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普通PCR及测序PCR原理解析.ppt 76页
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PCR技术 什么是PCR? 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是一种在DNA聚合酶作用下体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。 PCR技术操作简便，可在短时间获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝。80年代中期PCR技术的发明，引起了生物技术发展的一次革命，目前已被广泛应用于与分子生物学相关的各个领域。 PCR反应的几个要素 DNA聚合酶
模板（要扩增的DNA）
原料 Buffer（缓冲液）
稳定的环境 Mg 2+ 等
润滑剂 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 （6）两引物间避免有互补序列。 （7）引物3’端与模板序列要严格配对，3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 ；引物 5’端无严格限制。 （6）缓冲液（Buffer）
10mmol/L TrisHCl
调节PH，使Taq酶活性作用环境维持在扁碱性（pH8.3,室温）
50mmol/L KCL
有利于引物的退火，但过高会抑制Taq酶活性
0.01% 明胶
保护酶不变性失活
一个典型PCR体系 反应体系（50 ul）：
10x Buffer
5 ul dNTP(2.5mM)
4 ul DNA模板
0.1～2ug 上游引物(10P)
2 ul 下游引物(10P)
补足至50 ul
50 ul 反应流程（以扩增片段大小为800bp为例）：
------ PCR常见问题
假阴性，无扩增产物
无扩增产物
（一）防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 （二）设立对照 阳性对照：
阳性模板 阴性对照：
阴性模板 试剂对照：
除模板外的所有组分 PCR的不同类型 重组PCR
多重PCR 原位PCR
连接酶链反应 巢式PCR
递减PCR 热启动PCR
实时定量PCR LCR连接酶链反应
LCR （Ligase
reaction）基本原理为利用DNA连接酶.特异地将双链DNA片段连接，经变性-退火-连接三步骤反复循环，从而使靶基因序列大量扩增.
若连接处的靶序列有点突变，引物不能与靶序列精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接反应不能进行，也就不能形成连接产物.
巢式PCR（Nest-PCR）
递减PCR（TouchDown PCR）
热启动PCR （HotStart PCR）
逆转录反应的一般步骤 RNA模板+反转录引物，70℃，5min, 冰浴1min。 再加以下反应组分：
逆转录酶抑制剂
逆转录酶 以上组分加好后，混匀，42℃或37℃
60min。 70℃，5min 后再冰浴，所得产物就是cDNA， cDNA用做后面的PCR的模板。
二 、测序原理
双脱氧核苷酸终止测序法（也叫sanger测序法）的原理是：在PCR体系中加入双脱氧核苷酸（ddNTP）， 在PCR延伸过程中ddNTP随机掺入到合成链中从而导致延伸的终止，经过大量的这样随机终止的PCR反应，生成一系列长度相差1个碱基的PCR产物混合物，此产物通过电泳根据不同长度片段的电泳速度不同来检测整段DNA的序列。 双脱氧终止法示意 双脱氧终止法示意 双脱氧终止法示意 双脱氧终止法—示意 双脱氧终止法测
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基因工程概论(4-5)
4 基因工程的操作过程切 接 转增 检4 基因工程的操作过程A DNA的体外重组（切与接）同种内切酶生产的粘性末端的连接 同尾酶生产的粘性末端的连接 不同粘性末端的连接人工粘性末端的连接粘性末端的更换 重组率同种内切酶生产的粘性末端的连接5' GAATTC CTTAAG EcoRI 5' G CTTAA 5' 5' AATTC G G CTTAA 5' 5' AATTC G GAATTC CTTAAG 5'5'退火5' 5' G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G T4-DNA ligase 5' 5' GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G5'5'5' 5'GAATTC CTTAAGGAATTC CTTAAG同尾酶生产的粘性末端的连接5' BclI 5' T ACTAG 5' 5' GATCA T TGATCA ACTAGT 5'5'GGATCC CCTAGG BamHI 5' GATCC GGGATCC CCTAGG5'5'G CCTAG 5'退火5' 5' T GATCC ACTAG G T GATCC ACTAG G T4-DNA ligase 5' 5' TGATCC ACTAGG GGATCA CCTAGT G GATCA CCTAG T G GATCA CCTAG T5'5'5' 5'TGATCC ACTAGGGGATCA CCTAGT不同粘性末端的连接5' CTGCAG GACGTC PstI 5' CTGCA 3' G G 3' ACGTC 5' 5' GGATCC CCTAGG BamHI 5' GATCC G G CCTAG 5' GGATCC CCTAGG5'5'T4-DNA pol切平C G G CKlenow补平GGATC CCTAG 5'5'5'5' GATCC CTAGGT4-DNA ligase 5' 5' CGATCC GCTAGG GGATCG CCTAGC5' 5'CGATCC GCTAGGGGATCG CCTAGC人工粘性末端的连接 5‘突出末端5' G CTTAA 5' 5' AATTC G EcoR I 5' 5' GATCC G Klenow 5' GATCC CTAGG TdT GATCC CCCCCCCTAGG T4-DNA ligase BamH I BamH I G CCTAG 5'Klenow5' GAATT CTTAA 5' TdT补平5' AATTC TTAAG dGTP补平GGATC CCTAG 5' dCTP GGATCCCCCCC CCTAG5'GAATTGGGGGG AATTC GGGGGGTTAAG CTTAA退火BamH I 5' 5'GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAG5' 5'人工粘性末端的连接 3‘突出末端5' GCATG 3' C TdT C 3' GTACG dCTP Sph I 5' G 3' ACGTC TdT CTGCA 3' Pst I G dGTPGCATGCCCCCC 3' C C 3' CCCCCCGTACGG 3' GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG 3' G退火5' 5'GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTCKlenow Pst ICTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACGT4-DNA ligase Pst I5' 5'5'5'GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG5' 5'人工粘性末端的连接 平头末端5' G 3' C TdT C 3' G dTTP 5' G 3' C TdT C 3' G dATPGTTTTTTTTTT 3' C C 3' TTTTTTTTTTGG 3' AAAAAAAAAACCAAAAAAAAAA 3' G退火5' 5'T4-DNA ligaseGTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC加热CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTGS15' 5'TTTTTTT T GT TG CAA AC AAAAAAAAAAAAAA A CA AC GTT TG TTTTTTTTG ACCA GT粘性末端的更换5' BamHI 5' GGATCC CCTAGG 5'G CCTAG 5'Klenow5' GATCC G5'补平5' GATCC CTAGG5'GGATC CCTAG 5'T4-DNA ligase5'GGAATTCC CCTTAAGGEcoR IEcoR I linker5'GGATCGGAATTCCGATCC CCTAGCCTTAAGGCTAGG5'重组率重组率的定义重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。重组率提高重组率的方法提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：5' GAATTC CTTAAG EcoRI 5' p AATTC G G CTTAA p 5' GAATTC CTTAAG 5'碱性磷酸单酯酶5' G CTTAA OH 5'碱性磷酸单酯酶5' HO AATTC G5'退火HO OH 5' G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A G HO OH G A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G5'重组率提高重组率的方法加装同聚尾末端：5' GCATG 3' C TdT C 3' GTACG dCTP 5' G 3' ACGTC TdT G 3' GGGGGGACGTC CTGCA 3' G dGTP CTGCAGGGGGG 3' GGCATGCCCCCC 3' C C 3' CCCCCCGTACG退火5'GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTCKlenowCTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACGT4-DNA ligase5'5'GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG5'4 基因工程的操作过程B 重组DNA分子的转化和扩增（转与增）转化的原理与技术 转化率转化细胞的扩增转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如 大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外 膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用， 使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的制备： 100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体 用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心 收集菌体 用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体 冰浴放置12 - 24小时，备用转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的质粒转化： 取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组 DNA连接液，混匀 冰浴放置半小时 在42℃保温 2 分钟（热脉冲） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟 加入1 ml 新鲜培养基，于37℃培养 1 小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选转化的原理与技术细菌原生质体的转化革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA 的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞 去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化转化的原理与技术细菌原生质体的转化细菌原生质体的制备：不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例： 细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨 酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂转化的原理与技术细菌原生质体的转化细菌原生质体的转化：取0.2 - 1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10 - 20 ml DNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀 细菌原生质体的再生： 原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生 在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素转化的原理与技术l噬菌体DNA的转染感受态细胞的培养： 将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基 中培养至OD600 = 0.5 吸附： 加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟 转染裂解： 加入20倍体积的新鲜培养基，30℃培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选转化的原理与技术电穿孔转化将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和 细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受 体细胞均有效，但转化效率差别很大 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验转化率转化率的定义转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转 化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此 转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞 接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）转化率转化率的定义例如， pUC18 对大肠杆菌的转化率为 10 8 ，即每微克 pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个 分子（6.02X1017 / ），也就是说，每3400个pUC18分 子才有一个分子进入受体细胞 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克 pUC18 共需 2ml 感受态细胞，大约含有 2X1010 个大肠杆菌细胞，也就是说，每 200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA转化率转化率的用途利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模 例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体， 经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个 重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？ 若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要： 104 / 107 X 10 - 2 = 0.1 mg 载体DNA 考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为： 0.1 / 20% = 0.5 mg 载体DNA载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算 出（5 mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选转化率转化率的影响因素载体及DNA重组分子方面： 载体本身的性质： 不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同 载体的空间构象： 质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载 体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级 插入片段的大小： 对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低转化率转化率的影响因素受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高转化率转化率的影响因素转化方法方面： 受体细胞的预处理：影响最大 供受体的比例： Ca2+诱导转化 原生质体转化 转化方法： Ca2+诱导转化 原生质体转化 106 - 107 / mg DNA 105 - 106 / mg DNA 0.1 ml 感受态细胞 109 个原生质体 50 ng DNA 50 ng DNAl-DNA转染 电穿孔转化107 - 108 / mg DNA 106 - 109 / mg DNA转化细胞的扩增扩增操作转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时 原生质体转化后的再生过程 l噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作转化细胞的扩增扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选 表达外源基因，便于筛选和鉴定4 基因工程的操作过程C 转化子的筛选和鉴定（检）载体遗传标记检测 克隆DNA序列检测 外源基因产物检测4 基因工程的操作过程C 转化子的筛选和鉴定（检）由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借 助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子转化子重组子目的重组子载体遗传标记检测抗药性筛选法抗药性筛选法的基本原理： 抗药性筛选法可区分转化子与非 转化子、重组子与非重组子 将外源DNA片段插在EcoRI位点： 非重组子呈 重组子呈 非重组子呈 Apr、Tcr Apr、TcrROI ROP Pvu I Pst I Apr EcoR I Cla I Hind III Pst I BamH ITcrpBR3224363 bpSal I将外源DNA片段插在BamHI位点： Apr、TcroriBal IHind II重组子呈Apr、Tcs载体遗传标记检测抗药性筛选法抗药性筛选法的基本操作：Ap先将转化液涂布含有Ap的平板 再将Ap平板上的转化子影印至 含有Ap和Tc的平板上 在Ap平板上生长、但在Ap和Tc 挑选 影印平板上不长的转化子即为重组子Ap + Tc载体遗传标记检测营养缺陷型筛选法营养缺陷型筛选法的基本原理： 营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组 份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的 便是转化子载体遗传标记检测营养缺陷型筛选法常见的营养缺陷型筛选标记： 用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+ 用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激 酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk-缺陷型 哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径：APAP 氨基喋呤dCDPTKdTDPdTTPTK 胸腺嘧啶核苷激酶TRdTMPdTDPdTTP载体遗传标记检测显色筛选法显色筛选法的基本原理： 显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子 与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其 表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大 肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒 pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等载体遗传标记检测显色筛选法显色筛选法的基本操作：lacZ'将外源基因克隆在 pUC18 的 lacZ’ 标 记基因内部，使之灭活，此时重组oripUC18Apr子呈Apr、lacZ-，淡黄色菌落；而非 重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落Ap + X-gal重组子（Apr + lacZ-）载体遗传标记检测克隆DNA序列检测限制性酶切图谱法所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片 段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工 作量极大，实验成本也高。克隆DNA序列检测限制性酶切图谱法全酶解图谱法：区分重组子与非重组子 用BamHI酶切转化子质粒DNA 4.0 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI1.0 kb B E0.8 kb P B电泳观察酶解产物片段重组子： 2.7 kb + 4.0 kb非重组子： 2.7 kb 如果外源DNA片段也是2.7 kb，最好 选用单一切口的酶将质粒线型化，然lacZ’pUC18 2.7 kbAprori后通过其长度来鉴定其是否为重组子克隆DNA序列检测限制性酶切图谱法全酶解图谱法：区分重组子与非重组子 4.0 kb 如果外源DNA片段插在pUC18的 SphI位点处，原则上也可用SphI 酶解鉴定，但这样做很不经济， 因为SphI非常昂贵（每100单位 50美元）。用HindIII和EcoRI联 合酶解同样可以达到目的，但这 两种酶的价格只及SphI的1 / 50Apr1.0 kb S B0.8 kb P SHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRIlacZ’pUC18 2.7 kbori克隆DNA序列检测限制性酶切图谱法全酶解图谱法：区分目的重组子与非目的重组子 4.0 kb 用EcoRI酶切转化子质粒DNA 目的重组子： 3.0 kb + 3.7 kb 或者： 1.0 kb + 5.7 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI1.0 kb B E0.8 kb P BlacZ’用PstI酶切转化子质粒DNA目的重组子： 3.2 kb + 3.5 kb 或者： 0.8 kb + 5.9 kbAprpUC18 2.7 kbori克隆DNA序列检测限制性酶切图谱法全酶解图谱法：区分目的重组子与非目的重组子 对图示的克隆片段，转化子质粒 4.0 kbHindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI2.0 kb B E E2.0 kb BDNA用EcoRI酶切开后，只出现2.0 kb和2.7 kb两条带子，实际上 2.0 kb的条带中含有两种不同的lacZ’分子2.7 kb 2.0 kbAprpUC18 2.7 kbori克隆DNA序列检测限制性酶切图谱法部分酶解图谱法：该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据： BamHI全酶解：0.6 0.8 1.8 3.4 kb BamHI+EcoRI全酶解：0.6 0.8 1.8 1.2 2.2 kb 其中，1.2 kb片段的存在表明该片段位于一端 BamHI部分酶解：1.4 2.6 4.0 kb 其中，1.4 kb的片段必为0.6 kb和0.8 kb两片段，表 明两者是连在一起的；同理，2.6 kb的片段必为0.8 kb和1.8 kb两片段，表明两者是连在一起的；最后， 4.0 kb的片段必为0.6 kb和3.4 kb两片段，表明两者 2.2 kb 4.4 kbPstI EcoRI BamHI1.2 E0.6 0.8 B B B1.8 kb E是连在一起的克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基 因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法菌落原位杂交法的基本操作：用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜 用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜 影印80℃烘干固定影印薄膜薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温 用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜 用X光胶片覆盖薄膜感光 感光 杂交 洗涤克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的制备： 用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件： 单链结构（双链DNA可用碱变性）足够长度（至少12个碱基） 内部不含互补区 GACCTAAAGCGGATCGTAGGTC 探针的制备方法或来源包括： 人工合成 cDNA合成 同源序列 mRNAGC A A GACCTA G G CTGGAT GC A T克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：T4-PNP介导的末端标记5‘ HO 3‘ HOT4-PNP 5‘ p 3‘ HO Mg2+OH 3‘OH 5‘pppATP（g-32P-ATP）OH 3‘p 5‘克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：逆转录酶介导的反转录标记3’AAAAAAAAAAACCAGCUUCC???GAACUGAUUUAGGCU 5’mRNA 5’TTTTTTTTTTT反转录酶 Mg2+ dNTP + pppdATP（a-32P-dATP）3’AAAAAAAAAAACCAGCUUCC???GAACUGAUUUAGGCU 5’mRNA 5’TTTTTTTTTTTGGTCGAAGG???CTTGACTAAATCCGA 3’cDNA克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：DNA聚合酶介导的缺刻前移标记 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…DNase I 5‘ 5‘ … G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘ DNA pol I Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA（a-32P-dATP 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-GT… 3’ ）3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：ABC荧光标记荧光胺Biotin 生物素GCTTGAGCAGTAACCTG烷烃连接臂 Avidin 生物素结合蛋白克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：ABC显色酶标记生色底物 Biotin 生物素 显色酶GCTTGAGCAGTAACCTG烷烃连接臂 Avidin 生物素结合蛋白 颜色产物克隆DNA序列检测菌落噬菌斑原位杂交法杂交探针的标记：地高辛系统标记dUTP-连接臂-甾醇半抗原 digoxigenin DIG抗体-显色酶交联复合物克隆DNA序列检测DNA序列分析法双脱氧末端终止测序法的基本原理： DNA序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段，目前国际上流行 采用Sanger发明的双脱氧末端终止法测定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定DNA序列其关键技术有： DNA链聚合反应时的定点随机中断（ddNTP）聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（600 bp / 601 bp） 电脑自动检测、记录、编辑程序 用于DNA测序的专一性试剂盒（Kit）克隆DNA序列检测DNA序列分析法双脱氧末端终止测序法的基本操作：ssDNA Primer ssDNA Primer ssDNA Primer ssDNA Primer 聚丙烯酰胺凝胶电泳ACGTKlenowdNTPs ddATPKlenowdNTPs ddCTPKlenowdNTPs ddGTPKlenowdNTPs ddTTPACGTDNA聚合反应克隆DNA序列检测DNA序列分析法双脱氧末端终止测序法的基本反应：5' P GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA OH 3'ACGTKlenowT T TTdNTP + ddATPT T5' POH 3'外源基因产物检测蛋白质生物功能测定法淀粉酶目的基因的鉴定： 淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶 淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶于水 的淀粉加入固体培养基内，培养基呈混浊状。将 待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基因的目的重组子可 其表达的淀粉酶分泌出胞外，并均匀扩散，同时降解淀粉为可溶性 的多糖或单糖。因此，目的重组子菌落周围会形成透明圈。如果透 明圈不明显，还可往培养板上喷碘，使淀粉所在区域呈蓝色本底， 易于辨认。 蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定外源基因产物检测蛋白质生物功能测定法抗菌素抗性基因的鉴定： 抗菌素抗性基因表达的蛋白质能使受体细胞产生对该抗生素 的抗性。据此，只需往培养板中加入适量抗生素，理论上长出的 菌落即是含有目的基因的目的重组子 在实际操作过程中，由于抗生素有时会诱导受体细胞产生抗 性，因此必须从抗性重组克隆中抽出重组质粒，二次转化受体细 胞。如果此时转化平板上出现大量的抗性菌落，即可认为这种抗性确由目的基因的编码产物产生外源基因产物检测蛋白质生物功能测定法抗菌素抗性基因的鉴定：目的重组子 诱导抗性抽取重组质粒再次转化外源基因产物检测蛋白质生物功能测定法DNA结合蛋白编码基因的鉴定：用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板 用聚乙烯薄膜影印裂解平板 轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定 80℃烘干固定影印薄膜 与探针溶液中杂交 洗涤、干燥、感光 探针选用能与 感光 杂交 洗涤 影印 聚乙烯膜目标蛋白特异 性结合的DNA 片段外源基因产物检测蛋白质生物功能测定法杂交释放转译鉴定： 无细胞体外翻译系统：麦胚提取物、网织红细胞提取物重组DNA 单链DNA mRNA 杂交的mDNA 蛋白质 蛋白质合并变性上样淋洗洗脱翻译测活制 备挂 柱外源基因产物检测蛋白质生物结构鉴定法放射免疫原位杂交鉴定含抗体的聚乙烯膜影印： 用氯仿蒸汽或烈性噬菌体喷洒克隆平板用固定了特异性抗体的聚乙烯薄膜影印 裂解平板 轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定 与I125标记的IgG保温 洗涤、干燥、感光 与I125标记的IgG保温 洗涤 感光外源基因产物检测蛋白质生物结构鉴定法免疫沉淀鉴定：在琼脂培养基中加入目标蛋白的特异性抗体 然后涂布转化液 经培养后，目的重组子菌落变会分泌出目标 蛋白，后者与特异性抗体发生免疫沉淀 37℃ 培养反应，在菌落周围形成白色的圆斑此法简便快速，但灵敏度低，抗体消耗量大外源基因产物检测聚丙烯酰胺凝胶电泳法如果待筛选鉴定的目标蛋白既不 能测定生物活性，又无现成的抗体使用，则可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗略的筛选4 基因工程的操作过程A DNA的体外重组（切、接） B 重组DNA分子的转化和扩增（转、增） C 转化子的筛选和鉴定（检）5 目的基因的克隆基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组 中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和 生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌 （细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣 的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建 立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另 一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。5 目的基因的克隆A 鸟枪法鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的基本战略随机克隆供体细胞的全基因组DNA 片段，然后通过快速有效的筛选程序从 众多克隆中分离出含有目的基因的目的 重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适 用于原核细菌目的基因的克隆分离鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体DNA的切断超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开， 大小不可控 部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体转化受体细胞如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达 为 的受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）鸟枪法操作的改进使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA， 然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高 重组子中目的重组子的出现频率鸟枪法操作的改进在连接前将DNA片段进行分级分离例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI 片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此 凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进 行拼接2.0 kb 1.8 kb1.6 kb鸟枪法操作的改进凝胶DNA片段回收技术冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构5 目的基因的克隆B cDNA法cDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA法分离目的基因的基本程序 cDNA法法克隆目的基因的局限性cDNA法克隆目的基因的基本战略cDNA第一链的合成mDNAG 5‘ppp’5 GAAAAAAAAAAAAAAOH 3’引物G 5‘ppp’5 G退火AAAAAAAAAAAAAAOH 3’逆转录酶G 5‘ppp’5 GdNTPsTTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’cDNA第一链cDNA第二链的合成自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺 失G 5‘ppp’5 GAAAAAAAAAAAAAAOH 3’TTTTTTTTTTTTTTp NaOH 煮沸 5’TTTTTTTTTTTTTTpOH5’3’KlenowdNTPs TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’S1 TTTTTTTTTTTTTT AAAAAAAAAAAAAAcDNA第二链的合成置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺 失 G 5‘ppp’5 GRNaesH AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp DNApol dNTPs AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ S1 5’ 3’ 5’ 5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH 3’ AAAAAAAAAAAAAAp 5’ T4-DNA ligase TTTTTTTTTTTTTT 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’cDNA第二链的合成引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列G 5‘ppp’5 GAAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ TdT dCTP AAAAACCCCCCCOH 3’ TTTTTp 5’ NaOH TTTTTp 5’3‘ HOG 5‘ppp’5 G3‘ HOCCCCCCC 3‘ HOCCCCCCC退火3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG TTTTTp 5’ Klenow dNTPs3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGGTTTTTp 5’ AAAAAOH 3’cDNA法克隆目的基因的基本战略双链cDNA的克隆双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组 分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收cDNA法分离目的基因的基本程序完备分离程序提取细胞总 mRNA，合成总 cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子 筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法 筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆， 如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等cDNA法分离目的基因的基本程序特异分离程序提 取细胞总 mRNA，琼 脂 糖凝胶 电 泳分离 ， 回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆 特异分离程序较适用于 mRNA 丰度极高的目的基因克隆 如血红蛋白基因等cDNA法分离目的基因的基本程序差异分离程序利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对 应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克 隆这些新基因，进而研究其生物学功能差异分离程序多瘤病毒感染的FR3T3细胞提取mRNA 总mRNA 合成cDNA 上柱 cDNA正常的FR3T3细胞 提取mRNA 总mRNA 共价交联 病毒诱导表达的基因 cDNA克隆 双链cDNA合成第二链克隆单链cDNA原位杂交cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA结构 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感， 分离纯化困难 仅限于克隆蛋白质编码基因5 目的基因的克隆C PCR法PCR技术的诞生与发展 PCR法定向扩增目的基因的基本原理 PCR克隆目的基因的基本程序 PCR盒式引物扩增法PCR技术的诞生与发展聚合酶链反应（ Polymerase Chain Reaction，PCR ）又称为PCR 扩增技术，是一种高效、快速、特异性的体外DNA聚合程序。 1985年，美国PE-cetus公司人类遗传研究室的 Kary mullis发明了具有划时代意义的PCR技术； 1988年，美国PE-cetus公司推出世界上第一台PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化； 1993年，Kary mullis因发明PCR技术获得诺贝 尔化学奖； 1995年，定量PCR仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实。PCR法定向扩增目的基因的基本原理使用PCR技术克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目 的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应 所需的双引物目的基因5 ‘ 5 55 ‘ 5 ‘ 55‘ 5变性加热‘聚合底物‘ 5 ‘ 5‘5退火5 ‘引物5 ‘‘3 1‘ 5‘ 5 ‘ 5 ‘退火引物‘555‘聚合底物5 ‘‘‘55 ‘ 5 ‘ 5 ‘ 5 ‘5变性加热‘变性加热5 ‘‘25 ‘ 5 ‘55 ‘退火 引物5 ‘聚合底物5‘ 5 5 ‘‘ 5‘PCR克隆目的基因的基本程序由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基 的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接 ，也可以使用专门的T载体克隆5’ A T7 lacZ MCS ori Apr T 5’ T 载体 A 5’ PCR扩增产物5’ TPCR盒式引物扩增法染色体DNASau3A部分酶切5‘ 端不含磷酸基 团加装盒式接头片段变性 引物退火扩增5 目的基因的克隆D 化学合成法化学合成法的基本战略 化学合成的单元操作 DNA化学合成的用途化学合成法的基本战略全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：小片段粘接法：根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段混合退火T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体化学合成法的基本战略全基因合成补钉延长法：根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段混合退火 Klenow酶聚合 T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体化学合成法的基本战略全基因合成大片段酶促法： 根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段混合退火Klenow酶聚合T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体化学合成法的基本战略全基因合成上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合 成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片 段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95% 则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%化学合成法的基本战略探针等寡聚核苷酸合成在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其 编码的DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到 的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子 由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时必须考虑下列问题：生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针 探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间探针内部不应出现可能的互补区域化学合成法的基本战略探针等寡聚核苷酸合成某段连续的氨基酸序列所有可能的DNA序列Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn IleTGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T 设计的简并探针序列 C CGA TGTATGGACGAIATGA CGG TGTATGGATGAIATGA CGT TGCATGGACGAIATGA CGC TGCATGGATGAIATGA A expressed sequence tag G 此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计化学合成的单元操作化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。 从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯 法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两 种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离 程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的化学合成的单元操作DMT： 二甲氧基三苯甲基DMTO CH2 H H O O H H N CH Me Me CH Me G HDMTO CH2 O H H O H H H N CH G H激活Me O P MeMe O P MeMeCH MeMe脱取代基氧化缩合玻璃珠 连接臂DNA化学合成的用途合成天然基因如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素 基因等修饰改造基因如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等设计新型基因 制备探针、引物、接头5 目的基因的克隆E 基因文库的构建基因文库的基本概念 基因文库的构建程序 基因组文库重组克隆的排序基因文库的基本概念基因库与基因文库基因库（gene pool）特定生物体全基因组的集合（天然存在） 基因文库（gene library or gene bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式 存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为： 基因组文库（含有全部基因） cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）基因文库的基本概念基因文库构建的基本战略用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库 一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA 文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基因组文库基因文库的基本概念基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概 率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N = ln ( 1 C P ) / ln ( 1 C f )其中： P = 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率 f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因组的大小 例如，人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因文库中克隆片段 的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要 45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180 万个克隆基因文库的基本概念基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选基因文库的构建程序基因组DNA的制备为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组 文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高 用常规方法制备的染色体 DNA的长度一般在100 kb左右 如果先将细胞固定在低融点凝 胶中，然后置入含有SDS、蛋A A A A白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000 kb大小的DNA片段基因文库的构建程序基因组DNA的切割用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和 限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区第二，保证DNA片段大小均一 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！基因文库的构建程序载体和受体的选择出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的 l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体 由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体 通常选质粒 上述几种载体的最大装载量如下： 质粒 l-DNA 考斯质粒 BAC YAC 15 kb 25 kb 45 kb 300 kb 400 kb用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌基因文库的构建程序从基因文库中筛选目的基因大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除 了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白 编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮 操作步骤基因文库的构建程序从基因文库中筛选目的基因密集铺板（1-10万） 目的重组克隆杂交挖取铺板铺板基因文库的构建程序基因文库构建的技术性问题在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：严禁外源DNA片段之间的连接！！！为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用TdT酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端5 目的基因的克隆A 鸟枪法BC D EcDNA法PCR法 化学合成法 基因文库的构建
基因工程概论 周学时 32 (讲授: 实验: 0 ) 32 贺淹才.基因工程概论.北京:...9 月 26 日 4 至 10 月 1 日 第三章 基因工程的工具酶(3、4、5 节)...1999 年中国农科院博士入学基因工程概论试题一.名词解释: 1.CDNA 2 Ti 质粒 3. 2u 环 4. HAT 选择 5 a 互补 6 YAC 7 转导 8 基因文库 9 限制性内 ...曹爱忠 基因工程导论 南农爱整理团队 农学院 农学 农学 9* 职称: 教授 指导教师...每个基因组中含有数万个基因; 4)含多种不同程度的重复序列; 5)基因家族:真...第一章 基因工程概论 84页 5财富值 1 第一章 基因工程概论 90页 免费喜欢...(3)将加热杀死的 S 型细菌注射到小鼠体内,小鼠不死亡 (4)将 R 型的活...1 基因工程概论 206页 免费 第一章 基因工程概论 84页 5财富值 1 第一章 ...四、结语 基因工程是一项很精密的尖端生物技术。 可以把某一生物的基因转殖送...第一章 基因工程概论 第一节 基因工程的基本概述一、基因工程的基本概念 1、...能源:石油二次开采、纤维素分解、太阳能转换 4. 环保:微生物生态种群 5. ...华北科技学院 基因工程概论_理学_高等教育_教育专区。一、课程简要介绍 第一章 ...4 生物技术与农业:农业植物生物技术;农业动物技术;农业为生物 技术 5 生物技术...2013 年中国农业科学院基因工程概论考博试题 一、名词解释(20 分) : 尾部序列...基因剔除的概念和原理; 3、RNA 编辑的概念和方式; 4、基因 5’侧翼序列的...2004 年中国农科院博士入学基因工程概论试题 一、名词解释 1、2μ 环 2、hat 选择 3、Ri 质粒 4、cDNA 5、染色体步查 6、基因文库 7、α 互补 8、YAC 9...1.1 基因工程概述(第 1 课时)(一)DNA 重组技术的基本工具编制:张统省 审核...4.基因的针线是什么?其主要作用是什么? 5.基因的运输工具是什么?有什么作用?...
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