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ZetasizerNano系列:培训课程WhoAreMalvernInstruments?马尔文仪器是一家英国公司，专注于设计和制造精确的测量仪器，应用于粒子尺寸及其分布粒子的电荷分子量粒子形态分散体系的流体力学性质ZetasizerNano能够测量什么参数？三种测量技术动态光散射（DynamicLightScattering）通过非侵入背散射(NIBS)测量粒径及其分布激光多普勒电泳（LaserDopplerElectrophoresis）通过激光多普勒测速和相位分析光散射技术相结合的马尔文M3-PALS专利技术测量zeta电位静态光散射（staticlightscattering)分子量以及第二维利系数A2测量ZetasizerNano系列:Contents动态光散射（第一天）测量原理Nano系列的优化测量位置由相关曲线得到粒径信息–预算法则样品要求样品制备数据解释静态光散射及分子量的测定（第二天）Zeta电位测量原理（第二天）动态光散射DynamicLightScattering测试原理MeasurementPrincipleZetasizerNano是如何测试粒子的粒径的?动态光散射DynamicLightScattering(DLS)，也称光子相关光谱PhotonCorrelationSpectroscopy(PCS)，准弹性光散射quasi-elasticscattering，测量光强的波动随时间的变化粒子的布朗运动Brownianmotion导致光强的波动光子相关器correlator将光强的波动转化为相关方程相关方程检测光强波动的的速度，从而我们得到粒子的扩散速度信息和粒子的粒径d(h)从相关方程我们还可以得到尺寸的分布信息Nano的光学构造动态光散射及布朗运动动态光散射散射光强的波动相关方程表示随时间变化的相关性质相关方程（曲线）光强波动，相关函数和粒径分布STOKES-EINSTEINEQUATION动态光散射实际测量的是什么?流体力学直径动态光散射实际测量的是什么?流体力学直径离子强度的影响1/K,Debye长度是带电颗粒双电层的厚度,他取决于介质中的离子浓度动态光散射的特点：上亿个粒子的统计学效果，使得对粒径及其分布的测量更加准确对微量存在的大颗粒极其敏感在溶液状态下测量颗粒的尺寸测试速度快，所需样品少需要溶液的粘度和折光指数等光学参数所得到的尺寸分布正比于不同种类颗粒对光强的贡献率所需参数平均粒径和宽度（分散系数）温度溶剂的粘度和折光指数（温度依赖性）粒径的体积和数量分布米氏理论需要:样品的折光指数样品的吸收率动态光散射由相关曲线得到粒径信息:运算法则相关曲线相关曲线累积距法ISO)定义了应用于动态光散射技术的累积距法这种方法给出了平均粒子尺寸(z-average)和一个粒子的分布系数(polydispersityindex)这个分析方法只需要分散剂的折光指数和粘度累积距法ISO13321阐述用三次方多项式拟和相关方程Ln[G1]=a+bt+ct2这里t是衰减时间bαz-均扩散系数2c/b2为分布系数z-均直径z-均直径(ZD)的定义:累积距法得到的粒子平均尺寸对应于不同尺寸粒子散射光强的贡献这里“平均”的概念特指用于光散射试验中这种算法得到的平均尺寸对于大的缔合物及灰尘非常敏感分布系数 分布系数定义(PDI):有累积距法得到的分布系数是一个无纲量的值，代表粒子尺寸的分布宽度在ZetasizerNano软件中他的范围是0到1如果PDI大于1，这说明样品的尺寸分布非常宽，可能不适合用动态光散射的方法来测量分布系数 对于分布的分析对于相同的光散射数据，可以有几种不同的分析结果为了适应不同的样品类型,两种NNLS分析模型被应用到一起的软件中GeneralPurposeMultipleNarrowModes这两种算法的差异在于所得到的分布曲线的平滑程度generalpurpose算法适用于大部分分布状况未知的样品multiplenarrowmode算法适用于分布状况不连续的样品ZetasizerNano软件中的尺寸分布分析由DLS而得的基本的尺寸分布，是一个根据光强的贡献率，并使用(NNLS)分析方法得到的分布尺寸分布被表示为一个散射光相对光强对于对应的粒子尺寸的曲线默认地，在尺寸分布中最多可以出现70个等级ZetasizerNano软件中的尺寸分布分析使用光强分布数据应用Mietheory演算而来换算过程需要粒子的光学性质粒子的折光指数粒子对光的吸收率动态光散射DLS的粒子尺度分布光强分布，体积分布和数量分布之间的相互转换基于以下前提:所有的粒子都是球型的所有的粒子都是均匀的，且密度相同光学性质已知（折光指数，吸收率）动态光散射DLS技术往往高估分布峰的宽度，这个影响可以从体积
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激光动态光散射仪操作手册
激光动态光散射仪操作手册一、 动态光散射仪的工作原理 动态光散射技术（dynamiclightscattering,DLS）是指通过测量样品散射光强 度起伏的变化来得出样品颗粒大小信息的一种技术。之所以称为“动态”是因 为样品中的分子不停地做布朗运动，正是这种运动使散射光产生多普勒频 移。动态光散射技术的工作原理可以简述为以下几个步骤：首先根据散射光 的变化， 即多普
勒频移测得溶液中分子的扩散系数 D， 再由 D=KT/6πηr 可求 出分子的流体动力学半径 r，(式中 K 为玻尔兹曼常数，T 为绝对温度，η 为 溶液的粘滞系数),根据已有的分子半径-分子量模型，就可以算出分子量的大 小。 光在传播时若碰到颗粒，一部分光会被吸收，一部分会被散射掉。如果分子 静止不动，散射光发生弹性散射时，能量频率均不变。但由于分子不停地在 做杂乱无章的布朗运动，所以，当产生散射光的分子朝向监测器运动时，相 当于把散射的光子往监测器送了一段距离，使光子较分子静止时产生的散射 光要早到达监测器，也就是在监测器看来散射光的频率增高了；如果产生散 射的分子逆向监测器运动，相当于把散射光子往远离监测器的方向拉了一 把，结果使散射光的频率降低。日常生活中，但我们听到救护车由远而近时， 声音的频率越来越高，也是同样的道理。实际上我们可以根据声音频率变化 的快慢来判断救护车运动的速度。 光散射技术就是根据这种微小的频率变化来测量溶液中分子的扩散速度。由 D=KT/6πηr 可知， 当扩散速度一定时， 由于实验时溶剂一定， 温度是确定的， 所以扩散的快慢只与流体动力学半径有关。蛋白质多方面的性质都直接和它 的大小相关。 因此， 光散射广泛应用与蛋白质及其它大分子的理化性质研究。 动态光散射技术的优点： 1．样品制备简单，不需特殊处理，测量过程不干扰样品本身的性质，所以能够反映 出溶液中样品分子的真实状态； 2．测量过程迅速，而且样品可以回收利用； 3． 检测灵敏度高， 10kD 蛋白质， 浓度只需 0.1mg/mL,样品体积只需 20-50?L 即可； 4．能够实时监测样品的动态变化。 二、动态光散射技术的应用 溶液中的颗粒物质（如生物大分子、高分子聚合物、胶束等），其颗粒大小的变化 往往可以反应出某些性质方面的变化。由于光散射实际上是首先通过测量大分子物质的扩散系数，进而推导出其它参数。所以，光散射不仅可以用 来进行静态测量，还可以检测一些动态过程的变化。 下面以大家熟悉的生物学中的几个具体实例来介绍动态光散射技术的应用。 1.测定蛋白质分子的均一性 蛋白质样品的均一性是生长晶体的前提条件，在无法直接观察蛋白质在溶液中状态 的情况下，生长晶体是一个需要经验和运气的过程。但是用光散射技术，只需要几 分钟就可以确切地告诉你，这个样品是否有长出晶体的可能性。你还可以测定蛋白 在不同溶液中的状态，从而确定出哪种溶液最适合生长晶体。 2.测定蛋白质分子的 pH 稳定性 有些蛋白质分子在不同的 pH 值条件下，会有不同的构型，或者形成聚合态，或是 变性。如胰岛素在 pH2.0 时是以单体存在，而在 pH3.0 时则以二聚体形式存在，当 pH 升至 7.0 时则以六聚体存在。因为这种变化表现为大小的变化，所以光散射技术 可以用来测定蛋白质分子的 pH 稳定性。 3.测定蛋白质分子的热稳定性 对一些热不稳定的蛋白，温度改变会导致分子变性聚合，因此可以观察到分子半径 明显增大。所以可以利用光散射技术来研究蛋白质分子的热稳定性。 4.蛋白质变复性及折叠的研究 蛋白质变性时往往是以聚合形式或较松散的状态存在，复性后，蛋白质折叠成天然 状态，会发生结构的变化，这一变化可以导致流体动力学半径的变化，所以光散射 技术可以用来检测这一动态变化的过程。 5.临界胶束浓度的测定 一定浓度的表面活性剂分子加到溶液中会形成微胶束，但浓度不同会影响胶束的大 小以及是否能够形成胶束。如果浓度增加到一定程度，胶束就会形成，胶束的大小 和单分子大小会有明显区别，利用光散射就可以确定胶束形成的临界浓度。 动态光散射技术还可用于一些动态过程的检测， 譬如蛋白质复性的整个过程的监测。三、激光动态光散射仪的结构 动态光散射仪的结构原理图如下：仪器结构总是与其功能相适应的，下图为生命科学学院所有的 proteinsolution 公司 的 MS800 光散射仪的外形。上方为主机，包括激光器、检测器、相关器等；下方是温控器和样品室四、动态光散射仪的使用 1、样品制备 由于动态光散射仪对灰尘和气泡及其它大的颗粒非常敏感，所以制备样品时，一定 要注意不要让样品中混有大颗粒物质。一般采取如下措施：a)先将样品离心，12000g 离心 5 分钟,离心时的温度视样品要求而定。取上层样品 过滤，滤膜的选择要视样品分子大小而定，对蛋白质样品通常用 0.02?m 的滤膜， 如果目标分子在 100kD 以上，建议用 0.1?m 的滤膜。过滤后的样品直接加样到样 品室中。 、加样步骤 将加样针伸到样品池的底部，一边加样一边缓缓向上提起加样针，以免形成气泡， 然后盖上样品池的盖子。注意，加样针不能碰到样品池的窗口，否则会留下划痕， 影响测量。 1）样品池的清洗与准备 2）动态光散射技术非常灵敏，所以对每一个细节的要求都很高。样品池的内外表面 不能粘有脏物，不能有手指印迹等。 3）清洗步骤：用 1％tritonX－100 浸泡，超声清洗十分钟，然后用超纯水冲洗干净， 再用高纯氮气吹干。检测是否洗干净的方法是装上超纯水，进行光散射测量，看散 射光强是否与标准值接近。清洗干净的样品池保存在专用的盒子中备用。 3、数据分析与解释 *Polydispersity CP&15%ofRH?均一(如下图上排所示)。注意：均一并不说明一定是单体，下图上 排三种情况均是均一状态。 CP&30%ofRH?(如下图下排左一所示)CP&30%ofRH?(如下图下排左二、三所示)五、实验步骤 1、打开计算机，打开光散射仪电源； 2、运行 DynamicV6 程序，将温度设定在所需的值，并待其温度稳定； 3、装配过滤器，滤膜孔径为 0.02?m。将 100ul 配制好的蛋白质溶液 12000rpm 离 心 5 分钟，取上层样品 40 微升，过滤上样。 4、新建实验窗口，从 file 菜单中选择 new 或在主界面直接点击 new 快捷; 5、输入相应的参数和文件名，参数包括；溶剂类型，采集数据的时间，温度，样品 浓度，所选理论模型等; 6、将盛放好样品的样品池放到样品室中，盖上样品室盖子； 7、点击 record 按钮，采集数据； 8、收集十组以上有用数据，分析实验结果； 注意，样品池用过之后，下一次上样之前，必须清洗干净，判断方法是在样品池中 加入过滤后的超纯水，看所测结果是否符合标准。 六、注意事项 仪器中光路系统的干燥管需要定期检查，如果吸潮到一定程度，需要烘干再生。 实验流程 开机及打开软件 设置参数（包括温度，激光强度，分子结构模型） 将样品放到散射池中 将散射池放到样品室中 等五分钟，待温度平衡 采集数据 检测数据采集 保存数据如果数据较好，分析粒径分布 采样结束，取出散射池 清理散射池，装载下一个样品 采集数据 重复测试其它样品或终止实验 推出软件（必须在关闭仪器电源之前） 关闭电源 操作流程图示软件操作部分 1、新建一个文件2、点击右下的 connect,建立软件与仪器的连接；3、连接成功后，startbutton 会变成绿色。4、装载样品，点击 startbutton，即可开始采集数据。数据采集时，startbutton 为红 色，点击红色的 startbutton 即可停止数据采集。建议： 1]第一次上样建议用未过滤的样品，最小上样体积 12 微升。把加样针的前端伸到样 品池的底部，加样时缓慢将上样针上提，避免气泡产生。 2]如果采集的数据表明样品有聚集或者有大的颗粒，可将样品进行离心（15000g， 10min）,或者将样品进行过滤处理。当样品池放好，点击绿色 startbutton 按钮，采集数据。 如果按钮不是绿色，表明计算机没有和仪器连接起来；采集十组有效数据以上，停 止采集数据 5、数据的自动采集在程序界面的树目录栏位，点击右键，可以设置程序采集数据，可以设置时间延迟， 数据采集，数据保存，温度设置等。 7、数据保存点击 fileCsave，或点击 save 按钮保存文件。 8、数据分析处理 通过软件对采集的数据进行分析处理。您现在的位置：>>> 正文
动态光散射--胶体金：药物输送的黄金标准？
导语经过十年的投入，纳米技术已步入成熟。如今纳米医用材料正逐步出现在临床与医学实践中。从商业角度来说，到2015年底，这一悉心培育的研究成果有望使生物医学纳米技术市场产值突破700亿美元。而从实际应用来看，这意味着疾病靶向及治疗的方法可能会发生变革。&纳米级的胶体金在多重治疗与生物科技应用中具有很大潜力。以药物输送为例，通过控制胶体金独特的化学、物理和电子特性，研究人员能够开发出用于靶向药物输送的药物-纳米粒子复合物，提升药物在病变组织、癌细胞等特定生物目标中的生物分配和药代动力。因此，对创新细胞内输送媒介以及控制配方过程中的纳米粒子粒度而言，黄金纳米粒子便成为了一个重要平台，对于这项功能的定义至关重要。&本文阐述了检测颗粒大小在生物医学纳米技术中的重要性，并通过展示实验数据来说明如何利用先进的动态光散射（DLS）技术测量纳米级和亚纳米级的胶体金。&闪光之物：黄金疗法简史自古时起，人们便认为黄金具有治疗特性。然而直到18世纪，含氰金盐的抗菌性才被发现。时光飞逝，百余年后的今天，金盐已被用于风湿性关节炎的常规治疗和控制。但在这些传统的治疗手段以外，现代人对黄金的胶体形态又燃起了新的兴趣。&胶体金的许多特性使其非常适合于多种纳米材料基质的临床应用。它的化学和物理惰性确保其在活体内安全无毒，而精细的粒度则使它能够在无损细胞的情况下穿过细胞膜。此外，悬浮在水介质中的黄金纳米粒子会形成带负电的离子，对蛋白质、抗体等生物大分子有很强的亲合性，使它们在离子的周围形成生物配体。目前，显像探针、诊断剂、高级药物输送等各种生物医学应用都在开发这些独特的物理特性。在高级药物输送这一领域中，利用黄金纳米粒子为口服胰岛素、先进基因疗法所需靶向抗癌药及DNA复合物等一系列传统和创新疗法提供尖端输送机制的研发活动也正在进行之中。&和所有的微粒疗法一样，胶体金复合物的生物利用度和临床疗效等药代动力学特性会在很大程度上受粒度影响。因此，控制胶体金的粒度是确保治疗方法在活体内符合疗效与安全标准的关键。颗粒表征是纳米粒子研发及质量控制中非常重要的一方面，为此需在配方的中间及最终阶段进行常规分析，以确保颗粒直径均匀，且分散中不存在聚集体。这需要一项强有力的分析技术，将整个样本内稳健可靠的颗粒表征与常规分析所要求的高效率相结合。作为一项满足此类行业需求的高效技术，动态光散射（DLS）的优势正在凸显。&引入动态光散射在纳米粒子的开发中，有几种常规使用的颗粒表征技术。采用电子显微镜的颗粒显像技术已广泛用于细致了解系统内各个颗粒的结构与形态（图1）。然而，该技术存在的若干局限性限制了其在常规分析中的实际应用。&电子显微镜仅仅能够测量少数样本分布，且测得的是基于数量的粒度平均值。而胶体金产品由成千上万的颗粒组成，因此从统计角度来说，根据此类数据来推断产品的整体均匀性或聚集体浓度可能并不是好方法。即使出现低量的聚集体，临床疗效也会受影响，而且这通常还表示加工或配方存在问题，因此质量控制不能仅依靠电子显微镜。此外，用电子显微镜分析通常耗时长、强度大，既费成本又费人力。因此需要一项集合技术来做补充，以体积或质量为基准，确定整个分散体中的粒度分布，从而识别出不合规格的聚集体。&动态光散射（DLS）是一项非入侵式技术，通常用于分析分散粒子及胶态纳米粒子。DLS技术检测做无规则布朗运动的悬浮颗粒得到散射光强度随时间产生的波动。分析这些光强波动后便可以得到扩散系数，然后用斯托克斯-爱因斯坦方程算出颗粒大小。&近年来，DLS技术的一些进步已经提升了DLS测量在纳米级范围中的灵敏度和分辨率。例如，获得专利的非侵入式背散射（NIBS）光学仪器现已能在动态粒度范围内进行测量，可测颗粒直径在0.3nm至10微米之间，溶液浓度涵盖0.1ppm至40%w/v。用DLS技术进行数据采集速度快，不影响样本回收，无论在研究领域，还是质量控制中，都能够有效发挥作用。&以下案例分析探讨了DLS技术用于纳米粒子表征的优势。胶体金的实验数据重点说明了通过DLS技术获得的结果与电子显微镜技术之间的差别，以及如何借此更好地了解纳米粒子体系。&案例研究：使用DLS技术进行胶体金表征实验利用高级DLS系统（英国马尔文仪器Zetasizer&Nano&S）对某一胶体金样本进行了测量。所有测量都在25℃时进行，&DLS系统使用633nm激光光源，雪崩光电二极管（APD）作为光电探测器，检测散射光角度为173度。&图2展示了胶体金样本的光强粒度分布。图中显示了粒子的光散射在不同粒度等级中所占的相对百分比。分别位于13.6nm和339nm处的两个不同峰值表示粒子呈双峰分布，说明样本内存在聚集体。&首先，从粒度分布峰值的相对光强来看，样本内似乎存在大量的聚集体。然而，将其转换成基于体积的分布时，如图2所示，显然实际上聚集体的浓度是相对较低的。这一转换由智能仪器软件实施，其中运用了米氏散射理论以及粒子的折光指数和吸收率。体积粒度分布显示，在单位质量内，绝大多数样本颗粒为13nm左右的小颗粒，且原始粒子与聚集体之比为9:1。&将基于体积或光强的粒度测量与基于数量的分析方法相比较，便会发现DLS技术与传统纳米粒子分析技术相互补充的价值所在。如图4所示，基于体积的分布转换成了基于数量的分布。由于样本所含的聚集体极少，因此数量分布为单峰，峰均值为12.4，且仅考虑了原始粒子。该结果表明，如果用电子显微镜等技术对该样本进行表征，所呈现的大部分颗粒将会是小颗粒，因而难以准确地推断出聚集体的整体浓度。&动态光散射分辨率相对低于电镜技术，通常来讲如果颗粒粒径相差三倍或者更多，可以通过动态光散射技术得到分开的分布峰。然而，通过智能数据解读，我们还是可以了解到相当多的样品的粒径分布信息。比如，当单个颗粒与由2、3或4个颗粒组成的聚集体相混合时可能会产生一个宽峰。由于较大的颗粒散射了大部分光，因此相较于颗粒较小的原始粒子，聚集体对于峰值的影响更大。Z-均直径和多分散指数值都对聚集体的存在表现敏感，因此可以很好地指示样本内是否存在聚集体。Z-均直径是光强加权流体力学直径的平均值，多分散指数PDI表征了颗粒粒径分布宽度。这两项参数均由系统根据动态光散射国际标准ISO22412计算得出。&关于动态光散射纳米粒子的开发和配方需要对整个样本进行快速可靠的质量控制分析，而动态光散射提供了满足这一需求的解决方案。通过具有极高统计学意义的粒度分布图，DLS技术使用户能够快速地识别出聚集体或不合规格颗粒，而如果仅利用基于数量的粒度测量技术则可能无法做到。如今，商用DLS系统已经可以使用这一高端技术，为高级生物医药应用中的纳米粒子均匀性与聚集研究提供所需高灵敏度、高精确度和高分辨率分析。&Stephen&Ball&为马尔文仪器纳米粒子与分子表征产品营销经理。他于英国萨里大学获得计算机辅助化学学位，期间作为研究化学师在瑞士豪尔根的陶氏化学公司进行了为期一年的产业实习。在加入马尔文仪器之前，他曾在Polymer&Laboratories担任应用化学师，随后又在安捷伦科技担任光散射仪器产品经理一职。&&&&&&&&图1&从统计角度而言，在纳米粒子的均匀性与聚集研究中，仅仅依靠电子显微镜进行基于数量的粒度分布测量可能并不是一种好方法。&图2&胶体金样本的双峰光强粒度分布表明，样本内存在聚集体。&图3&以DLS技术分析的胶体金样本体积分布显示，超过90%的样本由13nm左右的小颗粒组成。&图4&以数量分布测量粒度、生成原始颗粒的单峰分布图。
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