复方蜥蜴散不同微粒组合剂对PLGC模型大鼠NF-κB信号通路相关蛋白P65/P50/IKBa的影响--《宁夏医科大学》2015年硕士论文
复方蜥蜴散不同微粒组合剂对PLGC模型大鼠NF-κB信号通路相关蛋白P65/P50/IKBa的影响
【摘要】：目的研究复方蜥蜴散不同微粒组合剂对PLGC模型大鼠NF-k B信号通路中p65、p50以及其相关因子Ik B-a蛋白表达的影响,从分子生物学角度探讨复方蜥蜴散不同微粒组合剂阻断和逆转PLGC发展的机制。方法将120只SPF级雄性SD大鼠随机分为6组,除空白对照组(A组)外,余组均采取MNNG配合饥饱失常及情绪刺激等因素共8周制备PLGC模型。病理检测造模成功后,除A组大鼠外,余随机分组B-F组,模型对照组给予生理盐水灌胃,治疗组分别给予复方蜥蜴散80目、100目、80+100目等量混合混悬液及维酶素混悬液灌胃,持续治疗12周,处死后取胃黏膜组织,应用免疫组化法检测NF-k B信号通路中p65、p50、Ik B-a蛋白的表达,光镜下观察胃黏膜病理组织学变化。结果通过图像分析系统对免疫组化图像光密度的测算,模型对照组p65、p50、Ik B-a的阳性表达显著高于正常对照组(P0.01),复方蜥蜴散80目、100目、80+100目组和维霉素组p65、p50、Ik B-a的阳性表达显著低于模型组(P0.05),复方蜥蜴散80+100目等量混合组p65、p50、Ik B-a的阳性表达显著低于复方蜥蜴散80目和100目组(P0.05)。结论①复方蜥蜴散不同微粒组合剂能促进PLGC组织中细胞凋亡相关p65、p50、Ik B-a蛋白的表达。②复方蜥蜴散不同微粒组合剂治疗PLGC的作用机制,可能是抑制NFk B通道中P65、P50、IKB-a蛋白的激活,改变NF-k B通道,恢复细胞增殖与凋亡的平衡,从而阻断和逆转PLGC。③复方蜥蜴散不同微粒组合剂对胃黏膜损伤的修复疗效优于复方蜥蜴散80目和复方蜥蜴散100目,说明中药复方制剂可通过不同微粒组合来提高其疗效。
【关键词】：
【学位授予单位】：宁夏医科大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：R285.5;R-332【目录】：
摘要4-5ABSTRACT5-7中英文缩略词表7-10前言10-13材料与方法13-18 1. 实验设备及材料13-14 2. 试验方法14-15 3. 标本处理15-16 4. 实验指标的检测16-18结果18-24 1. 实验大鼠的一般情况观察18 2. 造模前后大鼠体重变化18-19 3. 实验大鼠胃黏膜情况19-20 4. 免疫组化结果20-24讨论24-33 1. PLGC病因病机的探讨24-26 2. 实验动物造模方法的选择26 3. 蜥蜴散组方分析26-31 4. 实验检测指标的选择31-33结论33-34附图34-39参考文献39-45综述45-61 综述参考文献56-61致谢61-62攻读学位期间发表的学术论文62-63个人简历63
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NF-κB p65在人难愈合创面肉芽组织及增生性瘢痕中的表达和意义
2010年第7期目录
&&&&&&本期共收录文章20篇
　　[摘要]目的:本研究拟观察NF-κB信号传导通路关键基因p65在人难愈合创面肉芽组织、不同时间阶段的增生性瘢痕以及正常皮肤标本的表达水平是否存在差异及关系。方法:收集临床标本40例为实验组,其中难愈合创面肉芽组织(A组)、半年内增生性瘢痕(B组)、半年至1年增生性瘢痕(C组)、一年以上增生性瘢痕(D组)组织各10例,收集正常皮肤组织标本8例为对照组(E组)。采用组织免疫化学方法、实时荧光定量RT-PCR和Western blot技术分析检测各标本中NF-κB p65表达。结果:免疫组化SP法染色B、C、D组中表达阳性,尤其是在B组中皮肤基底细胞层细胞阳性表达尤为明显。RT-PCR检测中,各组间均无显著的统计学意义(P>0.05)。但从各组均数来看,B、C、D组处于较高水平(B组为0.44,C组为0.46,D组为0.47),数值相近,并且有高于E组和A组的趋势(A组为0.38,E组为0.30)。Western blot 检测中B、C、D组的蛋白表达水平明显要高于A组和E组(P<0.05)。结论:①在难愈合创面肉芽组织中NF-кB p65表达水平较低,表明难愈合创面肉芽组织中细胞凋亡增强,抗凋亡水平受到抑制,组织难以愈合;②在增生性瘢痕早期(半年内)中,NF-кB p65的表达明显增强,表明在增生性瘢痕早期瘢痕组织凋亡作用降低,抗凋亡作用明显增强,瘢痕组织表现出明显的增生作用;NF-κB p65皮肤基底细胞层细胞阳性表达尤为明显,表明NF-кB p65可能在增生性瘢痕增生中发挥着重要作用,对增生性瘢痕凋亡有着强有力的抑制作用,促进了增生性瘢痕增生;③在增生性瘢痕后期(半年至1年),NF-кB p65的表达仍高于正常皮肤,表明在增生性瘢痕后期细胞凋亡水平较低,抗凋亡水平较高,仍有组织增生;④在增生性瘢痕成熟期(1年后),NF-кB p65表达水平接近正常皮肤。瘢痕组织凋亡作用增强,增生减弱,变得平坦和消退。 中国论文网 /6/view-2795527.htm　　[关键词]增生性瘢痕;核转录因子-kappaB;凋亡;肉芽组织 　　[中图分类号]R619+.6[文献标识码]A[文章编号]10)07-1009-04 　　 　　Expression and significance of NF-κB in human chronic granulation tissue and 　　hypertrophic scar 　　LI Qiang1,XU Xiao-qun2,LI Zhe3,CAI Jing-long4 　　(1.Department of Burn & Plastic Surgery, Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, Shandong,C 2. Institue of Basic Medicine,Shandong Academy of Medical Science, Jinan 250062, Shandong,C 3. Department of Pathology, Jinan Central Hospital, Jinan 250011, Shandong,C 4. The 16th Department,Plastic Surgery Hospital, CAMS, Beijing 100144,China) 　　 　　Abstract:ObjectiveThis study was to collect the clinical chronic granulation tissue, hypertrophic scars and normal skin samples to observe the p65 gene in NF-κB signaling pathway key organizations in different stages the level of signaling expressed by the existence of differences.MethodsThe collection of clinical specimens,including 40 cases of various stages,10 cases each group of human chronic granulation tissue,hypertrophic scars,and 8 cases of normal skin. Using immunohistochemistry,Real-time quantitative RT-PCR testing and Western blot to detect .Experimental group: Group A for the chronic granulation tissue,hypertrophic scars six months for group B, six months to one year for hypertrophic scars for Group C,more than a year hypertrophic scars for the group D, the control group of normal skin group for the group E.ResultsImmunohistochemical staining SP method shows F-κB p65 expression in Groups B,C,D expressed positive. In particular, noted that the NF-κB p65 in Group B in basal layer of skin is particularly positive. RT-PCR NF-кB p65 activity levels were compared between the groups was no significant difference (P>0.05). However,Groups B,C,D are similar,and there is higher than that of Group E and Group A. Western blot test results NF-кB p65 in B group,C group,D group of protein expression levels were significantly higher than that of group A and E group (P<0.05).Conclusion①In the chronic granulation tissue, NF-кB p65 no significant changes in the chronic granulation tissue showed that apoptosis increased,the level of anti-apoptosis is inhibited, the organization difficult to heal. ②In the early hypertrophic scars (in six months),NF-кB p65 expression was significantly increased. Skin significantly enhance the role of anti-apoptosis,and apoptosis decreased significantly the performance of scar tissue hyperplasia role. As the basal cell layer of skin has the ability to split activly,which showed that NF-кB p65 may be in the proliferation of skin plays an important role in apoptosis of the skin has a strong inhibitory effect on skin,and plays an important role in proliferation. ③In the latter of hypertrophic scars (6 months to 1 year ), NF-кB p65 expression was still higher than normal skin, show that in the latter part of hypertrophic scars still hyperplasia.④In the mature hypertrophic scars (after 1 years), NF-кB p65 expression levels close to normal skin. Scar tissue to strengthen the role of apoptosis, proliferation weakened,HS become flat and faded.
　　Key words: NF-kappa B; chronic granulation tissue 　　 　　NF-κB信号转导通路贯穿于创伤修复与愈合的整个生物学过程。NF-k B存在于几乎所有类型的组织和细胞,是一类关键性的核转录因子,是由Rel/NF-kappaB家族的多肽成员所形成的一组二聚体形式的转录因子的统称,因能与B细胞免疫球蛋白κ轻链基因的增强子序列的B点位特异结合而得名[1]。以p50/p65异源二聚体最先确认并最常见。NF-κB是一种具有多向性调节作用的转录因子,活化后通过调节许多细胞因子、趋化因子、生长因子、粘附分子及多种酶的基因表达,对细胞内许多基因的表达起着关键性的调控作用,参与细胞生长、发育、凋亡等多种生理功能,并在细胞恶性转化、纤维化等方面起重要作用[2-3]。越来越多的研究表明许多疾病的发生和发展都与NF-κB的过度活化有关。而NF-κB中p65表达将阻止凋亡并提高TRAIL治疗细胞中的NF-кB的活性。许多抗肿瘤药物因能使NF-κB活化而使得许多肿瘤细胞产生药物抗性[4-5]。 　　 　　1材料和方法 　　1.1 实验材料及标本采集、处理及分组:收集山东大学附属省立医院烧伤整形美容外科手术切除的难愈合创面肉芽组织及增生性瘢痕组织40例以及正常皮肤8例,年龄2～42岁,平均22.7±10.60岁,其中女性15例,男性33例。其中,难愈合创面肉芽组织及增生性瘢痕病因如下:火焰烧伤为12例,热液烧伤为10例,化学烧伤为7例,外伤为6例,其它5例。难愈合创面肉芽组织为上述原因导致1～2个月尚未愈合的创面10例。增生性瘢痕位于面颈部5例、躯干10例,上肢8例,下肢7例。3～6个月内增生性瘢痕10例,0.5～1年增生性瘢痕10例,1～3年增生性瘢痕10例。临床收集标本,每份标本分为两部分,分别用于病理免疫组化检测和转录、翻译水平等检测,组织保存于液氮。 　　实验分组情况,难愈合创面肉芽组织为A组,半年内增生性瘢痕为B组,半年至1年增生性瘢痕为C组,1年以上增生性瘢痕为D组,对照组正常皮肤组为E组。 　　1.2 主要试剂:硝酸纤维素杂交膜:S&S公司产品,1kb DNA Marker:MBI,丙烯酰胺(上海生工生物工程公司),1g N,N'-亚甲双丙烯酰胺(Promega公司产品),NF-κB p65 兔单克隆抗体购自美国Cell Signaling 技术公司、酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体)购自北京中山金桥(美国SantaCruz Biotechnology, INC)。 　　1.3 常规HE、免疫组化染色:常规HE染色:取材组织块,经固定后,常规石蜡包埋,4μm切片,脱蜡,染液染色,封片。免疫组织化学染色S-P法:4μm的组织切片脱蜡、水化;3%双氧水室温孵育;蒸馏水洗;PBS洗;正常血清(1:10)湿盒孵育;滴加一抗,置湿盒中室温孵育;PBS洗;滴加生物素标记的二抗工作液置湿盒孵育;PBS洗;滴加链霉亲和素过氧化物酶复合物工作液室温孵育;PBS洗;DAB显色5～10min,在显微镜下掌握染色程度;再水洗复染脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、镜检。 　　1.4 RT-PCR检测NF-κB p65mRNA表达:根据文献[6],设计合成NF-κB p65及内参照β-actin的引物各一对,序列如下: 　　NF-κB p65上游引物P1:5'-TGCTGTGCGGCTCTGCTTCC-3' 　　 下游引物P2:5'-AGGCTGGGGTCTGCGTAGGG-3; 　　β-actin 上游引物P1:5'-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3' 　　 下游引物P2:5′-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC -3′。 　　扩增的片段分别为321bp和539bp。上述引物均由美国Invitrogen生物公司合成。 　　首先对实验所用物品去Rnase处理。再对各样本组织标本的组织及细胞总RNA进行提取,然后进行逆转录(RT)反应和聚合酶链反应(PCR)。RT反应条件如下:快速离心混匀;37℃ 1h,95℃ 10min灭活M-MLV;快速离心使蒸汽沉于管底。PCR反应条件快速离心混匀;95℃ 5min,冰浴冷却,然后快速离心使蒸汽沉于管底。加入1μl(1U/μl) Taq DNA聚合酶,快速离心混匀,加入30μl液体石蜡。循环条件:94℃ 158℃ 172℃ 1共35个循环,最后72℃延长7min。电泳鉴定。 　　将凝胶电泳图像输入美国Kodak凝胶分析系统,应用1D Image Analysis Software进行表达强度分析,按下公式计算相对系数。相对系数=细胞因子表达强度/-actin表达强度。 　　1.5 Western blot检测NF-κB p65蛋白表达:本试验应用蛋白提取液(含蛋白酶抑制剂10%)抽提各个实验组织的总蛋白,可以有效抑制蛋白降解。应用蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳方法及Western Blot方法。将SDS-PAGE凝胶电泳完毕,小心取下凝胶,转膜,洗膜后,将NC膜置于平皿或小袋中,加入适当稀释的一抗(兔抗人MICA多抗),再洗膜;加入适当稀释的酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体),再洗膜后显色,直至显色效果满意为止,立即将膜置于双蒸水中终止反应。 　　1.6 统计学分析:全部实验数据均采用SPSS13.0医学统计学软件进行分析,各组样本的凋亡水平均以均数±标准差(x ±s)。多组均数比较进行一维方差分析(One way ANOVA), P<0.05作为差异显著性界值。 　　 　　2结果 　　2.1 HE染色观测各组样本病理学形态 　　2.1.1 E组镜下可见表皮层次清楚,角化层角化明显,皮肤附属器丰富,包括汗腺、皮脂腺、毛囊等结构。胶原纤维束排列规则,少而疏松、卷曲,细胞较少(图1-1)。 　　2.1.2 A组镜下可见大量由内皮细胞增生形成的实性细胞索及扩张的毛细血管,向创面垂直生长;在毛细血管周围有许多新生的成纤维细胞,呈圆形,增生的成纤维细胞散在分布于毛细血管网络之间,很少有胶原纤维形成;多少不等的炎性细胞浸润于难愈合创面肉芽组织之中(图1-2)。 　　2.2.3 B组镜下可见表皮覆盖创面,但鳞状上皮薄,基底层增生较活跃,表层上皮细胞未见明显角化。许多成纤维细胞,呈扁圆形,有网状纤维及胶原纤维增多,网状纤维有胶原化,皮下胶原较旺盛,粗大,排列紊乱;间质中炎性细胞少见;可见少量毛细血管(图1-3)。 　　2.2.4 C组镜下可见表面鳞状上皮基底层、棘层及角化层层次较清楚,可出现较少角化现象。网状纤维及胶原纤维增多,网状纤维胶原化,皮下胶原纤维较前变细,排列规则,部分呈玻璃样变性;成纤维细胞减少或消失,仅见少量纤维细胞,呈细长;间质中炎性细胞消失;毛细血管闭合、退化、消失,可见稀少的小动脉及小静脉(图1-4)。 　　2.2.5 D组镜下可见鳞状上皮层次清楚,出现角化,但仍比正常鳞状上皮薄,无脚突,无皮肤附属器。皮下胶原细、少,排列更规则,呈玻璃样变性;仅见少量纤维细胞,细长;间质中炎性细胞消失;仅见稀少的小动脉及小静脉(图1-5)。
　　2.2 免疫组化SP法检测NF-κB p65表达及分布 　　2.2.1 NF-кB p65正常时主要位于细胞浆,当激活时转移至细胞核才能发挥其生物学作用。E组可见正常皮肤表现为表皮基底层、成纤维细胞细胞浆呈淡黄色,细胞核无黄染,在细胞上基底层,部分细胞核内出现黄染成纤维细胞基本无阳性表现,呈细长,背景清晰无非特异性着色。组织中胶原纤维无着色(图2-1)。 　　2.2.2 A组可见成纤维细胞偶见阳性表现,呈圆形,背景清晰无非特异性着色。组织中胶原纤维无着色(图2-2)。 　　2.2.3 B组可见成纤维细胞均匀着色的棕黄色颗粒,较多,呈圆形,背景清晰无非特异性着色。组织中胶原纤维无着色(图2-3)。 　　2.2.4 C组可见细胞阳性率下降,纤维细胞仍有着色,蓝色核染增多,背景清晰无非特异性着色。而细胞减少,瘢痕组织中大量胶原纤维无着色(图2-4)。 　　2.2.5 D组可见细胞阳性率偶见,成熟的纤维细胞胞浆内未见棕黄色颗粒,呈细长,背景清晰无非特异性着色。组织中胶原纤维无着色(图2-5)。 　　尤其注意的是在瘢痕增生早期组织中,可见表皮鳞状细胞层菲薄,而在瘢痕皮肤基底细胞层细胞有大量均匀着色的棕黄色颗粒,而相比较在皮肤其它各层却鲜见(图3)。 　　2.3 RT-PCR检测组织NF-кBp65的表达:NF-кB p65活性水平各组间比较差异无显著的统计学意义(P>0.05)。(表1,图4)。但从各组均数来看,E组和A组处于较低水平(A组为0.38,E组为0.30)。B、C、D组处于较高水平(B组为0.44,C组为0.46,D组为0.47),数值相近,并且有高于E组和A组的趋势。 　　2.4 Western blot检测NF-кBp65的表达:NF-кB p65在A组和E组中蛋白表达水平差异没有显著地统计学意义(P>0.05),B组、C组、D组的蛋白表达水平明显要高于A组和E组(P<0.05)(图5)。 　　 　　3讨论 　　有两条不同的信号通路参与调控TRAIL诱导细胞凋亡的胞内途径[7],其一是通过半胱天冬蛋白酶(Caspase)传导凋亡信号,称为Caspase通路,其二是通过活化NF-κB进行基因诱导调控。死亡受体DR4、DR5可经TRADD活化NF-κB,而NF-κB活化后又通过调节基因转录来调节TRAIL引起的凋亡。抑制TRAIL诱导的NF-κB活化可增强TRAIL诱导的凋亡,并减弱细胞对TRAIL诱导凋亡的抵抗力。与正常皮肤相比较,NF-κB P65蛋白水平在瘢痕疙瘩组织中表现为静息水平的高表达,其持续活化促进cyclinD1的表达,导致成纤维细胞的异常增殖,合成过量胶原,造成细胞外基质的异常堆积[8]。 　　在本实验中,NF-кB p65在难愈合创面肉芽组织中与正常皮肤组织中没有太大变化,在增生性瘢痕各阶段中,NF-кB p65的表达是高于正常皮肤和难愈合创面肉芽组织的趋势,而在难愈合创面肉芽组织与正常皮肤中处于较低表达水平的趋势。并结合免疫组织化学染色和western blot的实验结果,可以较明显看出NF-кB p65此趋势。而出现本实验RT-PCR的统计学结果,考虑临床增生性瘢痕的取材增生情况复杂,增生状态跨度大,增加样本量可能有较好的统计学结果。 　　在免疫组化瘢痕增生早期(半年内)组织中可见在瘢痕皮肤基底细胞层有大量均匀着色的棕黄色颗粒,而在皮肤其它各层却少见着色的棕黄色颗粒。由于皮肤基底细胞层有活跃的分裂能力,是表皮各层细胞的生发之源,这表明NF-кB p65可能在皮肤增生中发挥着重要作用,对皮肤凋亡有着强有力的抑制作用,对皮肤增生起着重要作用。NF-кB是抑制凋亡的中介者,它的激活通过抑制细胞因子caspase-8活性启动来提高抗凋亡细胞和组织的阈值。本实验研究率先检测了NF-кB p65在难愈合创面肉芽组织及增生性瘢痕中不同增生阶段的表达,提示了NF-кB p65凋亡调控极有可能参与难愈合创面肉芽组织异常凋亡增强和瘢痕增生中异常凋亡降低,对难愈合创面肉芽组织的修复和治疗瘢痕增生及其治疗时机提供了理论基础依据。 　　 　　[参考文献] 　　[1]Perkins ND. Integrating cell-signalling pathway with NF-kappaB and IKK function[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,): 49-62. Review. 　　[2]Griffin JD. Leukemia stem cells and constitutive activation of NF-κB[J]. Blood,): 2291. 　　[3]Baron F, Turhan AG, Giron-Michel J, et al. Leukemic target susceptibility to natural killer cytotoxicity: Relationship with BCR-ABL expression[J]. Blood,): . 　　[4]Beg AA and Baltimore D. An essential role for NF-κB in preventing TNF-α-induced cell death[J]. Science,8):782-784. 　　[5]Van Antwerp DJ, Martin SJ, Kafri T, et al. Suppression of TNF-α-induced apoptosis by NF-κB[J]. Science,8):787-789. 　　[6]Boya P, Larrea E, Sola I, et al. Nuclear factor-kappa B in the liver of patients with chronic hepatitis C: decreased RelA expression is associated with enhanced fibrosis progression[J]. Hepatology,):. 　　[7]Hussein MR, Haemel AK, Wood G.S. Apoptosis and melanoma: molecular mechanisms[J]. J Pathol,):275-288. 　　[8]Zhu G,Cai J,Zhang J,et al. Abnormal nuclear factor (NF)-kappaB signal pathway and aspirin inhibits tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappaB activation in keloid fibroblasts[J]. Dermatol Surg,):697-708. 　　 　　[收稿日期] [修回日期] 　　编辑/张惠娟
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