副猪嗜血杆菌Nest-PCR及TaqMan-MGB实时荧光定量PCR方法的建立与应用--《河南科技大学》2012年硕士论文
副猪嗜血杆菌Nest-PCR及TaqMan-MGB实时荧光定量PCR方法的建立与应用
【摘要】：副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属成员，主要引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等临床症状。给养猪业造成了严重的经济损失。本研究成功建立了基于副猪嗜血杆菌16S rRNAPCR和荧光定量PCR检测方法，并且在对临床上进行初步应用。
根据HPS的16S rRNA保守区基因序列，设计2对特异性引物，以HPSDNA为模板，建立了HPS Nest-PCR检测方法通过对引物浓度、dNTPs以及退火温度等反应条件的优化，同时对Nest-PCR检测方法进行了特异性、重复性和敏感性试验。对疑似感染副猪嗜血杆菌的临床样品进行了应用检测，并对检测到的阳性样品进行了测序。根据GenBank已登录的中的HPS16S rRNA保守部分基因序列设计合成特异性引物和MGB荧光探针，以定量10倍系列稀释的重组质粒为标准品，进行FQ-PCR扩增并绘制了标准曲线，经过对引物浓度、探针浓度以及退火温度等进行优化，建立了HPS的MGB探针实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测方法。对所建立的FQ-PCR检测方法进行了特异性、敏感性和重复性试验，并对疑似副猪嗜血杆菌病临床样品进行了应用检测，同时与普通PCR方法进行了对比实验。
结果：成功建立了HPS Nest-PCR诊断方法，通过对副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型、猪圆环病毒、猪传染性胸膜肺炎放线菌等病原体检测，仅副猪嗜血杆菌5型在305bp左右扩增出条带，而其它未出现条带，对副猪嗜血杆菌15个血清型检测均为阳性，表明该方法对HPS具有良好的特异性，不与其它病原发生交叉反应；Nest-PCR比常规PCR灵敏度高10倍，具有较好的稳定性和重复性；临床应用表明本方法的建立实现了对HPS的快速诊断。所建立的FQ-PCR检测方法标准曲线的循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系，相关系数为0.997；建立的HPS FQ-PCR检测方法灵敏度可达1.98×10~1拷贝/μL，比普通PCR灵敏度高；重复性好，对不同浓度的重组质粒进行4次扩增，批内与批间重复试验变异系数均小于2.5%。表明该方法具有良好的重复性。该方法对副猪嗜血杆菌进行扩增，呈阳性反应，而其他6个病原体扩增均为阴性反应，对副猪嗜血杆菌15个血清型扩增均为阳性反应，证明该方法特异性强。对15份临床疑似副猪嗜血杆菌感染猪组织病料进行了应用检测，结果11份为阳性，与Nest-PCR诊断方法的阳性符合率为100%。
【关键词】：
【学位授予单位】：河南科技大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：S855.12【目录】：
摘要2-4ABSTRACT4-10第1章 文献综述10-22 1.1 副猪嗜血杆菌生物学特征10-11 1.2 流行病学及分型11-13
1.2.1 血清型分型12-13
1.2.2 限制性酶切图谱分型13
1.2.3 基因型分型13 1.3 临床症状与病理变化13-14
1.3.1 HPS 临床症状13-14
1.3.2 病理变化14 1.4 发病机理与毒力因子14-16 1.5 诊断方法16-19
1.5.1 微生物学诊断16-17
1.5.2 血清学诊断17-18
1.5.3 分子生物学诊断18-19 1.6 防控措施19-21
1.6.1 加强饲养管理，减少各种应激因素20
1.6.2 药物预防20
1.6.3 免疫预防20-21 1.7 研究意义21-22第2章 副猪嗜血杆菌 Nest-PCR 检测方法的建立与应用22-33 2.1 实验材料22-23
2.1.1 毒株与菌种22
2.1.2 主要实验试剂22
2.1.3 主要溶液配制22-23
2.1.4 主要实验仪器23 2.2 实验方法23-27
2.2.1 引物设计和合成23
2.2.2 副猪嗜血杆菌 DNA 的提取23-24
2.2.3 PCR 扩增与鉴定24
2.2.4 DNA 快速回收试剂盒回收 DNA 产物24-25
2.2.5 PCR 产物与 pGEM-T Easy Vector 的连接及鉴定25-26
2.2.6 对 dNTPs 的优化26
2.2.7 对引物浓度的优化26
2.2.8 对退火温度的优化26-27
2.2.9 特异性试验27
2.2.10 敏感性试验27
2.2.11 稳定性和重复性试验27
2.2.12 应用试验27
2.2.13 应用范围试验27 2.3 实验结果27-31
2.3.1 Nest-PCR 检测方法的建立27-28
2.3.2 特异性试验28-29
2.3.3 敏感性试验29-30
2.3.4 稳定性和重复性试验30
2.3.5 应用试验30
2.3.6 应用范围试验30-31 2.4 分析与讨论31-33
2.4.1 建立 HPS Neat-PCR 诊断方法的意义31-32
2.4.2 Nest-PCR 方法的特点32-33第3章 副猪嗜血杆菌 TaqMan-MGB 实时荧光定量 PCR 检测方法的建立与应用33-43 3.1 实验材料33-34
3.1.1 毒株与菌株33
3.1.2 主要实验试剂33
3.1.3 常用实验溶液及培养基的配制33-34
3.1.4 主要实验仪器34 3.2 实验方法34-36
3.2.1 引物和探针的设计与合成34
3.2.2 重组质粒的提取与鉴定34
3.2.3 标准品制备34-35
3.2.4 对探针浓度的优化35
3.2.5 对引物浓度的优化35
3.2.6 对退火温度的优化35
3.2.7 FQ-PCR 扩增反应35-36
3.2.8 敏感性试验与标准曲线的绘制36
3.2.9 特异性试验36
3.2.10 重复和性准确性试验36
3.2.11 临床应用性试验36 3.3 实验结果36-41
3.3.1 质粒 DNA 浓度的测定36-37
3.3.2 副猪嗜血杆菌 FQ-PCR 方法的建立37-38
3.3.3 FQ-PCR 的敏感性结果38
3.3.4 FQ-PCR 的特异性结果38-39
3.3.5 FQ-PCR 的稳定性和重复性39-40
3.3.6 FQ-PCR 临床样品检测40-41 3.4 分析与讨论41-43第4章 结论43-44参考文献44-50缩略语词汇表50-51致谢51-52攻读硕士学位期间的研究成果52
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