钟，然后用PBS洗涤3遍。对于伤寒沙门氏菌来源的微细胞/巨噬细胞实验，将载玻片用4％的甲醛固定40分钟，然后用0.2％的三硝基甲苯X-100透过。用溶于含有5％BSA的磷酸缓冲液的5％正常山羊血清(NGS)非特异性封闭染色后，将盖玻片与抗脂多糖(LPS)抗体(兔4-O沙门氏菌体凝聚血清；1∶200稀释；Murex Biotech，Dartford，England)一起在室温下培养4小时。将细胞在PBS中洗涤3遍并与溶于PBS-BSA的第二抗体(1∶1000)，Alexa Fluor594(Molecular Probes，Eugene，OR，USA；山羊抗小鼠IgG结合物，激发590纳米，发射617纳米)一起培养。将板与第二抗体在黑暗中培养1小时并用PBS洗涤3遍，每次持续5分钟。用甘油包埋盖玻片并用共焦显微镜观察。
结果显示，伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和志贺氏痢疾杆菌来源的微细胞都被培养物中20％至30％的巨噬细胞所吞噬。微细胞发出亮绿色荧光，并与巨噬细胞相关。除了小的非特异性背景荧光外，对照非重组伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和志贺氏痢疾杆菌来源的微细胞未发现与巨噬细胞相关性绿色荧光点。对照重组伤寒沙门氏菌aroA-菌株也产生与两种重组微细胞所见类似的结果。
为了证实绿色荧光点位于巨噬细胞内，即为被吞噬的微细胞，而不仅仅是粘附于细胞表面，拍摄了伤寒沙门氏菌来源的微细胞-巨噬细胞相互作用的三维照片(使用矢状和冠状面)。在冠状面和矢状面中，微细胞位于巨噬细胞内，标明微细胞已经被巨噬细胞所吞噬。另外，绿色荧光点的抗-O4 LPS标记(加入第二抗体Alexa Flour593后的黄色荧光)显示绿色荧光点实际上是表达EGFP的微细胞而不是人工背景荧光。使用阳性对照沙门氏菌也观察到类似结果，显示在微细胞表面保存了细胞经受体介导被巨噬细胞摄取所需的细菌表面结构。
实例6.微细胞摄取以及在巨噬细胞吞噬溶酶体中的分解为了显示微细胞在巨噬细胞中的胞内结局，对经伤寒沙门氏菌来源微细胞传染的小鼠巨噬细胞进行了TEM研究。
简单说来，将小鼠巨噬细胞系RAW246.7在T25烧瓶中的标准培养基内培育至-50％融合。将大约107/100微升的微细胞直接加入烧瓶中的培养基内，并如实例5中所述进行巨噬细胞传染程序。采用的微细胞巨噬细胞近似比例为10∶1。在传染后30分钟、60分钟和2小时的相应时间点收集细胞。还另外包括一个未接受微细胞的烧瓶作为阴性对照。细胞经过胰蛋白酶化&丸化收集，并在4％的戊二醛(500微升)中固定。通过TEM处理并分析样品(University of New South Wales，Sydney，Australia)。
结果显示早至传染后30分钟，在巨噬细胞空泡中就观察到了近似于微细胞大小(400纳米)的电子致密颗粒(图5，照片A-F)。随着时间的推移(60分钟和2小时)，电子致密颗粒显得完整性更差，表面不规则并且丢失电子密度。
为了证实空泡内电子致密颗粒是微细胞所吞噬的，重复上述实验，但有一点不同，在传染后的各个时间间隔后，在室温下将细胞固定(4％多聚甲醛，0.1％戊二醛)30分钟，用PBS洗涤并通过轻柔的细胞刮擦将其收集在1.5毫升PBS中。处理样品用于免疫金-TEM(EM Unit，ICPMR，Westmead Hospital，Sydney，Australia)。将样品轻柔的形成丸状，并通过冰冻替代法处理。简单说来，将样品用1∶200稀释的第一抗体(抗伤寒沙门氏菌脂多糖[4因子，B组特异性]；Abbott Murex，USA)标记，然后加入结合金(10纳米)的第二抗体。用Philips CM-120 BioTWIN电子显微镜在80kV进行观察。捕捉照片至4489型Kodak EM感光乳剂胶片上。
结果显示金标记的抗-O4-LPS抗体能够明确的鉴定微细胞，因此在巨噬细胞空泡中观察到的电子致密颗粒就是伤寒沙门氏菌来源的微细胞。在未用微细胞传染的对照巨噬细胞中未观察到金标记。这个资料还显示，在更晚的时间点上，在空泡中观察到与微细胞无关的金颗粒。在更晚的时间点上，游离于微细胞外的金颗粒数量显著增长，这也与失去细胞壁完整性和细胞电子密度的微细胞的数量增加有关。这些资料显示微细胞遵循通过巨噬细胞展示的抗原摄取与处理的经典途径，其包括将外来颗粒摄入早期吞饮泡，然后经过吞饮泡-溶酶体融合，在酸性吞噬溶酶体中分解抗原。在传染的晚期游离于微细胞外的金颗粒可能显示了从微细胞的处理与消化中释放的LPS。
这些结果显示重组微细胞不但被哺乳动物细胞，比如巨噬细胞所吞噬，并且在胞内空泡，推测是吞噬溶酶体中被降解。
实例7.经微细胞转染的巨噬细胞表达异源性蛋白为了检测携带编码EGFP(在细菌细胞或微细胞中不表达)的哺乳动物基因表达质粒的重组微细胞是否能够将质粒传输至哺乳动物细胞核并在哺乳动物细胞中表达EGFP，进行了下面的实验。
如实例5所述，将小鼠巨噬细胞系RAW-264.7的细胞在体外进行培养，并用携带质粒pEGFP-Cl(表2)的纯化重组伤寒沙门氏菌、大肠杆菌与志贺氏痢疾杆菌来源的微细胞进行传染。在转染后48小时，用三维共焦显微镜观察传染的细胞。
结果显示大约20％的巨噬细胞发出绿色荧光，提示重组微细胞在巨噬细胞内，推测为在吞噬溶酶体中被分解，并且至少一部分被释放的质粒DNA在表达绿色荧光蛋白前被细胞核所摄取。对照巨噬细胞，即用非重组微细胞转染的巨噬细胞未发现绿色荧光。EGFP在实验细胞中的表达至少需要48小时。这个结果与用BioRad Genepulser电穿孔转染质粒pEGFP-Cl的阳性对照巨噬细胞中所观察到的结果类似。
为了进一步证实EGFP在微细胞转染的巨噬细胞中的表达并非背景荧光，对伤寒沙门氏菌来源的微细胞重复该实验。在此情况下，用甲醛固定后，将盖玻片与抗GFP单克隆抗体(Clontech Laboratories，Palo Alto，CA，USA；1∶300稀释)一起培养，并在4摄氏度下培养过夜。用PBS洗涤盖玻片3遍(每次洗涤5分钟)，并将其与溶于PBS/BSA的2％正常山羊血清一起培养20分钟。用PBS洗涤盖玻片两遍并}