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链特异性转录组测序
链特异性转录组测序
非链特异性转录组测序信息不包含链方向的特征信息，对正义和反义转录本无法准确判断，导致无法反映真实的转录情况。而链特异性转录组测序（strand-specific RNA seq）可以解决这个问题。链特异性建库的方式是在合成cDNA的第二条链时，用dUTP替换dTTP。待链合成后，再用USER酶降解cDNA的第二条链并再次进行PCR扩增，完成文库的制备。运用这种方法，可以在测序后的数据分析过程中确定转录本是来自正义还是反义DNA链。与非链特异性转录组测序相比，此方法更能准确地统计转录本的数量和确定基因的结构，同时可以发现更多的反义转录本，目前被广泛地应用于研究基因结构和基因表达调控等领域范围。
链特异性建库根据原核生物或真核生物的不同，建库方式略有差别。同时，链特异性建库既可以用于有参物种的转录组测序也可用于无参物种的转录组测序。
测序策略：
PE100或PE125
建议数据量：
真核生物：一般测序5-6G 深度测序10G
原核生物：一般测序1G 深度测序 5-10G
500mg新鲜植物样本，300mg新鲜动物样本
注: 肿瘤组织优先选择RNAlater保存
&5*106 悬浮/贴壁细胞
&3ml 全血/全血分离的有核细胞
&3μg，浓度 &50ng/μl, RIN值&&6.5
对于较难进行取材的医学类样品，可以适当降低样本标准。
有参链特异性转录组测序生物信息学分析流程
测序数据质控分析
高质量序列与参考基因组比对
基因表达谱构建
基因的可变剪切分析(真核生物)
基因结构优化及新转录本预测
样本间基因差异表达分析
差异表达基因的KEGG和GO功能分析
SNP、InDel等基因结构变异筛查
链方向性分析
差异基因的蛋白互作分析
个性化定制分析
无参链特异性转录组测序生物信息学分析流程
测序数据质控分析
参考序列拼接
Unigene的长度统计及功能注释
Unigene的表达谱构建
序列信息统计
Unigene在样本之间各类差异基因表达
Unigene的KEGG和GO功能分析
链方向性分析
个性化定制分析
运用链特异性转录组测序进行铬胁迫大米的顺式天然反义转录本分析
(有参链特异性转录组测序)
阐明新型的转录本和其顺式天然反义转录本（cis-NATs）的表达情况对于研究植物在应对和适应各种胁迫所发生的代谢过程是十分必要的。非链特异性转录组测序无法提供链方向的信息，因此在鉴定cis-NATs的过程中，必须采用链特异性转录组测序。本研究探索铬处理大米样品中cis-NATs的表达情况和其对应转录本在应对铬胁迫中起到的作用。结果表明，许多cis-NATs 都体现出了上调或者下调的趋势，35个与cis-NATs相关的基因位点在铬处理后的不同的组织和时间点组合显示了上调反应，表明cis-NATs根据环境变化而变化。虽然cis-NATs和RAP（大米基因注释数据库）转录本的对应并非绝对明确，然而通过证明cis-NATs和大米的铬胁迫代谢反应相关，提升了对植物环境胁迫反应的分子层面认知。
Oono, Youko, et al.
"Genome-wide analysis of rice cis-natural antisense transcription under
cadmium exposure using strand-specific RNA-Seq." BMC genomics 18.1 (2017): 761.(Impact factor：3.73)
铬处理24小时后表达上调的大米基因区域：Os05g0194500（红色标示）
B. 链特异性测序转录本的GO富集图，不同颜色代表不同的GO功能
小鼠卵母细胞的深度测序和重新组装揭示转录作用对DNA甲基化起到的影响
(无参链特异性转录组测序)
先前研究并没有清晰地阐述在小鼠卵母细胞中转录作用对DNA甲基化产生的影响，原因之一是没有应用链特异性测序方法，无法体现转录本的方向和确定可变的转录起始位点。本研究系统的探究了小鼠卵母细胞中转录组与DNA甲基化的关系，利用链特异性转录组测序和转录组重新组装的方法对小鼠卵母细胞形成的不同阶段（不生长期，生长期，8-14天，15天和完全生长的卵母细胞）进行了研究，揭示了上千个全新的mRNAs和可变启动子。重新组装后的转录组数据揭示了转录作用的确与DNA甲基化密切相关，受转录作用调控的DNA甲基化占全部甲基化作用的85-90%。后续通过结合甲基化检测，ChIP-seq等方法，准确的定义了小鼠卵母细胞的转录组。本研究不仅在小鼠卵母细胞发生过程中将转录作用与DNA甲基化建立了联系，同时也进一步地完善了小鼠卵母细胞的转录组图谱。
Veselovska, Lenka, et al.
"Deep sequencing and de novo assembly of the mouse oocyte transcriptome
define the contribution of transcription to the DNA methylation
landscape." Genome biology (2015): 209. (Impact factor:11.9）
A. 链特异性转录组测序后的生物信息学分析流程，上方信息为不同卵母细胞发育时期（N.G.O, G.O.1等），右边的条形图为各项分析后的转录本数量。
B. 不同样品（卵母细胞，不同时期胚胎等）中转录本的表达聚类分析，左边竖条代表卵母细胞中特异表达的转录本（紫色）和非特异表达的转录本（黄色）。
研究顺式天然反义转录本 (cis-NATs)；
无参考基因组或参考基因组不全的物种转录组图谱的构建或完善。
链特异性建库和非链特异性建库有什么区别？
1. 链特异性文库可以提供RNA方向信息，以区分转录本是来源于正义链还是反义链，避免了其互补链转录本重叠的干扰，使得基因定量更精确；
2. 链特异性文库可以提高反义链上非编码转录本的检出率，同时也便于确定那些位于基因间的非编码转录本的方向，这一点在普通转录组建库方法上很难实现；
3. 预测新转录本时需要进行组装，而转录组组装出来的unigene包含编码转录本和非编码转录本（如lncRNA），如果不区分其转录本是正义链还是负义链，那么有互补配对关系的编码与非编码转录本就会被组装成一条转录本；
4. 原核生物的基因为多顺反子结构，如果不加区分反义转录本上的基因，其对应位置的基因表达量会计算不准确，操纵子及基因结构的预测也随之不准确。
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阅微微博号到底要不要“链特异”？-一呼百诺
到底要不要“链特异”？作者：一呼百诺 / 公众号：allfrombionova发表时间 ： 到底要不要“链特异”？师妹：师兄啊，我的样品准备好了，打算做转录组测序，可是听说转录组有链特异性和非链特异性测序，这价钱也不一样，我该选哪种呢？师兄：是啊，链特异性测序要贵一点，但是也不知道是贵在哪里了，咱们实验室不差钱，就选择贵的吧，贵的肯定结果好啊百诺小编：这位不差钱实验室的师兄果真豪爽，不过有钱任性咱也要任性的有理由啊。众实验室：那么究竟转录组测序要不要选择链特异性呢？难道结果有什么差别么？百诺小编：既然很多老师对此发问了，小编就详细地讲讲这其中的差别。 我们都知道很多基因组区域都存在正负链的转录本，真核基因的反义转录是一种重要的调控方式；而原核以及低等真核生物的compact基因组，常常具有重叠基因。那么在测序过程中区分转录本来自正链还是负链对于后期数据分析至关重要。 然而DNA测序仪只能测双链的DNA，不能测单链RNA 。那么RNA测序测的是什么呢？其实是与RNA对应的双链cDNA。因此就很难区分出正义链和反义链了。
为了区分正义链和反义链便出现了链特异性测序。首先跟小编一起了解一下什么是链特异性转录组测序吧。链特异性转录组测序 链特异性转录组测序（strand-specific RNA-seq）是指在构建测序文库时，将mRNA链的方向信息保存到测序文库中。测序后的数据分析可确定转录本是来自正义还是反义DNA链。与普通转录组测序相比，它更能准确地统计转录本的数量和确定基因的结构，同时可以发现更多的反义转录本，同时也可能发现新的基因，是研究基因结构和基因表达调控的重要手段。 而链特异性转录组测序关键在于构建链特异性的文库，最常用的方法是掺U法。掺U法用常规的方法，从RNA上逆转录出第一链的cDNA；合成第二链时，所用的dNTP，是特殊的，用dUTP代替了dTTP，用这样的dNTP合成出的第二链中会掺入大量U碱基；在双链cDNA的两头接上接头，然后用USER酶进行消化。知识点USER酶它是一个混合酶。其中的尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)能够识别DNA链中的U碱基，并且把U碱基进行糖基化。接着，这个糖基化的U碱基从核酸链上被切掉，这样核酸链上就型成了一个缺碱基的空位。然后，混合酶当中的核酸内切酶VIII会在脱碱基位点上切断核酸链（即降解）。 降解发生之后，双链的文库就只剩下了一条链，而这条链的两端连有不同序列的接头。接下来进行PCR扩增时，扩增出来的文库保持了模板上两个不对称的接头序列。这样我们在后续测序的时候，测到的就是有方向的文库了。链特异性转录组测序文库构建流程：（看图就更加明白啦）1.提取Total RNA，去除rRNA（原核）/mRNA富集（真核）后，RNA片段化。2.以片段化的RNA为模板，用随机引物反转录合成cDNA的第一条链。3.合成cDNA的第二条链时，用dUTP替换dTTP。然后经过纯化、末端修复、加A和接头的步骤。4.用USER酶降解cDNA的第二条链后，进行PCR扩增，完成测序文库的制备。5.上机测序。那么区分了正负链去测序会有哪些优势呢？（以下都是“贵”的理由哦）1.基因表达定量更精确链特异性文库保留了RNA方向信息，能区分转录本的来源，避免了其互补链转录本的干扰，从而使得基因定量更精确。通过项目数据比较发现，在与参考基因组的比对中，链特异的比对率相近或稍高于非链特异的结果；对链特异性的测序数据进行基因定量分析时，其结果相比qPCR和非链特异性相关性都很高，链特异测序的结果更准确可信。如图，蓝链和红链是互补链，A和B为两个独立的转录本，现在要检测A的表达量，在普通文库测序中，有一部分来源于转录本B的reads是可以比对到A上的，那么A的表达量会被高估。2. 可变剪切检测更准确链特异性文库能够去除反义链转录本的影响，避免了可变剪切事件检测时出现的假阳性。这对于发掘非编码circRNA非常重要，它是由反向剪接形成，而非链特异性测序会使得可变剪接事件的识别存在假阳性，会降低检测circRNA的准确率，因此对于circRNA的检测强烈推荐链特异性的测序方式。3. 非编码转录本的检出率增高链特异性文库可以提高反义链上的非编码转录本的检出率，同时也便于确定那些位于基因间的非编码转录本的方向，这些都是普通文库无法区分的。4. 新转录本预测更真实 在预测新转录本的时候，需要进行组装，而转录组组装出来的unigene包含编码转录本和非编码转录本（如lncRNA），但是如果不区分正负链，那么有互补配对关系的编码与非编码转录本就会被组装成一条转录本。5. 原核生物操纵子分析原核生物的基因为多顺反子结构，反义转录本上的基因，如果不加区分，那么对应位置的基因表达量会计算不准确，并且预测操纵子以及基因结构也更不准确。构建链特异性文库，能更加准确地进行操纵子鉴定和分析。如图，橙色开放阅读框（ORF）与红色和粉色ORF处于两条链上，如果不做链特异性文库，其可能就会被认为是一个转录本。6.模式生物基因深度分析 模式生物拥有完整的基因注释信息，而实际研究中却存在很明显的个体差异。利用链特异性转录组测序可以对个体基因进行深度测序，对基因进行重注释。瞧瞧！链特异性测序有这么多优势，实验室的亲们都别纠结了，为了实验不从头再来，为了发优质文章，果断选择“链特异”，也避免了自己忙活半天竟然没有测到期待的结果！PS：一直致力于把更优质的测序服务带给一线科研人员的Bionova，温馨提示：
Bionova转录组测序均采用链特异性文库，我们只会把最专业的技术服务应用在您每一份珍贵的科研样品中，让您不再为“贵”而纠结！关注一呼百诺，这个夏天，我们一起涨姿势！一呼百诺生物科研资讯公众号ID：allfrombionova表观遗传学方案解决专家长按二维码关注相关文章猜你喜欢蜀都汇生活冀生堂新西兰纽菲尔德凤凰四川文化陈一手房源#统计代码当前位置：
&有关转录组测序的两个问题，谢谢！
有关转录组测序的两个问题，谢谢！
作者 tea_gl9871
准备做某个植物材料的转录组测序，和公司商议后，他们有链特异性文库和双链文库两种建库方法，不知道哪个方法更适合筛选差异表达基因和SNP位点分析等研究内容。另外一个问题，我的材料是4倍体商品种，现有的基因组文库信息是依靠2倍体材料做的，这样后期做信息注释或其他内容时是否好做？
希望大家给予指点，盼复！
你做的目的是筛选差异表达基因，我上次做的也是这个，但是我的没有参考基因，直接找公司做的转录组测序，后续的SNP人家都会帮你分析好，如果你有参考基因，只要分析差异基因，后续的SNP分析你不是太注重的话，直接做RNA-SEQ就行了。
引用回帖:: Originally posted by zq at
你做的目的是筛选差异表达基因，我上次做的也是这个，但是我的没有参考基因，直接找公司做的转录组测序，后续的SNP人家都会帮你分析好，如果你有参考基因，只要分析差异基因，后续的SNP分析你不是太注重的话，直接做 ... 双链特异性文库我不太了解，链特异性文库需提供参考基因序列、参考基因组序列，他的分析内容和常规的转录组对真核生物是一样的，相比较常规的转录组，他可以较全面的分析原核生物的，我觉得你做常规的就可以了，
引用回帖:: Originally posted by zq at
双链特异性文库我不太了解，链特异性文库需提供参考基因序列、参考基因组序列，他的分析内容和常规的转录组对真核生物是一样的，相比较常规的转录组，他可以较全面的分析原核生物的，我觉得你做常规的就可以了。... 四倍体的那个问题 我也不清楚 你可以咨询一下你要做的那家公司的技术部！
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