张艳君1& 李炳杰2
（1大庆市委党校卫生所& 黑龙江大庆& 大庆市第二医院& 黑龙江大庆& 163008）
【摘要】目的& 探讨Westen blot即蛋白免疫印迹法检测慢性粒细胞白血病（CML）细胞系K562细胞经过物理及化学因素（饥饿和伊马替尼）处理后，出现凋亡现象。方法　应用Western blot技术、细胞培养、蛋白质提取和定量以及凋亡的始动及执行因子Caspase-3(全长和活化)作为一抗体，羊抗兔辣根过氧物酶偶联IgG(H&L)作为二抗来检测CML细胞系K562细胞凋亡情况。结果　应用Western blot检测肿瘤细胞即K562细胞出现凋亡同时Caspase-3有高表达。
【关键词】 Western blot&& K562细胞& 凋亡&& Caspase-3
【中图分类号】R446&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 【文献标识码】A&&&&&&&&&&&&&& 【文章编号】（6-01
&&&&&&& K562胞是慢细性粒细胞白血病细胞（CML）系，90%的CML患者染色体异位t（9，22）导致染色体病变[1]，基因突变形成活性失控酪氨酸激酶BCR-ABL融合基因，该基因表达P210蛋白促发一系列信号转导通路，从而导致CML的发生。K562细胞是属于悬浮细胞，跟大多数肿瘤细胞相似，生长增殖很快。Western blot又称蛋白免疫印迹，它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。Western blot常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析[2]。Caspase特异性蛋白酶是一组与细胞因子成熟和细胞凋亡有关的蛋白酶，从1992年人类第一次纯化Caspase-1克隆并测序其DNA[3]。目前已发现的哺乳动物的caspase酶共有14种，其中Caspase-3在传递细胞凋亡过程中是被激活的关键激酶，它是传递细胞凋亡信号的主要效应因子[4]。并可水解各种细胞成分而使细胞出现凋亡[5]在本研究中，我们应用伊马替尼诱导k562细胞凋亡，伊马替尼是CML治疗的一次革命变革[6]运用上述方法探究K562细胞出现凋亡的机制，从而达到治疗慢性粒细胞白血病分子靶向治疗的新靶点。
&&&&&&& 1.材料与方法
&&&&&&& 1.1& 细胞培养及伊马替尼药物处理
&&&&&&& 材料RPM1640培养液及检测凋亡的caspase-3全长及活化一抗、actin抗体，羊抗兔IgG二抗。
&&&&&&& K562细胞用含10%胎牛血清RPM1640培养基培养。
&&&&&&& 1.2& 蛋白的提取及Western blot
&&&&&&& 伊马替尼处理24小时和48小时后用NETP裂解细胞，超声破碎后离心，上清收集后提总蛋白，沉淀用0.1mol/L的盐酸沉淀物中再超生破碎，离心后提取组蛋白。本研究应用总蛋白样品进行Western blot实验：第一步做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，本实验分别配10%和15%的胶，是待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成条带。其中Marker上样量5ul,每个总蛋白样品也依次上样5-10ul，电压100v一般1.5小时左右。第二步把凝胶中分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，用PVDF膜，转移的方法用电泳转移，电压85v、电流300mA转3个小时后的凝胶进行染色，几乎凝胶上没有剩余蛋白条带，转以后的PVDF膜用含5%脱脂奶粉封闭1个小时。最后一步是特异性抗体检测出已印迹在膜上所要研究的相应抗原。本实验使用Caspase-3活化和全长及actin作为特异性的第一抗体杂交结合后，放入摇床4度冰箱过夜，再用酶标的第二抗体（HRP）标记的第一抗体的抗体杂交结合，用羊抗兔二抗室温孵育1个小时，再加酶的底物ECL发光液显色进行X光底片上曝光的条带来显示抗原的存在。
&&&&&&& 1.3& 电子显微镜的形态学观察
&&&&&&& 我们培养的k562细胞在用伊马替尼(IM)处理24小时和48小时之前都用含0.1%FBS的RPM1640饥饿24小时，按上述剂量加的伊马替尼后，经过24小时和48小时后在倒置显微镜下观察如下结果：随着伊马替尼处理天数的增加，k562细胞凋亡明显增高；以及随着伊马替尼浓度增大，k562细胞凋亡明显增强。上述形态学观察结果表明k562细胞凋亡是与伊马替（IM）尼表现出时间和浓度依赖方式的。
&&&&&&& 2.结果与讨论
&&&&&&& 大量的研究表明，caspase-3的活化是细胞发生凋亡的标志之一。Caspase-3激活后通过其下游分子CAD(caspase激活的DNA酶)调解染色质凝聚。要确定caspase-3在伊马替尼诱导凋亡过程的功能，首先研究caspase-3是否被激活。为了说明caspase-3在伊马替尼诱导凋亡过程中的功能，首先研究caspase-3可以被伊马替尼激活[8]。K562细胞经过伊马替尼不同浓度处理24小时和48小时后，分别提取总蛋白，K562细胞经过伊马替尼作用后，提取细胞的总蛋白进行western blot分析。结果表明，caspase-3在伊马替尼处理24小时和48小时表现caspase-3被激活程度增加，另外随着伊马替尼浓度的提高也有caspase-3被激活提高。全长的caspase-3不受影响，该实验结果表明伊马替尼诱导caspase-3的激活是时间与浓度依赖方式的。本课题从以上几种方法，尤其是western blot研究了k562细胞出现凋亡时的确切检测结果，虽然我们同时还应用其它许多检测凋亡或磷酸化的抗体，有的得出了预期的结果，有些正在检测之中，有望在不远将来公之于众。本研究得出结论：caspase-3在凋亡过程中的确起着重要作用，通过本研究我们要研制出类似caspase-3的药物使更多的慢性粒细胞白血病得到根治。
[1] 王宇军，郭晓等 BCR/ABL mRNA 融合融合转录本水平与慢性粒细胞白血病演变关系检验医学与临床 2008年3月第5卷第6期.
[2] 网上下载 Western Blotting 全攻略.
[3] 熊世勤、丰锡华，Caspase激活与调控分子机制[J].生物化学与生物物理进展 ）：33-36.
[4] Watanabe M,kitano T,et al. Increase of nuclear ceramide through Caspase-3 dependent regulation of the sphingo myelin cycle in Fas-induced apoptosis[J].Cancer Res,):.
[5] 龙慧、李景和 TGF-B与Caspase在肿瘤细胞凋亡中的作用现代生物学进展2009 vol.9 No.13.
[6] N Venepalli,KRezvani et al Role of allo-ScT for CML in 2010 Bone Marrow Transplantation (9-1586.
[7] Lu C,zhuF,Cho Y Y,etal.Cellapoptosis:requirement of H2AX in DNA ladder formation,but not for the activation of caspase-3.MolCell,-132.
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Western Blot中的三大问题
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Western Blot中的三大问题
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3秒自动关闭窗口趣味故事 | 扒一扒 Western blot 的发明史
这篇文章里的「老西方」是指 Western blot，这项技术对于一众本科僧和研究僧来说，已经成为家常便饭的话题和常规实验室技术，就好像当年结婚三大件——冰箱、电视、洗衣机一样，没有听说过的或者没跑过几板 Western blot 的研究僧们都不好意思说自己是研究僧（临床专业的情有可原）。
Western blot 虐我千百遍，我待 Western 如初恋，相信这种感受各位多有体会。传说各大院校实验室均存在着同时跑 10 块胶以上的 Western blot 达人（图 1）。看着电泳仪咕嘟咕嘟冒着泡泡的时候，听着摇床噌噌的旋转响声，诸位是否曾想过是谁发明了老西方这个让人又恨又爱的技术吗？
历史总是有她的趣味性，尤其是科技发展的历史。今天就来八卦一下那些年老西方的故事。
让我们回到 1979 年。这一年是中国正式开始社会主义现代化建设，走改革开放正确道路的第一年（图 2）。这一年注定是忙碌的一年。西方有三个独立的科学家团队在这一年致力于蛋白印迹（protein blotting）/蛋白免疫印迹（protein immunoblot）方法的建立。注意一个细节，在 1979 年，蛋白印迹还不叫 Western blot。
三个团队的科学家们夜以继日力争要抢在对方前面发表自己的工作成果。这三个团队分别是尼尔伯奈特（Neal Burnette）, 哈利托宾（Harry Towbin）和乔治斯塔克（George Stark，这个名字有点像钢铁侠的名字）。
当时任职斯坦福大学的 George Stark 和他的小伙伴（Jaime Renart，Jakob Reiser）通过蛋白被动转移及碘 125 标记的蛋白 A 作为实现蛋白印迹的手段。在 1979 年 4 月提交了论文，并于 1979 年 7 月发表 [1]。
位于莱茵河畔巴塞尔的 Harry Towbin 的团队则应用现在众所周知的蛋白电泳转移原理，成功将蛋白从 SDS-PAGE 胶转移到硝化纤维膜介质。在这个方法中，诞生了著名的「三明治」结构以及二抗的应用（图 3）。这一论文于 1979 年 6 月提交，同年 9 月发表 [2]。
位于西雅图 Burnette 的团队，在 1979 年提交了他们的研究工作，但是不幸被编辑拒稿。拒稿的原因包括对科学并没有明显的贡献以及 Burnette 给蛋白印迹技术冠了一个并不学术且带有些许调侃意味（Burnette 团队实验室在美国西北区的西海岸）的名字——Western blot。几经周折终于在 1981 年发表了相关工作 [3]。
虽然时间上滞后了，但 Western blot 这个带有玩笑意味的名字却很神奇的一直沿用至今。当时 Burnette 这个家伙把自己的方法和文章传播给同事和朋友，大肆推广，同事们用了 Burnette 的蛋白印迹方法觉得这个方法还不错，所以 Burnette 版本的蛋白印迹技术虽然比 Stark 和 Towbin 的晚，但是知名度却远较前两者高。
那么问题来了，究竟哪个团队是 Western Blot 的发明团队，拥有真正意义上的冠名权呢？毕竟冠名权决定了撰写文章时的引用问题。Stark 的团队最先发表了蛋白印迹的方法。Towbin 的团队蛋白印迹方法流传最广，也最为贴近目前实验室用的蛋白印迹技术。Burnette 的团队为蛋白印迹起了一个广为流传并且沿用至今的名字，Western Blot。
这个让人头大的问题一直持续争论了二十多年，也未形成共识。到现在为止，很多研究人员引用蛋白印迹的方法时，仍然同时引用 Burnette 和 Towbin 两个团队最初发表的文章。这也从侧面说明了首创和技术归属问题依然悬而未决（注意一个细节，Stark 团队的工作并不在此列）。
不管是 Stark、Burnette 还是 Towbin，三个团队在当年连抗体都要自己制作的时代，致力于科学技术的研发和推广，这种精神还是值得我辈在茶余饭后回顾历史的时候学习一二的，你们说呢？
参考文献：
[1] Renart J, Reiser J, Stark GR. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. PNAS. 16-3120.
[2] Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS. 50-4354.
[3] Burnette WN. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. : 195-203.
学霸推出了 WB 在线视频教育课程，本课程在讲解 Western blot 基本原理和技术的同时，也会对近年来的技术发展做一简要评述，帮助各位朋友少走弯路，提高效率。教你如何分析条带、如何获得条带、如何提高效率。
作者：Dr.Capri
图片来源：Dr.Capri
题图来源：视觉中国
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