甘草紫杉烯5α-羟化酶cDNA的生物信息学分析_图文_百度文库
甘草紫杉烯5α-羟化酶cDNA的生物信息学分析
ｗｗｗ．ｇｄｃｈｅｍ．ｃｏｒｎ
２０１４年第９期第４ｌ卷总第２７５期
甘草紫杉烯５仅．羟化酶ｃＤＮＡ的生物信息学分析
桑雪雨１，渠萌１，张春荣１，唐晓敏１，程轩轩１，梁晓薇１，杨全１，２，３＋
（１．广东药学院中药学院，广东广州５１０００６；２．中国中医科学院中药资源中心，北京１００７００；
３．道地药材国家重点实验室，北京１００７００）
［摘要］【目的】分析甘‘草紫杉烯５ａ－羟化酶（ＧｕＴ５Ｈ）ｃＤＮＡ序列及其编码的蛋白质的结构特征。［方法］以甘草ＧｕＴ５Ｈ全长ｃＤＮＡ为研究对象，
运用‘扛物信息学软件和网络工具预测其编码的蛋白质序列，并分析该蛋白质的结构、功能及分子进化特征。［结果］甘草ＧｕＴ５ＨｃＤＮＡ全长１６９２ｂｐ，含有１４２８ｂｐ的开放阅读框，编码４７５个氢基酸残基的蛋白质；该蛋白质与细胞色素Ｐ４５０家族紫杉烯５Ⅱ．羟化酶（Ｔ５Ｈ）成员具有高度的序列一致性，分于进化ｆ二与川科植物大豆、卣蓿、鹰嘴豆的Ｔ５Ｈ关系最为密切。［结论】甘草ＧｕＴ５ＨｃＤＮＡ编码紫杉烯５仅．羟化酶，属于细胞色素Ｐ４５０家族成员。
『关键词］ｔｊ草：紫杉烯５ｄ．羟化酶：生物信息学；细胞色素Ｐ４５０［中图分类号］ＴＱ
【文献标识码】Ａ
［文章编号］１００７—１８６５（２０１４）０９．００２８—０２
ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＡｎａｌｙｓｉｓｏｆ
Ｔａｘａｄｉｅｎｅ５ａ—ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｃＤＮＡｉｎＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ
ｕｒａｌｅｎｓｉｓ
ＳａｎｇＸｕｅｙｕｌ，ＱｕＭｅｎ９１，ＺｈａｎｇＣｈｕｎｒｏｎ９１，ＴａｎｇＸｉａｏｍｉｎｌ，ＣｈｅｎｇＸｕａｎｘｕａｎｌ，ＬｉａｎｇＸｉａｏｗｅｉｌ，ＹａｎｇＱｕａｎｌ，２＇３＋
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０００６：２．ＮａｔｉｏｎａｌＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｒｅｆｏｒＣｈｉｎｅｓｅ
ＭａｔｅｒｉａｌＭｅｄｉｃａｌ，ＣＡＣＭＳ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００７００；３．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆｇｅｎｕｉｎｅｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００７００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｅｔ：『０ｂｊｅｃｔｉｖｅｌＴｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅ
Ｇｌｖｃｙｒｒｈｉｚａ
ｗｅｒｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｔａｘａｄｉｅｎｅ５ａ．ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ
ｅＤＮＡ（ＧｕＴ５功ａｎｄ
ｔｈｅｄｅｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｕｒａｌｅｎｓｉｓ．ｘＭｅｔｈｏｄｓ、ＴｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｄｃＤＮＡ
ａｎｄｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ｆｕｎｃｔｉｏｎ．ｐｈｙｌｏｇｅｎｙｏｆｔｈｅｄｅｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｏｆＧＵＴ５Ｈ
ａｎａｌｙｓｉｓ．ｆＲｅｓｕｌｔｓｌ
ｏｆ４７５ａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓ．ＴｈｅＧ“Ｔ５Ｈｐｒｏｔｅｉｎｈａｓ
ＴｈｅｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｏｆＧｕ巧日ｗａｓ
１６９２ｂｐｗｉｔｈｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｏｆ１４２８ｂｐ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ
ｈｉｇｈｓｅｑｕｅｎｃｅｉｄｅｎｔｉｔｙｗｉｔｈｏｔｈｅｒｔａｘａｄｉｅｎｅ５ａ—ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓ（Ｔ５Ｈ、ｗｈｉｃｈｂｅｌｏｎｇｔｈｅｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ
ｆａｍｉｌｙ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ，ＧｕＴ５ＨｗａｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈＴ５ＨｓｉｎＧ咖ｃｉｎｅｍａｘ，Ｍｅｄｉｃａｇｏｔｒｕｎｃａｔｕｌａ，ＣｉｃｅｒａｒｉｅｔｉｎｕｍａｎｄｏｔｈｅｒＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅｐｌａｎｔｓ．
『ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎｌＧｕ巧ＨｃＤＮＡｅｎｃｏｄｅａｐｒｏｔｅｉｎｏｆｔａｘａｄｉｅｕｅ５ａ．ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，ｗｈｉｃｈｂｅｌｏｎｇｔｏｔｈｅｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０ｆａｍｉｌｙ．
ＫｅｙｗｏｒｄｓＧ，ｙｃｙｒｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓ：ｔａｘａｄｉｅｎｅ５ａ—ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ：ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０
甘草（ＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓＦｉｓｃｈ．）为豆科多年生草本植物，其
根和根茎入药，具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药之功效【ｌ】，为常用的大宗药材和日用甜味剂【２】。萜类化合物是甘草主要的药效成分之一［３】。我们通过甘草根转录组测序发现了一个紫杉烯５－ａ羟化酶（ｔａｘａｄｉｅｎｅ５ａ．ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，Ｔ５Ｈ）ｃＤＮＡ
序列，命名为Ｇ－ｕＴ５Ｈ。Ｔ５Ｈ催化ｔａｘａ－４（５），１１（１２）．ｄｉｅｎｅ形成
２结果与分析
ＧＨ乃日ｃＤＮＡ的开放阅读框及其编码蛋白质的理化性质
甘草ＧｕＴ５ＨｃＤＮＡ全长１６９２ｂｐ。采用ＮＣＢＩ的ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ程序，检测到一条１４２８ｂｐ的开放阅读框，编码４７５个氨基酸残
ｔａｘａ－４（２０），１１（１２）．ｄｉｅｎ．５ａ－ｏｌ，是萜类化合物生物合成途径的关键酶【４】。我们的前期研究发现，适度的干旱胁迫调控ＧｕＴ５Ｈ基因的表达，表明ＧｕＴ５Ｈ在干旱胁迫调控甘草萜类化合物的合成中起着重要作用。为了进一步分析ＧｕＴ５Ｈ的功能及其在甘草干旱适应中的作用机制，本文应用生物信息学方法对甘草ＧｕＴＳＨｃＤＮＡ及其编码产物的结构、功能和进化关系进行研究。
基的蛋白质（ＧｕＴＳＨ），ＰｒｏｔＰａｒａｍ分析ＧｕＴ５Ｈ的相对分子质量为５３．７８ｋＤａ，理论等电点为９．３３。
Ｇ”巧Ｈ的跨膜结构分析与亚细胞定位
采用ＴＭＨＭｌＶｌ预测ＧｕＴ５Ｈ的跨膜结构，发现其Ｎ．端第２～１９位氨基酸残基构成１个跨膜结构（图１）。用ＴａｒｇｅｔＰ分析ＧｕＴ５Ｈ的亚细胞定位，此蛋白质定位于线粒体的可能性最大，第１－－４８位氨基酸为线粒体引导肽序列。因此，切去引导肽的ＧｕＴ５Ｈ成熟蛋白
１材料与方法
１．１材料
ＧｕＴ５ＨｃＤＮＡ序列来源于我们的甘草转录组测序数据。利用该序列在ＧｅｎＢａｎｋ中进行ＢＬＡＳＴ分析，得到与其同源关系较高
的鹰嘴豆Ｃｉｃｅｒａｒｉｅｔｉｎｕｍ（ＣａＴ５Ｈ，ＸＭ００４４９１３１１）、大豆Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ（ＧｍＴ５Ｈ，ＮＭ００１２５５９０９）、蒺藜苜蓿Ｍｅｃｆｉｃａｇｏｔｒｕｎｃａｔｕｌｅ（ＭｔＴ５Ｈ，ＸＭ＿００３６１７４４２）、葡萄Ｈｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａ（ＶｖＴ５Ｈ，ＸＭ００２２７８５０５）、野草莓Ｆｒａｇａｒｉａｖｅｓｃａ（ＦｖＴ５Ｈ，ＸＭ００４２９９６６２）、蓖麻Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＲｃＴ５Ｈ，ＸＭ００２５２２９２３）、马铃薯Ｓｏ．ｈｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ＳｔＴ５Ｈ，ＸＭ＿００６３４６１６５）、黄瓜Ｃｕｃｕｍｉｓｓａｔｉｖｕｓ（ＣｕｓＴ５Ｈ，ＸＭ＿００４１４０７７６）、毛果杨Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ（ＰｔＴ５Ｈ，ＸＭ＿００２３１７０６３）、柑橘Ｃｉｔｒｕｓｓｉｎｅｎｓｉｓ（ＣｓＴ５Ｈ，ＸＭ＿００６４６７９５４）、
位于线粒体基质中。
ｌ∞２∞２５０３００
３５０４００４５０
Ｆｉｇ．１
ＧＩＴｍ蚺∞ｍ
ＧｕＴ５Ｈ的跨膜结构预测
百脉根（Ｌｏｔｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ（ＬｊＴ５Ｈ，ＢＴｌ４０６９６）等植物的Ｔ５Ｈ序列。
１．２方法
采用基于网络的生物信息学工具，如ＮＣＢＩＯＲＦＦｉｎｄｅｒ、ＰｒｏｔＰａｒａｍ、ＴＭＨＭ／Ｖｌ、ＴａｒｇｅｔＰ、ＳＯＰＭＡ、ＳＷＩＳＳ．ＭＯＤＥＬ等‘５】
ＴｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＧｕＴ５Ｈ
２．３ＧｕＴ５Ｈ的二级结构与３Ｄ结构
采用ＳＯＰＭＡ在线工具预测ＧｕＴ５Ｈ的二级结构，甘草ＧｕＴ５Ｈ
对ＧｕＴ５Ｈ的开放阅读框及其编码的蛋白质Ｇ“巧日的理化性质、跨膜结构域、亚细胞定位、二级结构及三级结构进行分析和预测。采用ＤＮＡＭＡＮ进行多序列比对。采用ＭＥＧＡ６．０对ＧｕＴ５Ｈ及其
它植物的Ｔ５Ｈｓ构建系统进化树。
较多的ａ．螺旋。应用ＳＷＩＳＳ．ＭＯＤＥＬ程序构建ＧｕＴ５Ｈ的３Ｄ结
蛋白结构中，睢螺旋占４８．００％，随机卷曲占３５．５８％，延伸链占１２．２１％，Ｄ．折叠占４．２１％（图２Ａ）。因此，甘草ＧｕＴ５Ｈ蛋白含有
构模型，采用的模板为集胞藻ｓｐ）Ｐ４５０．．素色胞细
ＣＹＰｌ２０ＡＩ（ＰＤＢ登录号：２ｖｅ３）［…，如图２Ｂ所示，ＧｕＴＳＨ的３Ｄ
［收稿日期］［基金项目］
２０１４．０４一０２
国家自然科学基金项目（８１１７３４８８），中医药行业科研专项（２０１２０７００２），中国中医科学院中药研究所自主选题项目（２０１１ＺＤＸＫ－０１），
中国中医科学院中药资源中心开放基金项Ｉｉｌ（ＫＦＫＴ２０１３００５），广东省中医药局科研项目“茉莉酸甲酯对干旱胁迫调控甘草次级代谢的作用机制研究”
［作者简介】桑雪雨（１９８８一），女，回族，硕士研究生，从事中药资源与质量研究。＊３０通讯作者：杨全，男，博士，教授，从事中药资源与开发研究。
贡献者：易昊懂
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浅论沙眼衣原体主要外膜蛋白生物信息学分析
来源：　 13:15:00　【】　
&&&&& 作者：朱珊丽，尤孙武，娄崇洁，龚红君，张丽芳【摘要】& 目的：分析和预测E血清型沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)的结构和功能。方法：采用计算机辅助生物软件和网络数据库，从SwissProt蛋白质数据库中检索MOMP氨基酸序列，用Expasy服务器分析预测MOMP蛋白理化性质、二级结构，同时用Pcons服务器分析模拟蛋白质空间结构。结果：分析显示，Ct MOMP蛋白为一跨膜16次的酸性蛋白质，其空间结构为β-桶状膜蛋白，推测其功能为孔蛋白。结论：通过对MOMP生物信息学分析获得该蛋白的特性，为进一步研究Ct的感染与发病机制、研制Ct亚单位疫苗以及研究MOMP新的功能域等提供理论依据。 【关键词】& 沙眼衣原体；主要外膜蛋白；生物信息学；结构预测&& Abstract:& Objective: To analyze and predict the structural characteristics of the major outer membrane protein (MOMP) of Chlamydia trachomatis (Ct) serovar E. Methods: From SwissProt database，amino acid sequences of MOMP were obtained. Physio-chemical properties，secondary structure and tertiary structure of MOMP were analyzed by the computational analysis and bioinformatics webs，Expasy and Pcons，respectively. Results: The results showed that Ct MOMP was an acidic protein which transmembrane 16 times， and the tertiary structure was β-barrel membrane protein. It probably acted as a porin. Conclusion: The characteristics of Ct MOMP can be obtained by online structure predication software and computational analysis， which provides scientific proof for the research on its pathogenesis and new subunit vaccines.&& Key words:&& Chlamydia trachomatis；MOMP；bioinformatics；structure prediction&& 沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）具独特的发育周期，有原体（Elementary Body）和网状包涵体（Reticulate Body）两种形式。其独特的生命周期是原体感染细胞发育为网状包涵体，包涵体再分裂为原体释放，进而再次感染细胞的循环过程[1]。Ct是一种在人体内长期生存并又广泛传播的病原体，是我国性传播疾病（sexually transmitted diseases，STDs）的主要病原之一，它在一定条件下能引起异位妊娠、早产、流产及尿道感染等多种疾病。研究发现，Ct感染尚与许多自身免疫疾病发病有关，如衣原体感染后可引起反应性关节炎、Reiter综合征等。目前，尚无Ct感染的特异性预防方法，由于其主要外膜蛋白(major outer membrane protein，MOMP)可在机体内诱导出较强的细胞免疫及产生中和抗体的体液免疫，已成为Ct疫苗的研究热点[3-4]，但Ct MOMP的蛋白特性及其主要功能至今尚不清楚。本研究以E血清型Ct MOMP氨基酸序列为基础，对MOMP蛋白进行了生物信息学分析，为进一步研究Ct的感染与发病机制以及Ct亚单位疫苗的研制等提供理论依据。&& 1& 材料和方法&& 1.1& 材料& 国际互联网的生物信息学资源：SwissProt蛋白质数据库、Expasy服务器、PDB数据库、Pcons服务器、Spdbv及Rasmol软件。E血清型Ct MOMP在NCBI的登记号为DQ064286。&& 1.2& 方法& E血清型Ct MOMP氨基酸序列检索自瑞士生物信息研究所提供的SwissProt蛋白质数据库，使用Expasy中的GOR和ProtParam模块分析后，将Ct MOMP氨基酸序列提交到Pcons服务器，得到初步的三级结构分析结果。返回的结果优化后用Spdbv及Rasmol软件进行分析。&&& 2& 结果&& 2.1& Ct MOMP的理化性质& ProtParam 分析显示该蛋白质相对分子质量为42.4 kDa，理论等电点（pI）为5.07，具体氨基酸组成见图1，推测分子式为C8O583S21；不稳定系数(instability index，II)为25.82，表明此蛋白性质稳定；其疏水性平均值（Grand average of hydropathicity，GRAVY）为-0.088，表明其为亲水性蛋白。&& 2.2& Ct MOMP二级结构分析& 应用Expasy服务器上的GOR预测MOMP的二级结构，提示其二级结构由29.77%α-螺旋（Alpha helix，Hh）、18.22%β-片层（Extended strand，Ee）、51.91%无规卷曲（Random coil，Cc)构成，见图1。二维结构显示MOMP蛋白有16个β-片层组成的跨膜区，见图2。&& 2.3& Ct MOMP三级结构模拟& 将其氨基酸序列导入Pcons服务器，返回的结果按照分值排序，选择Pcons和ProQ分值较高的返回数据，将其导入Spdbv及Rasmol软件中，分析推测其三级结构。结果显示Ct MOMP与脑膜炎奈瑟菌自转运蛋白结构域的结构非常相似，两者都是主要由β折叠片层蛋白组成的桶状结构。Ct MOMP有2个螺旋，16个折叠，23个转角和190个氢键；而来自于PDB数据库（PDB ID:1UYN）的脑膜炎奈瑟菌自转运蛋白的结构域，有1个螺旋，12个折叠，33个氢键，没有转角，见图3。1&&&
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《基因组学与应用生物学杂志》2015年第四期1结果与分析1.1小桐子JcMSRA基因全长cDNA的克隆以小桐子叶片材料提取总RNA，并反转录cDNA为模板，扩增JcMSRA基因cDNA全长序列。结果表明，扩增得到的产物约0.9kb(图1A)。将目的条带切胶回收后与T/A克隆载体pEASY-T1连接，转化大肠杆菌，菌落PCR验证阳性克隆(图1B)。挑取阳性克隆过夜摇菌，提取重组质粒pEASY-T1-JcMSRA(图1C)，并以M13通用引物进行测序。1.2小桐子JcMSRA基因的生物信息学分析经测序分析，本研究克隆的小桐子JcMSRA基因的cDNA序列全长879bp，包含一个完整的开放阅读框(780bp)，编码259个氨基酸(图2)。通过将JcMSRA编码框与其基因组序列(Jcr4S~16350位,1702bp)比对，发现JcMSRA基因包含2个外显子(长度分别为528bp与252bp)与1个内含子，且内含子的序列(924bp)较2个外显子都长，符合AT/GT的剪切规则。ProtParam分析结果显示，JcMSRA编码的蛋白质分子量为29.1kD，理论等电点为8.75，且单体亚基不稳定，说明其属于多聚体蛋白质。另外，该蛋白质N端不含信号肽，预测其亚细胞定位可能性最大的为线粒体、其次为细胞核。ExPASy的COILS预测发现，该蛋白质在190~220位有一个明显的卷曲螺旋区域(图3A)。作为一种超二级结构，卷曲螺旋一般由2~7个短的琢-螺旋组成，是许多转录因子与功能蛋白质的结构元件，该卷曲螺旋出现的位置正好是其二级结构中琢-螺旋最长的部位，与SOPM服务器预测的结构吻合(图3B)。分别以大肠杆菌(Escherichiacoli)、酿酒酵母(Sa-ccharomycescerevisiae)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、蒺藜苜蓿(Medicatruncatula)、毛果杨(Populustrichocarpa)、家鼠(Musmusculus)、人(Homosapiens)与小桐子MSRA氨基酸序列进行多重序列比对(图4)，发现MSRA氨基酸序列在N端与C端都没有同源性，差异变化较大，而在中部相对保守。MSRA属于单结构域蛋白，位于该酶蛋白活性中心的核心氨基酸残基为Phe102、Trp103、Tyr132、Glu144、Tyr184(图4,菱形标注)，而-GCF-W-保守序列的Cys与C端的两个保守Cys残基主要起维持酶活性中心结构的功能。将小桐子MSRA氨基酸序列进一步与MSR家族的三类不同(MSRA,MSRB,fRMSR)的MSR氨基酸序列进行多重序列比对，并构建系统进化树(图5)。由图中可以看出，不同的MSR被聚类为明显的三条分支，印证了MSR三个家族在氨基酸一级序列及高级结构等方面的进化差异性。我们得到的小桐子MSR被归入了MSRA分支中，与小桐子的近科物种毛果杨(Populustrichocarpa)在进化上距离较远，序列相似性仅为22.19%，而与芸豆(Phaseolusvulgaris)、棉花(ssypiumbarbadense)、油菜(Brassicanapus)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)的亲缘关系较近，序列相似性分别为70.30%、68.82%、61.65%、60%。目前，通过X-晶体射线衍射法已经获得了几种(如大肠杆菌,毛果杨,牛)MSRA的高分辨率三维结构。我们通过同源建模方法构建了小桐子MSRA的三维空间结构并进行了氨基酸残基能量评估(图6)。综合研究MSRA的晶体结构显示，其表面都有一个口袋状结构，且该结构周围的氨基酸残基相对保守，后被证实是底物甲硫氨酸亚砜的结合位点。小桐子MSRA蛋白的底物结合位点氨基酸构成为Tyr132、Glu144、Tyr184，另外，-GCFW-保守序列中的最后两位氨基酸Phe102、Trp103也参与了催化中心的形成(图6A)，而-GCFW-保守序列结构域中的Cys101以及C端的保守Cys251、Cys257在维持结合位点空间结构方面也是不可或缺的。Ramachandram能量图分析显示有96.9%的氨基酸残基处于能量稳定区域，说明预测的三维结构可信(图6B)。小桐子MSRA空间结构核心区域是3段琢-螺旋包裹的6条茁-折叠片层结构，呈现琢/茁卷状，二级结构组成顺序以茁1-琢1-茁2-茁3-琢2-茁4-琢3-茁5-茁6排列，并且茁1与茁6较短，而核心4条茁-折叠较长，在拓扑结构上排列为反平行方式。另外，在茁2与茁3之间有1段极短的琢-螺旋，在琢2与茁4之间存在2条反平行的极短茁-折叠与1段极短琢-螺旋，而在靠近N末端还存在1段极短琢-螺旋，C端存在2段极短琢-螺旋。蛋白质核心区域被两端柔性区包裹，包括N端的92个氨基酸残基(Met1-Glu92)与C端的33个氨基酸残基(Ala227-Gly259)。2讨论甲硫氨酸亚砜还原酶作为生物体内的抗氧化修复因子属于多基因家族，目前已经报道的甲硫氨酸亚砜还原酶有三个亚家族，不同家族虽然催化相似的反应，但没有一级氨基酸序列及三维结构相似性(Rouhieretal.,2006)。最早被报道的两个亚家族是MSRA与MSRB，MSRA与MSRB能够分别特异性地还原Met-S-SO与Met-R-SO，且两者既可以催化游离的甲硫氨酸亚砜，也可以催化蛋白表面的甲硫氨酸亚砜。第三个MSR家族最早在大肠杆菌中发现，命名为fRMSR(freemethionine-R-sulfoxidereductase)，而该酶只能催化游离的甲硫氨酸亚砜。MSRA最早从大肠杆菌中分离出来的，是一类相对较小的胞质酶，编码该酶蛋白的基因广泛存在于生物界，如梭状芽孢菌(Clostridiumsp.Ohilas)、金属还原菌(Shewanellaoneidensis)、嗜热古生菌(T.kod-akaraensis)、酵母菌、拟南芥、杨树、果蝇、小鼠、大鼠及人。该亚家族不同种属间同源性不高，但其催化部位的氨基酸序列是非常保守的。在N端存在一个保守序列-GCFWG-(尤其是中心的Cys)，这一序列的突变将导致MSRA完全失活；另外，在C端存在两个保守的还原型Cys残基，以上三个保守的Cys在空间结构上共同参与MSRA催化中心的构成(Rouhieretal.,2007)。MSRB最初也是从大肠杆菌中发现的，且在黄单孢菌(Xanthomonascampestris)、梭状芽孢菌(Clostriidiumsp.Ohila)、拟南芥、烟草、果蝇及人等生物体中都存在，属多基因亚家族，在不同生物体(如人,小鼠等)中一般都有3个MSRB，主要定位于内质网与线粒体，其N端定位信号肽在不同的MSRB中较为保守。MSRB在其N端同样存在-GCGWP-保守序列，除此之外，大部分MSRB在其C端仅存在一个保守的Cys残基(Dingetal.,2007)。与MSRA不同，MSRB中还包含两个-CXXC-保守序列，用于结合Zn2+或Fe2+，共同构成MSRB的活性中心(Olryetal.,2005)。目前关于MSRA与MSRB的表达、调控及作用机理的研究主要集中在微生物及动物中，如大肠杆菌、酵母菌、小鼠及人等，而对于植物MSR的研究报道近几年才逐渐增多，本研究中克隆的小桐子MSRA基因也是首次报道。研究发现，拟南芥中至少存在5个编码不同形式的MSRA基因AtMSRA1-At-MSRA5，同时存在至少9个MSRB基因AtMSRB1-AtMSRB9；另外，在毛白杨中发现9个MSR基因，包括5个MSRA与4个MSRB；在水稻中发现4个MSRA与3个MSRB基因。利用在线软件预测发现，不同的MSR在植物细胞中有不同的定位，目前发现的包括细胞质、叶绿体、线粒体、内质网及分泌型MSR等(Rouhieretal.,2007)。芯片数据与转录组数据都表明不同亚细胞定位的MSR有着不同的组织表达模式，胞质型MSR通常在所有组织器官中都有表达，叶绿体型MSR主要在绿色组织尤其是叶中表达。Romero等(2004)通过RT-PCR分析了拟南芥不同MSR类型的组织表达特异性，结果表明，AtMRA4在除根以外的所有组织中的表达量都很丰富，其总表达量在所有MSRA中也是最高的；AtMSRA2和AtMSRA3表达量仅次于AtMSRA4，且主要在根和茎中表达；而AtMSRA1和AtMSRA5在所有组织中的表达量都很少；AtMSRB2、AtMSRB6的表达量在叶和其它绿色部位中最高，而AtMSRB5、AtMSRB7、AtMS-RB8、AtMSRB9则主要在根中高表达。大量数据表明，各种生物与非生物胁迫可以诱导高等植物不同MSR基因的表达，强光与盐胁迫可以强烈诱导拟南芥质体型AtMSRA4的表达(Gustavssonetal.,2002)。定位在内质网中的AtMSRB3可清除在植物受冷胁迫时内质网中积累的MetSO和ROS，过表达AtMSR-B3可以提高拟南芥植株的耐寒性(Kwonetal.,2007)。而水稻OsMSRB1.1在受到包括盐、甘露醇、低温、甲基紫精和ABA在内的非生物胁迫时表达量上升，而高温处理则会使OsMSRB1.1表达量下降(Guoetal.,2009)。以上事实说明MSR基因表达种类的多样性与组织特异性、表达调控的复杂性以及与植物应答逆境胁迫的关联性，同时也暗示其在植物抗逆性研究中的应用前景。3材料与方法3.1实验材料及处理供试小桐子种子采自云南省楚雄州元谋县。选取饱满的小桐子种子，用1.5%CuSO4消毒20min，无菌水漂洗5次，于26℃的恒温培养箱中吸涨24h(李忠光和龚明,2010)。将吸涨的种子在无菌水中漂洗3次，播于垫有5层用无菌水湿润滤纸的白磁盘(24cm伊16cm)中，于相对湿度75%、昼夜温度26/20℃、光周期16/8h的恒温培养箱中萌发5d。之后将发芽的种子播于消毒的培养土中并于同样恒温培养箱中培养15d至第二片真叶展开。取第二片真叶材料，液氮速冻后置于-80℃冰箱中用于RNA的提取。3.2菌株与主要试剂大肠杆菌Trans1-T1(DH5琢)菌株由本实验室保存；TransZolUp、DNase玉、TransStartTaqDNAPoly-merase、Amp、X-gal、IPTG、2伊EasyTaqPCRSuperMix(+dye)、TransScriptTwo-StepRT-PCRSuperMix、EasyPureQuickGelExtractionKit、EasyPurePlasmidMin-iPrepKit、pEASY-T1CloningKit、Trans2KPlus域DNAMarker购自全式金生物技术有限公司；引物合成和测序由深圳华大基因有限公司完成。3.3实验方法3.3.1总RNA的提取及cDNA第一链的合成取0.2g小桐子叶片材料，按照王海波等(2014)的方法利用TransZolUp试剂提取并纯化总RNA。以AnchedOli(dT)18为逆转录引物，利用TransScriptTwo-StepRT-PCRSuperMix合成第一链cDNA。3.3.2小桐子JcMSRA基因全长cDNA的克隆以拟南芥MSRA全长mRNA序列(XM_.1)为种子序列，对我们高通量测序得到的小桐子低温锻炼转录组(GenBank登录号:GAHK)的45251条Unigenes进行本地Blast，得到小桐子MSRA基因的序列Unigene850_JC-CK_1A(GAHK0-4bp)。序列分析表明其包含全长F(780bp)。以此序列为基础设计全长cDNA克隆引物，并送深圳华大基因合成。引物序列为：上游F(5''''-ACACAACTTAACTCAACACGTCA-3'''')；下游R(5''''-AACCCAGCAAACTGTATAAAAAC-3'''')。以3.3.1中反转录cDNA模板，使用TransStartTaqDNAPolymerase进行PCR扩增，扩增条件为：94℃5min寅[94℃30s,54.9℃30s,72℃1min]35寅72℃20min。扩增完成后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，利用EasyPureQuickGelExtractionKit从琼脂糖凝胶中回收目的基因片段(879bp)，并与克隆载体pEASY-T1连接，转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，涂LB抗性平板(LB-Amp垣IPTG垣X-gal)，过夜生长，挑取白斑菌落进行菌落PCR鉴定。阳性克隆取名为pEASY-T1-JcMSRA，并送深圳华大公司利用pEASY-T1质粒上的M13F与M13R通用引物进行双向测序。3.3.3小桐子JcMSRA基因的生物信息学分析利用Spidey软件进行克隆cDNA序列与基因组序列比对以确定JcMSRA基因内含子与外显子的结构。利用BioEdit软件将JcMSRAcDNA序列翻译成氨基酸序列，利用在线工具ProtParam计算蛋白质的理论分子量、等电点等基本参数。利用WolfSpt在线软件对蛋白质进行亚细胞定位预测，并利用SignalP3.0Server分析蛋白质信号肽序列，接着利用在线工具TMHMM与Proscale检测其跨膜结构与亲水/疏水特性。分别利用SOPM与ExPASy的COILS软件分析其二级结构与卷曲螺旋结构。利用NCBICDD工具进行结构域与功能元件的鉴定。从Gen-Bank下载其它物种MSR氨基酸序列，利用ClustalX进行序列相似性比对，然后用MEGA4.0软件通过邻接法构建系统进化树，并采用泊松法进行检验。利用Phyre2进行蛋白质三维结构的同源建模，利用VMD软件显示其三维空间结构，并结合Ramachandram图验证模型的准确性。作者：王海波邹竹荣龚明单位：云南师范大学生命科学学院,生物能源持续开发利用教育部工程研究中心云南省生物质能与环境生物技术重点实验室曲靖师范学院生物资源与环境科学学院基因组学与应用生物学杂志责任编辑：杨雪&&&&阅读：人次
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