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题名: 中华鳖免疫相关基因的筛选、克隆及表达分析
学位类别: 博士
授予单位: 中国科学院水生生物研究所
授予地点: 水生生物研究所
其他题名: Screening, cloning and expression analysis of immune-relevant genes in Chinese soft-shelled turtle Trionyx sinensis
中文摘要: 摘 要
本研究在最为薄弱的爬行动物免疫学研究领域进行了有意义的探索。应用抑制性差减杂交技术，首次构建了一个与嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila) 感染有关的中华鳖 (Trionyx sinensis) 主要内脏器官的差减cDNA文库。从200多个克隆中筛选到42个差异或上调表达的基因，其中16个与免疫相关基因系爬行类首次鉴定。经虚拟Northern 杂交和RT-PCR验证，其中的6个基因（IL-8、SAA、CD9、ATF4、CL和毒素样蛋白）在中华鳖感染组织均上调表达。
通过RACE方法得到中华鳖IL-8、SAA、毒素样蛋白、CD9和Fg基因的全长cDNA序列并进行了分子结构和进化分析；通过Genome Walking方法得到前3个基因的基因组及启动子序列。中华鳖IL-8基因组全长4924 bp，由三个内含子和四个外显子组成；cDNA全长为1188 bp，开放阅读框包含312 bp，编码蛋白为104个氨基酸，含有保守的CXC结构域、4个半胱氨酸和与功能相关的ELR基序。SAA基因组全长3153 bp，由两个内含子和三个外显子组成；cDNA全长为554 bp，开放阅读框包含381 bp，编码蛋白为127个氨基酸，C-端氨基酸十分保守，N-端由疏水氨基酸组成。毒素样蛋白基因组全长1995 bp，由两个内含子和三个外显子组成；cDNA全长为580 bp，开放阅读框包含267bp，编码蛋白为89个氨基酸，含有8个保守的半胱氨酸和三指蛋白家族的标志序列C-末端CCXXXCN基序。CD9 cDNA全长为1146 bp，开放阅读框包含672bp，编码蛋白为224个氨基酸，包含四个跨膜结构域（TM）和大小两个胞外环（LEL和SEL），LEL内含有保守的CCG基序和4个半胱氨酸，SEL内含一个N-端糖基化位点。Fg cDNA全长为1605 bp，开放阅读框包含1320bp，编码蛋白为440个氨基酸，含有FReD结构域、N-末端球形结构域C-gamma、Ca2+结合位点和聚合口袋结构等。系统进化分析显示，除毒素样蛋白与一种美洲大毒蛇的毒素样蛋白聚为一支外，其余四个蛋白均与鸟类的同源分子聚为一支。
RT-PCR分析显示在中华鳖相关组织中均检测到IL-8、CD9和毒素样蛋白基因的转录产物。其中IL-8基因为组成型表达；CD9基因主要在肝和脾组织表达；而毒素样蛋白基因主要在肝和肾组织中表达。RT-PCR结果表明，除SAA外，其余4种急性期蛋白（APP）Fg、C3、ALB和 CL基因均在肝组织表达。
通过RQ-PCR，发现在嗜水气单胞菌感染条件下，IL-8、CD9和毒素样蛋白在中华鳖相关组织中呈现动态表达变化。其中IL-8基因于感染后第4天以肝、脾和肾组织上调表达最明显；而CD9基因在2-4天以肝、脾和血液上调表达最明显；毒素样蛋白基因于感染后第1–2天以肝、脾、心脏和血液上调表达最明显；除ALB基因下调表达外，其它4种APP基因在肝组织均有不同程度的诱导表达，其中SAA于感染后第2天在肝组织上调至2000倍；表明这些基因的表达变化与爬行类抗细菌免疫密切相关。
完成了中华鳖IL-8基因的原核表达和蛋白纯化。趋化实验表明，rIL-8蛋白浓度为1.0―20ng/ml时对中华鳖嗜中性粒细胞有趋化作用，对淋巴细胞趋化作用不明显。首次证实了爬行动物rIL-8对嗜中性粒细胞的趋化作用。
语种: 中文
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中华鳖免疫相关基因的筛选、克隆及表达分析.周秀霞[d].中国科学院水生生物研究所,
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山东大学硕士 学位论文中文摘要裤 基 克是入究物因结和能前， 于 　　 的隆深研植基的构功的提 助在 物因 有分子水平上阐明植物遗传及生长发育的控制机制。基因克隆有多种方法，其中文库筛选一直被广泛的应用。 近年来， 源序列扩增法已发展成为一 同种 保基的 方乡 作 部 行 利部同 克 守因 效法 工 两 进： 用分 探 隆 有 本分分 一 源针筛选玉米 ｃＮ 文库， ＤＡ 克隆相关基因， 为本实验室筛选玉米核基因组 ＢＣ Ａ文库贮备技术。 利用同源序列扩增法， 二， 根据已克隆的植物抗病基因保守序列设计引物， 对玉米基因组 ＤＡ Ｎ 进行 ＰＲ Ｃ 扩增， 以期得到玉米候选抗病基因。本工作 Ｉ 　　　　：根据种属间基因的同源性，利用两组混合探针（ 探针 Ｉ 、探针Ｉ ， Ｉ 分别筛选玉米叶片 ｃＮ 文库。 ） ＤＡ 探针 Ｉ 从水稻中分离的编码磷 由 脂酶ｃ磷脂酞肌醇合成酶，磷脂酞肌醇激酶的基因片段组成；探针ｎ由 ， 来自 大肠杆菌编码胆碱脱氢酶 （Ｄ） ＣＨ 基因（ ｔ 和拟南芥的Ｎ／＇ ｔ ｂＡ ｅ　 ） ａＨ ｎｉ ＇ａ －组成 Ａ ＮＸ ） ｐ ｒ 基 因 （ ｔＨ Ｉ１ ｏｔ ＤＡ 知，该 ｃＮ 片段长。ｅ针 得ｂ个 “ 经编 ｋ　杂１至长的开放阅读框，” ｂ包含一个 ３“阳 隆 测 ｔ 交５一 性 ，序 Ａ ３ｐ 探 １１ｂ，其中 ５２ｐ码 由 ４１ ５ 个氨基酸组成的肤链。序列分析得知，此片段与 ｂ ｔ 的同源性 ｅ　 Ａｅ　 Ａ ０ 经同源 不高。而 ｈ ｔ 探针与构建文库载体中的部分序列有 ４ ％同源性。性比 较分析得出， 。Ｎ 片段的核昔酸序列与水稻 ＰＣ 该 ＤＡ Ａ 库中 １ 号染色体Ｐ５９０ 克隆的 １ ７９ｐ　 ８５６ 之Ｉ有高 ０１ ４ Ｄ ５ ２ｂ－　 ２４ｐ ｆ ６ １ ５ ｌ ｏ 度同 源性， 在核普酸和蛋 白 质水平上的同源性分别是８％；　 另外与 ６ ８％； ８ 拟南芥 ３ 号染色体Ｃ － Ｈ Ｒ３１ ５０１ ｘ １ ０ 克隆在核昔酸及蛋白质水平上分别有 ８ ％，　％的同源。水稻 ２２ ３ ７ ２和南中蛋有指白结。 拟芥该白锌蛋的构 夕本工作 ｎ： 根据已经克隆的植物抗病基因和候选抗病基因保守序列Ｐ ｌｏ ．　 ａｅ 及ＧＰＡ 设计一系列简并引 － ｏｐ Ｋｎｓ２ ｉ ＬＬＬ 物，利用多种引 物组合对玉米基组Ａ 进Ｐ 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　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＤＲ－Ｃ ＤＴＰＲＤ ｆｅｅｔａ Ｄｓ ｌｙ　ｖｒｅ　ａ ｓｒ ｐ ｉｎ　Ｒ ｉｆｒｎ ｉｌ　 ｐ ａ Ｒ ｅｓ Ｔ ｎ ｃ ｉｔｏ Ｐ ｉ ｅ ｒ Ｃ差异显示反转录 ＰＲ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ＣＤＧ ＩＤｇｘｇｎｎ ｉ ｉ ｉ ｏ ｅ 地高 辛 Ｅｈｅｅｉ ｉｅｅｒａｅｉ Ａｉ 乙 ｔｙｎｄａ ｎｔｔ ｃｔｃ　 ｄ 二胺四乙酸 ｍ ａ ｃＥｐ ｎｏｆ ｐ ｅｄｒＥＴ Ｓ ＩＴ ＰＧＥｐｅｓ Ｓｑ ｎ Ｔｇ ｘ ｓ ｄ　ｕ ｃ ａ ｒ ｅ ｅ ｅ ｅ　表 序列 签 达 标Ｉｏｒｐｌ　－－ｈｏａａｔｐｒｎｓｄ ｓＰｏｙ Ｓ　 Ｔ ｉＧｌｃｏｙａｏ ｉｅ ＤＫａｎ ＬＲ ＮＢＳ ＮＢＴ ＰｃＲ ＰＩ异丙基硫代一Ｄ　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 －一半乳糖昔 ＤＫｎ ｙｉ ａａ ｃ ｍ ｎ Ｌｕｉ －ｉ Ｒ ｅｔ ｅ ｎ ｒｃ ｅ ａ ｃ ｅ ｈ　 ｐＮｃｅｔｄ Ｂｎｉ Ｓｔ ｕｌｏｉ ｉ ｎ ｉ ｅ　 ｄ ｇ　 ｅＮｔｏｌｅ　 ｒａｌｕ ｉ Ｂｕ Ｔｔａｏｉ ｒ ｅ ｍ Ｐｏｐａｉｙｉｏｉ ｌ ｈｓｈｔｄｌｎｓｔ ｏ卡那 素 霉 富 酸重 序列 亮氨 复核昔酸结合位点氮蓝四陛 磷脂酞肌醇Ｐｌ ｅ ｓ Ｃａ Ｒ ｃｉ 聚合 链式 应 ｏ ｍｒ ｅ　 ｉ ｅ ｔ ｎ ｙ ａ ｈ ｎ　 ｏ ａ 酶 反８ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山东大学硕士学位论文Ｐ了 上Ｄ Ｊ了 土 ｝ＫＰｏｐａｉｙｉ ｉｏ ｋｎｓ 　　 ｈｔｄｌｎｓｔｌ　 ａｅ ｈｓ ｏ ｉＰｏｐｏｉａｅ　 　　 ｈｌｐｓ Ｃ ｈｓ磷脂酞肌醇激酶磷脂酶 ＣＰｎ乙， ＬＰｏｐａｉ ｉ ｓｔ 　ｓ ｔ ｅ磷脂酞肌醇合成酶 　　 ｈｔｄｌ ｏｉ ｌ　 ｎｈｓ ｈｓ ｙｎ ｏ ｙ ａ「七ＰＲＣ ＡＥＲｐ Ａ ｌｆｃｔｏ ｏ ＤＡ　 ｓ 　　 ｄ　ｐ ｉｉａ ｉｎ　 ｃＮ Ｅｄ ａｉ ｍ ｆ　 ｎｃＮ 末端快速扩增 　　　　　　　　　　　　　　　　 ＤＡＲ－Ｃ ＣＰＲＲｐ Ｃ ｎｎ ｏ ｕ ｌｌｎｔ ｃ Ａ ｂ ｃ ｅｎｎ 　　ｄ　ｏ ｉｇ　 ｆ ｌ－ｅｇｈ　 Ｎ ｓ　 ｓｒｅ ｉｇ ａｉ ｌ ｆ　 Ｄ ｙ　 ｐ ｏ ｏ ＤＡ　 Ｃ 　　 ｓ　 ｃＮ ｂ ＰＲ ｏ ｌ ｆ　 ｙ　ＰＲ 　　　　　　　　　　 Ｃ 法从ｃＮ 文库中快速克隆 ｃＮ 全长片段 ＤＡ ＤＡＲＬ ＦＰＲ ｓ ｉｔｏ Ｆ ｇｅｔ　 ｇｈ　 ｙｏｐ ｉｍ 　　ｒｃ ｉｎ　ａｍ ｎ Ｌｎ ｔ Ｐ ｌｍ ｒｈ ｓ ｅｔ ｒ ｅ ｏ限制性片段长度多态性 　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＲＡ ＧｓＲｓｓ ｎ ｅ Ａ ｏ 　　ｔ ｃ Ｇ ｅ　ｌ ｓ ｅｉ ａ ｅ　 ｎ ｇ ｎ ａＤｓａｅ　 ｉｔｎｅ　 ｅ ｉｅｓ Ｒｓｓａｃ Ｇｎ ｅ ｅ抗病 类似序列 基因抗病基因Ｒ 基因ＳＡＴ ＭＲＴ ｅ　 ｔｈｎ Ｍｃａ ｉｍ　 ＇　 ｄ　 Ｎ Ｔ ｐ ｅｅ 　　Ｓ ｉｃ ｉｇ　 ｈｎ ｓ Ａ ５ ｎ ｏ ＲＡ　ｍ ｌｔｓ ｈ ｗ ｅ ｔ　 　ｅ ｆ　 ｅＲＡ ＇端模板转换机制 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ＮＳＳＨ ＳＳ ｐｒ ｓｉｎ　 ｂｒ ｃ ｉｅ　 ｂ ｉｉａ ｉｎ ｕｐｅｓｏ Ｓ ｔａ ｔｖ Ｈ ｒｄ ｚ ｔｏ ｕ ｙ抑制性减法杂交 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＳＫ ＴＳｒｎ－ ｈｅｎｎ ｐｏｅｎ　 ｎｓ ｄｍ ｉ ｅ ｉｅｔｒ ｏ ｉｅ　 ｔ ｉ ｋ ａ ｅ　 ａ ｎ ｒ ｉ ｏ丝氨酸／ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 苏氨酸蛋白 激酶结构域Ｔ ｔ ｅ Ｔｉ ｒ ｓＴｔ ｃｃｉ ｅ ａ ｌｅ ｒｙ ｎ四 环素Ｔｉ（ ｄｏｙｅｈｌ ａｉｏｅｈｎ ｒｓｈ ｒｘｍｔｙ）　 ｎｍｔａｅ ｙ ｍ三（ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 轻甲基）氨基甲 烷Ｔｉ Ｃ ｒ ｓ　ｌＴｉ ｈｄｏｈｏｉｅ　 ｒｓ　 ｒｃｌｒｄ　　　　　　　 ｙ Ｔｉ ｒｓ盐酸盐５ｂ ｏｏ４ ｃ ｌｒ－－ｎｏｙ－　 Ｄｇ ｌｃｏ ｉｅ －ｒｍ－－ｈ ｏｏ３ ｉｄ ｌｌ ０　－ａａ ｔｓｄ －Ｘｇ ｌ －ａ５澳－ 氛－３ ５ －　　 　　　　　　　　　　　　 － ４ －ｕａ ０ Ｄ ＇ Ｉ Ａ －一半乳糖奋ＹＣ ＡＹａｔ　 ｉｉｉｌ　 ｏｏｏｅ ｅｓ Ａｔｆｃａ Ｃｒｍｓｍ ｒ ｈ酵母人２染色体山东大学硕士学位论文１前言１１ ． 基因克隆的策略 在基因结构和功能研究中， 　　　　 通常需要将目 的基因分离出来， 在体外或 体内 进行详细的分析研究，这种从生物有机体中克隆某一特定 ＤＡ片断 Ｎ （ 或基因）的实验程序，总称为基因克隆的实验方案或策略。 目 　　　　 前己经发展出了 好几种诸如 ｃＮ 克隆和基因组 ＤＡ ＤＡ Ｎ 克隆等不同的基因克隆策略。 这些策略各有不同的优缺点， 适用于不同的实验材料和研究目的。 同时还有若干因素， 包括待克隆的ＤＡ Ｎ 分子的特性， 拟将采用的 重组体 ＤＡ Ｎ 分子的筛选与检测方法等， 都会影响到基因克隆的效率。 因此在正式开始实验之前，正确地选择一种适宜的克隆方案无疑是十分重要的。１１１ ．　功能互补法基因克隆［ ．　 ｑ 功能互补法基因克隆技术， 　　　　 可以认为是经典的微生物学方法的一种直接的扩展与延伸。 如果被克隆的ＤＡ Ｎ 片断， 同重组体ＤＡ Ｎ 分子寄主细胞的 染色体ＤＡ Ｎ 是同源的， 那么使用功能互补进行基因克隆， 将是一种十分有 效的方法。 它的一种最简单的方式是将一组含有大肠杆菌基因组全部ＤＡ Ｎ 序列结构的重组体ＤＡ Ｎ 分子的异质群体， 导入一种大肠杆菌营养缺陷型菌株的感受态细胞。 然后将此受体细胞涂布在一种缺少该菌株所需要营养物质的基本培养基上。 因此， 只有那些获得了营养缺陷型互补基因的受体细胞才会长成转化子菌落。１ ６ ｌ 和Ｃｒｏ［ 　　　　ａｋ ａｂｎ　 Ａ ｄ 加尾技术， ９ 年Ｃ ｒ ７ ２ ， 应用ｄ：　 Ｔ 将大肠杆菌ＤＡ Ｎ的随机片断克隆到 Ｃｌｌ ｏＥ 质粒上， 构成了基因组文库， 成功地分离到若干种 细菌的操纵子。 对于难以转化的菌株， 他们又发展出了另一种方法， 即首 先用重组的质粒群体转化含有 Ｆ 质粒的大肠杆菌， 这样， 转入宿主细胞的 重组质粒， 便通过以Ｆ 质粒为媒介的转移作用， 导入众多的Ｆ 一的营养缺山东大学硕士学位论文陷型菌株细胞。 采用这种方法， 有可能从同一基因组文库中分离出多个不同的基因。真核基因和原核基因在结构上存在着很大的差别。 　　　　 只有细菌的染色体 基因和其它少数低等生物 （ 如酵母） 的基因， 才能够同大肠杆菌的营养缺陷型互补，从而运用这种方法进行基因的克隆。１１２ ．　基因组ＤＡ ． Ｎ 克隆 基因组 Ｄ 克隆的出发材料是基因组ＤＡ 如果实验的目的是为了 　　　　Ａ Ｎ Ｎ， 在真核生物中表达外源的真核基因，或者是为弄清楚在不同的发育阶段中ｍＮ 的序列结构及不同来源的组织特异的ｍＮ 的序列结构， ＲＡ ＲＡ 选择基因组 文库更为合适。基因组文库避免了从某个组织或某个发育阶段构建的ｃＮ ＤＡ基因文库在使用上的局限性。高等真核生物染色体基因组文库， 　　　　 通常是用 入 噬菌体或柯斯质粒作载体构建。后者虽然比前者可以承受更大分子量的外源 ＤＡ Ｎ 片段的插入， 但是用菌落杂交法筛选柯斯质粒重组体的基因组文库， 与用噬菌斑杂交法筛选人 噬菌体重组体的 基因组文库相比， 其结果清晰度差。 另一方面， 用含柯斯质粒的细菌贮存基因组文库时， 细菌的成活率会下降。 这两个方面的原因降低了柯斯质粒的实用效果。 基因组克隆的大体步骤是： 首先用内切 酶将高分子量的染色体ＤＡ Ｎ 部分消化， 然后与选择的合适载体如ａ 噬菌体 载体进行连接， 将重组体包装成人 噬菌体颗粒， 用后者感染宿主细胞建立基因组文库， 最后以人工合成的寡核昔酸或同源性片段为探针筛选目的基 因克隆，也可利用所制备的抗体通过放射免疫筛选分离目的基因克隆。１１３　 Ａ ．　 ｃＮ 基因克隆 ．　 Ｄ 真核生物基因组ＤＡ 　　　　 Ｎ 十分庞大， 而且含有大量的重复序列。 因此无论 是采用电泳分离的技术还是通过杂交的方法， 都是难以直接分离到目 的基 因片断。 这是以染色体ＤＡ Ｎ 为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难山东大学硕士学位论 文所在， 为解决这个问题， 我们可以通过由ｍＮ 反转录产生的ｃＮ 进行克 ＲＡ ＤＡ隆。 尽管高等生物一般具有几万个左右不同的 基因， 由于基因的选择性差 异表达，使在一定时间阶段的单个细胞或个体中，都仅有 ２％ ５ 左右的基因得以表达，产生出约 １００种不同的 ｍＮ ５０ ＲＡ分子．可见由 ｍＮ ＲＡ出发的ｃＮ 克隆，其复杂程度要比 ＤＡ 直接从基因组克隆简单的多。ｃＮ 克隆 的基本过程是通过 一系列 的酶促 反应 ，使 总的 　　　　　　 ＤＡ ｐｌ（ ｍＮ 转变成双链 ｃＮ 群体， ｏｙＡ ＲＡ ） ＤＡ 进而将此 ｃＮ 导入原核载体。 ＤＡ 这一流程，已成为当今研究真核分子生物学的基本手段。１１３１ＤＡ ．　 ｃＮ 文库的构建〔 ．　 ．　 ３ １ （ １ ）构建 。Ｎ ＤＡ文库的第一步是分离细胞总 ＲＡ Ｎ，然后从中纯化出主要含ｍＮ 的部分。 ＲＡ 真核生物 ｍＮ 分子的３ 末端的ｐｌ （ 尾巴，为从细胞 ＲＡ ’一 ｏｙ　 Ａ ）总ＲＡ Ｎ 中纯化 ｍＮ 提供了方便的途径。 ＲＡ（ ２ ）用ｏｉｏｄ） ｌｇ （ 引导的ｃＮ 合成法或随机引 Ｔ ＤＡ 物引导的ｃＮ 合成法合成 ＤＡ第一链 ｃＮ． ＤＡ（ ３ ）用自 我引导合成法或ＲＡｓ Ｎａｅ 酶降 Ｈ 解取代法合成第二链ｃＮ． ＤＡ（ ４ ）将合成的双链 ｃＮ 重组到质粒载体或噬菌体载体上，导入大肠杆菌 ＤＡ细胞扩增，得到所需的ｃＮ 文库。 ＤＡ １１３２　 Ａ ．．． ｃＮ 文库的筛选方法和探针制备 Ｄ（ １ ）目前，从 ｃＮ 文库筛选目的基因的方法主要是基于核酸相互杂交分 ＤＡ 离目的基因。根据核酸杂交原理，利用核酸探针检测 ｃＮ 文库中目的基 ＤＡ因的表达序列， 是获得细胞中某种表达基因全长序列的一种最为有意义和 可靠的实验技术． 若己知细胞中存在着某个未被克隆的重要功能基因， 这 一筛选方法能够迅速地从这些细胞构建出的ｃＮ 文库中分离出这一基因 ＤＡ表达的全部序列，从而能够对该基因的结构和生物学功能进行深入的研究，使用这种方法必须要有适合的核酸探针，探针的来源途径有：山 东大学硕士学位论文Ｉ 同源探针：同 　　　　 ． 源探针核昔酸序列与待分离目 的基因的一部分序列完全相同，因此， 在筛选时， 能够使杂交反应在最严谨的条件下进行， 增加阳性结果的可靠性。 同源探针的主要来源是已经克隆的部分 ｃＮ 序列， ＤＡ目前可获得最有价值同源探针的技术有 ａ 、表达基因的差异显示技术（ ｆｅｅｔａ ｄｓｌｙ　 ｅｓ ｔａｓｒｐｉｎ　 ，　 ＴＰＲ ＂ ｄ ｆｒｎｉｌ　 ｐａ ｒｖｒｅ　 ｎｃｉｔｏ ＰＲ ＤＲ－Ｃ）　 ｉ ｉ ｅ ｒ Ｃ Ｄ ＇ ，这是 一种极为灵敏地反映出不同状态下两种细胞内部表达基因差异的技术。 利用这一方法显示出的差异表达基因片段设计同源探针， 已成功地克 隆到数以百计的调控基因，在新基因的发现上发挥出了较大的作用。 ｂ ， 利用种属间基因同源性，从ＥＴｅｐｅｓｄ　 ｕｎｅ　 ） Ｓ （ ｒｓｅ ｓｑｅｃ ｔｇ数据库搜寻同 ｘ ｅ ａ 源探针，在自 然界中从低等生物到高等生物都存在许多进化保守的基因，尤其是一些具有重要生物学功能的基因， 如参与个体发育调控和细胞周期调控的基因以及参与重要信号传播途径的基因。 我们从模式植物中鉴定出 某种具有重要功能的基因后， 就可以 采用计算机进行序列同源性分析， 从 ＥＴ数据库中搜寻与其在核昔酸序列或氨基酸序列上有高同源性的其他 Ｓ生物的ＥＴ Ｓ 序列， 选用这些序列设计特异性同 源探针， 从这些ＥＴ Ｓ 表达细胞构建的 ｃＮ ＤＡ文库中筛选出完整的目的基因。人端粒酶催化亚基 ｃＮ ＤＡ克隆就是采用这一策略的一个成功范例〔 ， ， 。Ｉ． 简并性寡核昔酸探针：简并性寡核昔酸探针是根据目 　　　　 Ｉ 标蛋白 的一小段氨基酸 （ 个以 序列推导合成出的寡核昔酸片段，由于密码 ６ 上） 子的简并性问题，一段核昔酸序列往往具有多种可能的核昔酸编码序列，因此实际应用中的简并性探针是包含这些可能性序列的多种寡核昔酸片段混合物． 为了避免此方法造成的假阳性等问 可采用的策略是： 题， 尽可 能选择简并性程度低的肤段来设计探针；采用猜侧体探针来降低简并性。近两年来随着双向电 泳技术和质谱分析方法的结合， 使从蛋白 质到基因的研究策略在功能基因组学研究中发挥重要的作用．一升一升升一一升一些矍里掣些盆升１１ ｃ Ａ 针： 接采 从ｍ Ａ 板反 录 　　　　 探 直 用 Ｒ 模 转 并对ｃ Ａ 一 进 １　　Ｎ ．　 Ｄ Ｎ Ｄ 第 链 Ｎ行 记 作 筛 Ｄ 文 核 探 ， 两 类 。 种 总ｃ Ａ 标 ， 为 选ｃ Ａ 库的 酸 针 有 种 型 一 是 Ｄ 探 Ｎ Ｎ 针， 种探针只 筛选 胞中 丰 这 适合 细 高 度的ｃ Ａ ； 一 扣 Ｄ Ｄ 基因 另 种是 除ｃ Ａ Ｎ Ｎ 探 是利 法杂 过 富 某 类 细 特 达的ｍ Ａ 针， 用减 交的 程， 集出 种 型 胞中 异表 Ｒ， Ｎ以 分ｍ Ａ 模板反 录出 第 链ｃ Ａ 探 扣除ｃ Ａ 这部 Ｒ 作为 Ｎ 转 的 一 Ｄ 作为 针。 Ｎ Ｄ 探 Ｎ针适合于筛选细胞经某种 特殊处 前后发生差 达的 理 异表 基因， 如药物处理前后细胞内有差异表达的基因。（ ＤＡ ２ Ｎ 文库差示筛选法也是具有竞争力的筛选文库的 ）　 方法， 这一方法特 别适用于分离在特定组织中表达的基因、 在细胞周期特定阶段表达的基 因、 受生长因子调节的基因以 及在特定发育阶段表达的或是参与发育调节 的基因， 同时亦可有效地用来分离经特殊处理而诱发表达的基因。 如对于 两种不同的组织细胞，先提取它 们的 ｐｌ（ ＋ＲＡ ｏｙＡ ｍＮ，分别构建这两 ） 种组织的ｃＮ 文库， ＤＡ 然后以 这些ｍＮ 为模板， ＲＡ 合成放射性标记的ｃＮ 探针， ＤＡ再用这两种探针分别与同一个 ｃ Ａ Ｄ 文库的两套重复考贝杂交，与两种探 Ｎ 针都杂交的克隆是两种组织细胞中 都表达的基因， 而仅与一种探针杂交的克隆则是在一种组织细胞中特异表达的基因， 再对这样的克隆进行测序比较和鉴定， 就可分离到这种组织特异表达的基因。 用这种方法已 分离到许多根茎叶和生殖器官等特异表达的基因。 （ ＰＲ法从 ｃＮ ３ Ｃ ）　 ＤＡ文库中快速克隆 ｃＮ ＤＡ片段 （ａ ｉ　　　　　ｏ Ｒｐｄ　ｌｎｎ ｆ ｃｏｉｇ　ｆｌ ｌ ｇｈ　 Ａ ｂ ｓ ｅ ｉ ｐｏｓ　ｃ Ａ　 ＰＲ Ｒ－Ｃ）　 ｕｌ ｅ ｔ ｃ ｓ　 ｃ ｅ ｎ ｏｌ ｏ Ｄ ｂ Ｃ，　 ＰＲ ＂ －ｎ Ｄ Ｎ ｙ　 ｎ ｇ　 ｒ ｆ　 ｙ　 Ｃ Ｎ ＇ ，在 ＰＲ Ｃ 法问世之前， 筛选噬菌体文库的方法主要是用标记的ＤＡ Ｎ 或寡核昔酸探针进行噬菌斑的原位杂交，但是这种杂交方法对检测低丰度的 ｍＮ ＲＡ 不敏感且假阳性高。近来，以ＰＲ Ｃ 法为基础的筛库方法已被成功地运用：Ｔｋｍ＂ ａｕｉ＇ Ｒ－Ｃ 方法从小鼠 等用 ＣＰＲ 脑垂体肿瘤细胞 Ｇ３ＤＡ ＨｃＮ 文库中分离到了转化生长因子 ８ 受体的全长 ｃＮ 序列。这种方法弥补了用放射性标记 ＤＡ山东大学硕士学位论文的Ｄ 或 核 酸 针 选ｃ Ａ 库 不 之 且 质 及 菌 文 Ｎ 寡 昔 探 筛 Ｄ文 的 足 处 对 粒 噬 体 库 Ａ Ｎ都适合［［ ａ１ ，３ 一１１１３３　ＤＡ ．．．　ｃＮ 克隆优越性（ ｃ Ａ 隆以ｍＮ为 料， 对于 些Ｒ 病 例如 病毒 １Ｄ 克 ）　 Ｎ Ｒ 材 这 有 Ｎ 毒， 流感 和呼 Ａ Ａ肠孤病毒来说是特别的适用。 因为它们的 增殖并不经过ＤＡ Ｎ 中间体。 所以 研究这样的生物有机体， ＤＡ ｃＮ 克隆就成为唯一可行的方法。（ ＤＡ 文库的 ２ Ｎ 基因 ）　 筛选比 较简单易 一 全的ｃ Ａ 行。 个完 Ｄ 基因文库所含 Ｎ的 隆 要比 个完 基因 库 含的 数 克 数， 一 整的 组文 所 克隆 少的多。 型的 核 典 真生物细胞在某一特定的发育阶段约有 １ ０ 到３００ ０ ０ ００ 个不同种的ｍＮ 序 ０ ＲＡ 列， 而标准的真核基因组ＤＡ则足以 Ｎ， 形成 １ 到 １ 个其大小适于基因组 ０ ０ ５ ‘ 克隆的ＤＡ Ｎ 片断， 两者相差 １－１ 倍． ０ ０ ０ 一般来说， 在基因文库中， 某种 特定克隆的存在频率是与其相应的ｍＮ 丰度成正比的。因此恰当地选择 ＲＡｍＮ 的来源， ＲＡ 就有可能使所构建的ｃＮ 基因文库中， ＤＡ 某一特定序列的克隆达到很高的比例。从一些特定的组织如产蛋鸡的输卵管所制备的 ｃＮ ＤＡ 基因文库， 卵清蛋白 基因序列占明显的 优势。 这样便大大地简化了筛选特定序列克隆的工作量。这是基因组克隆所不具备的优点。 （ ３ ）由于每一种 ｃＮ 克隆都含有一种ｍＮ 序列， ＤＡ ＲＡ 这样在选择中出现假阳性的几率就比较低。（ ＤＡ ４ Ｎ 克隆除了具备前述的优点外，还具有其自 ）　 身的特殊用途。这包括 两个方面， 即克隆的基因可在细菌中表达和作基因序列结构的测定。 目前，尚无证据表明在原核生物基因中也存在着内含子的现象。 由此推断， 在细 菌细胞中是不太可能存在着能够从真核基因转录本上移去内含子序列的酶蛋白分子。 因此， 在细菌细胞中表达真核外源ＤＡ Ｎ 序列的所有成功的 例子都是使用 ｃＮ ＤＡ克隆。在基因序列结构的测定方面，尽管核酸杂交分析能够测定出基因组克隆中基因内含子序列的位置， 然而更精确的结果， 则￣￣一升￣一升升一坚竺里掣夔头一要 过比 基 组 同 Ｒ 转 本 核 酸 列 构 的 异 能 通 较 因 基因 其ｍ Ａ 录 在 普 序 结 上 差 才 Ｎ 确 一 而 测定ｍ Ａ 列 构 最 单 方 是， 定 定。 般 论， Ｒ 序 结 的 简 的 法 测 它的ｃ Ａ Ｎ Ｄ Ｎ 拷贝 列。 此， Ｄ 隆 以 效 分 断 的 构。 知 序 因 ｃ Ａ克 可 有 地 析间 基因 结 在己 基 Ｎ 因 Ｎ序 情 下， 过 Ｄ 比 还 研 内 和 显 组Ｄ 列的 况 通 同。 Ａ 较， 可以 究出 含子 外 Ａ Ｎ子的界线。１１４ ．． 基因图位克隆（ ｐ ａｅ　ｃｏｉｇ Ｍ －ｂｓｄ　 ｎｎ） ａ ｌ基因的图 　　　　 位克隆技术是 先由 桥大学的Ｃｕｓ ０ 的一 首 剑 ｏｌ　ｓ ｏ］ ｎ 提出 种新的 克 技 是 分离 编 产 不 道的目 基因 一 有 基因 隆 术， 用于 其 码 物尚 知 的 的 种 效方法． 该方法是利用分子标记将目 标基因精确定位在染色体的特定位置之后， 标 两侧紧 连 标 筛 含 大的 入 用目 基因 密 锁的 记 选 有 插 片断的 组文 基因 库（ Ｃ Ａ） 通过染色体步 （ ｒｍｓ ｅ　ｋ ｇ 法逐步靠近目 　　或ＹＣ， Ｂ Ａ 行 ｃ ｏ ｏ ｗｌｉ ） ｈ ｏｍ ａ ｎ 的 基因； 若标记与目 基因间 距离小 库中 的 的 于文 平均插入片段的大小， 可 就以 直接筛选到含有目 标基因的 克隆， 然后通过遗传转化试验证实目的 基因的 能 功 。自１ ２ 位 隆 术 先 用 拟南 上 功 离 Ａ１ ｀ ９ 年图 克 技 首 应 在 芥 成 分 Ｂ ０ ９ ３１基因 Ａ ＂ 和Ｔ Ｗ＂基因以 来，己 十 有数 个植物基因 用此技术 成功克隆。 着 随各种植物的高密度遗传图 谱和物理图 谱的相继构建成功， 位克隆技术在 图 植物的基因克隆中已 被广泛的 应用并己 成为分离基因的常规方法。 但是就目 而言， 前 该技术还是主要应用 于基因 组较小 且有高 度分子 连锁图 密 标记的 拟南芥、 番茄、 水稻等模式植物上， 对于像小麦、 玉米等具有大型染色体组的粮食作物仍然是十分艰难的工作。１１ ．　 ． ５基因 标签法克隆 〔 基因ｉ ）该方法包括转座子标签法和 ＴＤＡ标签法，原理是利用转座子或 　　　　 －ＮＴＤＡ － 插入植物的 Ｎ 基因组中引 一 起某 基因失 活产生 一些突变体， 然后用相应转座子或 ＴＤＡ对突变体文库进行筛选，以 －Ｎ 选到的阳性克隆片段为探 针， 再筛选野生型植物基因文库以 分离目 的基因． 如将一株携带有功能的一一升升升一一升尘里掣鳖翌选一升转 子 统 植 与 一 在 传 有 异 同 植 杂 ，杂 后 座 系 的 物 另 株 遗 上 差 的 种 物 交在 交 代中 择由 转 子 入 某 特 基 序 中 致 型 变的 变 体 选 于 座 插 到 一 定 因 列 导 表 改 突 个 ， 用 纯 突 株构 基因 库， 后 克 的 座 作 针， 该 库 该 合 变 建 文 然 用己 隆 转 子 探 从 文 中 选出 有同 转座 筛 带 源 子的目 基因。 着再以 基因 为 的 接 该 片断 探针， 从正 常的 性基因 亲本中 隆出 应的 列。 座子 签法主 用于 在 显 纯系 克 相 序 转 标 要 存内 性 座子的 种 如 米、 鱼草 而ＴＤ 标 源活 转 植物 类， 玉 金 等； － Ａ 签法在 式 Ｎ 模植物拟南芥中已被成功地运用。１１６生物信息学方法克隆基因 ．．随着人类及一些模式生物基因 　　　　 组计划的进行， 己克隆和测序的基因越 来越多， 生物数据库容量的增长使生物信息分析技术日 臻完善， 为基因克 隆开 创了 广阔的前景。 生物信息学用于克隆基因的技术称为电子克隆。 从 部分序列得到全长的ｃＮ 的分子生物学实验方法通常有杂交筛选文库或 ＤＡ５ 末端延伸法，电子克隆不采用传统的单一分子生物学实验方法，而是 ’ 综合多种 ＤＡ Ｎ 序列分析技术，由一个查询序列开始，即以部分 ｃＮ 为起 ＤＡ始， ｅｅａｋ Ｓ数据库ＥＴｂ 和Ｇｎｂｎ 的ＥＴ Ｓｄ进行ＢＡＴ ＬＳ 检索， 得到与５ 端或３ ’ ＇ 端有相似序列的ＥＴ 然后以 Ｓ 为模板， Ｓ， 该ＥＴ 进一步搜索ＥＴ Ｓ 数据库， 一 直往前延伸， 直到找到终止密码子，得到全长的 ｃＮ。 ＤＡ 该方法依赖于足够的 端重 并且 够 延 末 叠 能 往前 伸的Ｅ 序 赵贵军｝ 方 得了 Ｓ 列。 Ｔ 〔 ９ ］ 用该 法获 一种新的蛋白激酶 Ａ 锚定蛋白 基因一ＡＡ 基因。 ＫＰ １２植物抗病基因克隆的进展 ．病害是影响作物高产稳产的重要因素之一 植物抗病基因 （ ｌｎ 　　　　 ｐａｔｄｓａｅ　 ｉｔｎｅ　 ｅ 简称 Ｒ基因） ｉｅｓ ｒｓｓａｃ ｇｎ ， ｅ ｅ 的克隆是抗病分子生物学研究和抗病育种的基础， 不仅对于揭示抗病分子机制， 实施农作物基因工程高 效育种具有重要意义， 而且对于了 解植物抗病的信号传递途径及转换系统也具有重要意义． 因此， 植物抗病基因的分离克隆目 前己成为国内外研究山东大学硕士学位论文的热点。 近年来随着植物病理学与分子生物学的交叉渗透及生物技术的深 入发展与广泛运用，植物抗病基因分离克隆的研究取得了很大的进展。Ｆｏ（ 于 ９７年根据亚麻对锈菌小种特异抗性的研究提出了了 　　　　 １４ ｌ ｚ ｒ０ １ 基 因对基因假说 （ｅｅ　 ｇｎ ｈｐｔｅｉ） 这一假说构成了 ｇｎ ｆｒ　 ｅ　 ｏｈｓｓ， ｏ ｅ ｙ 现在克隆病源无毒基因和植物抗病基因的理论基础。 该假说认为： 寄主植物有抗病基因和感病基因的区别， 病原有带无毒基因和有毒基因的区别， 只有当带有无毒基因的病原侵染带抗病基因的植物，植物才表现抗性。自１９ 年 ９２Ｊｈｌ Ｂｉ ｓ　 ｏ 和 ｒｇ ［ ａ ｇ＝ ｎ 通过转座子标签法克隆了 个 第一 抗病基因 （ 基因） Ｒ ，玉米抗圆斑病基因 ＨＩ Ｍ ，迄今已 有近 ３ 个 Ｒ ０ 基因被克隆，它们分别介导对植物病原真菌、 细菌、 病毒和线虫的抗性。 通过对己克隆的植物抗病基因的蛋白质序列分析表明，这些抗病基因所编码的蛋白质都存在同源序 列， 根据这些同源序列的结构特征可把 Ｒ 基因分为 ４ 第一类含富亮氨 类：酸重复序列 （ｅｃｎ－ｉｈ　ｅｔＬＲ 和核昔酸结合位点 （ｕｌｏｉｅ ｌｕｉｅｒｃ ｒｐａ，　） ｅ Ｒ ｎｃｅｔｄｂｎｉ ｓｔ，　）　９ 第二类仅仅含有富 ｉ ｎ ｉ ＮＳ　２１ ｄ ｇ　ｅ Ｂ ［ｚ ２； － 亮氨酸重复序列而无核昔酸 结合位点〔［；第三类含有亮氨酸重复区 ａ３ ｎｑ ｄ　 和一个丝氨酸／ 苏氨酸蛋白 激酶结构域 （ｓｒｎ－ｈｅｎｎ ｐｏｅｎ　 ａｅ　 ａｎ ＳＫ 无核普酸结 ｅｉｅｔｒｏｉｅ　 ｔｉ ｋｎｓ ｄｍｉ，　 ） ｒ ｉ ｏ Ｔ合位点〔： ３ 最后一类含有蛋白 ２ １ 激酶结构域而没有亮氨酸重复序列或核昔酸结合 位点〔． ３ 这些结果揭示， 源 ３ １ 同 序列可能 存在于大多 植 数的 物抗病基因家族中。 因此用同源序列分离克隆基因和寻找新的抗病基因可能是一条经济、快捷的途径。目前，Ｒ 基因的克隆方法有 （ １ ）图位克隆， 该方法如前所述． 已克隆的Ｒ 基因中大部分是通过该方法获得的，如番茄的 Ｐｏ３ Ｃ－［ 、Ｃ－［，　 ５６ ｔ［，　 ２＇ ｆ４４ Ｃ－１等基因、拟南芥 ３ ｆ ３ １ １ ３ ｆ ３ １ ，Ｒ ２］ ，　５１Ｒ Ｉ１Ｒ １１Ｒ ５１Ｒ ８ ，基因 水 抗白 Ｐ （２ Ｒ ［，　 ［，　 ［，　 ［ Ｐ ［ Ｓ ２３ Ｐ ＂ Ｐ ２ Ｐ ３ Ｐ ３ Ｐ＇ ２１ Ｓ （ Ｍ５ Ｐ＇ Ｐ＇ ，　 ＇ 等 、 稻叶枯病基因Ｘ２［，　 ［、 ３１ １ Ｘｌ ］ 抗瘟病基因Ｐ－ ＂． ３ ａｕ ３ ｉ　 ＂ ｂ（ ２ ）转座子标签法， 其基本原理如前所述。目 前为止至少有 ７ Ｒ 个 基因是一升升升升升升￣ ｝望里型； ｕ ｒ ｝ ｝ 级用 策 克 到 ， 玉 的Ｈ 基 「 烟 花 病 基 ＋ 番 该 略 隆 的 如 米 Ｍ 因２ 草 叶 毒 因Ｎ１ 茄 Ｉ １ ］ 、 ， 、 的 叶 病 抗 霉 基因Ｃ ＂、 麻 锈 基因Ｌ｀ 玉 抗 病 ｆ ０亚 抗 病 ９＇ ６］ 米 锈 基因Ｒｌ ＂ ６ ２ 和 ｐ Ｄ＂ －等。 但是由 于一些植物很难获得转座子突变体， 从而不能运用该方法克隆其抗病基因。（ ３ ）基于同源序列的候选基因法 （ｏｏｏｙｂｓｄ　ｎｉａｅ　 ｅ ｈｍｌｇ－ａｅ ｃ ｄｄｔ ｇｎ ａ ｅｍｔｏ） 己 ｅｈｄ ， 克隆的Ｒ 大多都具有保守 基因 序列，如富亮氨酸重复序列（ ｕ ｉｅｒｃ ｒｐａ ，Ｒ）核昔酸结合位点（ｕｌｏ ｉｅ　 ｄｎ ｓｔ， ｌ ｃｎ－ｉｈ　 ｅｔ ＬＲ、 ｅ ｅ ｎｃｅｔｄ ｂｎｉｇ　 ｅ ｉ ｉＮＳ 、蛋白激酶结构域 （ｓｒｎ－ ｈｅｎｎ ｐｏｅ ｎ　 ｎ ｓ ｄｍ ｉ ， Ｂ） ｅ ｉｅｔｒ ｏ ｉｅ　 ｔ ｉ ｋ ａｅ　 ａ ｎ ｒ ｉ ｏＳＫ Ｔ ）等。这一特点为克隆 Ｒ 基因开创了一条新思路，即同源序列的候选基因法。 最早是 Ｅｉｓ２ ｌ　４ ｓ（ １ 利用此法克隆了 亚麻中抗锈病的Ｍ 基因家族。目 前已 成功地从多 种单子叶、 双子叶植物中分离了 抗病基因。如Ｙ 等Ｌ根 ｕ ９ ３ ）据烟草 Ｎ 和拟南芥 ＲＳ 基因的ＮＳ Ｐ２ Ｂ 区同源序列设计简并引物，从大豆中 扩增并克隆出 １ 类含 ＮＳ １ Ｂ 序列的片段，其中 ５ 个定位于己知大豆抗病基因Ｒｖ 和Ｒｖ Ｒｓ，　 ，　 以 ｒｄ 近。ｅｉｌｔ “（９７ ｓｌ ｐ，　ｌ ｐ２Ｒｓ 及 ｍ 的附 Ｆｕｌｅ 等〔 １ ） ｐ Ｒｓ ｐ３ ， ９利用丝氨酸／ 苏氨酸蛋白激酶中 ２ 个保守结构域设计的简并引物，以小麦叶片 ＲＡ为材料反转录成 ｃＮ ，然后 Ｐ Ｒ Ｎ ＤＡ Ｃ 扩增该 ｃＮ ，克隆了一个具有 ＤＡ丝氨酸／ 苏氨酸蛋白激酶特征的片段 （ｐ５ ） ｗｋ６，采用近等位系进行 ＲＬ ＦＰ 分析， 将该片段定位到小麦叶锈基因Ｌ１ 位点上， ｒ０ 被认为是 Ｌ１ 的候选 ｒ０基因。 ｏｌｎ 等（利用己 Ｂ－ Ｒ 抗性蛋白 Ｂ 区保守 Ｃｌｉｓ ４ ５ １ 知ＮＳ ＬＲ 的ＮＳ 序列设计引物，从玉米中扩增并克隆到 １ 类片段 （工ｌ－ＰＣ １，经序列分析， １ ＰＣ ｌ Ｉ２ ）它们与己克隆的抗病基因蛋白的保守序列ＮＳＬＲ Ｂ－Ｒ 及数据库中其它的抗病基因同源序列 （Ｇｓ 在氨基酸水平上有高度的同源性。 ＲＡ ） 用这些序列作 为探针， 进行了ＲＬ 作图、 ＦＰ 分析， 发现 ＰＣ０ ＰＣ３ 工２，　 １ 分别与抗锈病基因 工ｒｌ ｒ３ ｐ，　 共分离，因此把 ＰＣ０ ＰＣ３ ｐ Ｉ２，　 １ 定为玉米抗锈病基因ｒｌ ｒ３ Ｉ ｐ，　 ｐ 的候选基因。 另外在大麦、 Ｌｉｔｒ　） 水稻 （ｅｓｅ Ｗ ， ａｏ＇， （ｅｓｅ ＂ 、 ０ ｌ Ｌｉｔｒ　 Ｍｇｕ） ｊ　山东大学硕士学位论文番茄（ ｍｒ　ｒ、 Ｏ ｏｉ　３ 拟南芥 （ａｔ＂） ｈ ｔ＂ ）　 Ａｒｓ 、生菜 （ｈｎ ｃ中 ＇　 Ｓｅ）　 都有类似的 ｝ ， 报道。目 在 前 美国的国 基因 心 （ ｔ ｎｌ　ｔ ｆ Ｇｎ ｅ 际 组中 Ｎ ｉ ａ Ｃｎ ｅ　 ｅ ｍ ａｏ ｅｒ ｏ ｏ ｒ　Ｒｓｕｓｓ ＮＧ，　ｐ／ｗｗｎｇ．ｒ／ｅｅｒｈ） ｅｏｒｅ，　Ｒ ｈｔ： ｗ．ｃｒｏｇｒｓａｃ／ 收集并分析的来源 Ｃ ｔ ／于各种植物 ＮＳＬＲ Ｂ－Ｒ 抗病基因及相关序列达 ５４ 这一抗性基因序列数 ７ 个，据库的建立将很大程度上促进植物抗病基因的分离和鉴定〔 ５ ３ １（ ４ ）分离抗病基因的其他方法： 在真核生物基因组中得到表达基因的只有 ２ ％左右，所以从 ｍＮ 水平寻找抗病基因可大大简化分析背景，从而使 ５ ＲＡ目 标序列相对得到富集， 便于分离。 差异显示ＰＲ ｄｆｅｅｔａ ｄｓｌ Ｃ （ｉｆｒｎｉｌ　ｐａ ｉ ｙ ｒｖｒｅ　ｎｃｉｔｏ ＰＲＤＲ－Ｃ） 、 ｅｅｓ ｔａｓｒｐｉｎ　，ＤＴＰＲ（ 抑制性减法杂交（ ｐｒｓｉｎ ｒ Ｃ ＂ ｓ ｐｅｓｏ ｕ ｓｂｒｃｉｅ　 ｒｄｚｔｏ，Ｓ）＂ ｃＮ 代表性差异分析（ Ｎ ｕｔ ｔｖ ｈｂｉｉ ｉｎＳＨＥ，　 Ａ ａ ｙ ａ ５ Ｄ ｃＡ Ｄ ｒｐｅｅｔｔｖ ｄｆｅｅｔ ｌ　ｌｓｓｃＮ－Ａ）　 ｅｒｓｎａｉ ｉｆｒｎｉ ａａｙｉ，　 ＲＤｒ等技术的出 ｅ　 ａ ｎ ＤＡ ＂ 】 现，为该策略的实施提供了有力的工具。１３ ． 本工作的目的和意义本工作包括两部分：第一部分，利用本实验室已构建的玉米叶片 　　　　　　ｃＮ 文库，采用噬菌斑的原位杂交技术筛选该文库，为本实验室筛选玉 ＤＡ 米基因组 ＢＣ Ａ 文库做好了良 好的技术储备； 第二部分，根据已知的抗病 基因编码蛋白的保守序列设计简并引物， 以玉米基因组 ＤＡ Ｎ 为模板， 扩增 并克隆到抗病相关基因片段，为分离抗病基因打好基础。山 东大学硕士学位论文ｚ 材料、培养基和溶液２ １材料 ．２１１植物材料、文库及探针 ．．（）用于扩增抗病基因同源序列的玉米品种为优 良自 １ 交系遵 ９ １０ 它对 ０ １，危害玉米的几种病害一大斑病、 小斑病、 青枯病、 粗缩病等都具有良好的抗性。（ ２ ）本实验王栋同学利用 自 交系遵 ９ １０ ０ １ 构建了玉米叶片 ｃＮ 文库。合 ＤＡ成 ｃＮ ＤＡ第一链的方法为美国 ＣＯＴＣ ＬＮＥＨ公司发明的 ＳＡＴＳｉｃｉ ＭＲ （ ｔｈｎ ｗ ｇ Ｍｃａｉｍ　 ５ ｎ ｏ ＲＡ　 ｐａｅ） ｅｈｎｓ Ａ ＇　 ｄ　 Ｎ ｔ ｌｔｓ技术。 ｔ　 　ｅ ｆ　 ｅ ｍ 这一技术构建 ｃＮ 文 ＤＡ 库的主要优点［有：所需的 ＲＡ量极少； ５ ８ ］ Ｎ 全长的 。Ｎ ＤＡ和长片段的 ｃＮ ＤＡ 含量高； 没有 ｒＮ 污染； ＲＡ 能与ｃＮ 末端快速扩增 （ａｉ Ａｐｉｉａｉｎ ＤＡ Ｒｐｄ　ｌｆｃｔｏ ｍｏ ｃＮ Ｅｄ，　 ） ｆ　Ａ　 ｓＲＣ 连用； 表性好。 Ｄ ｎ ＡＥ 代（ ３ ）所用的探针为上海植生所薛红卫研究院馈赠的磷脂酞肌醇代谢途径中的酶基因片段 （ 水稻， 来自 碱基序列未知） 磷脂酶Ｃ　 Ｃ 基因片 ：即 （Ｌ） Ｐ段， 长度 ５０ｐ ０６，磷脂酞肌醇激酶 （ＩＫ 基因片段，长度 ７０ｐ 磷 ＰＰ） ０６，脂酞肌醇合成酶 （Ｉ）基因片段，长度 ９０ｐ ＰＳ ０６ 。另外还有山东师范大学张慧教授馈赠的大肠杆菌胆碱脱氢酶基因（ｅ　 长度 １ ５ｐ ｂｔ ， Ａ ） ５ ｂ 和拟南芥 ９ 中Ｎ＇ ＇　ｉｏｔ ａ Ｈａｔｐｒ 基因（ｔ Ｘ） ／ ｎ　 Ａ　 Ｉ　 Ｎ ，长度 １ Ｈ ． ｐ ６ ５ ２１ ．　 ． ２菌株及载体（ １ ）菌株为大肠杆菌 Ｘ１Ｂｕ．　 ５８ Ｄ５ ａ；构建文库的载体为 Ａ Ｌ－ｌｅ Ｂ２． 及 Ｈ－　 ＭＴｉｌｘ， 部包含质粒载体ｐｒｐＥ２（ ） 抗病基因克隆所用载 ｒｐＥ２其内 Ｔｉｌ ｘ 图１；ａ ｅ ｐＥ 一 Ｅ ｓ Ｖ ｃ ｏ ． Ｇ Ｍ Ｔ　 ｙ　 ｔ ｒ检测 ｃＮ 文库外源片段大小的引物序列为： ＤＡＰ ｉ ｅ Ｉ： ＇　 Ｔ Ｇ Ｇ Ａ Ｃ Ｃ Ｃ Ａ Ｔ Ｔ Ｔ Ｇ Ｔ　 ＇ ｒ ｍ ｒ　 ５　 Ｃ Ｃ Ｇ Ａ Ｇ Ｇ Ｇ Ｃ Ｔ Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ ３Ｐ ｉｅ １：＇　Ｔ ＣＡＴＡＴ ＴＧＧＧＡＴＧ Ｃ　 ｒｍ ｒＩ ５ ＡＡ ＧＣＣＣＡＡＧＣＡＴ ＧＣ ３ 　　　　　　 ＇：山东大学硕士学位论文孟 ｄｌ （ ３ ｉ ｐ 应　７ 幼沙 ｆ ４Ｍａ 　　　　 入ｌ ｌ 目４ 月的】 曲 ４ 乙导 ．Ｆ　 仔Ｐ　Ｕ 　　　　 ＩＯ Ｗｔ Ｋｂ ＡＬ －） －． 　　　　　　 臼口自己 　　　　 泊（４１ （ ） ３ＡＮ、 （６ ＼ ３） ｌｊ ０ ｗ ３１１ ） （５ １３．－ ｎ 　　％ ｐ ５Ｔ １ Ｕ－ 山竹 脚ｏｅ加ｒ ａｏ Ｒ ｏ 翎ｉｎ时ｎ ｌ ｕ用川．ｉ 目二 ｏ ｎ目ｏ ｔ ｆ目 ｎ 二 时 目； 加 口创 ｌ目ｍ１ 　　　　 构建文库的载体Ａ　ｐＥ２　 Ｔｉｌ ￥其内部包含的质粒载体ｐｒｐＥ２ ｒ ｘ ｃ Ｔｉｌｘ 图谱２１３ ．． 试剂盒、酶及尼龙膜标记探针的试剂盒及带正电 荷的 尼龙膜为 Ｂｅｒｎｅ ｏｈｉ ｒ公司生产： ｇ 连一升升一一一一一遨里塑里鳖选升一接 剂 为Ｐ ｍ ａ 司 产 Ｄ 片 玻 奶 收 剂 为 大 克 试 盒 ｒ ｅ 公 生 ：Ａ 段 璃 回 试 盒 博 泰 公 ｏｇ Ｎ 司 产； ａ酶， ｆＩ 切 Ｅ Ｒ　切 为Ｔ ａ 公 生 生 Ｔ ｑ Ｓ 内 酶， ｃ Ｉ 酶 ａ ｒ 司 产； ｉ　 ｏ 内 ｋａ２２ ． 培养基和溶液 ２ ２ １培养基 ．．（ Ｌ液体 基： ０ ／ １ Ｂ 培养 １克 升蛋白 ５ ／ 酵 取 ５ ／ Ｎ ｌ ）　 陈、 克 升 母提 物、 克 升 ａ Ｃ （ Ｌ Ｍ Ｏ 体培 ２ Ｂｇ； ）　 Ｓ 液 养基： ／ 每升 Ｌ 液 培 基中 Ｂ 体 养 加入 １ 毫 １ ＭＳ ０ 升 Ｍ　 Ｏ ９，溶液（ Ｌ／ｇ ； 体培 ３ ＢＭＳ 固 养基： ）　 Ｏ 每升Ｌ／ｇ ； 培养基中 ＢＭＳ 液体 Ｏ 加入 １ 克 ５ 琼脂 （ Ｌ／ｇ０ Ｍｌ ｓ 液体 ４ Ｂ Ｓ， ａｔ ｅ 培养基： ）　 Ｍ ／ ｏ 每升灭 菌的 Ｌ／ｇＯ Ｂ Ｓ 液体培养 Ｍ ， 基冷却至 ５＇以下，加入 １ 毫升 ２％ ａｔｓ 溶液 ０ Ｃ ０ ０　 ｌｏｅ Ｍ（ Ｌ／ｇ０上层软琼脂糖： ５ ＢＭＳ， ）　 每升 Ｌ／ｇＯ ＢＭＳ， 液体培养基中加入 ７２克琼 ．脂糖（ ＳＢ ６ Ｏ 培养基： ０ 升蛋白 ）　 ２ 克／ 陈、 克／ ５ 升酵母提取物、 ． 克／ ＮＣ， ０５ 升 ａｌｌｍ Ｍ ｃ ， ｏ ｍ　 ｌ ｇ（ ＳＣ ７ Ｏ 培养基：每升 ＳＢ ）　 Ｏ 培养基中加入 ２ｍ １ 的葡萄糖 ０１　 Ｍ２２２溶液 ．．（ ＩＸ Ｃ 缓冲液：５０Ｍ　１ ｌ０Ｍ　ｉ－ｌ　 ．　 ５Ｍ　 １ Ｏ ＰＲ ）　 ０ｍ Ｋ ，　 ｍ Ｔ ｓＣ （ ８３，１ｍ Ｍ Ｃ ０ ｒ ｐ ） Ｈ ２ ｌ Ｃ ｇ （ ２ ）四环素贮存液： １ｍ／ｌ ５ｇｍ： 卡那霉素贮存液：５ ｍ／ｌ 氯霉 ０　 ｍ； ｇ 素贮存液：３ ｍ／ｌ ４　 ｍ；氨节青霉素贮存液：５ｍ／ｌ ｇ ０ｇｍ（）　 ａ ３ ＩＸ　稀释缓冲液：．　 ａ ｌ　 Ｍ　 Ｏ Ｈ ０３Ｍ　 ｓＨ １ｐ７５ Ｏ １Ｏ ＮＣ ０ １ ＭＳ， ， ．　 Ｔ ｉ－Ｃ （ ．　 Ｍ　 ．　 ｇ ７ ０　 ５ ｒ Ｈ ） （ １　 稀释缓冲液： 每升含有 ｌ０ｌ　 ｘ　 ４ Ｘ　 ）　 ａ ０ｍ ｌ Ｘ ｏ 稀释缓冲液；５ｌ　明 ｍ ２ ％胶 （ 终浓度为 ０ ０％ ．１） （）　Ｔ ：０ｍ ５ Ｉ Ｇ ｌ０Ｍ Ｐ （）　Ｇ ｌ １０ｍ ６ Ｘ ａ ：０ｍ －（）原位杂交所需溶液： ７山东大学硕士学位论文变性液：０５ｎＯ ，　５ＮＣ ．ＭａＨ １ Ｍａｌ ． 中和液：０５ Ｔ ｉ－ｌ　 ．　 １５ＮＣ ．Ｍ　 ｓＣ （ ７４，　 Ｍａｌ ｒ ｐ ）　．　 Ｈ２ Ｘ　 ：　３ 柠檬酸钠、３ＮＣ ０　Ｓ ０ Ｍ ＳＣ　． Ｍａ １洗涤液： ｌ ｍ 顺丁烯二酸一ａＨ、１ ｍ ＮＣ ０ｍ ０ ＮＯ ５ Ｍ　 ｌ ０ ａ 封阻液： 将十倍浓缩的封阻液用马来酸缓冲液以１ １稀释 ：　 ０预杂交液：５ ＳＣ ０１ Ｘ Ｓ，　 ％月桂酸钠、００％Ｄ，　 ． ．２ＳＳ １封阻液 ％ 洗膜液 Ｉ Ｘ　 ，　１ＳＳ ：２　Ｓ ０ ％Ｄ ＳＣ ．　洗膜液Ｉ：０１　Ｓ ，　ＩＳＳ Ｉ ．　ＳＣ ０ ％Ｄ Ｘ　 ．　抗体溶液： 以 １５０ 的比例用封阻液将 ａｔ－工－Ｐ ： ０ ０ ｎｉＤＧＡ 稀释检测缓冲液：ｌ０Ｍ　ｉ Ｈ１ｐ９５、ｌ ｍ ＮＣ ０ｍ Ｔ ｓ Ｃ（ ．） ０ Ｍ　 ｌ、５Ｍ Ｍｃｚ ｒ－ Ｈ ０ ａ ０Ｍ　 ｌ ｇ显色底物溶液：将 ４ ｕ　 Ｂ／ＣＰ ０　 ＮＴＢＩ 浓贮存液加进 ２ｌ ｌ　 ｍ 检测缓冲液中显色终止液： ｌ Ｍ　ｉ－Ｃ （ ８０、１ ＥＴ Ｏ Ｔ ｓＨ１Ｐ ．） ｍ ＤＡ ｍ ｒ Ｈ Ｍ　（ 提取植物基因组 ＤＡ ８ ） Ｎ 的溶液配方 ＣＡ 抽提液 （ Ｘ　 Ｂ　２ＣＡ （ Ｖ ＴＢ ２　Ｔ ） ％ＴＢ　 ） ＣＡ ：　 Ｗ ／ ｌ０Ｍ　ｉＣ （ ８０ 、２ｍ ＥＴ （ ８０、１４ ＮＣ ０ｍ Ｔ ｓｌｐ ．） ０Ｍ　 Ａ　Ｈ．） ．　 ａｌ ｒ Ｈ Ｄ ｐ Ｍ　Ｔ 缓冲液：ｌｍ ＴｉＣ，　 ＥＴ Ｅ ＯＭ　 ｓｌ ｌＭ　 Ａ ｒ ｍ Ｄ抓仿／ 辛醇： ２／ ４１异丙醇２３本实 ． 验所用的生物学程序及软件ＢＡＴ ＬＳ 程序，Ｐｉｅ ｐｅｉｒ　０ ＧｎＴｏ．　 ＩＡ． ｒｍｒ　 ｍｅ ５ ，　 ｅｏｌ Ｏ Ｇ２０ ｒ ． ｅ 　 Ｍ山东大学硕士学位论文３ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 研究方法３１　 Ａ ．　 Ｎ 文库质量鉴定 ｃ Ｄ３１１检测文库的 ．． 滴度 （ １ ）于Ｘ１ ｌｅ Ｌ－ ｕ 大肠杆菌ｗｒｉｇ　 ｃ ｐａｅ 挑一个分割良 Ｂ ｏｋｎ ｓｏｋ　 ｔ 上， ｔ ｌ 好的单克隆，放入 １ｍ Ｌ／ｇＯ ｍｌｏｅ　 ｔ ５１　 ＭＳ， ａｔｓ ｂｏｈ中 （０ｍ 三角瓶） ７ ， Ｂ ／ ｒ １０１ ，３＇ Ｃ　１ ｒ 过夜培养， ４ｐ ０ｍ 直到Ｏ．　０ ５０ｒｍ 心５ Ｄ ２ ．　０ｐ 离 分钟， ．　０ 倒掉上清液， 用７５１　 Ｍ　Ｓ。 ．ｍ Ｉｍ Ｍ Ｏ Ｏ ｇ 重悬沉淀。（ ２ ）预热并干燥适当 数目 直径为９ｍ 的Ｌ／ｇＯ 的 ０ｍ ＢＭＳ； 平板。（）按一定的比例稀释文库： ３（ ａ １０ 噬菌体稀释液 （ 扩增后的文库） ）将 ０ １ 取自 加入到 ｌｌ １ ａ ｍ 的 Ｘ　 稀释缓冲液中，此为稀释液 １ ，稀释度为 １ １０ ：　 ． ０ ０１ １ 加入到另外的 ｌｌ　 Ａ ｍ １　 稀释缓冲液中，此为稀释 Ｘ　 （） 将 １ １ 稀释液 １ ｂ：　０ 液 ２ 　　 ，稀释度为 １ １ ．将（ ） ３ 一ｂ ） （）取 ４ ７ １ ４ 个 ｍ 的离心管， １的大肠杆菌和 （） （ 的噬菌体稀释液 体积混合，并将混合液 ３℃水浴 １ 分钟． ７ ５ 按表 １表１ 文库滴度的鉴定体系离心管号ＯＭ　 认重悬 ｇ １ Ｘ Ｘ　 稀释缓冲 ＩＭ ＭＳ液（） （ 的噬菌 ３ 一ｂ ）体稀释液５ １ １ ｌ １ ｏｐ　 ２ ｉ　 ０　１ Ｌ Ｏａｌ的菌液ｌ ｏｐ　 ｏ １ １ ０１　 ０ １１ １ ０１ ０ １１ １ ０１１ ０ １ ２ ０　１ ０ ｐ　 ２ ０　１ ０ ｐ　 ２ ０　１ ０ ｕ　 ２ ０　１ ０ ｕ　１２ ３４（ ５ ）每个离心管中加入３１ ｍ 融化（５　的Ｌ／ｇＯ ４Ｃ） ＢＭＳ， 顶层琼脂糖（．２） ０７％．混匀，并迅速倾倒在 ３℃保温的 Ｌ／ｇＯ平板上，旋转平板，使琼脂糖 ７ ＢＭＳ，山东大学硕士学位论文均匀分布。（ ６ ）让平板在室温冷却 １ 分钟，盖好，倒置平板，３℃培养 ６ 小时。 ０ ７ 一７（ ７ ）按下面的公式计算文库滴度： 文库滴度＝噬菌斑数Ｘ 　　　　 噬菌体贮存液的稀释倍数Ｘ　 １　 ｌ １＇　 ｍ＋铺板 ０ １ ／所用的噬菌体稀释液的“ 数 １３１２检测文库克隆重组率： ．　 ． 在Ｘ　ｐ ｘ 中， 　　　　Ｅ２ 克隆位点存在于０ 半乳糖昔酶基因 （ａＺ 多 Ｔｉｌ ｒ 一 Ｌｃ）。肤的编码区， 所以可用ａ 互补方法检测重组体。 基本方法相同于文库滴度的鉴定， 不同之处是在把大肠杆菌和噬菌体的混合物倒平板之前， 需在融化的上层琼脂糖中加入 ＩＴ（ ０Ｍ和ＸＧＩｌ ｍ） ０　０　 培养 ＰＧｌ ｍ） －ａ（ ０Ｍ各５ ｐ　３℃ ０ ０ １ ７６ ８ －１ 小时， 直到有蓝色噬菌斑出现。白 斑在总噬菌斑中所占的比 例即为重组克隆的比例。３１３　 检测插入片段的大小 ．　 ＰＲ ．　 Ｃ（ １ ）从板中挑取多个分隔良 好的噬菌斑，分别加入到装有 ２ ｐ　 ５　 １水的 Ｅ Ｐ 管中，轻弹振荡，并在 ４ ℃至少放置 ２ 小时。（ 从中取 ５ １ ２ ） １ 液体作为模板进行 ＰＲ ＰＲ Ｃ．　 体系为： ０ ｂｆｅ２５ １ Ｃ １Ｘ ｕｆｒ． ｐ　 ， Ｐｉｅ Ｉ　 ｐ　 Ｐｉｅ Ｉ（ ｐ　 Ｉ ｌ见 ２１３ ｒｍｒ　 ０　 ，　 ｍｒ　 ０　 （ Ｍ ｒ ２ ）　 Ｉ　 Ｍ ２ ）各 Ｉ （ ．　 中的（） ，　Ｐ Ｉ　 ． １） ｄＴ Ｎ（０ ）　 １　 ａ ＤＡ 　　Ｍ ０５ １ Ｔｇ　 聚合酶（ ／　 ）　２ ｐ　 １．　ｕ　 １ｍ ． ，　 Ｎ ５ ４　０１５　、水 ４８５　、模 Ｕ １　 ．　 １ ７ １ 板５ １ １ ，总体积为 ２ １１ ＰＲ ５ 　 Ｃ 反应条件为：９＇预变性 ５ ，　 ５ Ｃ 分钟，９＇３ ５ ０ Ｃ 秒、６＇３ 秒、７１３ ０ ０ Ｃ　 ２ 分钟，共 ３ 个循环，７＇５ Ｃ ０ ２ 分钟． Ｃ　（ ３ ）取８ １　 产物进行电 １　 Ｃ ＰＲ 泳检测． ３２筛选文库 ． ３２１ ．． 提取含有探针片段的质粒 方法见 《 　　　　 分子克隆实验指南》 质粒 ＤＡ Ｎ 的大量制备。 用合适的限制酶酶切质粒，琼脂糖电泳，回收酶切片段。山东大学硕士 学位论文３２２低熔点琼脂糖法回收酶切片段 ．．（ １ ）质粒 ＤＡ Ｎ 经酶切后，先进行预电泳， 记录电压大小，时间及 目的ＤＡ Ｎ片段的确切位置。（）制备一新的凝胶 （．％ ， ２ ０８ ） 在目的ＤＡ Ｎ 片段处切除原有的琼脂糖凝胶， 灌入低熔点的琼脂糖（ ） １ ．加上样品，电泳。 ％（ ３ ）在紫外灯下切下含有目的条带的琼脂糖， 转至一个干净的一次性的塑 料离心管中， 尽量使切出的琼脂糖块体积最小， 减少抑制剂对 ＤＡ 以 Ｎ 的污染量倍体积的 ２ｍ Ｔｉ－ｌｐ８０、０１ ＥＴ （ ８０至琼脂糖 ０Ｍ　 ｓＣ （ ．） ．　 ＤＡ　 ．　 ｒ Ｈ ｍ Ｍ　 ｐ ） Ｈ （）加 ５ ４５ 一１ 分钟以融化凝胶。 块中 ，盖好管盖，于 ６℃温育 ５ ０（ ５ ）待溶液冷却至室温后， 加等体积的 ．　 ｒｓＣ 平衡至ｐ８０ 用０１ Ｔｉ．　 Ｍ　 １ Ｈ．　 的 酚， 将混合液来回倒置混合２－ ０ 在 ２＇４０ｇ ０ ６ 秒， ０ ００ 离心 １ 分钟， Ｃ　 ０ 回收水相，界面的白色物质即为琼脂糖。再用酚：氯仿、氯仿各抽提一次。（ ６ ）将水相转移至另一离心管中， ． 倍体积的 ｌ 加０２ ｏ ｍ乙酸按， 充分混匀，再加２ 倍体积４ 预冷的乙 混合液在室温放置 １ 分钟， ＇１００ｐ ℃ 醇， ０ ４ ００ｒｍ Ｃ　离心 ２ 分钟，沉淀 ＤＡ ０ Ｎ，（ ７ ）小心弃上清液，０ ７％酒精洗涤沉淀一次， 室温晾干， 溶于 ２ １１ ０ 　 水中。（ ８ ）取 ２ １ １ 回收的样品电泳检测片段大小。 １ １ 取 １ 回收的样品， 澳化乙锭荧光法检测 ＤＡ Ｎ 浓度３２３ 标记 ＤＡ ．． Ｎ 探针（ １ ）在反应管中加入 １ ｇ Ｒ 模板ＤＡ 无菌双蒸水将体积加到 １１　 Ｎ， ６１ ．（ ２ ＤＡ ）将 Ｎ 在沸水中加热 １ 分钟变性，迅速放入冰乙醇中冷却。 ０ （ ３ ）加入 ４　 Ｄｇ　 ｈ　ｍ， ｐ　ｉ Ｈｇ Ｐｉｅ混匀，稍事离心，３＇保温 １－２ 小时。 １　 ｉ ｒ ７ Ｃ ５ ０（ ４ ）加入２　 ０２ ＥＴ 或６℃ ｕ　 ．　 ＤＡ ５ 加热 １ 分钟终止反应 １　 Ｍ　 ０３２４噬菌体噬斑的印迹吸印 ．．＝巴二二二＝＝＝＝巴二二二＝＝＝山东大学硕士学位论文 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（ 体 １ ）菌 文库的 平板方 基 检 文 滴度。 直 铺 法 本同 测 库的 对于 径为９ ０ 二的 平 吸印 噬菌 数目 多 ５ ０ 可， 噬菌 大 适当 不 板， 时 斑的 不 于１ ０ 即 且 斑的 小 互 ０相连。平板置于 ４ １ ０ 小时以上． Ｃ　（ ２ ）在变性液、中和液中各浸泡几张滤纸。（ ３ ）将尼龙膜仔细地覆盖在预冷的长有噬菌斑的平板上， 注意避免移动尼 龙膜， 避免产生气泡。 用大头针在尼龙膜上扎３ 个不对称的小孔， 进行定位。待膜完全被浸湿后，在平板上放置 １ 分钟．（） ４ 用平头镊子取出尼龙膜 （ 不要拖动尼龙膜） ，面朝上放在干净的滤纸或纸巾上室温晾干 １ 分钟以上。 ０（）膜印迹面朝上，依次放在被变性液、中和液浸泡的滤纸上各 ３ ５ 分钟、６ 分钟。 然后将膜在 ２　 Ｃ Ｘ　 溶液中 Ｓ Ｓ 洗涤 ５ 分钟，洗掉附着的琼脂糖。（ ６ ）尼龙膜夹在两张干净的滤纸之间，室温晾干 （０ ３ 分钟） ，在 １０ ０℃烘 烤１ 小时， ＤＡ 使 Ｎ 牢固结合在尼龙膜上。 若暂不做杂交可把尼龙膜用干净的滤纸夹好，室温保存． ３２５杂交及显色 ．．杂交可以在杂交袋中进行，也可以 　　　　 用耐热的塑料或玻璃盒、培养皿或旋转瓶。要保证膜与膜不要粘在一起，而且能够被杂交液完全覆盖。（ １ ）尼龙膜放在一个杂交袋中， 加入适量的预杂交液 （０ｌ１０ｍ ， ２ｍ／０ｃｚ 赶 ）尽气泡，否则会影响杂交的均匀度。（）　 ２ ８ ℃预杂交至少 １ 小时。 －２（ ＤＧ ３ Ｉ 标记的探针（ ２ｎ／ｌ在沸水中变性 ５分钟，冰上骤冷，然后 ）　 ５ ５ｇｍ） － 加到预热的预杂交液中 （．　 １０ｍ ｏ ２５ｌ ０ｃｚ ｍ／ ）（ ３ ）去预杂交液，换上杂交液，６１ ８ Ｃ，杂交至少 ６ ６ －１ 小时。（ ５ ）杂交完后，可把杂交液回收到 Ｅ 管中，贮存在一２ ０ Ｐ ０　 Ｃ，杂交液可以 反复使用多次，每次用时在 ９ ℃以上变性 １ 分钟。 ５ ０一一升一￣一一升尘Ｖ＊ ｔ Ｃ塑ｔｌ ｉ ９（ 取 尼 膜 在 温 用２　　０％ Ｓ 两 ， 次５ 钟 ６ 出 龙 ， 室 下 Ｘ　 ．　 洗 次 每 分 ， ） Ｓ Ｓ １Ｄ Ｃ　 Ｓ 再 尼 膜 ．　 Ｃ　 ＩＤ在６ 洗 次 每 ５ 钟 把 龙 用０ Ｘ　 ０ ％ Ｓ ０ 两 ， 次１分 。 １　　　　　　　　　 Ｓ ．　 Ｓ Ｓ ℃（ 取出 龙 用 层 纸 干 面 水 （ 一 可 期 置） 用 ７ ） 尼 膜， 两 滤 吸 上 的 分 这 步 长 放 ，马 酸 冲 漂 分 ， 适 的 阻 １封 掖，８ １ ０ｍ 来 缓 液 洗１ 钟 在 当 封 液（ 租 １ｍ ｌｃ） Ｘ ０ ／ ０２中室温封阻 ３ 分钟。 ０（ 用Ｉ 封阻 将ａｔ Ｄ － 稀 到１ ｍ ｍ（ ５ ０， 掉 阻 ８ ） ｘ 液 ｎｉ Ｉ Ａ 释 ５ ｕ ｌ ： ０ 倒 封 液， － ＧＰ ０／ １０ ）尼龙膜在抗体溶液中室温孵育３ 分钟。 ０（ ９ ）取出 尼龙膜置于 皿中， 洗涤液洗 两次， 每次巧分 钟。 （ ）弃洗涤液， １ ０ 尼龙膜在检测缓冲液中 平衡２ ５ － 分钟（ ）将 １ 新配的 色溶 与 起置 塑 袋 １ 显 液 膜一 于 料 封闭 并 暗中 ， 在黑 温育， 显色时不要摇动。（ ）显色结束后将膜取出，用清水或显色终止液终止反应。 １ ２３２６二、三级筛选 ．．（ １ ）用枪头挑选初次筛选得到的阳性噬菌斑，把噬菌斑连同琼脂糖加到５ １ 的噬菌体稀释液中，轻弹振荡，４ ０，　 １ ℃放置至少 ２ 小时。（ ２ ）噬菌体稀释液以 不同的比 例稀释， 各取 １１ 与２０ １ ０ １ ０ １　 １ 宿主菌共培养后铺平板，检测其滴度．（ 含有合适的噬菌斑数 （０ ０） ３ ）以 ５－１ 的噬菌体稀释液与宿主菌共培养 ０ 后铺板， 待噬菌斑大小合适， 进行印 杂交、 膜、 显色等操作，以 验证前次筛选的到的阳性噬菌斑．３２７ ．． 阳性克隆的检测与分析ＥｃｌＢ２．　 　　　　５８ 中存在 Ｃｅ重组酶 ，当重组噬 菌体被转化 到 ．　 Ｍ ｏｉ ｒＥｃｌＢ２． 中后在重组酶的介导下发生位点特异性重组， ．　ｉＭ５８ ｏ 从而释放出ＰＴｉｌｘ 质粒．具体步骤如下： ｒｐＥ２ （）从 Ｂ２． ｗｒｉｇ　ａｅ １ Ｍ５８　 ｋｎ ｐ ｔ 上挑取分割良 ｏ ｌ 好的单克隆接种到含有相应一￣一升一今一￣一些竺里掣丝组抗 素 （ ｍ 的１ １　 ｇ ， 体 养 ， １　５ ｐ振 培 生 Ｃ ） ０ Ｌ Ｍ Ｏ 培 基中 ３＇ １ ｒ 荡 养７ ａ ｍ Ｂ Ｓ液 ／ Ｃ　 ｍ ０－８ 小时，直到 Ｏ．　 １ ．０ Ｄ １ 一１４ ．　（ 在５ｌ 述菌 加 ０　 １ Ｍ ｌ使Ｍ ｌ 浓 ２ ） ｍ 上 液中 入５ｕ　 ｇ ， ｇ ： 度为Ｉ Ｍ １　 ｃ， ｃ 终 Ｍ　 Ｏ． Ｍ（ ３ ）挑取原位杂交平板上分割良 好的阳 性克隆 加入到 ３０　 １　 稀 ５ｕ　 ｘ　 释 １　 Ｘ缓冲液中，４ ℃过夜。（ ４ Ｅ 管中混合 ２０ １ ）在 Ｐ ０ １　 菌液与 １ １　 ５ １ ０ 阳性克隆稀释液，１ 温育３ ３＇ Ｃ ０分钟 （）加入 ４０ １　液体培养基，３１，　 ｒｍ ５ ０ １　 Ｂ Ｌ １ ２５ｐ 振荡培养 １ Ｃ ２ 小时。一１ １ 感受态细胞悬液涂布在 Ｌ／ａｂ １ ＢＣｒ 平板上，倒置平板 （） 取 １ ０ １ ６３℃培养。 １（ ７ ）从每个平板上挑取多个分割良 好的单菌落分别进行液体培养， 用碱裂 解法小量制备质粒 ＤＡ（ Ｎ 方法见 《 分子克隆实验指南》。 ） 酶切确定外源片 段的存在，测序工作委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行。３３玉米抗病相关基因ＤＡ ． Ｎ 片段克隆３３１ ．．　 引物设计：根据从其它植物中克隆到的抗性基因及抗性基因类似物的保守的氨 　　　　基酸序列 （ ） 图２ 及玉米中密码子的偏好性设计三组简并引物序列 （ ） 表２３３２ ．． 玉米总ＤＡ Ｎ 的提取［：改 ６ 进的ＣＡ 法 ７ ］ ＴＢ （ １ ）取３ ４ 一 克叶子 （ 新鲜或冻存叶子）用液氮速冻并研磨成细粉末后转 ，移至 ５ｍ 塑料离心管中，加入 ｌ ｌ ０ｌ ｏ 预热抽提液和 １０　 疏基乙醇。 ｍ ０ ｕ　 １ （）　＇Ｍ育 １ ２ ６Ｃ ５ 小时，间隔摇匀。（ ３ ）取出后降至室温，加入等体积的抓仿／ 辛醉，快速颠倒混匀抽提 １ ０分钟， ００ｒｍ １００ｐ 离心 １分钟， ０ 然后将上清液移至另一离心管中， 再抽提一次， 方法同上。 （ ４ ）上清液中加入 ０８ 异丙醇，室温沉淀 １ 分钟，出现絮状沉淀。 ．ｘ ５山 东大学硕士学位论文（ ５ ）用枪头将沉淀移至一个 ７１ ｍ 离心管中，用 ３１　％ 乙 醇 ／乙 酸 钠 ｍ ７ ６ （．　０３）洗涤一次． ０２／．　 Ｍ Ｍ （）晾干沉淀后将其溶于 ４０　 Ｔ 中，加入 Ｒａｅ ６ ０ ａ　 Ｅ １　 Ｎｓ 消化 （ ７ ）用氛仿／ 辛醇抽提一次，再用盐离子／ 无水乙醇沉淀 （）用 ８ ％乙醇洗涤 ２ 次后于一２℃保存 ８ ０ 一３ ０ （）紫外分光光度计检测纯度和浓度，凝胶电泳检测质量 ９３３３　 反应体系及反应条 ．　 ＰＲ ．　 Ｃ 件１Ｘ ｕｆ ２０ １ 　　　　 ｒ． ｕ　简并引物 （ ｕ）各 Ｉ ｌ见 ２１３ Ｏ ｂｆｅ 、 ２Ｍ ０ Ｉ （ ．　 中的 （ ） ， Ｉ　 ． １）ｄＴ （ＯＭ ０４　，　ｑ　 聚合酶（ ／　 ）　“ 、水 １． １ 、模 ＮＰ　 ｍ）　 ｔ Ｔ ＤＡ Ｉ ．　１ ａ Ｎ １　 ５ ｕ　０１ １ Ｕ １　 ．　 ４５ １ １ 板１ １ “ ，总体积为 ２ ｕ　 ０　。反应条件９＇预变性 ５ １ ５ Ｃ 分钟，９＇３ 秒、４ ５ ０ Ｃ ５Ｖ３ 秒、７０２ ０ ２ 分钟，共 ４ 个循环，７０１ 分钟。 Ｃ ０ ２　０ Ｃ　｝一 １一！一　２ 　 　二 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　１ 　 　０５ ８ ５｝ 朴｝ 一默 』｝｝ ｈａ一 ｝３ ５ ６．．．．．．．７　ｉ １ ｈＶ　 拿ＣＣ井ＭＩ９ １ １ ５　 ２ 。１２　＂４砂 Ｃ ５执 ３ Ｑ １＂ ｌＳ 目 ＇ｅ ｆ ｄ ａ ｆ ．翻 ｄ 幼 ｉ ｌ ｉ ｃ ． ．七口 ， ． 空 ｄ ａ 亡 。Ｆ ． ｌ Ｓｃ ．． 七甘 生 ｅ ｆｃａｆ 。 ｌｋ ｉｅ 。乙‘甘． 乙民工昌了 ‘『 种 ￣ 种 砂 『． 乙民丁日了．月７ ５ Ｐ月． ２ 即． 二工２ Ｃ－１ …皿 １ ， 皿丁 习 ，．。 二． ｆＩＶ！ 刀口甘．ｋＳ 盆七ＣＴ１ＹＣＳＬ．．． ＬＯ ｆＰ ＲＴ Ｖ Ｌ ｒｙ Ｌｓ ｓｉ Ｒ ＊ ｆ．． Ｃ尸Ｉ 亡． Ｉ 儿… 二 ‘ 盆口口Ｍ ＹＣ 今Ｉ．． ．ＶＩ ｌ ＣｉＦＩ ２ Ｃ１ ＰＩ Ｃ２１目口几Ｊ士份 盆 。 日 吏工 ． 二，日 皿。 ， 。翻凡口几了，恤。二 Ｓｓ盆ＬＬ公１民二 ， ＂ ＩＬ 甲，叹爪 …Ｐ Ｃ１ Ｉ ３ＰＩＣ１ ５Ｌ Ｌ Ｔ 。峨 Ｃ １ ｃ ｉ 。 Ｉ Ｓ ． 。ｐ Ｔ ｈ Ｓ ．乙民 Ｓ 乙 ｔ．。‘ Ｃ下蕊 双Ｏ 了Ｃ扭 Ｖ．． ．ＰＣ ＩＫ Ｐ Ｃ１ Ｉ ６ＰＩ Ｃ１７Ｓ 工‘ ，了 对 乙 皿。 。 。 Ｓ ＩＩ 峨… ＲＩ ＳＴ口峨 乙Ｉ乙，日 砚．百． 习盆Ｖ 工王， １， …Ｐ Ｃ １－ Ｉ １ １ Ｆ Ｃ１ Ｉ ９Ｐ ＩＧ Ｓ． 欲 飞 ，双… 日 Ｖ工 ，． ｅｏＩＬＶ４Ｓ ．．． ａ护工 ２０ Ｃ二 ｅ．名日 胶目６ 呀留 １ 爪…口 名丁匕口，日皿…Ｌ ａ 黑． 从ｏ＝ 跳ＩＣ吕 目．图２ 双子叶植物的Ｌ，　 Ｒｐ，　 ｌ Ｒｓ，　 － 抗病基因中ＮＳＬＲ ６ Ｎ，　 ５ Ｒｍ，　 ２ １ １ ｐ ｐ ｐ ２ Ｃ Ｂ－Ｒ 保 守区氨墓酸序列与从玉米分离的抗病基因 类似物 （Ｉ１－Ｉ２） 小麦中抗病基 ＰＣ１ＰＣ０、因 似物（ Ｃ４的 测氨 酸 列比 箭 的 表示引 方向‘ 类 ｓ Ｓ） 推 基 序 较。 头 方向 ｓ 物的 ４ ５ ］３ １山东大学硕士学位论文表 ２ 简并引物序列，保守的氨基酸序 引物名称列！物 列 引序ＧＧＴ （ ｌｏ） ＶＫＴＰ ｏｐ －正向引物Ｐ ５ＹＡＣ ｒ ＇　Ａ＇ ｉ 　ＧＤ＇ ｍ ＡＧＣ　 ｅＧＣＧ ｒＡＤＡ ｌＧＧ３ ｌ　ＮＣ －ＤＡＩ ２ＡＴ＇ １　ＳＣ 　ＮＡ ＧＲ Ｃ　 ＡＧ ３ ＴＧ ３ ＳＣ ＴＮ ＣＡ ＮＰ ｉｅ３ ｒｍ ｒ ｝ ＇　 Ｔ Ｃ Ｇ Ｔ Ｃ Ｎ Ａ Ｇ Ｃ Ｔ　＇ ５　　　　　　Ｎ Ｔ Ｇ Ｃ Ａ Ｇ ３ Ｃ ＡＴ ＮＧＰＡ ＬＬＬ正向引物Ｐ ｉ ｅ ３ １ ｝ ＇　 Ａ Ｔ Ｇ Ｂ Ｔ Ｇ Ｃ Ａ Ｇ ３ ｒｍ ｒ－ ５ Ｃ Ｃ Ｇ Ｔ Ｃ Ｓ Ａ Ｇ Ｃ Ｔ　＇ Ｔ Ｐ ｉ ｅ ３ ２ 】 ＇　 Ａ Ｔ Ｇ Ｂ Ｔ Ｇ Ｃ Ａ Ｇ ３ ｒｍ ｒ－ ５ Ｃ Ｃ Ｇ Ｔ Ｃ Ｓ Ａ Ｇ Ｔ Ｔ　 Ｔ ＇Ｐ ｉ ｅ ３ ３ ｝ ＇　 Ａ Ｔ Ｇ Ｂ Ｔ Ｇ Ｔ Ａ Ｇ ３ ｒｍｒ－ ５ Ｃ Ｃ Ｇ Ｔ Ｃ Ｓ Ａ Ｇ Ｃ Ｔ　＇ Ｔ Ｐ ｉ ｅ ３ ４ ｝ ＇　 Ａ Ｔ Ｇ Ｂ Ｔ Ｇ Ｔ Ａ Ｇ ３ ｒｍｒ－ ５ Ｃ Ｃ Ｇ Ｔ Ｃ Ｓ Ａ Ｇ Ｔ Ｔ　＇ ＴＬ ＩＶＬＶＤ Ｖ （／ ／）ＬＤ （ｉａｅ２ ｋｎｓ－）Ｐ ｉｅ ２ ｒｍ ｒ！ ＇　 Ｇ Ｇ Ｗ Ｇ Ｇ Ｎ Ｇ Ｃ ３ ５ Ｎ Ｎ Ｃ Ａ Ｎ Ｇ Ａ Ｎ Ｃ　＇ ＡＰ ｉ ｅ ２ １ ｝ ＇　 Ｃ Ｃ Ａ Ａ Ｎ Ｃ Ｎ Ｎ Ｇ Ａ Ｇ Ｃ　＇ ｒｍｒ－ ５ Ａ Ｔ Ｇ Ｇ ＧＧ Ａ Ｇ Ｇ ＮＧ Ｃ ３ ＡＰ ｉ ｅ ２ ２ ｝ ＇　Ｃ Ｃ Ａ Ａ Ｖ Ｃ Ａ Ｎ Ｇ Ａ Ｉ Ｃ　＇ ｒｍ ｒ－ ５ Ａ ＴＧ Ｇ Ｇ Ｇ Ｓ Ｇ Ｇ Ｓ Ｇ Ｃ ３ Ａ＊（　＋＋，　＋＋，　＋＋＋，　 ＋ ， ：　 Ｖ　ＣＧ Ｗ　ＴＹ　Ｔ ） Ｂ　ＧＴ Ｄ　ＧＴＮ　ＣＧＴ Ｒ　Ｃ Ｓ　Ｇ ：　 ，　 ＋，　＋， ：　 Ｃ ：　 Ａ ：　 Ａ ：　 Ｃ ，　＋＋ ：　 ：　 Ａ ＋ Ａ Ａ Ｃ　３３４　 产物的回收 ．　 ＰＲ ．　 Ｃ按博大泰克公司玻璃奶回收试剂盒方法回收 ＰＲ 　　　　 Ｃ 产物，步骤为：（）待回收的ＤＡ １ Ｎ 片段经电泳分离后， 从琼脂糖凝胶上切下所需ＤＡ Ｎ 片段， 放在 １５１Ｐ ．　Ｅ 管中。 ｍ（ ２ ）准确估量凝胶的体积，加入 ３ 倍体积的溶胶液 （０ １ 体积胶加入 １０ １ １　３０１ ０ｗ 溶胶液为一标准反应） 室温下放置５ ， 分钟或５℃ ０ 保温 ３ 分钟，其间轻摇 Ｅ 管几次使胶完全融化。 Ｐ（ ３ ）加入 ｌｗ 玻璃奶 （ ｏｌ 玻璃奶回收前充分混匀 ！，颠倒混匀，冰浴下放 ）山东大学硕士学位论文置 １ 分钟。每隔２ 分钟混匀一次。１００ｐ 离心 ３ 秒，吸弃上清。 ０ 一３ ２０ｒｍ ０ （ ４ ２０１ ）加 ５９ 漂洗液 （ 浓缩漂洗液使用前， 按浓缩漂洗液： 无水乙醇＝３ ： ７配制成工作浓度） ，用加样器吹打漂洗液，轻柔地将玻璃奶悬浮混匀，１ ０ｒｍ ２ ０ｐ 离心３ 秒。 ０ ０（ ５ ）重复步骤 ４（ 尽量吸尽漂洗液） 。吸取完漂洗液后再离心 １ 秒钟，用 ０ 枪头将最后一点漂洗液洗千净。然后，放置于 ３０烘箱干燥直至沉淀成 ７ Ｃ 白色，约 １－２ 分钟。 ５ ０ （）加适量的洗脱缓冲液 （０１ ６ ２９ 为一标准反应） 混匀， ０ ， ６℃水浴 ５ 分钟，１ ０ｒ 离 分 回收 备用。 ２ ０ｐ 心１ 钟， 上清 ０ ｍ 重复步 ，能 骤６ 提高回收率。（）对回收产物进行定量 ７注意事项： 　　　　 溶胶液为无色透明或稍呈淡黄色均不影响实验效果。 为提 高回收率，加入的溶胶液体积比可以适量的高。每次切胶的体积最好保持在 １ ９ 左右。Ｎ 的量过多或胶体积过大 　　　　 ０１ ０ ＤＡ时，最好分成几管进行以提高回收率。 使用玻璃奶前，将其充分混匀。加入玻璃奶后，室温放置的时间适 　　　　 当延长可以提高回收率。 每次漂洗操作时手法都应轻柔， 　　　　 不可用力吹打 （ 尤其对超螺旋质粒） ，禁用振荡器． 尽可能去尽漂洗液， 如离心或适当延长干燥时间。 否则， 未 除净的乙醇会影响后续实验。３３５　 产物的 ．　 ＰＲ ．　 Ｃ 连接按ｐＥ－ 试剂盒进行 ＧＭ Ｔ ３３６ ．． 感受态细胞的 制备及转化， 蓝白 斑筛选，阳 性克隆的获得（ １ ）从经过３℃培养１－２小时的大肠杆菌Ｄ５ ａ ７ ６ ０ Ｈ－　 的新鲜平板中挑取一 个单克隆 （ ２ ３ｍ，转到 ５ｍＬ 液体培养基中，于 ３℃剧烈振摇 直径 － ｍ） ０１　 Ｂ ７（０ｒｍ 培养约３ ３０ｐ） 小时 （ 活细胞数不应超过 １ 个／ｌｏ ０ ／ ）　 ． ｍ（ ２ ）无菌条件下将细菌转移到一个无菌的，一次性使用的、冰预冷的－升升￣升升升升￣尘竺掣蜜翌坚升７ ｍ离 ． １ 心管中， ｍ／ ， 冰上 置１分 使 养 冷却 ＊ 以 ５ ５ｌ 在 放 ０ 钟， 培 物 至Ｏ　 管 Ｃ（下均为无菌操作） 。（ ４ ４０ｒｍ ３ ０ ００ｐ 离心 １ 分钟，回收细胞。 ）　 Ｃ　 ０（ ４ ）倒出 培养液， 将管倒置于滤纸上使残液流尽。（ ５ ）以 ｌｌ ｍ 冰预冷的０１Ｃｃｚ ．　 １ Ｍａ 重悬每份沉淀放置于冰上 １ 分钟。 ０ （ ４ ４０ｒｍ离心 １ 分钟 回收细胞． ６ ＇ ００ｐ ）　 Ｃ　 ０ （ ７ ）倒出培养液，将管倒置于滤纸上 １ 分钟， ２０１ 用 ０ｗ 冰预冷 ０１ＣＣ： ．　 ｌ Ｍａ重悬每份沉淀放置于冰上。此为感受态细胞。 （ ８ ）加入 ｌ　 ｌ 连接产物，轻轻旋转以混匀内容物， Ｌ ｌ 在冰上放置 ３ 分钟。 ０（ ９ ）将管放到 ４ ℃水浴中，９ 秒，不要摇动。 ２ ０（ ）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却 １ 分钟。 １ ０ －２（１ １）每管加 ８０１Ｏ 培养液，３＇ ２０ｐ １ ０ｋＳＣ ７ ０ｒｍ　 Ｃ　 小时 ４ 分钟， ５ 使细胞复苏并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。 （ ）将 １０１已转化的感受态细胞转移到含有 ＩＴ １ ２ ０ｗ ＰＧ、Ｘ ａ －ｇｌ及 ２ｍ ０ＭＭＳ， ｇＯ 和相应抗生素的ＳＢ Ｏ 琼脂培养基上， 用一无菌玻璃涂布器将转化的细胞涂布到琼脂平板表面。（ ）平板置于室温直至液体被吸收。 １ ３ （ ）倒置平板于 ３℃培养，１－１ 小时， １ ４ ７ ２ ６ 直至蓝白 斑出现， 放置于４　 ０ Ｃ一段时间可以使蓝斑更加明显，白斑为重组克隆。３３７ ．． 重组克隆的验证及序列分析按《 　　　　 分子克隆实验指南》的方法进行重组克隆质粒 ＤＡ的提取，经 ＮＰＲ Ｃ 反应及Ｅｏ Ｉ ｃＲ　 酶切， 验证克隆片段的大小， Ｃ 反应体系及反应条件 ＰＲ见 ３３ ３ ． ． ．测序工作委托博亚公司进行。山东大学硕士学位论文４ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ．结果与分析４１ ．　 文库质量的鉴定和筛选 ４１１ ．． 文库滴度从原噬菌体文库中取 ｌ 　　　　 ｐｌ噬菌体稀释液，用 １ Ａ Ｘ　 稀释缓冲液稀释１０ 倍，取 ２ ｐ　 ００ ０　 己稀释 １ ０ １ ０ 倍的噬菌体稀释液与 ２０　 宿主菌共培 ０ ０ ｐ　 １养后铺平板，得到约 ２０ 个噬菌斑，根据公式： ００ ｐｕｍ＝ 　　　　 ｆ／ｌ平板中噬菌斑数Ｘ噬菌体溶液的稀释倍数 Ｘ　 ０ １０ ＝铺平板 ０ 所用的噬菌体稀释液的ｐ 数 １此文库的滴度为： ００　 ０Ｘ　 ０ ２＝１ ｐｕｍ 　　　　 ２０Ｘ　 ０　 ０＝ ０ ０ ｆ／ｌ １ ０ １ ０ ８４ １２重组率 ．　 ．． 　　 本实验所用的 。Ｎ ＤＡ文库的 构建载体是Ｘ　ｐＥ２ 其中含有大肠杆 Ｔｉｌｘ， ｒ菌０ 半乳糖昔酶基因， 一 如果这种载体不含有外源片段， 那么转入 ｌｃ宿 ａ一主菌Ｘ１ ｌ 后， Ｌ－ ｕ Ｂ ｅ 在含有Ｘｇｌ 工 Ｇ 平板上形成淡蓝色噬菌斑， －ａ 及 Ｐ 的 Ｔ 如果外源片段插入到了此载体的多克隆位点， 其半乳糖昔酶基因大部分被置换，转入这种 ｌｃ宿主菌 Ｘ１Ｂｕ 后，在含有 Ｘｇｌ ＩＴ 的平板上 ａ一 Ｌ－ｌｅ －ａ 及 ＰＧ形成无色噬菌斑，我们可以根据这个原理计算出重组噬菌体所占的比例。表３ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 铺平板对蓝斑和白 斑记数平板 １ 蓝斑 白斑２ １２ ４平板 ２１平板 ３２ １５ ６平板 ４０２０ ２２５ ３根据白斑在总噬菌斑中的比例计算重组率： 　　（４＋２ ＋６ ＋３ ）　２ １１０ １２２０ １５ ２５＝ ９ 。 １２２ ０ １５２ ５ ／ ＋＋＋＋４＋２＋６＋ ３） ９ （４１３插入 ｃＮ 片段的长度 ．． ＤＡ随机挑选了 ６ 　　　　 １ 个克隆， Ｃ 扩增后电泳检测 （ ＰＲ 方法见 ３１３） ．． ，发现
山东大学硕士学位论文５ 体会与讨论５１ ． 筛选文库体会 众所周知，以筛选文库的方法进行基因克隆是一种费时费力的工作， 　　　　然而鉴于其 自身的优点，多年来， 一直被认为是一项不可取代的技术。 通过文库的筛选我有如下体会：（ １ ）筛选文库时， 需要限制噬菌斑的大小， 便最大限度地提高每个平板 以 所筛选的噬菌斑的数目， 所以可用存放时间较长的琼脂平板， 适量提高顶 层软琼脂中的细菌密度， 并使用较高浓度的 顶层琼脂糖， 适当降低培养箱的湿度 。（ ２ ）在鉴定文库滴度及整个筛库工作中， 噬菌体的平板培养过程中注意了以下问题：（ ａ ）当使用融化的顶层琼脂糖和细菌、 噬菌体混合物铺平板时， 融化的顶 层琼脂一定要控制在 ４℃以下， ７ 温度过高会杀死细菌。（）在铺平板之前，琼脂平板在 ３℃预热，保证琼脂表面没有水珠。平 ｂ ７板温度过低，则刚刚倾倒在平板上的上层琼脂糖来不及分布均匀就已 凝 固；若琼脂表面有水珠，那么在 ３℃培养时，水蒸气会在顶层琼脂糖表 ７ 面形成水珠， 使生长中的噬菌斑随水珠流动而互相污染， 这直接影响了噬菌斑的计数及筛库工作。 （）噬菌体噬斑的印迹吸印时， ３ 经变性液、 中和液浸泡的滤纸湿度不宜太 大，膜的变性及中和时间不宜太长，否则会造成噬斑的扩大，（ ４ ）第一次使用探针时，为了决定最佳的探针使用浓度和避免产生背景， 可做一系列模拟杂交， 即将小块无ＤＡ Ｎ 的空膜在不同探针浓度的杂交液中杂交过夜， 显色后， 采用背景可以接受的最高浓度的探针进行正式的杂交。５２ ． 设计引物中应注意的问题 在本实验设计引物时，对通常 ＰＲ 　　 Ｃ 引物设计应注意的问题和玉米中密山东大学硕士学位论文码子的偏好性做了适当的考虑：在引物设计中，Ｄ Ｓ Ｙ Ｒ ｗ的使用是为了 （ 　　　　 ，　 ，　 ，　 和 与使用 Ｎ 相比）降 低引物的简并性，并平衡引物中的Ｇ％含量。 Ｃ在 Ｐｉｅ － ，Ｐｉｅ １２ Ｐ 　　　　ｌ１ ｒｍｒ　 ，　系列和 Ｐｉｅ２１ Ｐｉｅ２２ ｒｍｒ － ３ ｒｍｒ－，　 ｍｒ－ 引物 ｒ 中 ＧＤ代表编码甘氨酸的密码子，玉米中甘氨酸密码子的使用频率为： ＧＧ Ｇ ２％ Ｇ Ａ ８ ；　Ｔ ：２％ Ｇ Ｃ ４％ Ｇ ：　 ；　 ：　 Ｇ ０ Ｇ ％ Ｇ ０ ；　 ：　 ｅ Ｇ ２在 Ｐｉｅ － 和 ｒｍｒ　 　　　　 ｌ１ Ｐｉｅ １２中应用了互补设计的思路，Ｐｉｅｌ１ ｒｍｒ － ｒｍｒ－ 中使用了频率相对较低的 ＧＧ ＧＡ ＧＴ Ｇ，　 ，　 ，而 Ｐ ｉｅ １２中相应位置上 Ｇ Ｇ ｒｍｒ　 －使用了频率相对很高的ＧＣ Ｇ． ＣＳ 　　　　 Ｔ 代表编码亮氨酸的密码子。 玉米中编码亮氨酸密码子的使用频率为：ＣＧ ２％ ＣＡ ８ ；　 ：　 ；　 ：　 ；　 ：　 ；　Ａ ５ 。因 Ｔ ：　 ；　 ：　 ＣＴ １％ ＣＣ ２％ ＴＧ １％ Ｔ ：　 ９ Ｔ ％ Ｔ ７ Ｔ ７ Ｔ ４ Ｔ ％此使用了频率较高的ＣＧ ＣＣ即ＣＳ． Ｔ 和 Ｔ （ Ｔ） ＧＢ 　　　　 Ｔ 代表编码缴氨酸的密码子。玉米中缴氨酸密码子的使用频率为： ＧＧ ３％ ＧＡ ８；　 ：　 ；　 ：　 。选择时，去掉了使用频率较 Ｔ：　 ；　 ：　 ＧＴ ２％ ＧＣ ３％ ８ Ｔ ％ Ｔ ２ Ｔ １低的 ＧＡ Ｔ ，而选用 ＧＧ ＧＴ Ｔ （ Ｔ） Ｔ ，　 ，　 Ｃ 即ＧＢ ． Ｔ 　ＧＶＣ 　　　　 Ｇ 代表编码丙氨酸密码子的互补序列。 玉米中丙氨酸密码子的使用频率为： Ｃ：　 ；　 ：　 ；　 ：　 ；　 ：　 。 ＧＧ ２％ ＧＡ １ ＧＴ ２％ ＧＣ ３％ 选择时， ４ Ｃ ７ Ｃ ４ Ｃ ４ ％ 去掉了使用频率较低的ＧＡ 而选用 ＧＧ ＧＴ ＧＣ Ｃ， Ｃ，　 ，　 。因为 ＧＰＡ 为反向引物， Ｃ Ｃ ＬＬＬ 所以 在引物中对应于Ａａ ｌ 的序列为ＣＣ ＡＣ ＧＣ（ Ｇ） Ｇ，　 ，　 即ＶＣａ Ｇ ＧＳＧ 　　　　 Ａ 代表编码亮氨酸密码子的互补序列， 对它的说明可结合ＣＳ Ｇ Ｔ 和ＶＳ的解释。在两个靠近 ’ 　　　　 ３ 端位置，用 Ｉ 代替Ｎ ，可以降低引物的简并性。如果要覆盖全部信息， 　　　　 理论上还应该合成很多条引物， 在本实验中我们本想首先合成部分引物， 进行探索性研究， 如果实验有一定的结果， 则再合成其他的引物． 由于时间和工作量的限制， 我们没有合成其它的引物山东大学硕士学位论文对，而是对所得到的克隆进行了 序列分析。 ５３ ． 候选基因的标准及如何得到候选基因 由于植物中有许多与 ＬＲ ＮＳ 　　　　 Ｒ 或 Ｂ 同源的基因并不都与抗病有关， 而且抗病基因往往呈簇分布，所以难以判断克隆的基因片段是否为目的基因。经过对 ＰＲ Ｃ 扩增以及克隆的产物进行序列分析，发现推测的Ａ 克隆氨基 ９}