人工气候老化试验箱老化处理对辣椒浸出电导率的影响

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人工老化

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当前栏目:<FONT COLOR='#04年1月16日　作者:ctnyzn
高压静电场处理对老化黄瓜种子脂质过氧化的影响
朱诚　房正浓　曾广文
摘　要：研究了167 kV/m电场处理对老化黄瓜种子脂质过氧化的影响。结果表明，处理1，3，5 min可提高种子发芽率、发芽指数和活力指数，其中以处理3 min效果较佳；并可提高种子内过氧化物酶（POD），过氧化氢酶(CAT)和超氧物歧化酶(SOD)的活性；降低丙二醛(MDA)和氢过氧化物含量及电解质渗漏。认为降低脂质过氧化程度，促进膜系统的修复是静电场提高种子活力的生理原因之一。关　键　词：高压静电场；黄瓜种子；脂质过氧化中图分类号： Q946.4； S642.2　　　文献标识码： A文章编号：00)02-0127-04
The effect of HVEF treatment on lipid peroxidation of aged cucumber seeds
ZHU Cheng，ZHENG Guang-wen（Life science coll., Zhejiang Univ., Hangzhou 310029, China）FANG Zheng-nong（Science coll., Zhejiang University, Hangzhou 310028, China)
Abstract: The effect on the lipid peroxidation of aged cucumber seeds of the high voltage electrostatic field (HVEF)treatment was studied. The aged cucumber seeds were treated for 1,3 and 5 min with HVEF (167 kV/m). The results showed that the germination rate, germinating index and vigor index of seeds were significantly increased, the activites of POD, CAT and SOD were raised, the contents of MDA and hydroperoxide, leakage of electrolyte were lowered. The better condition was 167 kV/m for 3 min. It suggests that the decline of the lipid peroxidation level and the stability of the membrane structure are the main physiologicol causes of promotion of seed vigor.Key words： high voltage lipid peroxidation
　　种子活力降低是自然界的普遍现象，也是农业生产中的一个严重问题，而种子预处理是提高种子活力的一条重要途径。静电场对农作物种子产生的生物效应早已被学术界所接受。已有报道表明静电场处理可提高多种农作物（如水稻、小麦、番茄、茄子等）种子的活力，促进其幼苗的生长［1］。并从酶(如脱氢酶、α-淀粉酶、过氧化物酶等)活性、呼吸强度以及物质成分的改变等方面研究了其生理原因［2，3］。近年来，许多研究指出种子活力下降与活性氧或自由基的伤害密切相关［4］。本文试图从脂质过氧化作用方面探讨静电场处理提高种子活力的生理原因，以进一步分析其提高种子活力的作用机制，为静电场应用于生产实践提供理论依据。
1　材料和方法
1.1　材　料　　黄瓜种子(Cucumiis safivus L) 为津研7号。1.2　方　法1.2.1　种子人工老化　　按Delouche的方法［5］，老化温度40 ℃，相对湿度93%。1.2.2　静电场处理　　将老化0,3,7 d的种子辅成单粒厚度，置静电场中在167 kV/m均强下分别处理1,3,5 min, 然后测定种子活力和生理生化指标。1.2.3　种子萌发和活力测定　　参照朱诚的方法［6］.1.2.4　生理生化指标测定　　种子浸出液的电导率测定取10粒种子，加6 mL蒸馏水，26 ℃下平衡6 h，用DDS-11A型电导仪测电导率(A)，然后用100 ℃沸水中杀死种子，冷却至26 ℃再测电导率（B），以相对电导率R=A/B×100%表示。过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶 (CAT) 和超氧物歧化酶 (SOD) 酶液制备和活性测定的方法以及氢过氧化物和丙二醛含量测定均参照朱诚的方法［6］。酶活性单位以毫克蛋白质中的量表示。以上测定均重复四次。
2　结果与分析
2.1　对老化黄瓜种子萌发的影响　　以167 kV/m的场强对不同老化程度的种子进行1，3，5 min处理。由表1可见,未经老化的种子(发芽率为94%)经预处理后其发芽率与对照基本相同，发芽指数和活力指数略高于对照，但均未达到显著水平。老化3 d和7 d的种子(发芽率在51%～70%之间)，经静电场预处理后，其发芽率、发芽指数和活力指数均明显地高于对照，其中以3 min处理的最显著。老化3 d静电场预处理3 min，其种子发芽率、发芽指数和活性指数分别提高了30%、32.4%、29.5%。老化7 d，静电场预处理3 min，其发芽率、发芽指数和活性指数分别提高了70.5%，59.30%和59.70%。表明在发芽率较高的情况下，静电场处理影响不大，但发芽率较低时，静电场预处理对种子活力的提高有显著的作用。
表1　高压静电场处理对老化黄瓜种子萌发和活力的影响Table 1　Effects of HVEF on germination and vigor of aging cucumber seed
老化天数/d
处理时间/min
25.6026.8027.8026.90
71.2075.1477.1874.89
17.4919.9823.17**18.02
54.2161.1770.18**60.14
13.1716.1920.9815.87
40.1858.92**64.19**54.17**
1―老化 0 　2―老化3　3―老化7 d图1　高压静电场处理对老化黄瓜种子细胞膜透性的影响Fig. 1　Effect of HVEF on the conductivity in Leakageof aged cucumber seeds
2.2　对老化黄瓜种子细胞膜透性的影响　　种子浸出液中相对电导率大小在一定程度上反映了种子细胞膜系统的完整程度。种子活力与电导率一般呈负相关［6］。从图1可见，随着老化时间的延长，种子浸出液的相对电导率逐渐增大。经静电场处理的种子，浸出液相对电导率表现出不同程度的下降，其中经静电场处理3 min的效果最佳。老化3 d和7 d的种子经静电场处理3 min后，相对电导率分别比对照降低了40.1%和42.1%。这与其对发芽指数和活力指数的影响相一致，说明静电场可以减少膜系统的渗漏，提高老化种子的活力。
1―老化 0 　2―老化3　3―老化7 d图2　高压静电场处理对老化黄瓜种子POD（A）、CAT（B）和SOD（C）活性的影响Fig. 2　Effect of HVEF on the activities of peroxidase (A)，catalase (B) and superoxide dismutase (C) in aged cueumber seeds
2.3　对老化黄瓜种子自由基清除酶系统的影响　　POD，CAT，SOD是自由基清除酶系统的主要酶类。由图2可见，种子老化程度越高，这三种酶的活性降低也越多。不同老化程度的种子经静电场预处理对种子内部的POD，CAT，SOD酶活性影响不同。对未老化的种子(发芽率94%)，静电场处理对这三种酶系统无显著影响。而老化3 d和7 d的种子经静电场处理与对照相比可显著地提高这三种酶的活性，其中处理3 min的效果最明显，POD,CAT和SOD活性比对照分别提高了90.2%～97.9%,42.6%～59.1%和40.4%～49.9%。表明静电场预处理老化种子，可提高种子内自由基清除酶的活性。
1―老化 0 　2―老化3　3―老化7 d图3　高压静电场处理老化黄瓜种子对氢过氧化物和丙二醛含量的影响Fig. 3　Effect of HVEF on the contents of MDA(A) and hydroperoxide (B) in aged cucumber seeds
2.4　对老化黄瓜种子MDA含量和氢过氧化物的影响　　MDA是脂质过氧化的主要产物之一，其含量可以反映脂质过氧化的程度。氢过氧化物是脂质发生过氧化反应的中间产物［7］。由图3可见，静电场处理种子，可降低种子中的MDA和氢过氧化物含量，其中静电场处理老化3 d和7 d的种子表现最明显。老化3 d和7 d的种子MDA和氢过氧化物的含量分别为1.58 μmol/g.DW, 1.93　μmol/g.DW和I2 101.78 mg/g.DW和I2 129.17 mg/gDW。静电场预处理3 min后，MDA和氢过氧化物含量分别降低到0.85　μmol/g.DW, 0.98　μmol/g.DW和86.17 mgI2/g.DW，93.18 mgI2/g.DW，均达到了显著的水平。这与对种子浸出液电导率的变化趋势相似，说明静电场处理使膜系统受过氧化作用而致的损伤程度降低，保护了膜系统的结构与功能。
　　研究结果显示，种子活力状态不同，静电场预处理的效果也不同，对中低等活力的种子，静电场处理可提高种子的发芽率、发芽指数和活力指数，这与前人［2,9］报道相类似。　　许多研究表明种子表现低的萌发能力是与细胞膜系统损伤引起的膜透性增大有关［7］。本实验表明，静电场处理可使老化种子浸出液的电导率降低，物质外渗量大幅度降低，种子活力提高。说明静电场对种子膜系统的修复具有一定的促进作用。　　随着老化天数增加黄瓜种子活力显著下降，SOD，CAT等酶活性降低，氢过氧化物和丙二醛含量增加［6］。氢过氧化物和MDA分别是膜脂过氧化的中间产物和终产物，它们的大量积累将加速种子活力的下降［6,8］。SOD和CAT，POD是清除生物体内活性氧或其它过氧化物自由基的关键酶类，它们的活性降低，将致使活性氧增多，膜脂过氧化作用增强，从而使细胞膜的正常组分和膜结构受到破坏而严重影响膜的功能［8，10］。本实验的结果表明，静电场处理提高老化黄瓜种子的活力与其对SOD，CAT，POD活性和氢过氧化物、MDA含量的调节有关。静电场处理可明显提高POD，CAT和SOD活性和抑制氢过氧化物和MDA的积累。　　电场作用可引起细胞内蛋白质、糖类、脂质等极性分子和金属离子的定向排列，从而引起含Mg，Cu，Zn，Mn，Fe等金属离子的酶构象变化［2］。SOD是一种典型的含Cu，Zn，Fe金属的诱导酶，POD和CAT均含有Fe，静电场使老化黄瓜种子中POD，CAT和SOD活性增强，很可能是电场引起了这些酶构象的变化，加速了对这些保护酶的激活作用，从而减轻了由活性氧启动的膜脂过氧化作用，从而对膜起到了保护作用。　　Smith 和Bearjar［4］认为脂质过氧化作用的加强和膜结构的破坏是种子活力下降的主要原因之一。静电场处理能减轻种子脂质过氧化程度，保护膜系统结构和功能的完整性，这是静电场处理提高老化种子活力的原因之一。静电场处理种子是一种非常简单有效的方法，但其作用机理是非常复杂的，本文仅从脂质过氧化的角度进行了解释。 &上一篇文章:&下一篇文章:&&点击数:9738 &本周点击数:6 & &
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[园林学]苦瓜种子人工老化的生理生化分析
苦瓜种子人工老化的生理生化分析聂转花（仲恺农业工程学院,农业与园林学院，广东广州，510225）摘要：本试验以苦瓜（Momordica charantia L.）种子为材料，采用高温高湿人工老化的方法(43±1 100% RH)，研究了种子在老化过程中所发生的一系列生理生化变化。试验结果表明：随着老化时间的延长，老化苦瓜种子的发芽率和发芽势下降，MDA 含量及种子浸出液电导率升高，SOD、POD 活性下降。对电导率、MDA、SOD、POD 与发芽率、发芽势进行相关性分析，结果表明种子 MDA 含量、浸出液电导率与发芽势呈显著负相关，SOD、POD	则与发芽势均呈显著正相关，说明膜脂过氧化是老化苦瓜种子活力下降的主要机理。关键词：人工老化	苦瓜种子	种子活力Biochemical and Biophysical Analysis on Artificially Aged Bitter Gourd SeedNie Zhuanhua, Lu Meilian(College of Agriculture and Landscape Architecture, Zhongkai University&& of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225,China)Abstract:	Biochemical and biophysical changes in Bitter gourd（Momordica charantia L.）seeds were investigated with accelerated aging, the seeds were aged at 100% RH and 43±1& for 0 to 5 days at one-day interval. The result showed that both emergence percentage and emergence potential decreased in the aging-enhanced seeds, while MDA content and conductivity increased as the aging time prolonged. Moreover, activities of SOD and POD decreased in the aged seeds than that in the untreated seeds. There was significant negative correlation among MDA content, conductivity and emergence potential, while there was significant positive correlation among activities of SOD, POD and emergence potential. Therefore, the lipid peroxidation appeared to be the main mechanism of the reduced vigor of aged seeds.&& Key words: A Bitter G Seed vigor
种子活力是决定种子或种子批在发芽和出苗期间的活性水平和行为特性的综合表现[1]。苦瓜(Momordica charantia L.)种子为短命种子，在普通仓库条件下贮藏 6 个月，发芽率就迅速下降，特别是我国南方地区高温高湿气候条件能使种子活力下降很快[1-2]。高温高湿人工老化方法可克服自然老化所需时间较长的不足，所控制的条件接近于自然条件，两者的吻合度较高[3]，老化机制相似，主要在于种子劣变速度不同[4]。目前国内尚未见关于苦瓜种子人工老化的研究报道。本文以苦瓜种子为材料，研究人工老化对苦瓜种子生理生化特性的影响，揭示苦瓜种子活力指标的相互关系，为苦瓜种子活力的研究及人工老化法在苦瓜上的应用提供参。1	材料与方法1.1	材料供试品种为广州市白云区太和广联种苗行提供的油绿长身厚肉苦瓜种（净度&#%，纯度&#%，发芽率≥85%，水分&#%）。1.2	人工老化
参照陆美莲[5]的方法，在	43±1℃、100%RH 下进行人工老化，老化时间为 0d、1d、2d、3d、4d、5d。具体做法如下：在干燥器底部放一定量蒸馏水，选取完整健壮的苦瓜种子，装入塑料网袋中放入干燥器中，再将干燥器密封，放入 43℃恒温培养箱中。每天放入 1 批种子，共放 5 批。5d 后将所有种子取出，以未经处理种子作对照进行生理生化测定。1.3	发芽率与发芽势的测定每处理的种子随机数取 30×3 粒进行标准发芽试验。每天记录发芽的种子数，4d 统计发芽势，14d 统计发芽率。1.4	种子浸出液电导率的测定称取苦瓜种子 5g，用去离子水冲洗 2~3 遍，吸干种子表面水分后放入盛有 100ml 去离子水的烧杯（250ml）中，在	20±1℃下浸泡，每间隔	2h（2h，4h，6h，8h，10h）用 DDS-307 型数字电导仪测定种子浸出液电导率。1.5	丙二醛（MDA）含量的测定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法。取 0.4g 苦瓜种子在常温下吸胀 24h，研磨后用冷冻离心机在	10000r/min	下离心20min，上清液即为粗酶液，下同。取酶液1.5ml，TBA2.5ml	配成反应液，于沸水浴中反应	20min	后放于冰浴中止反应，于5500r/min	下离心 15min。于 TU1810APC型紫外可见分光光度计在波长532nm,600nm,450nm	下测定吸光度。MDA(μmol/L)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450。1.6	超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定采用硝基四氮唑蓝（NBT）光还原法。在 560nm 下测定吸光度。1.7	过氧化物酶（POD）活性的测定采用愈创木酚法。在 290nm 下测定吸光度。以每分钟 OD290 增加 0.01 定义为 1个酶活力单位。2	结果与分析2.1	老化对种子发芽率与发芽势的影响随着老化时间的延长，发芽率与发芽势呈下降趋势（表	1）。老化 3d	时，发芽率与对照相比差异极显著(p<0.01)，老化3~5d 内，平均下降了 12.3%。老化 2d 时，发芽势与对照相比差异显著(p<0.05)，老化3~5d 内，平均下降了 15.0%。可见老化处理后期(3~5d)，种子发芽势比发芽率下降幅度大，人工老化对发芽势影响较大，老化种子活力先于生活力衰退。2.2	老化对种子 MDA 含量的影响短期人工老化处理对苦瓜种子	MDA含量影响不大，长期人工老化处理能使其急剧上升（表 1）。老化 1~4d 时，MDA 含量与对照相比均差异不显著，老化 5d 时与对照相比差异极显著(p<0.01)。2.3	老化对种子 SOD 活性的影响随着老化时间的延长，苦瓜种子SOD活性呈下降趋势，各处理与对照相比均差异极显著 (p<0.01)，且各处理间差异显著(p<0.05)（表1）。老化1~3d时，SOD活性几乎呈直线下降的趋势，各处理间差异显著。2.4	老化对种子 POD 活性的影响随着老化时间的延长，苦瓜种子 POD活性呈逐渐下降趋势（表	1）。老化	1~3d时，POD 活性下降较缓慢，与对照相比均差异不显著。老化	4~5d 时，POD 活性迅速下降且与对照相比差异极显著(p<0.01)。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 表1& 老化对种子发芽率、发芽势、MDA、SOD、POD的影响Table1 Effect of artificial aging on emergence percentage, emergence potential, MDA, SOD and POD
老化时发芽率（%）发芽势（%）MDASODPOD
间（天）	EmergenceDays 	percentage (%) Emergencepotential (%)(μmol/L)(U/g)(U/g.min)
0(CK)	90.0	a	A& 86.7	a	A& 0.030	b B	77.65	a	A& 571.14 a	A
186.7	a	AB	78.0	ab	A 0.038	b B	59.10	b B 567.66a	A
	ab	AB 70.0	b	AB	0.054	b B	45.88	c	BC	474.24 a	A77.8	b	B	66.7	b	AB	0.091	b B	33.32	d CD 469.63 a	A61.1	c	C	52.2	c	BC	0.177	b B	16.65	e	DE	250.58 b B53.3	d	C	36.7	d	C	0.821	a	A 12.32	e	E& 199.61 b B
注：同列中不同小写字母间表示差异显著（p<0.05），不同大写字母间表示差异极显著(p<0.01)。Note: The different small letters show significant difference (p<0.05) and the capital letters show highly significantdifference (p<0.01).
2.5	老化对浸出液电导率的影响随着老化时间的延长，各处理种子浸出液电导率均呈上升趋势（图1）。随着浸泡时间的延长，老化时间较长的种子浸出液电导率上升幅度大，老化时间较短的种子浸出液电导率上升幅度小。22202.6发芽率、发芽势与电导率、MDA、SOD、POD的关系将苦瓜种子各项活力指标进行直线回归分析，结果表明发芽率、发芽势与电导率、MDA	呈显著负相关，与	SOD、POD则呈显著正相关& (表	2)。其中发芽势与电导率呈极显著负相关，相关系数为-0.937* * (>r0.01=0.917)；与 SOD、POD 呈极显著正相关，相关系数分别为	0.954* *、0.970* *(>r0.01=0.917)。说明电导率、MDA、SOD、POD 均与发芽势相关程度较高，可较好地反应种子当前的活力水平。电导率与 SOD、POD	呈极显著负相关，相关系数分别为-0.985* *、-0.910* * (>r0.01=0.917)。电导率的大小是反应膜脂过氧化程度的最常用指标，电导率与 SOD、POD 等主要的自由基清除酶活性相关程度较高，说明膜脂过氧化使这些酶活性降低是苦瓜种子活力下降
2h4h老化时间(天)Aging time6h	8h	10h的重要原因。
图 1	老化对苦瓜种子浸出液电导率的影响Fig. Effect of artificial aging on conductivity
&&&&&&&&&&&&&
&& 表2	发芽率和发芽势与电导率、MDA、SOD、POD的相关性分析Table4 The correlation among emergence percentage,emergence potential, conductivity, MDA, SOD and POD电导率越高，说明膜脂过氧化加剧导致苦瓜种子发芽率和发芽势降低。在本试验中，经老化处理的苦瓜种子发芽率、发芽势和
活力指标Vigor index电导率ConductivityMDASODPODSOD、POD活性呈显著正相关，与种子MDA含量和浸出液电导率呈显著负相关。
发芽率Emergencepercentage发芽势Emergencepotential电导率Conductivity-0.912*-0.937* *-0.838*0.931**0.991* *-0.857~	0.954**0.970* *0.646	-0.985**-0.910**尤其是种子发芽势与SOD、POD、MDA等生理生化指标的相关程度较高,提供了人工老化方法通过发芽势预测苦瓜种子田间出苗率以及种子活力的应用前景。参考文献[1]& 颜启传主编.种子学[M].北京:中国农业出版社,.
MDASOD3	讨论0.646-0.985* *-0.678-0.678-0.* *[2]& 张施君,陈润政.不同含水量苦瓜种子的贮藏研究[J].中国农学通报,7-189.[3]& 董国军,胡兴明,曾大力,等.水稻种子人工老化和自然老化的比较研究 [J].浙江农业科学 ,
人工老化条件下(43±1℃、100%RH),随着老化时间的延长,苦瓜种子发芽率、发芽势、SOD、POD活性明显下降，而种子MDA含量和浸出液电导率则明显升高。种子老化过程中，自由基引起的膜脂过氧化作用加剧，导致膜系统受破坏，而MDA作为膜脂过氧化的最终产物能使重要的自由基清除酶（如SOD、POD等）活性降低，使细胞内积累的过氧化物等有害物质得不到及时清理，进一步加剧膜脂过氧化作用，从而使细胞膜系统受破坏程度增加，这被认为是许多植物种子老化或组织衰老的主要机理[6-8]。苦瓜种子经人工老化处理后，老化程度越高的种子MDA含量与浸出液-29. [4]& 陈晓玲,陈叔平.豇豆不同类型间种子耐贮性差异[J].作物品种资源,-41.[5]& 陆美莲,梁关生,乔爱民,等.	芥兰老化种子活力指标相关性分析[J].种子,):45-46. [6]& 谢皓,陈学珍,祁佳,等.人工加速老化对大豆种子活力的影响	[J].	北京农学院学报,):15-17. [7]& 马金虎,杨小环,王宏富,等.棉花不同品种在加速老化过程中种子生理特性的变化[J].山西农业大学学报,-137.[8]& 李雪峰,邹学校,刘志敏.辣椒种子人工老化及劣变的生理生化变化[J].湖南农业大学学报(自然科学版),):256-258.--博才网
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野大麦种子人工老化处理的影响
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《草地学报》2015年第六期
以带Ｅｐｉｃｈｌｏё内生真菌和不带Ｅｐｉｃｈｌｏё内生真菌的野大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍｂｒｅｖｉｓｕｂｕｌａｔｕｍ）种子为试验材料，在５８±１℃和１００％相对湿度条件下设置０，５，１０，１５，２０，２５，３０和３５ｍｉｎ人工老化时间，研究老化过程中种子的活力变化以及内生真菌对种子的生理影响。结果表明：在人工老化过程中，种子的发芽率、发芽势、胚芽胚根长和活力指数随老化时间增加而降低；浸出液的电导率和可溶性糖含量随老化时间的增加而增加，且与发芽率、发芽势、胚芽长、胚根长和活力指数呈极显著负相关（Ｐ＜０．０１），但被内生真菌侵染的种子其老化生理反应变化明显有所减缓。研究认为，与未被内生真菌侵染的种子相比，内生真菌可促进野大麦的发芽，促进芽长根长的生长，降低膜的损伤，减少浸出液电导率和可溶性糖的含量，从而降低种子的劣变程度，延长种子贮藏时限。
内生真菌；野大麦；种子；人工老化；活力
禾草内生真菌（ｇｒａｓｓｅｎｄｏｐｈｙｔｅ；ｆｕｎｇａｌｅｎｄｏ－ｐｈｙｔｅ；ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｉ）是指在禾草体内渡过整个或者大部分的生命周期，而禾草自身不显示外部症状的一大类真菌［１］。内生真菌与植物形成互惠的关系，一方面可促进植物生长发育、增强植物的抗逆性和非生物胁迫的能力［２－３］，另一方面从宿主中吸收营养供自己生长需求。绝大多数内生真菌通过种子进行传播［４］，多存在于禾草的地上组织。野大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍｂｒｅｖｉｓｕｂｕｌａｔｕｍ）是禾本科大麦属优良的多年生禾本科牧草，多分布于我国东北、华北及新疆等低湿草地上，表现为生长期短、适口性好、耐盐碱［５］、草质柔软、生产性能良好，具有较高的经济利用价值［６］，是一种良好的放牧－刈割兼用的多年生禾本科牧草。禾草和内生真菌的共生不仅为内生真菌提供了营养、生存环境及繁殖载体［７］，也促进了禾草的生长，防止或减少食草动物的采食，提高了其抗逆性。Ｗｉｌｓｏｎ等首次在野大麦中发现了内生真菌［８］，内生真菌的侵染可显著提高野大麦抗虫［９］、耐盐［５］等逆境条件抗逆性。
种子老化指的是种子发育完成其生理成熟期，其活力达最高水平，随着时间及其环境的变化，引起种子内部生理生化过程的变化，活力不断下降直至丧失生命力的综合效应［１０］。引起种子老化的原因主要有：贮藏物质的变化、代谢中产生有毒物质含量的变化、能量的变化、生物膜系统的变化、酶活性的变化及遗传物质的改变等［１１］。种子活力是决定种子萌发及其生长表现的重要特征，是反映种子老化水平的主要指标之一，在种子贮藏管理中具有重要的意义［１２］。目前对于种子活力的检测主要集中在对其物理特性（种子质量、颜色、大小等）、发芽特性（芽长、发芽率、发芽势、发芽指数等）及生理生化特性（浸出液电导率、浸出液可溶性糖等）的测定。其中浸出液电导率的高低是反映老化过程中膜透性变化的重要指标；同时老化过程中可溶性糖的含量随着种内贮藏物质的变化而变化，是评价贮藏物质变化的主要指标之一［１３］。研究表明，内生真菌的侵染能促进种子的萌发，并提高其胚根、胚芽的长度及其幼苗的生物量［１４－１５］。相对于自然老化，人工老化有效缩短了处理周期，并且在模拟自然储存种子的环境中人为进行老化处理，在短时间内进行高温高湿处理，势必会引起种子内部生理反应的差异［１６］。对于探索种子老化过程机理以及寻找有效减缓种子活力下降方法具有重要的意义。本试验以野大麦为试验材料，采用人工模拟自然老化过程的方法，研究内生真菌在人工快速老化条件下对野大麦种子活力的影响，以期利用内生真菌在种子贮藏中的应用为种子的储藏提供参考。
１材料与方法
１．１试验材料供试材料野大麦于２０１３年采自甘肃省河西走廊的兰州大学临泽试验站（Ｅ１００°０６′０４″，Ｎ３９°１１′０７″，海拔１７８３ｍ），参照李春杰等［１７］的方法对野大麦茎髓部进行内生真菌的检测，收集带内生真菌（Ｅ＋）与不带内生真菌（Ｅ－）野大麦种子，４℃保存于农业部牧草与草坪草种子质量监督检验测试中心（兰州），以保证种带内生真菌的活性。
１．２人工老化处理随机挑选带菌（Ｅ＋）与不带菌（Ｅ－）野大麦种子，在５８±１℃和１００％相对湿度条件下进行人工快速老化处理。老化时间分别为０（对照ＣＫ），５，１０，１５，２０，２５，３０和３５ｍｉｎ，取出处理完成的种子在室温条件下进行晾晒３至４天，使种子含水量尽量恢复至原始状态，然后进行各项指标的测定。
１．３测试项目及方法
１．３．１萌发测定采用纸上（ＴＰ）发芽法，随机挑选老化处理过的带菌（Ｅ＋）与不带菌（Ｅ－）种子各５０粒于事先灭菌的培养皿进行萌发测试，各处理４个重复。参照卫东和王彦荣的方法［１８］，放入光照培养箱（ＬＲＨ－２５０－Ｇ）中，在２５℃（恒温）条件下进行测定，试验持续１２天，试验期间保持滤纸湿润，每天记录种子发芽数，在种子发芽后的第５天测量胚芽长度（ｃｍ）和胚根长度（ｃｍ），统计发芽数，分别计算种子发芽势、发芽率和活力指数。１２天野大麦种子发芽结束后，最后统计发芽数并计算终期发芽率。发芽率＝发芽种子数／供试种子数×１００％发芽势＝第５天发芽种子数／供试种子数×１００％活力指数＝（平均胚芽长＋平均胚根长）×发芽率
１．３．２浸出液电导率的测定分别挑选老化处理后的Ｅ＋、Ｅ－野大麦种子各５０粒，３次重复，称量（精确到０．００１ｇ）后用去离子水冲洗３次，置于１５０ｍＬ三角瓶中，加入１００ｍＬ的去离子水，用封口膜封住瓶口，设空白对照（１００ｍＬ的去离子水），于２０℃下静置２４ｈ备用。参照国际种子检验协会《种子活力测定方法手册》［１９］有关电导率的测定方法，用ＤＤＳＪ－３０８Ａ型数字式电导率仪测定浸出液的电导率［μｓ•（ｃｍ•ｇ）－１］。浸种液电导率＝（样品电导率－对照电导率）／样品质量
１．３．３浸出液可溶性糖的测定参照李合生等［２０］的方法，对老化处理后的野大麦种子可溶性糖含量进行测定。分别取老化处理后的Ｅ＋、Ｅ－野大麦种子０．５ｇ置于１５０ｍＬ的三角瓶中，加１００ｍＬ的去离子水，锡箔纸加盖后在２０℃恒温下２４ｈ。分别移取各处理后的浸种液１ｍＬ于试管中，加入蒽酮试剂５ｍＬ，小心震荡，使液体混合均匀，至沸水浴中１０ｍｉｎ后取出冷却至室温。以对照调零，采用紫外－可见分光光度计（ＷＦ－ＺＵＶ－２１０２型）在波长６２０ｎｍ下测光密度值，结合可溶性糖的标准曲线计算浸出液可溶性糖含量（μｇ•ｇ－１）。
１．４数据处理和统计分析试验所得数据录入Ｅｘｃｅｌ２００７并制图，采用ＳＰＳＳ１７．０软件进行差异显著性分析及相关性分析，并用Ｄｕｎｃａｎ法对各活力指标进行多重比较。
２结果与分析
２．１内生真菌对野大麦种子萌发和幼苗生长的影响
２．１．１对发芽率和发芽势的影响在人工老化处理的过程中，Ｅ＋和Ｅ－野大麦种子发芽率的变化呈先缓慢下降，后大幅度下降的趋势（图１Ａ）。其中Ｅ＋种子的发芽率要高于Ｅ－种子，老化５，１０，１５和２０ｍｉｎ后Ｅ＋和Ｅ－种子的发芽率差异显著（Ｐ＜０．０５），随老化时间的增长，发芽率在老化２５ｍｉｎ后大幅度下降，在３５ｍｉｎ时降到最低，且Ｅ＋种子和Ｅ－种子的发芽率差异不显著。随老化程度的加剧，发芽势呈现与发芽率相似的变化趋势（图１Ｂ）。老化５，１０，１５和２０ｍｉｎ后的Ｅ＋种子的发芽势要显著高于Ｅ－种子（Ｐ＜０．０５），且Ｅ＋种子上升和下降的幅度要小于Ｅ－种子。
２．１．２对苗长、根长的影响种子发芽１２天后，野大麦的苗长和根长随着老化时间的增加而呈逐渐下降趋势，其中Ｅ＋的苗长和根长始终大于Ｅ－。在老化５，１０，１５和２０ｍｉｎ后Ｅ＋的胚芽长显著长于Ｅ－（Ｐ＜０．０５），在老化５，１０，１５和２５ｍｉｎ后Ｅ＋的胚根长与Ｅ－差异显著（Ｐ＜０．０５）。
２．１．３对活力指数的影响随人工老化程度的加剧，种子的活力指数先急剧下降后缓慢下降，Ｅ＋种子的活力要始终大于Ｅ－种子，其中老化０，５，１０，１５，２０，２５ｍｉｎ后，Ｅ＋种子的活力要明显高于Ｅ－（Ｐ＜０．０５），而老化处理３０，３５ｍｉｎ后，Ｅ＋和Ｅ－种子的活力指数没有显著差异，在３５ｍｉｎ后Ｅ－种子的活力基本丧失，活力指数为９．６（图２）。
２．２内生真菌对野大麦种子生理指标的影响
２．２．１种子浸出液电导率电导率测定的结果显示，随着老化时间的延长，种子的电导率逐渐增加，在老化３５ｍｉｎ后达到最高，且Ｅ＋始终低于Ｅ－。在老化５，１０，１５，２０ｍｉｎ后Ｅ＋与Ｅ－之间差异显著（Ｐ＜０．０５），其他处理时间，Ｅ＋和Ｅ－之间差异不显著（图３）。
２．２．２种子浸出液可溶性糖含量在人工老化处理过程中，由于种子的膜透性发生改变，浸出液可溶性糖的含量随老化时间的延长呈增加趋势，其中Ｅ＋的含量要低于Ｅ－，且Ｅ＋变化幅度要大于Ｅ－。在老化０，５，１０，１５和２０ｍｉｎ后，Ｅ＋要明显低于Ｅ－（Ｐ＜０．０５），而其他处理时间下两者差异不显著（图４）。
２．３野大麦种子生理指标与活力指标的相关性分析对野大麦种子的浸出液电导率和可溶性糖与种子的发芽率、发芽势、胚芽长、胚根长和活力指数进行相关性分析，结果如表２所示。对野大麦种子浸出液电导率和可溶性糖与种子的发芽率、发芽势、胚芽长、胚根长和活力指数的相关分析可知：电导率和可溶性糖与种子活力指标之间呈显著负相关（表２）（Ｐ＜０．０１）。
禾草内生真菌主要靠种子进行传播［４］，本研究通过控制不同老化时间来观察野大麦种子各生理生化指标，比较被内生真菌侵染（Ｅ＋）的野大麦种子和未被侵染（Ｅ－）种子各生理生活指标的不同，表明内生真菌在种子老化情况下对其贮存、生长的促进作用。种子活力与种子的贮藏、劣变、萌发等过程有着密切的联系［２１］，人工老化处理野大麦的种子，其发芽率、发芽势、胚芽长、胚根长以及活力指数随着老化程度的加剧而逐渐降低［２２］，对于人工老化时间相同的种子，被内生真菌侵染的（Ｅ＋）野大麦种子各生理指标要明显高于未被侵染的（Ｅ－），且变化幅度也小于未被侵染的（Ｅ－），由此可见内生真菌的存在为种子的萌发等带来一定积极的影响。这与张兴旭对内生真菌与保存时间互作对醉马草（Ａｃｈ－ｎａｔｈｅｒｕｍｉｎｅｂｒｉａｎｓ）种子的生理影响研究结果类似，在不同处理时间下内生真菌可以显著促进种子的萌发［２３］。随着人工老化时间的增加，种子的带菌率逐渐降低，种子的活力指标也相应降低，以２５ｍｉｎ为指标变化的拐点，当种子的内生真菌基本失活后，内生真菌对种子的活力也失去了影响。人工老化与自然老化条件下种子的生理生化会产生相似的结果，都会表现出种子发芽率、发芽指数等活力指标的降低，以及种子可溶性糖泄露的增加［２４］。国内外研究表明，种子劣变期间发生的最主要的生理变化是质膜受损，受损后膜的透性便增强，细胞内的电解质和代谢物的渗透量增大［２５］，大量可溶性营养物质与蛋白质、糖、无机离子、氨基酸等渗漏出去［２６］，同时还会释放特定的气体，使种子浸出液的导电性增强［２７］，因此电导率和可溶性糖可作为测定种子活力的方法。本研究表明，在（５８±１）℃热水中进行种子老化，浸出液电导率和可溶性糖含量随着老化时间的加长而增加。说明随着老化处理时间的延长种子劣变加剧，细胞质膜的受损程度变大，种子内溶物透过膜外渗增加。但在有些禾本科种子老化的过程中，电导率与活力指标并无相关性。如王彦荣等对苏丹草（Ｓｏｒｇｈｕｍｓｕｄａｎｅｎｓｅ（ｐｉｐｅｒ）ｓｔａｆｐ）和老芒麦（ＥｌｙｍｕｓＳｉｂｉｒｉｃｕｓ）等禾本科种子劣变研究过程中发现电导率与生活力无相关性［２５］，这可能是由于种子结构、化学组成不同所引起的。试验结果中种子浸出液的电导率和可溶性糖含量与种子各活力指标之间呈负相关，并且达到了极显著水平。说明浸出液电导率和可溶性糖含量可作为评价野大麦种子活力的适宜指标。且本研究中被内生真菌侵染的野大麦种子电导率和可溶性糖的变化幅度要小于未被侵染的种子，表明内生真菌在一定程度上减缓了质膜的损伤程度，降低了膜的通透性，但随着老化时间的加长，当内生真菌基本失活后，浸出液的电导率和可溶性糖含量与未被内生真菌侵染的种子基本相同。
在人工老化过程中，种子的发芽率、发芽势和活力指数随老化时间增加而降低；胚芽长和胚根长也随老化时间的增加而减少；浸出液的电导率和可溶性糖含量随老化时间的增加而增加，且与发芽率、发芽势、胚芽长、胚根长和活力指数呈极显著负相关（Ｐ＜０．０１），但被内生真菌侵染的种子明显减缓了种子老化生理反应变化的幅度。研究认为，与未被内生真菌侵染的种子相比，内生真菌可促进野大麦的发芽率，促进芽长根长的生长，降低膜的损伤，减少浸出液电导率和可溶性糖的含量，从而降低种子的劣变程度，延长种子贮藏时限。
作者：赵晓静李秀璋王萍李春杰单位：草地农业系统国家重点实验室兰州大学草地农业科技学院
草地学报责任编辑：杨雪&&&&阅读：人次
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