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pET32a图谱
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求助高手：质粒兼容性（求与pET-32a 兼容的质粒）
我先在做原核表达，酶活的验证需要表达四个基因，但一个质粒表达四个基因太难了，但一个质粒表达两个基因，分两个宿主菌表达，各方面条件不一样，很难验证酶活。所以想找两个相容的质粒克隆到一个宿主里面。一个质粒带两个基因，两个基因就可以带四个基因了。我发现很多文章都这样做。但无法判断质粒是否兼容。
（1）但如何判断质粒是否兼容？是看复制子吗？我们实验室克隆表达最常用的质粒，pET32a，pET-28a， pGEX-4T3&&pTwin1 等是 pBR322 origin，所以不兼容。
（2）各位高手：有没有与pET32a兼容的质粒，如果有的希望可以交换。我们实验室有常用的表达载体pET32a，pET-28a， pGEX-4T3&&pTwin1 ，还有基因敲出载体pK18，以及一些带荧光的质粒等等
我的qq号，加我qq号！谢谢了
pET-Duet和pACYC-Duet可以相容吗？ 我要表达四个基因，而pET-Duet我们实验室有，但他只能表达两个基因
petduet 只能表达两个基因，而我要表达四个基因。 只要两个基因的复制原件不一样，就不会有竞争，也就不会有不相容性
我们用过pETDUET,一个质粒连四个基因质粒上可用的酶切位点很少，前两个基因应该比较好连，但到后面酶切位点不好用，加上质粒负荷太大，成功的几率基本为零。理论上可行的，操作上却很难到达！
我的qq号，想请教你几个问题！
pET-Duet和pACYC-Duet其实都可以连两个基因，不知你是否有pACYC-Duet？我的qq号，想请教你几个问题!
可以相容，没问题的
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【求助】三种shRNA质粒的区别
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这个帖子发布于2年零97天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
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各位大神， 以慢病毒为载体的shRNA质粒，真核表达载体的shRNA质粒和慢病毒包装的shRNA这三者有什么区别，**
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其实你问的是2个质粒的区别，第一个和第三个是一回事。但是可以加上siRNA(它不是质粒，就是单纯其沉默作用的RNA)区别：1、siRNA,其实就是RNA的一种（~21-25核苷酸），可激发与之互补的目标mRNA的沉默。其缺点不言而喻--容易降解，不易保存及运输，。2、真核表达载体shRNA，他的目的和siRAN相同，只是以DNA的形式，把它构建到真核表达载体上（目的基因，及能表达出siRNA的基因前，存在真核生物启动子，能启动转录，形成siRNA以执行沉默效应），该载体上多还有荧光基因，比如绿色荧光蛋白，以观察转染效率。该载体易于保存，且能够保存在大肠杆菌内，需要的时候扩增细菌然后提取质粒就可以，可以反复的应用（不用老花钱买）。缺点就是只是瞬时转染，不能长期表达（3-5天），因为细胞内的酶很快就会将其讲解掉。3、慢病毒表达载体的shRNA，和2差不多，就其本身而言也是真核表达载体，但是重要的是其可以在辅助质粒共存的条件下包装查慢病毒，而携带有目的基因的慢病毒可以对细胞形成稳定转染（慢病毒将可表达siRNA的基因整合到细胞基因组DNA中），更重要的一点就是慢病毒可以感染如干细胞、原代细胞等不易转染的细胞。缺点就是构建比较麻烦，买的话也挺贵，公司一般只卖病毒液，不卖质粒。
话说的有点啰嗦，希望能帮到你。祝实验顺利！
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回答得很全面。做shRNA干扰时要预计到它的效率和off-target 效应，建议至少有2-3个超过70%以上的knockdown效率的构建，不要一个序列做到底。否则，发表时候就成问题，一般3-5+分文章是必须2+条有效序列的验证结果。
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一般的可以用来克隆的质粒载体不能超过10kb，我们常用的质粒载体如pBR322，它自身大小4.36kb，那么我们的外源基因的长度就不能超过6kb。大多数质粒的携带量不能超过8kb。
常用的噬菌体载体包括M13噬菌体载体和λ噬菌体载体。M13噬菌体载体的优点是它使人们可以获得单链的被克隆的DNA，但是M13噬菌体载体可容纳DNA片段很有限，通常认为100bp就是它的上限了。为此，人们开发出了M13和质粒的杂交载体——噬菌体质粒（plagemids)，pEMBL8就是这类的载体，但是这类质粒必须要有正常的M13作为辅助噬菌体来提供必要的复制酶和蛋白质外壳。用这种噬菌体质粒可以携带不超过3kb的DNA片段。
λ噬菌体载体最大的优点就是可以用来克隆大片段的DNA分子，这些DNA分子的长度可从5kb到25kb，它们很难用质粒载体或M13载体来处理。λ噬菌体载体常被用来构建基因组文库。
质粒和病毒在作为基因工程载体时是有所区别的。利用病毒作为基因运载体时，所带的基因一般还需要转到受体细胞的染色体DNA中去，才能成为稳定的结构。质粒的情况也可以是这样，但大多数情况下不是如此。质粒一旦带有人所需要的新基因，它本身就可能成为一种稳定的重组DNA。进人受体细胞后，它多半不需要把所带的基因转到受体细胞的染色体上去，这样的质粒就会进行自我复制，异源性DNA也得到了复制。这就是利用质粒作为基因运载体表现优越的地方。所以目前进行的基因工程操作，多用质粒作为基因的运载体 。
质粒是位于细菌体内的小型环状DNA分子，主要控制细菌的次级代谢。而噬菌体是DNA病毒。
用质粒做运载体时，只改变质基因。 用噬菌体或病毒就可以改变核基因了。 在实际生产过程中，质粒的受体细胞只有细菌和酵母菌，用来生产某些激素之类的产物，我们称他们为“工程菌”。 而用噬菌体或病毒做运载体时，受体细胞有细菌，酵母菌，动植物细胞，一般采用受精卵，或早期胚胎，幼嫩的茎尖等，这时候改变的就是核基因了。像基因治疗，基因工程培育高产农作物，都是改变的核基因，有的不需要运载体，基因在体外重组后用显微注射技术直接将重组基因导入受精卵。
1.质粒载体
质粒载体主要用于DNA分子的亚克隆，表达外源蛋白，DNA序列的测定和基因的体外重新构建等。优点：1.与外源DNA重组操作简便；2.外源DNA在质粒载体中相对较稳定，3.质粒DNA的制备和纯化方便，快速简单，所以得到广泛应用。缺点：1.它容纳外源DNA片段有限，通常最多为15kb左右，因为当质粒大于15kb时，转化效率明显下降。质粒载体与外源DNA重组原理见图1。
1．1 质粒的基本特性 质粒通过细菌间的结合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子。1946年，莱德伯格(Lederburg)和塔特姆(Tatum)发现的F因子是最早发现的质粒，1952年，由Lederburg正式命名为质粒。确切地讲，质粒是细菌内的共生遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并赋予宿主细胞一些表型，例如对抗生素的抗性，产生抗生素，降解复杂有机化合物及限制酶与修饰酶等。质粒是一个双链、闭环的DNA分子，其大小为1～200kb，它们都是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位，但它们又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录，它是比病毒更简单的原始生命。它有以下4个特性：(1)复制能力：质粒DNA的复制要由复制细菌染色体的多种酶系来完成，但不同质粒在宿主菌内复制起始阶段的机理以及所采用的酶系迥然不同，并且在宿主菌内复制的程度也相差悬殊。(2)不相容性：利用同一复制系统的不同质粒，在细菌生长繁殖几代后，不能稳定地共存于细菌的一个单细胞中，称之为不相容性质粒。例如：带有ColEl和pMBl复制子的质粒彼此不相容；而带有pSC101和p15A复制子的质粒却彼此相容。(3)转移性：在自然条件下，许多质粒都能通过细菌结合作用转移到新宿主菌内，而质粒上的mob基因为转移所必需的基因；同时在质粒上还需要nic／bom位点。(4)赋予宿主细胞一些遗传表型，如对抗生素的抗性。
1．2 作为载体粒所具备的条件(1)分子相对较小，3～10kb；(2)具有松驰型的复制子，如ColEl，pMBl；(3)在复制子外，存在一个或几个单一的内切酶位点；(4)具有筛选标记。
2 以λ噬菌体载体为例
λ噬菌体载体迄今为止研究得最为详尽的一种大肠杆菌双链DNA噬菌体，它主要用于cDNA文库和DNA文库的构建。不同的λ噬菌体载体能容纳外源DNA片段的长度约为0～25kb。
2．1 λ噬菌体的基本特性和工作原理：λ噬菌体的基因组是一长度为50kb的双链DNA分子。在λ噬菌体颗粒内，该DNA分子为一线状分子，其末端为长12个核苷酸的互补单链(粘端)。当λ噬菌体进入宿主细胞后，其粘端被宿主细胞的DNA连接酶连接并形成闭环DNA分子，该DNA分子在感染早期充当转录模板。λ噬菌体有2种生长过程，即裂解性生长和溶源性生长。裂解性生长过程包括：吸附，立即早期转录，延迟早期转录，DNA复制，晚期转录，噬菌体的组装和裂解。λ噬菌体载体与外源DNA重组原理见图2。
2．2 λ噬菌体作为载体所要具备的条件 (1)具有自我复制能力；(2)含有多种限制内切酶的单一位点；(3)具有选择性标记以区别转化与非转化细胞；(4)分子量较小以便DNA体外操作。
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