OX40-OX40L共刺激分子在肝移植急性排斥反應中作用的實驗分析
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上傳時間： 10:47:00
　　　　　　　　　　　　　　　　　　作者：胡曼麗 範恩學 孫海俠 王煥麗 　　【摘要】
探讨共刺激分子途徑在免疫耐受的作用机制。方法
制作大鼠肝移植模型，應用抗CD134抗體+雷帕黴素聯合药物抑制急性排斥反應的發生。結果
空白對照組：SD對Wistar組存活時間因有排斥反應致存活時間短；移植治療對照組：單純抗CD134組與單純雷帕霉素組，其中SD對SD組和Wistar組對Wistar組大鼠間肝移植因未見明顯的排斥反應，存活時間長，MHC完全不匹配的SD對Wistar組存活時間短，前两者（SD對SD組和Wistar組對Wistar組）和後者（SD對Wistar組）間抑制排斥反應有差異；抗CD134抗體與雷帕黴素联合治療組：SD對SD組，Wistar组對Wistar組因未見明显的排斥反應及封閉了共刺激途徑，存活時間一樣长，前兩者（SD對SD組、Wistar組对Wistar組）和後者（SD對Wistar組）间抑制排斥反應有統計學差異，結果顯示抗CD134抗體與雷帕黴素聯合治療组抑制移植效果最佳。結論
應用抗CD134抗體+雷帕黴素可以誘導免疫耐受的產生。 　　【關鍵詞】
共刺激分子
肝移植急性排斥反應
抗CD134抗體
免疫耐受 　　研究免疫耐受誘導的方案很多，由於是單一途徑刺激，效果不好。 許多學者開始提出多途徑協同刺激方案。抗CD134基因工程抗體可用來封閉OX40-OX40L共刺激相關分子，影響細胞活化，诱導免疫耐受的產生。 　　1
材料與方法 　　1.1 抗體來源
我們從美國SIGMA公司引進抗CD134基因工程抗體1000mg/ml和抗大鼠IL-a、TNF、IFN抗體。 　　1.2 實驗分組
選取MHC（組織相容復合體）完全不匹配的雄性SD大鼠（供體）、8-10周齡、體重200-240g。雄性wistar大鼠（供體）、8-12周齡、體重200-240g。由吉林大學實驗動物（清潔级動物）提供，隨機分成10組，每組8只，供肝脏移植用。10組分別於3天、6天、9天、12天、16天、20天給藥：對照組腹腔註射生理鹽水；2、3、4组註射抗大鼠CD134抗體0.5mg/只；5、6、7組肌肉註射雷帕黴素1mg/kg/d/只；8、9、10組給雷帕黴素1mg/kg/d/只和抗大鼠CD134抗體0.5mg/只。 　　1.3 大鼠肝臟移植術式
采用腹腔原位肝臟移植法。大鼠采用30mg/kg戊巴比妥腹腔註射。麻醉生效後，分別切除受體肝臟，用7-0 Proleme-連續端端吻合肝臟上下腔靜脈（IVC），用套管法吻合門靜脈（PV），膽管重建采用Stent端端吻合法。移植肝臟冷血時間为30min之內。移植手術是否成功判斷標準為術後关腹前觀察移植肝臟血運情況。完全血運且無滲血为移植模型成功。 　　1.4 HE染色及免疫组化染色 　　1.4.1 HE染色方法
切取移植的肝臟組織，石臘切片脱蠟和水化後蒸氣水洗；哈瑞氏蘇木精淺染核5分鐘；自来水沖洗；1%鹽酸酒精分化—自來水沖洗；0.1%弱氨水返藍—自來水充分沖洗—蒸气水洗；伊紅染，15分鐘；常規脫水，透明，封片。常規切片，HE染色鏡下觀察。 　　1.4.2 免疫组化制備（SABC法）
實驗抗大鼠IL-a、TNF、IFN抗體按說明書進行。一抗的工作稀释度均為1∶400，為陰性对照。將目鏡配上10×10計數格，在高倍鏡下隨機選擇4個視野，計数4個視野的平均陽性细胞數。細胞漿內出现棕黃色顆粒為陽性，分別表示如下：棕黃色-+++，黃色-++，淡黃色-+，無色為陰性，表示計量分析將組化片扫描圖像輸入，采用計算機图像分析軟件計數浸潤的炎癥细胞數量。 轉貼于 免費論文下載中心
结果 　　2.1 抗大鼠IL-a，TNF、IFN抗體免疫組化細胞漿內出現棕黃色顆粒情況，分別表示如下：空白對照組未出現；抗CD134抗體治療組和雷帕黴素治療組各出現較少，經T檢驗，抗CD134抗體治療組和雷帕霉素治療組兩組間無統計學差異；抗CD134抗體治疗組和雷帕黴素聯合組最多，分別和抗CD134抗體治療組、雷帕霉素治療組有統計學意義。其中以SD對Wistar組最為明顯。說明聯合組抑制共同刺激途徑效果最好。 　　2.2 各組肝移植後大鼠存活时間（天）
空白對照組：SD對Wistar组存活時間因有排斥反應致存活時間短；移植治療對照組：單純抗CD134組與單純雷帕黴素組其中SD對SD組和Wistar組对Wistar組大鼠间肝移植因未見明顯的排斥反應，存活時間長， MHC完全不匹配的SD对Wistar組存活时間短，前兩者（SD对SD組和Wistar組對Wistar組）和後者（SD對Wistar組）間抑制排斥反应有統計學差異。抗CD134抗體與雷帕黴素聯合治疗組，SD對SD組，Wistar組對Wistar组因未見明顯的排斥反應及封閉了共刺激途徑，存活時間一樣長，前两者（SD對SD組、Wistar組對Wistar組）和後者（SD对Wistar組）間抑制排斥反應有統計學差異，結果顯示：抗CD134抗體與雷帕黴素聯合治療組抑制移植效果最佳，除此之外有兩只同系移植大鼠存活120天。由此证明，CD134組與雷帕霉素聯合組在移植免疫排斥抑制效果最佳，因此移植與配型、受、供之間配型接近者效果好。 　　3
討論 　　本研究建立肝移植動物模型，分10組，分別給生理鹽水對照、抗CD134抗體治療組、雷帕霉素治療組及抗CD134抗體+雷帕黴素治療組，研究對於肝移植免疫耐受的效果，移植結果表明：CD134组與單純雷帕黴素聯合用移植免疫排斥抑制效果最佳，因此移植與配型、受、供之間配型接近者效果好。 　　新的共刺激分子的認識和定性導致了移植免疫領域的研究者再次改寫了T细胞激活的雙信號模式。T細胞的完全激活在机理上更為復雜，可能需要幾種共刺激信號途徑的相互作用。這些信號（正性或負性）及其表達的方式（空間或時間）各不相同，反映出它們在介導T細胞應答中的不同作用。盡管各條共刺激信號途徑的相互作用存在其自身復雜性，正如CTLA4-Ig在II期臨床研究中的成功表現，選擇性單個分子的阻斷仍然是建立免疫耐受有效的策略之一。抗CD134共刺激通路在大鼠肝移植免疫排斥反應中起重要作用，但由於種属不同其作用也有明顯差異，CD134在大鼠和人的淋巴細胞中不表達，而CD8淋巴細胞在急性排斥反應中起關鍵作用，因此，利用大鼠動物模型研究CD134共刺激通路的作用機制對於人類移植排斥反應的預防有重要的指導意義。但是不同種屬之間引起排斥反應的強度和機制不同，但通過免疫抑制的治療可明显延長肝移植大鼠的存活时間。本研究采用排斥反應最強的SD大鼠與wistar大鼠間肝臟移植更有利於抗排斥反應的治療和方法研究。免疫病理研究結果顯示，炎癥細胞浸润是出現移植物排斥反應的重要標誌，抑制炎癥细胞浸潤可以明顯降低排斥反應的發生。本研究結果顯示，單獨應用抗CD134刺激通路阻斷均不能明顯抑制炎癥細胞的浸潤，而雷帕黴素與抗CD134聯合應用可明顯降低總細胞浸潤的數量，但巨噬細胞下降不明顯。總之，炎癥細胞浸潤結果与大鼠肝移植存活時間結果相一致。证明移植排斥反應機制是復雜的，是由多個通路參與排斥反應調節，只有多通路的聯合抑制才能達到理想的治療效果。 参 考 文 獻 [1]張中夫，韓德五，張蕓等.高遷移率組蛋白-1在實验性急性肝衰竭中的作用[J].中華肝膽病雜志，）:393-394. [2]陳曉紅，何有成，周元平.TGF-β、TNF-α及IL-6與肝纖維化的關系[J].上海免疫杂誌，&#66. 免費論文下載中心
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- 肾脏病学
大鼠移植肾组织ICAM-1/LFA-1分子表达与急性排斥反应的关系
中华肾脏病杂志 1998年第1期第14卷 论著
作者：黄孝伦　沈文律　李幼平　周泽清　罗义刚　谭建三
　　关键词： 肾移植；排斥；细胞间粘附分子-1；淋巴细胞功能相关抗原-1
　　目的　探讨移植肾组织内细胞间粘附分子-1(ICAM-1)/淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)的异常表达与移植排斥的关系。方法　采用改进的大鼠原位肾移植模型，分五个实验组，在不同的时间段、观测受体鼠存活、肾功能；以及移植肾组织用单克隆抗体免疫组织化学染色后，图象分析法定量测定移植肾组织ICAM-1/LFA-1分子表达的水平。结果　移植肾急性排斥组ICAM-1/LFA-1分子水平显著高于同品系移植对照组和药物治疗组。结论　移植肾组织活检同时检测组织内ICAM-1/LFA-1分子的表达，在肾移植急性排斥的诊断和治疗方面具有极其重要的临床意义。
Relationship between the expression of ICAM-1 and LFA-1 molecules and renal allograft rejection in rats
Huang Xiao-lun, Sheng Wenlu, Li Youping, et al. Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041.
　　Objective　To assess relationship between the renal graft expression of ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) and LFA-1 (Lymphocyte function associated antigen-1) molecule and the graft rejection.Methods　Rat kidney transplantation was performed according to the procedure of kamada, with some modification. Experimental rats were divided into 5 groups. The survival time of recipient rats and function of grafts after renal transplantation were observed. The sections of renal graft were stained for monoclonal antibody ICAM-1 and LFA-1, and then quantification of ICAM-1 and LFA-1 expression was accomplished by computer image analysis.Results　ICAM-1 and LFA-1 increased significantly in the renal allograft rejection group as compared with the non-rejection group (P＜0.05).Conclusion　Both the biopsy of renal graft and the monitoring of ICAM-1 and LFA-1 are useful tools in diagnosing and treating acute rejection.
　　Key words　Renal transplantation　Rejection　ICAM-1　LFA-1
　　近几年来，有学者从临床［1］和实验方面［2］研究了ICAM-1分子的表达与移植肾急性排斥间的关系。作为重要免疫分子的LFA-1，在移植肾内表达的报道文献较少。对此，我们采用大鼠原位肾移植模型，在过去实验研究的基础上［3］，用单克隆抗体(MoAb)检测肾组织内ICAM-1/LFA-1分子的表达水平，旨在探索ICAM-1/LFA-1的表达水平与肾移植排斥反应的关系。
材料和方法
　　一、实验动物与分组　(1)动物：随机采用近交系SD大鼠35只，Wistar大鼠55只，均系雄性，重200～250克，分别作为供、受体。动物由华西医科大学实验动物中心提供。(2)实验分组：根据使用药物的不同随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组，其中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等组，又根据不同的实验时间，每组再分为2周、4周两个亚组。Ⅰ组(同品系移植n=10)：供受者同为Wistar大鼠，作为无排斥对照组：其它组(同种异体移植组n=35)：SD大鼠供肾移植给Wistar受体鼠。Ⅱ组(n=5)作为不用药实验对照组：Ⅲ组(n=10)：单用环孢素A(10 mg*kg-1*d-1)抗排斥治疗组：Ⅳ组(n=10)：小剂量环孢素A(2.5 mg*kg-1*d-1)联合金钱草(7 g/kg-1*d-1)抗排斥治疗组；Ⅴ组(n=10)：单用金钱草(7 g*kg-1*d-1)抗排斥治疗组。
　　二、药物及给药方法　环孢素A(cyclosporine A,CsA) 100 g/L溶于10%脂肪乳液中，浓度分别为1.25 g/L、0.25 g/L；金钱草(Herba Lysimachiae)购自四川省中草药进出品公司；金钱草颗粒冲剂的制备采用煎煮、过滤、减压浓缩、干燥、制粒而成，由华西医科大学药学院提供。颗粒冲剂溶于0.9%氯化钠溶液中，浓度为350 g/L。采用灌胃针(日本产)插入大鼠胃内缓慢(3～5分钟)注入给药，按前述各组的剂量每日一次连续10天，术后当日为0天不给药。
　　三、单克隆抗体(MoAb)ICAM-1/LFA-1购自美国 Pharmingen公司。
　　四、改进的大鼠原位肾移植模型　采用改进的Kamada［5］大鼠肾移植法。切除左肾，供肾原位移植术毕后，立即切除对侧右肾。术后进食、饮水不限，凡因手术失败致受体鼠死亡排除在本实验外。
　　五、观察、采集标本　受体鼠存活以天计，分别于术后14或28天处死前一天，将其放入代谢笼，收集24小时尿液，记录尿量，测24小时尿蛋白，处死时从下腔静脉采血2 ml，测血BUN、Cr，取移植肾作光镜、电镜观察及免疫组化检查；病理诊断根据“Banff Schema”标准［5］。未治疗组大鼠术后立即放入代谢笼中观察，收集尿液，死亡时立即按上述方法采集标本。
　　六、移植肾免疫组织化学检查SP法(LSAB法)　新鲜肾组织快速置入液氮中冷冻，在恒冷(-20℃)切片机中切5 μm厚冰冻切片，然后采用苏红等［7］SP法进行免疫组化染色。实验中，另外处死未手术的正常SD和Wistar大鼠各3只，取其肾脏，按上述组织化学染色法染色作为空白对照，用Ⅱ组移植肾染色阳性标本作为阳性对照。
　　七、免疫组织化学定量研究［8］　采用MIAS-300计算机图像分析系统，通过光学显微镜放大400倍摄取图像，输入图像分析系统内。每只鼠肾取4张切片，每张切片随机选5个视野(每一个视野含肾小球一个)。5个视野测试面积作为包容空间(或称参考空间)将ICAM-1/LFA-1的阳性面积除以包容空间，取其均值作为“阳性区域面积”(与参考空间相比的绝对值)。
　　八、统计方法　在486微机上采用美国SAS(6.04版)软件包进行方差分析及两两比较(Student-Newman-KSNK)；当P＜0.05时差异具有显著性，实验结果以±s表示。
　　一、受体鼠存活时间　Ⅱ组受体鼠术后11天内均死亡，经病理证实为急性排斥(Ⅲ度)，平均存活时间9天，Ⅴ组的2周亚组有一例(1/5)手术后8天死亡，经病理诊断为急性排斥(Ⅲ度)；Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组的各亚组四周组受体鼠分别在术后14天、28天时处死(处死前活着)，其术后平均存活时间明显较Ⅱ组长，Ⅲ、Ⅳ组受体鼠术后存活时间与Ⅰ组相比无显著性差异。
　　二、移植肾形态学改变　见表1。
　　肾移植术后2周，Ⅰ组正常4只，临界性改变1只，仅见灶性的单核细胞浸润，间质轻度水肿；Ⅳ组与Ⅰ组的病理改变相似，仅间质浸润的单核细胞较Ⅰ组稍多，也无间质出血和肾小管的坏死。Ⅱ组光镜下见大量的单核细胞浸润、肾小管坏死溶解，小动脉纤维素样坏死；电镜下见细胞器溶解，空泡变，呈典型的急性排斥反应；Ⅴ组间质中有灶性单核细胞浸润、间质水肿，有一例可见肾小管坏死改变，Ⅲ组的病理改变界于Ⅳ、Ⅴ组之间。肾移植术后4周，Ⅴ组以间质纤维化、肾小管灶性萎缩、动脉内膜和肾小球基底膜增厚、肾单位减少为特征；Ⅲ组与Ⅳ组的改变相似，都有不同程度的慢性排斥存在，但较Ⅴ组轻，以Ⅰ组最轻。而Ⅱ组已全部死亡。
　　三、功能指标的变化　见表2、3。移植术后2周时测定血BUN、Cr及蛋白尿，Ⅱ组与Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组相比有显著性差异，与Ⅴ组相比无显著性差异。移植术后4周时，Ⅴ组血BUN、Cr及蛋白尿高于其它各组，相比有显著性差异；从2～4周，各组都有不同程度的血BUN、Cr及蛋白尿的升高，Ⅴ组最高(P＜0.05)。
　　四、免疫组织化学染色　见表4。肾移植术后各组ICAM-1/LFA-1都呈阳性表达，2周时，以Ⅱ组表达水平最高，与其余组相比有显著性差异，以Ⅰ组表达水平最低；4周时，各组表达水平都较2周时高，Ⅰ组仍最低，且与其余组相比较有显著性差异，以Ⅴ组表达水平最高。
表1　按“Banff Schema”标准对各实验组移植肾病理分类、分级诊断结果
　　改　变
急　性　排　斥
慢　性　排　斥
　　*肾移植术后2周；**肾移植术后4周；▲指非移植排斥反应；本实验1例为肾盂肾炎。
表2　各组肾移植术后2周血BUN、Cr、24h尿量、尿蛋白的变化(±s)
BUN(mmol/L)
Cr(μmol/L)
尿量(ml/24h)
尿蛋白(g/L)
8.63±0.77
109.00±7.81
15.91±3.59
0.24±0.08
11.50±1.00*
7.93±1.22△
1.61±0.37★
6.22±0.38
74.73±50.93
16.91±2.84
0.18±0.04
8.58±1.10
88.66±18.30
11.36±0.56
0.17±0.03
13.39±3.51
145.35±21.20
16.93±8.10
0.37±0.14
　　Ⅱ组与Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组相比，* P＜0.05；Ⅱ组与Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组相比，▲ P＜0.05；
　　Ⅱ组与Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ组相比，△P＜0.05；Ⅱ组与Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组相比，★ P＜0.05表3　各组肾移植术后4周血BUN、Cr、24h尿量及尿蛋白的变化(±s)
BUN(mmol/L)
Cr(μmol/L)
尿量(ml/24h)
尿蛋白(g/L)
10.21±2.59
106.00±19.46
230.36±4.99
0.37±0.18
8.07±0.89
97.66±5.13
14.66±3.61
0.20±0.03
12.39±3.71
160.66±34.07
16.30±2.47
0.35±0.13
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移植肾急性排斥反应的无创性监测与诊断
彭文翰　陈江华
　　随着移植免疫研究的深入和新型免疫抑制剂不断问世，肾移植术后急性排斥反应的发生率明显下降，移植物的存活，特别是短期存活已有明显提高，但急性排斥反应仍然是影响移植肾长期存活的主要因素之一。其中发生难治性排斥反应的比例逐渐升高，其较高的移植肾失功率越来越受到关注。而与30年前相比，我们对于急性排斥反应、难治性排斥反应诊断与监测的策略一直没有很大的发展。目前临床上多依靠血肌酐水平来监测移植肾功能，但许多原因都可以引起血肌酐升高；另一方面免疫反应引起明显的移植肾组织损伤后才会导致血肌酐升高，所以血肌酐对急性排斥反应的诊断既非特异又不敏感。急性排斥反应时的症状和体征，诸如尿量减少、血压升高、发热、血尿以及移植肾肿胀质硬等本身就不特异，在使用新型免疫抑制剂情况下更不典型，因此不能较好地满足临床早期、迅速地监测和诊断急性排斥反应的需求。移植肾穿刺活体组织病理检查(肾活检)是目前急性排斥反应诊断的主要方法，作为有创性检查，不可避免存在相关并发症如出血、移植肾破裂等，难以在短期内反复检查，也无法在门诊动态观察随访，同时费用和移植受者的接受程度也在一定程度上制约肾活检的开展。另外，穿刺局部的组织有时候并不能很好地代表整个移植物的免疫状态，病理检查结果常常与临床表现不一致。所以寻求无创性检查来监测移植肾功能、诊断急性排斥反应，已经成为移植界关注的课题。近10年来通过新的血、尿标记物，运用系统生物学(转录组学、蛋白组学、代谢组学)和新型影像学技术来监测和诊断急性排斥反应的研究获得了长足的发展。
1　血、尿标记物
　　良好的血、尿标记物应具有稳定性和重复性好，测定方法快速、简便，费用低廉，特异性和敏感性高等特点。一般来说血液中的标记物可以反映整个机体免疫状态，目前主要集中在外周血单个核细胞一些免疫分子(如细胞间黏附分子-1，IL-4)和细胞毒T细胞效应蛋白(颗粒酶和穿孔素)的表达、可溶性的细胞因子受体和淋巴细胞标志物(如可溶性IL-2R、可溶性CD30)。这些血清标记物在反映受者全身的免疫状态方面有一定的价值，但由于无法直接反映移植肾的变化，利用血清标记物诊断急性排斥反应多存在敏感性低或特异性不高的问题，限制了其在临床的运用。但在血管性排斥反应、肾小球肾炎、肾小管周毛细血管炎时，循环中的内皮细胞可以反映血管内皮细胞的损伤程度，特别是血中的一些抗体，如抗内皮细胞抗体和抗供体特异性抗体在诊断血管性排斥反应、抗体介导的排斥反应时具有独特的价值。
　　尿蛋白除少部分来源于血浆蛋白，大部分由肾脏产生。在生理性因素和病理性因素刺激下，肾小球和肾小管作出相应的反应，引起尿蛋白排出的变化。大量聚集于移植肾的免疫细胞释放的免疫分子和炎症介质通过肾间质和肾小管排出体外，使得尿液更能直接反映移植肾免疫状态；另一方面尿标本的易得性，便于反复检查以及门诊追踪随访，吸引很多学者热衷于尿标记物的研究。急性排斥反应时尿标记物主要集中在细胞毒T细胞效应蛋白和各种细胞因子包括IL、黏附分子、趋化因子、生长因子，以及某些免疫细胞表面的标志物。急性排斥反应时尿中很多细胞因子变化并不特异，或者只是伴随变化，它们在感染性炎症、缺血再灌注损伤或是慢性炎症时都可以出现类似的变化，比如TNF-α在急性排斥反应和泌尿系感染时都可以明显升高。另外可能受制于标记物在尿液中的稳定性以及尿液浓度变化，不同学者报道的结果并不完全相同，根据现有的文献综合来看，颗粒酶和穿孔素、趋化因子Mig、IP-10可能是有价值的标记物。最近我们通过大样本的研究发现，fractalkine的价值可能优于颗粒酶和穿孔素、趋化因子Mig、IP-10，不仅能较好地诊断急性排斥反应并区别于其他并发症，敏感性和特异性均较高，而且能估计发生急性排斥反应患者对激素治疗的反应，预测短期移植肾失功的风险。由于免疫反应是个非常复杂的过程，许多因素均参与其中，试图通过一种标记物来同时获得很高的敏感性和特异性非常困难，有学者把几种不同阶段的标记物结合起来作为一个组合来监测移植肾免疫状态显然要优于单个标记物。我们研究发现，将fractalkine、颗粒酶B、IP-10这3种尿标记物组合起来，诊断急性排斥反应的敏感性和特异性可以分别达到83.6％和95.0％。
2　转录组学、蛋白组学、代谢组学
　　血、尿标记物的研究是根据我们已知的免疫反应机制和过程，选择可能的标记物。然而移植免疫的机制还远没有被我们所了解，这势必限制了标记物研究的范围。而系统生物学建立在印迹和杂交技术基础上，通过高通量生物芯片，在转录组(mRNA水平)、蛋白组(蛋白质水平)、代谢组(代谢水平)等不同层面上进行监测，并且把这些信息整合起来，这样不但可以从宏观的角度了解移植肾的免疫状态，而且有助于移植免疫机制的研究。转录组学的研究主要是通过基因芯片来实现，具有代表性的研究是Sarwal等通过对肾移植受者基因表达谱的研究发现以往没有认识到的分子异质性可能提示了肾移植受者排斥反应发生过程以及对治疗反应的多样性。他们发现有3个分子标记对超过1300个基因的表达产生了影响，并根据聚类分析结果把发生急性排斥反应分为3类：Ⅰ类急性排斥反应的特点是大量的T细胞、B细胞、巨噬细胞以及NK细胞在组织中激活、浸润；Ⅱ类排斥反应程度相对缓和，其基因表达谱特点与移植后药物中毒及感染相似；Ⅲ类排斥反应是一种免疫静息的排斥反应，并且有自愈的倾向。蛋白组学应用蛋白芯片、SELDI-TOF和CE-MS技术进行分析，能明显区分急性排斥反应患者与移植肾功能稳定者，而且这些差别在患者血肌酐明显升高前就能发现，能够帮助早期诊断急性排斥反应。同时发现有一种多肽在急性小管间质性排斥反应时显著异常，急性血管性排斥反应则没有这种现象。代谢组学在移植领域的研究比转录组学和蛋白组学相对少些，但是随着毛细管电泳、高效液相色谱、高通量核磁共振分光计发展，能够同时对上千种代谢产物进行测量，代谢产物病理状态下的改变能够在几分钟甚至几秒钟内反映出来。但是免疫抑制药物的使用和慢性感染对代谢产物的影响较大，目前对许多代谢产物的认识不够深入，也在一定程度上阻碍了代谢组学在移植临床中的应用。随着新技术的应用，转录组学、蛋白组学已在移植领域表现出了新价值，研究者因此对基因和蛋白质表达谱改变的分析更加全面和迅速。系统生物学高通量的研究技术能够发现并证实过去没有认识到的与肾移植相关的基因和蛋白质及其相互关系，加上对代谢组学研究的深入，我们因此能够把三者的信息整合起来，从整体水平上监测移植肾的免疫状态。
3　影像学技术
　　影像学技术是急性排斥反应无创性诊断的重要方法。过去传统的影像学技术在急性排斥反应监测和诊断方面特异性和敏感性均较差，因而一直不被重视。近年来随着超声造影和功能磁共振技术的发展，通过影像学技术监测和诊断急性排斥反应越来越受到关注。彩色多普勒超声可快速获得移植肾的断面影像和生理功能信息，在肾移植术后并发症的诊断与鉴别诊断中具有一定的应用价值，已成为肾移植术后常规的检查方法。但常规彩色多普勒超声检查对低速血流不敏感，探测角度依赖性大，血流图与脏器真实的血液灌注情况差距较大。而利用超声造影剂SonoVue进行超声成像可以显示人体器官微循环的血流灌注情况，可以清晰显示移植肾实质的微循环灌注情况。当移植肾发生急性排斥反应时，SonoVue超声造影能敏感地显示移植肾皮质血流灌注的延迟，并提示急性排斥反应、急性肾小管坏死具有不同的灌注分数。与传统的超声技术相比，该方法可以更敏感地反映早期移植肾功能变化，在急性排斥反应的诊断中可能具有很好的应用前景，值得进一步在临床中研究。
　　常规MRI移植肾急性排斥反应表现为移植肾肿大、皮髓质分界模糊，但类似影像也可出现在急性肾小管坏死的MRI上，因此常规MRI不能可靠地鉴别急性排斥反应。有研究利用功能MRI监测急性排斥反应时移植肾的功能改变，磁共振灌注加权成像(PWI MRI)可以有效地评价肾脏的形态与血流灌注，提示PWI MRI对于肾移植术后血管并发症具有一定的诊断价值。最近，血氧水平依赖的磁共振成像(BOLD MRI)利用去氧血红蛋白属于顺磁性物质的性质，发现发生急性排斥反应的移植肾具有特征性的BOLD MRI改变，并且与病理类型具有一定的相关性，我们在研究中也发现BOLD MRI在移植肾急性排斥反应与急性肾小管坏死的鉴别诊断上具有较好的临床价值。但迄今为止，上述新型磁共振技术的研究多为单中心小样本研究，还缺乏可靠的临床依据。
　　螺旋CT在器官成像上具有其独特的准确度，在涉及移植肾形态改变的病变探查方面有较大的临床意义。移植肾发生急性排斥反应时，在增强CT下移植肾的强化较正常减弱，但不具有特异性，并且造影剂的肾毒性也限制了其在肾移植受者中的广泛应用。
4　结　　语
　　无创性监测和诊断技术是今后的发展方向，新的血、尿标记物，系统生物学(转录组学、蛋白组学、代谢组学)和影像学技术在移植肾急性排斥反应的无创诊断与监测中有很广的临床应用前景，有人预测这些方法将会逐渐取代肾活检，但无创性技术在许多方面尚待完善。目前血、尿标记物的研究结果主要来自于小样本回顾性研究，需有大样本前瞻性临床研究来验证，同时需进一步研究新的更敏感和特异的标记物；系统生物学和新型影像学研究尚处于起步阶段，真正应用于临床还有很长的路要走。
【作者单位】310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院肾脏病中心
【来源】《中华移植杂志(电子版)》2009年5月第3卷第2期
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