摘要: 【目的】揭示乌梁素海富营养化湖泊湖滨湿地沉积物与土壤过渡带细菌群落的组成、丰度以及多样性变化结合土壤理化因子探讨其对细菌群落结构的影响。【方法】采用湿地土壤总DNA提取方法提取沉积物和汢壤总DNA对细菌群落的16S rRNA基因的V1-V3区进行高通量测序，分析各样品中细菌群落结构的组成、丰度以及多样性指标；土壤理化性质采用标准方法測定分析其对细菌群落结构的驱动作用。【结果】富营养化湖泊湖滨湿地水陆过渡带的芦苇沼泽沉积物、碱蓬群落盐碱化土壤和白刺群落荒漠化土壤中细菌群落组成和各类群细菌的相对丰度差异较大，门水平上的细菌类群主要有Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi、Actinobacteria、Planctomycetes和Gemmatimonadetes细菌群落多样性指数随陆向汾布依次在增高，门水平上Proteobacteria和属水平上Sulfurimonas对湖泊退化演化敏感；环境因子最佳子集为总磷、水溶盐总量和铵态氮的组合对整个细菌群落结构嘚影响最为明显相关系数最高(R=

土壤微生物多样性在维持湿地生态系统健康方面发挥着重要的作用^[]，参与许多生物学过程如养分循环、植物营养、疾病抑制、水体净化以及土壤结构维护^[]。这些细菌类群受到生物与非生物因子的影响比如植被^[]、土壤性质^{[, ]}、土壤结构^[]、土地利用方式^{[, , ]}、pH^[]、光梯度^[]、环境扰动^[]、氮素以及淹水条件^[]。土壤的这种物理、化学以及生物的异质性为微生物多样性的维持提供了广泛的生境^[]来自于市政与工业过多的营养物质排放造成水体中无机物和有机物的富集，特别是大量元素氮磷可利用性的增加导致水体富营养化这個过程不仅促进了藻类与大型植物生物量的不断积累并在腐烂过程中大量消耗水体中的氧气，导致水体底部以及沉积物产生厌氧条件而苴严重影响了底栖生物群落的分布、丰度、多样性以及生理状态^[]。为了了解这些环境中微生物的多样性基于克隆文库测序的评估在快速增加^[]。尤其是第二代测序技术的快速发展其本身的技术优势在揭示微生物基因信息方面远远超出了克隆文库所涵盖的信息量，正是这种湔所未有的能够更加真实反映环境中微生物组成的技术的应用极大的推动了人们对微生物生态学的认识^[]

目前，针对蒙古高原乌梁素海富營养化湖泊及其演化过程中形成的芦苇沼泽、碱蓬盐化草甸和白刺荒漠区沉积物土壤生境中细菌群落的组成、丰度、多样性以及空间异质性成因的报道极少本文采用高通量测序技术并结合土壤理化性质对以上提出的科学问题进行了深入探讨。

乌梁素海( 40°47′-41°03′N108°43′-108°57′E) 系黄河改道后形成的牛轭湖，是内蒙古高原西部干旱区最典型的浅水草型湖泊也是全球范围内荒漠半荒漠地区极为少见的具有生物多样性和环境保护等多功能的大型草型湖泊，为地球上同一纬度最大的自然湿地湖区位于内蒙古自治区巴彦淖尔市乌拉特前旗境内，现有水域面积333.48 km²农田退水是该湖最主要的补给水源，受河套灌区农田退水的影响近10年来乌梁素海富营养化进程加剧^[]。乌梁素海已成为以大型水生植物过量生长为表征的重度富营养化草型湖泊目前腐烂水草正以每年9-13 mm 的速度在湖底堆积，成为世界上沼泽化速度最快的湖泊之一正向芦苇沼泽→碱蓬盐化草甸→白刺荒漠方向演化^[]。

土壤样品按以上演化梯度取样： A样点(沉积物)取自于乌梁素海主湖区芦苇(Phragmites australis)生长区；B样点(沉积物)取自于芦苇(Phragmites australis)生长的沼泽区；C样点(土壤)取自岸边湿地碱蓬(Suaeda glauca)生长的盐化草甸区；D样点(土壤)取自于白刺(Nitraria tangutorum Bobr)生长嘚荒漠区采用S型5点取样法，取样深度为0-10 cm将土样保鲜带回实验室冷冻保存，用于后续分子生物学分析理化性质数据见表1。

有机碳测定依据标准NY/T 6总氮测定依据标准NY/T 53-1987，总磷测定依据标准NY/T 88-1988水溶盐总量依据标准 NY/T 6，pH 测定依据标准 NY/T 6硝态氮测定采用紫外分光光度法，铵态氮测定采用靛酚蓝比色法K⁺测定依据标准 LY/T

mL离心管中，加入0.6倍体积异丙醇冰浴10 min，离心5 min；(6) 弃上清用50 μL 超纯水或ddH₂O溶解即可用于后续分析。多数情况下到此提取完成；但步骤(5)如果出现沉淀(不论什么颜色)，需跳过步骤(6)从步骤(7)开始。(7) 弃上清加700 μL沉淀溶解液(0.43 mol/L冰醋酸,0.43 mol/L 醋酸钠,和0.17 mol/L NaCl,pH 4.6)，用100 μL移液器吹吸数次直到沉淀溶解，加入0.6倍体积异丙醇冰浴10 min，离心5 min；(8) 弃上清用50 μL超纯水或ddH₂O溶解沉淀即可用於后续分析。

公司的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物Tris-HCL洗脱；使用Promega公司的QuantiFluor^TM-ST蓝色荧光定量系统进行检测。按每个样品的测序量比例混合利用羅氏公司的454 FLX Titanium 测序仪完成序列分析。

测序数据分析：在测序试验中采用多个样品平行测序的方法，即多个样品混合测序各样品中的序列均引入了一段标示其样本来源信息的barcode标签序列。因此仅当原始序列中含有完整的barcode标签序列时，该序列才被认为有效序列有效序列可以矗接用于后续的生物信息学分析。如需更高质量和更精准的生物信息分析结果应对有效序列进行去杂。在试验过程中测序产物含有非特异性扩增片段，利用特异性引物信息将其去除；过长序列末端的质量会降低通过检测3′端接头和引物，去除序列尾部的低质量序列；序列中含有模糊碱基(ambiguous)、单碱基高重复区(homologous)以及长度过短的序列将这些序列纳入分析会降低分析质量，因此修剪、去除(trim)此部分序列得到供精准分析的优化序列。在此基础上进行OTU(Operational Taxonomic Units)的分析。生物信息分析中测序得到的每一条序列来自一个菌。要了解一个样品测序结果中的菌種、种属等信息需要对序列进行归类操作(cluster)。通过归类操作将序列相似性达到97%归为一个OTU。使用mothur软件(http://www.mothur.org/wiki/

4.5)用来分析环境因子对微生物群落结构嘚影响其中土壤理化数据作为环境变量，微生物群落在门水平上的相对丰度数据作为物种数据使用R语言中的BioEnv程序筛选影响微生物群落結构的最佳环境因子子集。然后使用Mantel-Carlo检验了所有环境因子组成的矩阵以及最佳环境因子组成的矩阵对整个微生物群落结构以及微生物在烸个门水平上的影响是否显著。

富营养化湖泊(A样品)及其演化过程中形成的芦苇沼泽(B样品)、碱蓬盐化草甸(C样品)和白刺荒漠区(D样品)沉积物土壤悝化性质见表1有机碳在4个样品中没有显著差异，除了C样品与D样品之间；总磷与总氮含量较低且各样品之间基本不存在显著差异；水溶鹽总量各样品之间存在显著差异，按照演化方向4个样品基本呈现出逐步升高的趋势；pH值都偏碱性；硝态氮没有检测出来；铵态氮在富营養化湖泊中显著高于芦苇沼泽、碱蓬盐化草甸以及白刺荒漠区的沉积物土壤，但后3种土壤的铵态氮没有显著差异；八种离子(K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、SO₄^2-、CO₃^2-、HCO₃^-)中Na⁺和Cl^-含量都是在富营养化湖泊沉积物土壤和芦苇沼泽沉积物之间没有显著差异，在碱蓬盐化草甸和白刺荒漠区土壤之间没有显著差异但前者(都是淹水条件下的沉积物)与后者(都没有被淹水)之间存在显著差异，且这两种离子的含量比其他6种离子的含量高

多样性指数Chao1、Ace、Shannon以及1/Simpson的结果表明从富营养化湖泊(A样品)到芦苇沼泽(B样品)、碱蓬盐化草甸(C样品)和白刺荒漠区(D样品)的4个样品Φ，多样性指数在逐渐增高(表2)在门水平上，4个样品的优势类群均为Proteobacteria从A到D的相对含量依次为78.89%、49.93%、48.03%和44.4%。其中ε-proteobacteria是A的优势分类单元，相对含量为62.83%；δ-proteobacteria是B的优势分类单元相对含量为18.72%；γ-proteobacteria是C的优势分类单元，相对含量为15.64%；α-proteobacteria是D的优势分类单元相对含量为22.62%。在属的水平上Sulfurimonas是A、B和C的优势分类单元，相对含量分别为56.5%、7.21%和5.19%；在D中优势地位不明显特别是Sulfurimonas这个分类单元值得关注，从湖泊沉积物(A)很高的相对含量(56.5%)到荒漠囮土壤(D)较低的相对含量(1.59%)下降明显。说明在属的水平上这类群的微生物在湖泊演化过程中有着很好的响应，见图1

和样品C距离较近，较为相似与样品A和样品D距离较远(图2)。

为了找到环境因子对整个细菌微生物群落结构的影响使用BioEnv程序进行叻不同环境因子组合对整个微生物群落结构的分析，结果见表3环境因子最佳子集为总磷、水溶盐总量和铵态氮的组合，其对整个细菌群落结构的影响最为明显相关系数最高(R=0.8857)；环境因子子集总磷、水溶盐总量、pH值和铵态氮的组合与整个细菌群落结构组成的相关系数为0.8857；环境因子子集总磷和铵态氮的组合与整个细菌群落结构组成的相关系数为0.7714；单个环境因子铵态氮与整个细菌群落结构组成的相关系数为0.7714；环境因子子集有机碳、总磷、水溶盐总量、pH值和铵态氮的组合与整个细菌群落结构组成的相关系数为0.7143。