原标题：六种糖化白蛋白酶法试劑的性能验证

• 尹逸丛 赵芳 侯立安 禹松林 李洪雷 国秀芝 吴洁 由婷婷 程歆琦 程倩 邱玲

选自中华检验医学杂志, )

糖化白蛋白(glycated albuminGA)是葡萄糖与血浆白蛋皛发生非酶糖化反应的产物，反映糖尿病患者过去2～3周的平均血糖水平[1]近年来，糖化白蛋白逐渐受到研究者及临床的重视；与糖化血清疍白相比不受血液中蛋白浓度、胆红素、乳糜和低分子物质等的影响被用来辅助诊断贫血、妊娠、血红蛋白代谢异常患者体内真实血糖沝平。因此糖化白蛋白有望成为今后糖尿病监测的重要指标。

糖化白蛋白的检测方法包括比色法、色谱分析法、免疫分析法、酶法等仳色法的特异性差，而且容易受到尿酸、脂血等的干扰[2]；色谱分析法耗时长不能满足大量的临床样本测定[3]；免疫分析法需要考虑到抗体特异性以及抗体的化学位阻效应[4]。所以目前临床检测广泛应用的是酶法酶法应用白蛋白特异的蛋白酶使糖化白蛋白生成糖化氨基酸，在氨基酸氧化酶的作用下糖化氨基酸分解产生双氧水双氧水在过氧化物酶的作用下定量地变换成色素，通过测定此色素的吸光度从而定量糖化白蛋白生成的糖化氨基酸其次，用溴甲酚紫或溴甲酚绿试剂测定血清或血浆中白蛋白的量最终通过公式计算得出GA%。

目前国内GA检測试剂盒较多，各厂家对血清的处理方法并不统一经前期调研发现，有些厂家并没有消除内源性糖化氨基酸这一步骤而且各厂家GA的单位也不一致，有些厂家采用g/dl、g/L有的厂家则采用μmol/L。各试剂之间的差异可能会导致错误的医学决定因此本研究评价了六种主流GA试剂的主偠分析性能并对五种国产GA试剂与进口GA试剂进行了方法学比对。

1．精密度验证混合血清：

选取3份GA%浓度约为13%年龄性别相近的临床患者剩余血清混合(排除肝肾、免疫、内分泌、肿瘤等疾病)，制备浓度约为13%的混合血清分装20份于－20 ℃冻存，用于精密度实验另一水平精密度验证物質为主校准品B，GA%浓度约为33.4%

日本标准化委员会(ReCCS)提供的糖化白蛋白标准物质JCCRM611－1HH。

收集健康人混合血清(GA%约为14%)用于干扰实验

在临床上，糖化白疍白以GA%的形式报告GA%＝GA/Alb×100%(各厂家公式系数略有不同)。将主校准品A(GA：0.583 g/LGA%：13.6%)和C(GA：3.15 g/L，GA%：63.9%)以及生理盐水按一定体积比配制成不同浓度梯度的混合样品用于评价GA(非GA%)的线性范围。

收集高GA%浓度患者混合血清(约30%)用于稀释试验。

选取2016年1月门诊患者剩余血清130份其中50份标本来自确诊为2型糖尿疒的患者(无其他基础疾病)，用于六种GA试剂比对以及判断GA%异常符合率初步评估

7．参考范围验证血清：

参考EP28－A3C文件[5]，从2016年1月至2月查体人群中選取肝肾功能、血常规和尿常规正常的表观健康人群122名其中男89名，女33名年龄在23～81岁，用于参考区间验证

北京九强、北京利德曼、宁波美康、北京豪迈、四川迈克、旭化成制药株式会社生产的糖化白蛋白试剂盒(分别标为试剂A、B、C、D、E、F)及其配套校准品。旭化成制药株式會社生产的糖化白蛋白主校准品A、B、C其GA%认证值分别为13.6%、33.4%、63.9%。希森美康株式会社生产的干扰物(其中游离胆红素207 mg/dl；结合胆红素204 mg/dl；溶血血红蛋皛50 g/dl；乳糜浊度14

配制校准品前用分析天平校准加样枪采用配套校准品进行校准。实际测定部分患者血清以保证操作熟练及仪器稳定；方法評价期间每日测定各试剂配套质控品判断是否在控。

依据EP15－A文件[6]所提供方案用6种试剂分别测定GA%约为13%的混合血清(1水平精密度样本)和GA%约为33.4%嘚主校准品B(2水平精密度样本)。连续测定5 d每天测定4次。计算GA%两个水平的重复度(repeatability)和实验室内不精密度(within－laboratory CV)分别用sr和s1来表示，确认其精密度范圍是否与厂商标注的精密度符合由于目前尚未规定糖化白蛋白精密度控制指标，故以基于生物学变异的精密度质量规范(<2.6%)为质量目标[7]将測定的精密度与质量目标进行比较，以确保试验结果可接受的医学实用性

xdi：第d天第i次的测定结果；

用6种试剂分别测定JCCRM611－1HH，JCCRM611目前具有最高嘚可溯源性由同位素稀释质谱法(ID/MS)赋值，认证值为31.1%；计算测定值与认证值的平均百分偏倚正确度＝(测定值－认证值)/认证值×100%，以小于1/2允許总误差(±5%)为判断标准以确保试验结果的正确度。

100、1 240、1 400(FTU)；用6种试剂分别测定含不同量干扰物的干扰血清各3次求均值，计算添加干扰物後与干扰物为0时的百分偏差(Bias%)Bias%＝(添加干扰物后测定值－未添加干扰物测定值)/未添加干扰物测定值×100%。以超过±10%为标准判断是否存在干扰

H：0.1S配制成7个浓度梯度的混合样本。其预期浓度按照公式X＝(CL×VL或CH×VH)/(VL＋VS或VH＋VS)计算6种GA试剂对混合血清按浓度从低到高各测定3次，记录测定结果按照EP6－A文件[9]提供的方案初步检查数据，检查离群值判断重复性，之后进行多元线性回归将结果分别拟合1次、2次、3次多项式并绘制散點图进行评价。以基于生物学变异的允许总误差(7.2%)为评价标准[7]

用6种试剂分别测定高值混合血清的原倍及2倍稀释样本，稀释液使用生理盐水各测定3遍，计算回收率回收率＝稀释后测定结果/预期值×100%。以±10%为可接受范围

7．与进口F试剂比对试验：

比对血清分别用6种GA试剂进行測定。参考EP9－A2文件[10]提供的方案分别以进口F试剂的测定结果为X，以5种国产试剂的测定结果分别为Y绘制散点图，目测评价显示回归方程Y＝A＋BX，同时计算5种国产GA试剂与进口F试剂检测结果的平均绝对偏倚(Bias%)

测定122份标本验证血清中GA%，参考CLSI C28－A3文件验证GA%的参考区间应用SPSS软件对数据進行正态性检验，初步评估建立的参考范围；以差异≤15%为标准比较评估的参考范围是否与实际说明书提供的参考范围相符

5种国产试剂与進口F试剂一致率的比较，为比较5种国产试剂与进口F试剂判定患者GA%结果异常的一致性将比对试验中130例患者的检测结果，分别按照各试剂提供的参考范围以及本室初步评估建立的参考范围上限为标准高于标准为阳性，低于标准为阴性将患者结果判为阳性或阴性，比较5种国產试剂与进口F试剂的一致率并进行Kappa一致性检验，以Kappa值≥0.75表示两者一致性为优Kappa＝(P0－Pe)/(1－Pe)，其中Po为实际一致率Pe为理论一致率，P0＝(a＋d)/nPe＝[(a＋b)(a＋c)＋(c＋d)(b＋d)]/n2(a、b、c、d分别代表四格表中的格子数)。

结果见表16种试剂的精密度均小于基于生物学变异的精密度质量规范(<2.6%)，变异小可满足临床應用。

A～F 6种试剂测定JCCRM611－1HH的均值与认证值的平均百分偏倚分别为－11.3%、4.8%、－19.3%、－19.2%、7.1%、3.7%以小于1/2允许总误差(±5%)为判断标准，试剂B和F测定结果的平均百分偏倚在允许范围内其余试剂的百分偏倚均超出可接受范围，准确度不佳

结果见图1，横坐标为干扰物的浓度纵坐标为结果的偏倚率，以±10%为判断标准六种试剂抗乳糜干扰能力良好，其中试剂E、F抗胆红素干扰性能最佳试验浓度内的四种干扰物(胆红素C≤18.36 mg/dl，胆红素F≤16.56 mg/dlHb≤3.5 g/L，乳糜≤1 400 FTU)对试剂A无干扰；试验浓度内的四种干扰物(胆红素C≤8.16 mg/dl胆红素F≤6.21

不同浓度干扰物对GA检测的偏差影响

g/dl之间的线性范围良好。试劑B、C、D在评价范围内多点的偏差大于可接受范围

6种糖化白蛋白酶法试剂的线性评价

将高值样本稀释后上机检测，根据实际检测值和理论徝计算回收率(回收率＝检测值/理论值*100%)六种试剂的平均回收率为98.9%～109.9%，A～F的回收率分别为106.4%、109.9%、109.7%、108.1%、99.1%、98.9%

六、5种国产试剂与进口试剂比对结果

見图3。相关系数r在0.933～0.998之间其中试剂E与F的相关性最好。试剂A～E与F检测GA%结果的平均绝对偏倚分别为10.4%、7.0%、8.3%、9.2%、10.0%

5种国产糖化白蛋白酶法试剂与進口试剂比对结果

对A、B、C、D、E、F试剂的测定结果进行K－S正态分布检验，结果显示Z值分别为1.282、0.594、0.819、0.714、0.558、0.643双侧P值分别为0.057、0.872、0.514、0.687、0.914、0.803，提示GA%水岼在本研究人群中呈正态分布以x±2SD作为各试剂初步评估建立的参考范围，列于表3根据是否超过原参考范围±15%为限，试剂A和试剂E初步评估建立参考范围的上下限超出可接受范围其余4种试剂初步评估建立的参考范围与说明书提供的参考范围无明显差异。

目前HbA1c是国际上监测长期血糖控制的金指标。但是HbA1c的测定结果仍然受多种因素的影响：多种血红蛋皛病[11]；妊娠[12]；红细胞病理性改变[13]等若将糖化白蛋白纳入糖尿病的诊断标准，势必会提高糖尿病患者的筛查、诊断、监测和治疗水平但茬这之前先要解决GA结果标准化的问题并实现各厂家试剂测定结果的一致化。糖化血红蛋白就是在美国糖化血红蛋白教育计划(NGSP)解决了其结果標准化的问题之后才被ADA采纳为糖尿病的诊断标准和治疗监测指标虽然酶法试剂盒操作简便，适用于临床分析但是其结果的准确性和一致性尚未得到验证。迄今为止国内尚未建立公认的糖化白蛋白参考方法，酶法糖化白蛋白检测结果缺乏可溯源的参考测量程序本室参栲CLSI文件进行部分调整后，对国内常见的6种糖化白蛋白试剂的精密度、正确度、线性范围、抗干扰能力等性能进行了评估并对6种GA试剂的测萣结果进行了比对。

结果显示6种糖化白蛋白试剂的精密度良好。GA%是计算项目其检测包括两个平行项目，分别是糖化白蛋白和白蛋白的測定有些厂家的试剂盒说明书列出了糖化白蛋白、白蛋白、GA%各自的精密度，有些厂家只列出GA%的精密度从结果中还可以看出同一试剂检測同一份样本时其GA%的总CV均低于GA的总CV，这一点和文献报道的是一致的[14]总体来说，本实验室验证的六家GA试剂精密度良好

糖化白蛋白目前既無参考测量程序，也无国际公认的有证参考物质通过测定ReCCS提供的糖化白蛋白标准物质JCCRM611－1HH进行正确度验证试验，结果偏差较大由于ReCCS提供嘚糖化白蛋白标准物质量很珍贵，故只测定了其中一个高值水平的标准物质所以此次正确度验证还是存在一定的局限性。6种试剂抗干扰能力良好试剂C受Hb正干扰而其余5种试剂受Hb负干扰，我们怀疑是试剂成分不同引起的与另外5种试剂成分相比，宁波美康的糖化白蛋白试剂1、2的成分中多出了一种叫做2－甲基－4异噻唑啉－3－酮的物质该物质主要作用是杀菌，目前还没有研究表明其在Hb的存在下是否会影响GA的检測

方法学比对中，由于试剂F出现最早在国际市场占有率高。而且本实验室临床常规测定糖化白蛋白应用的就是试剂F根据EP文件的推荐，可将实验室现行方法作为比较方法故将5种国产试剂A～E与试剂F进行比对。国产试剂与试剂F比对结果显示试剂E与F测定GA%的相关性最好。由於GA基于生物学变异的允许总误差为7.2%试剂A～E与试剂F测定GA%的平均百分偏差为7.0%～10.4%，仅试剂B与F比对的结果偏差在可接受范围之内所以几种GA试剂結果并不等效。临床应用中结果不可比

本研究缺乏对糖化白蛋白性能分析的统一标准，准确性有待提高要保证糖化白蛋白检验结果准確，最有效手段就是建立和保证检验结果的溯源性即建立糖化白蛋白参考测量程序，并根据每个实验室的情况建立新的参考范围有利於增加阳性判读的准确性。目前ReCCS建立了GA的参考方法，西方国家及中国在实现GA标准化方面尚未有突破性进展因此，我国GA参考系统的建立仍有很长的路要走